Method Article

Identyfikacja mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego w zespole mielodysplastycznym i ostrej białaczce szpikowej

DOI:

10.3791/66093

⸱

November 10th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Wilmot Cancer Institute, University of Rochester Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 3Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center, 4Genomics Research Center, University of Rochester Medical Center, 5Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, University of Rochester Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół izolowania i charakteryzowania mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego z mysich modeli zespołów mielodysplastycznych i ostrej białaczki szpikowej. Technika ta identyfikuje zmiany w niekrwiotwórczej niszy szpiku kostnego, w tym w komórkach śródbłonka i mezenchymalnych komórek zrębu, wraz z postępem choroby.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrośrodowisko szpiku kostnego składa się z odrębnych populacji komórek, takich jak mezenchymalne komórki zrębu, komórki śródbłonka, komórki osteolineage i fibroblasty, które zapewniają wsparcie dla hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC). Oprócz wspierania prawidłowych HSC, mikrośrodowisko szpiku kostnego odgrywa również rolę w rozwoju zaburzeń hematopoetycznych komórek macierzystych, takich jak zespoły mielodysplastyczne (MDS) i ostra białaczka szpikowa (AML). Mutacje związane z MDS w HSC prowadzą do zablokowania różnicowania i postępującej niewydolności szpiku kostnego, zwłaszcza u osób starszych. MDS może często przekształcić się w oporną na terapię AML, chorobę charakteryzującą się szybką akumulacją niedojrzałych blastów szpikowych. Wiadomo, że mikrośrodowisko szpiku kostnego jest zmienione u pacjentów z tymi nowotworami szpiku. W tym miejscu opisano kompleksowy protokół izolacji i fenotypowej charakterystyki komórek mikrośrodowiskowych szpiku kostnego z mysich modeli zespołu mielodysplastycznego i ostrej białaczki szpikowej. Wyizolowanie i scharakteryzowanie zmian w populacjach nisz szpiku kostnego może pomóc w określeniu ich roli w inicjacji i progresji choroby oraz może prowadzić do opracowania nowych terapii ukierunkowanych na zmiany sprzyjające nowotworom w populacjach zrębu szpiku kostnego.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrośrodowisko szpiku kostnego składa się z komórek krwiotwórczych, niekrwiotwórczych komórek zrębowych oraz macierzy zewnątrzkomórkowej1,2. To mikrośrodowisko może sprzyjać samoodnawianiu się krwiotwórczych komórek macierzystych, regulować różnicowanie linii oraz zapewniać strukturalne i mechaniczne wsparcie tkance kostnej1,2,3,4,5. Wnęka zrębu obejmuje komórki osteolineage, fibroblasty, komórki nerwowe i komórki śródbłonka6, podczas gdy nisza krwiotwórcza składa się z populacji limfoidalnej i szpikowej1,2,3. Mikrośrodowisko szpiku kostnego może nie tylko wspierać prawidłowe HSC, ale także odgrywać rolę w rozwoju zaburzeń krwiotwórczych komórek macierzystych, takich jak MDS i AML7,8,9,10,11. Wykazano, że mutacje w komórkach osteolineage sprzyjają rozwojowi MDS, AML i innych nowotworów mieloproliferacyjnych10,12,13,14.

Zespoły mielodysplastyczne to grupa zaburzeń przedbiałaczkowych, które powstają w wyniku mutacji w krwiotwórczych komórkach macierzystych. MDS jest często związany z blokadą różnicowania HSC i wytwarzaniem komórek dysplastycznych, co często może prowadzić do niewydolności szpiku kostnego. MDS jest najczęściej diagnozowanym nowotworem szpiku w Stanach Zjednoczonych i wiąże się z 3-letnim wskaźnikiem przeżycia wynoszącym 35%-45%15. MDS często wiąże się z wysokim ryzykiem transformacji w ostrą białaczkę szpikową. Może to być śmiertelne powikłanie, ponieważ AML wywodząca się z MDS jest oporna na większość terapii i istnieje prawdopodobieństwo nawrotu. Ostra białaczka szpikowa, która powstaje de novo w wyniku translokacji lub mutacji w krwiotwórczym trzonie układu krwiotwórczego i przodkach, jest również często oporna na standardową chemioterapię16,17. Ponieważ MDS i AML są przede wszystkim chorobami osób starszych, z których większość diagnozuje się w wieku powyżej 60 lat, większość pacjentów nie kwalifikuje się do leczniczego przeszczepu szpiku kostnego. W związku z tym istnieje istotna potrzeba zidentyfikowania nowych regulatorów postępu choroby. Ponieważ mikrośrodowisko szpiku kostnego może stanowić wsparcie dla komórek nowotworowych14, zdefiniowanie zmian w niszy szpiku kostnego wraz z postępem choroby może prowadzić do identyfikacji nowych terapii mających na celu zahamowanie przebudowy niszy nowotworowej. W związku z tym istnieje pilna potrzeba zidentyfikowania nowych regulatorów progresji choroby. W tym celu kluczowe znaczenie ma zidentyfikowanie i scharakteryzowanie zmian w populacjach komórek zrębu szpiku kostnego, które mogą stanowić wsparcie dla komórek nowotworowych.

Wygenerowano kilka mysich modeli AML i MDS, które mogą być używane do badania zmian w mikrośrodowisku szpiku kostnego podczas inicjacji i progresji choroby6,1,19,20,21,22. W tym miejscu opisano protokoły identyfikacji zmian w populacjach komórek zrębu szpiku kostnego przy użyciu mysich modeli retrowirusowo indukowanej AML6,20, a także dostępny na rynku model Nup98-HoxD13 (NHD13) transformacji MDS wysokiego ryzyka do AML19. Myszy przeszczepione komórkami AML de novo zapadają na chorobę w ciągu 20-30 dni6. Myszy NHD13 rozwijają cytopenię i dysplazję szpiku kostnego około 15-20 tygodni, która ostatecznie przekształca się w AML, a prawie 75% myszy zapada na chorobę około 32 tygodnia. Aby przeanalizować populacje mikrośrodowiska szpiku kostnego w modelu mysim, pobiera się kości, szpik kostny i kolce kostne są trawione za pomocą trawienia enzymatycznego, a następnie komórki są wzbogacane o populacje niehematopoetyczne CD45-/Ter119- przez sortowanie magnetyczne. Chociaż podobne analizy zostały już wcześniej opisane11,13,22,23,24,25, często koncentrują się one na szpiku kostnym lub kości i nie uwzględniają w swoich analizach komórek z obu źródeł. Połączona charakterystyka tych populacji, w połączeniu z analizami ekspresji genów, może zapewnić kompleksowe zrozumienie, w jaki sposób komórkowe mikrośrodowisko krwiotwórcze zapewnia wsparcie dla inicjacji i progresji choroby (Rysunek 1). Podczas gdy opisany poniżej protokół koncentruje się na retrowirusowo indukowanym modelu AML i genetycznym modelu MDS, strategie te można łatwo dostosować do badania zmian w niszy szpiku kostnego dowolnego interesującego nas modelu mysiego.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Zasobów Zwierzęcych Uniwersytetu w Rochester. Myszy były hodowane i utrzymywane w placówkach opieki nad zwierzętami na Uniwersytecie w Rochester. Do modelowania MDS wysokiego ryzyka wykorzystywany jest dostępny na rynku model mysi NHD1319. W tym modelu komórki zrębu szpiku kostnego są analizowane u samic myszy NHD13 w wieku 8 tygodni, przed wystąpieniem choroby. De novo AML jest generowany zgodnie z wcześniejszym opisem6,11,20. Onkogeny wykorzystywane do indukcji AML, takie jak MLL-AF9 i NRas, są znakowane GFP lub YFP, co pozwala na analizę niebiałaczkowych populacji szpiku kostnego GFP za pomocą cytometrii przepływowej. Krótko mówiąc, 10-tygodniowym samicom myszy C57BL/6J przeszczepia się mysie komórki AML GFP/YFP+, a szpik kostny pobiera się 2 tygodnie po przeszczepie. Podczas gdy samice myszy są wykorzystywane w tym badaniu do celów demonstracyjnych, protokół ten można przeprowadzić zarówno na samcach, jak i samicach myszy. Można go również przeprowadzić przy użyciu jednej kości udowej lub wszystkich kości długich.

1. Pobieranie szpiku kostnego

UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat protokołu sekcji zwierząt, zapoznaj się z Amend et al.26.

  1. Oczyść moździerz i tłuczek 70% etanolem, opłucz je schłodzonym buforem FACS (Tabela 1) i umieść na lodzie do ostygnięcia przed rozpoczęciem zbiorów. Umieść również bufor MAC (Tabela 1) na stole, aby umożliwić mu osiągnięcie temperatury pokojowej.
  2. Poddaj zwierzę eutanazji zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi i protokołami dotyczącymi opieki nad zwierzętami i użytkowania.
  3. Na blacie dokładnie spryskaj mysz 70% etanolem, aż jej sierść będzie mokra. Za pomocą kleszczy i zakrzywionych nożyczek podnieś skórę na brzuchu i wykonaj dwa nacięcia o długości około 0,5 mm po obu stronach myszy, po bokach brzucha. Następnie wykonaj nacięcie 0,5 mm dystalnie od brzucha. Pociągnij w dół, aby usunąć skórę i sierść z nóg myszy.
  4. Umieść nożyczki prostopadle do miednicy, dociśnij, jednocześnie ciągnąc kość udową kleszczami. Głowa kości udowej powinna odłączyć się od miednicy. Oddziel kość udową i piszczelową w stawie rzepkowo-udowym. Umieścić kości w buforze FACS na 6-dołkowej płytce na lodzie.
  5. Usunąć tkankę z kości za pomocą tkanki laboratoryjnej i umieścić oczyszczone kości na nowej 6-dołkowej płytce ze świeżym buforem FACS na lodzie.
  6. Umieść wszystkie kości w moździerzu z 2-5 ml buforu FACS, tak aby wszystkie kości były zanurzone w buforze (dostosuj objętość buforu w zależności od liczby przetwarzanych kości). Zmiażdż i zmiel kości za pomocą tłuczka okrężnymi ruchami, aż tkanka szpiku kostnego zostanie uwolniona.
  7. Za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml homogenizować szpik kostny, pociągając do góry i spłukując płyn z moździerza.
  8. Za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml wyciągnij płyn z moździerza i przefiltruj go przez sitko o pojemności 70 μm do probówki o pojemności 50 ml na lodzie. Wypłucz kawałki kości/tkanki z filtra z powrotem do zaprawy za pomocą buforu FACS i wróć do kroku 1.7, aby homogenizować i odcedzić po raz drugi. Jest to frakcja szpiku kostnego.
  9. Wypłucz pozostałe kawałki kości (spikule) z powrotem do moździerza za pomocą buforu FACS i przepłucz je do probówki o pojemności 15 ml za pomocą buforu FACS, aby zapewnić maksymalną wydajność komórek. Jest to frakcja kolców kostnych.

2. Trawienie szpiku kostnego

  1. Odwirować szpik kostny przy stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować i odrzucić supernatant.
  2. Zawiesić szpik kostny w 2 ml mieszaniny do trawienia szpiku kostnego (Tabela 1) i przenieść go do probówki o pojemności 15 ml. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut na rotatorze.
  3. Dodać 10 ml buforu FACS, aby zatrzymać trawienie enzymatyczne. Przefiltrować mieszaninę przez sitko o pojemności 70 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml.
  4. Mieszaninę osadzać w stężeniu 400 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Zawiesić osad szpiku kostnego w 1 ml buforu do lizy RBC (patrz tabela materiałów). Inkubować przez 4 minuty na lodzie.
  6. Dodaj 10 ml buforu FACS, aby zatrzymać lizę. Przefiltrować mieszaninę przez sitko o pojemności 70 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml.
  7. Mieszaninę osadzać w stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl buforu FACS.

3. Trawienie kolców kostnych

  1. Odwiruj kolce kostne od kroku 1.9 i pozwól im się osadzić. Zdekantować supernatant i zatrzymać kość na dnie.
  2. Zawiesić kolce kostne w 1 ml mieszaniny do trawienia spikul kostnych (Tabela 1).
  3. Umieścić probówki na rotatorze rurowym na 60 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Dodać 10 ml buforu FACS, aby zatrzymać trawienie enzymatyczne. Przefiltrować mieszaninę przez sitko o wielkości 70 μm do probówki o pojemności 50 ml zawierającej szpik kostny poddany lizie erytrocytów i strawiony.

4. Barwienie

  1. Delikatnie wymieszaj kolce kostne i zawiesinę komórek szpiku kostnego.
  2. Użyj 10 μl zawiesiny komórek, aby policzyć liczbę żywych komórek na hemocytometrze przy użyciu 0,4% barwienia na bazie błękitu trypanowego, zgodnie z opisem w opublikowanych protokołach27. Zbierz 50 000 komórek do niezabarwionej kontroli z zawiesiny komórek.
  3. Odwirować pozostałe komórki przy sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić go w 100 μl buforu FACS.
    UWAGA: Przeciwciała można miareczkować w celu określenia idealnego rozcieńczenia. Dobór przeciwciał (epitopy i fluorochromy) można dostosować.
  4. Do barwienia przeciwciałami w celu zubożenia magnetycznego dodaj blok FC (1 μL na 25 x 106 komórek), CD45-APC (10 μL na 25 x 106 komórek) i Ter119-APC (4 μL na 25 x 106 komórek) (patrz Tabela materiałów).
  5. Inkubować na lodzie przez 20 minut. Przemyć buforem FACS, usunąć 50 000 komórek (~50 μl) do kontroli barwionej APC, odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić w 100 μl buforu FACS.
  6. Do barwienia zawiesiny komórek mikrogranulkami w celu wyczerpania magnetycznego należy dodać mIgG (8 μL na 25 x 106 komórek) i mikrogranulki anty-APC (20 μL na 25 x 106 komórek) (patrz tabela materiałów).
  7. Inkubować na lodzie przez 20 minut. Przemyć 10 ml buforu FACS, odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.

5. Zubożenie próbki przez sortowanie magnetyczne

UWAGA: Ten krok jest wykonywany za pomocą dostępnego na rynku ręcznego separatora magnetycznego zgodnie z instrukcjami producenta. Ten etap można również wykonać za pomocą automatycznego separatora (patrz Tabela materiałów).

  1. Przygotować kolumnę LD, przemłukując ją 2 ml buforu MAC (Tabela 1). Wyrzuć ścieki i wymień rurkę zbiorczą.
  2. Ponownie zawieś do 1 x 108 komórek w buforze MAC i przefiltruj je przez probówkę o pojemności 5 ml z nasadką sitową 35 μm.
  3. Umieść kolumnę LD na stojaku separatora magnetycznego. Umieść probówkę o pojemności 5 ml poniżej kolumny, aby zebrać eluat.
  4. Dodaj zawiesinę komórek do przygotowanej kolumny LD. Pozwól, aby frakcja ujemna przepłynęła do probówki zbiorczej. Przemyć kolumnę dwukrotnie 1 ml buforu MAC, zbierając eluat w tej samej probówce. Jest to frakcja ujemna użyta w kroku 5.6 poniżej.
  5. Wyjmij kolumnę LD ze stojaka separatora magnetycznego i umieść ją na nowej probówce o pojemności 5 ml. Za pomocą pipety dozować 3 ml buforu do kolumny, aby wypłukać komórki, które zostały pozytywnie oznakowane, za pomocą tłoka kolumny.
  6. Odwirować frakcje ujemne i dodatnie przy sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić je ponownie w 100 μl buforu FACS.
  7. Policz 10 μl frakcji ujemnej i dodatniej za pomocą 0,4% błękitu trypanowego. Objętości do poniższego barwienia osteoanalizy/panelu śródbłonka będą oparte na tej liczbie komórek.
  8. Użyj 50 000 żywych komórek z frakcji dodatniej do kontroli bramkowania cytometrii przepływowej.

6. Osteoanaliza/barwienie panelu śródbłonka

UWAGA: Kompensacja powinna być wykonywana zgodnie ze standardowymi protokołami cytometrii przepływowej, w tym wszystkimi odpowiednimi kontrolami barwienia i bramkowania.

  1. Do barwienia frakcji ujemnej CD45/Ter119 (1 μl każdego przeciwciała na 1 x 106 komórek) dodać CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE i CD140a-PE-Cy5 (patrz Tabela materiałów).
  2. Inkubować na lodzie przez 20 minut. Przemyć 2 ml buforu FACS, następnie odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Dodać 1 ml buforu FACS i rozcieńczyć PI w stosunku 1:1000 do barwienia żywego/martwego, a następnie przefiltrować próbkę przez probówkę o pojemności 5 ml z nasadką sitową o wielkości 35 μm.
  4. Przeanalizuj komórki na wielokolorowym cytometrze przepływowym.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje opartą na cytometrii przepływowej metodę analizy mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego, takich jak śródbłonek i mezenchymalne komórki zrębu, z MDS i mysich modeli białaczki (Rysunek 1). Rysunek 2 przedstawia strategię bramkowania dla wykrywania interesujących populacji, zaczynając od wyboru komórek (P1) w strawionej i zubożonej frakcji CD45/Ter119 poprzez profil rozproszenia do przodu i z boku. Przykładowe bramkowanie komórek w próbce białaczki...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele białaczki mysiej są szeroko stosowane do identyfikacji wewnętrznych i niszowych sygnałów komórkowych, które sprzyjają postępowi agresywnej białaczki szpikowej 6,19,21. W artykule przedstawiono kompleksowy protokół oparty na cytometrii przepływowej w celu określenia składu komórkowego mikrośrodowiska szpiku kostnego w mysich modelach MDS i AML.

Przed uzyskaniem danych cytometrii przepływowej z p...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Rdzeniowi Cytometrii Przepływowej URMC. Praca ta była wspierana przez American Society of Hematology Scholar Award, nagrodę Leukemia Research Foundation oraz granty NIH R01DK133131 i R01CA266617 przyznane J.B.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Końcówki do pipet 1 ml Genesee Scientific 24-165RL
1,7 ml probówki do mikrowirówekAVANTL211511-CS
10 µ L Końcówki do pipetGenesee Scientific 24-140RL
10 ml pojedynczo pakowane sterylne pipety serologiczneGlobe scientific1760
1000 mL Termos do filtracji próżniowejNEST344021
15 ml Probówka wirówkowaVWR10026-076
Pipeta aspiracyjna 2 mLNEST325011
200 µ L Końcówki do pipetGenesee Scientific 24-150-RL
25 ml Sterylne pipety serologiczne pakowane pojedynczoGlobe scientific1780
5 ml Sterylne pipety serologiczne pakowane pojedynczoGlobe scientific1740
5 ml polistyrenowa probówka okrągłodenna  12 x 75 mmstyl Falcon352054
5 ml polistyrenowa probówka okrągłodenna z nasadką sitka do komórek 12 x 75 mm stylFalcon
Probówka wirówkowa 50 mlNEST602052
6-dołkowa, płaska denna z pokrywką o niskiej parowaniuFalcon353046
Chłonne podkładki z wodoodporną barierą przeciwwilgociowąVWR56616-031
Mikrokulki APCMiltenyi 130-090-855
autoMACS Pro SeparatorMiltenyi Biotec GmBH4425745
BD Pharmingen Oczyszczony szczurzy anty-mysi CD16/CD32 (mysi blok BD Fc)BD Biosciences5531410,5 mg/ml 
Surowica bydlęca AlbuminaSigma-AldrichA790666.000 g/mol
Brilliant Violet 421 przeciwciało anty-mysie Ly-6A/E (Sca-1) (D7)Invitrogen404-59810,2 mg/ml
C57BL/6J MyszyJackson Laboratory 664
Zbiornik dwutlenku węgla AirgasCD50
CD31 (PECAM-1) Przeciwciało monoklonalne (390), PE-cyjanina7Invitrogen25-0311-820,2 mg / ml
Przeciwciało monoklonalne CD45 (30-F11), APCInvitrogen17-0451-820,2 mg / ml
Sitko komórkowe 70 i mikro; m Nylon Falcon352350
Cole-Parmer Essentials Moździerz i tłuczek; Agat, 125 mlCole-ParmerEW-63100-62
Kolagenaza z Clostridium histolyticumSigma-AldrichC5138-500MG
Kolagenaza typu ISTEMCELL7415
Mini wirówka CorningCORNING6770
Kontroler pipet Corning Stripettor Ultra Corning4099
Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcejSigma-AldrichD4513
Dispase II, proszekGibco117105041
DPBS 10xgibco14200-075
eBioscience 1x bufor do lizy RBCInvitrogen00-4333-57
Absolutny etanol, KOPTEC, spełnia specyfikację analityczną BP, Ph. Eur., USP (200 Proof)VWR89125-174
Cienkie nożyczki - ostreFine Science Tools14061-10
Foundation B Płodowa surowica bydlęcaGeminiBio900-208
Gilson  Zestawy startowe do pipet PIPETMAN LFisherScientific 
Graefe KleszczeFine Science Tools11051-10
Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS) 10xgibco14185-052
HemocytometrFisher02-671-10
Inkubator BINDERC150-UL
KimwipesKIMTECHK222101
LABGARD Class II, Type A2 Szafa bezpieczeństwa biologicznegoNuaireNU-425-400
LD KolumnyMiltenyi Biotec GmBH130-042-901
LSE Mieszalnik wirowyCORNING6775
LSRII/Fortessa/Symphony A1Becton, Dickinson i spółka647800L6
MACS MULTI PODSTAWKA Miltenyi Biotec GmBH130-042-303
Rotator rurowy MACsmix Miltenyi Biotec GmBH130-090-753
mIgGMillipore-Sigma18765-10mg2 mg/ml 
NUP98-HOXD13 (NHD13) Laboratorium Jacksona Myszy 
PE Przeciwciało przeciw mysim CD51 (RMV-7)Biolegend1041060,2 mg/ml
PE/cyjaninina 5 przeciwciało anty-mysie CD140a (RUO)Biolegend1359200,2 mg/ml
Penicylina-Streptomycyna Gibco1514012210 000 U/ml
Plastipak 3 ml strzykawkaBecton, Dickinson and Company309657
Jodek propidium - 1,0 mg/ml roztwór w wodzieThermoFisher ScientificP3566
QuadroMACS  Separator Miltenyi Biotec GmBH130-090-976
Wirówka serii Sorvall X Pro / ST PlusThermo Scientific 
Przeciwciało monoklonalne TER-119 (TER-119), APCInvitrogen17-5921-820,2 mg/ml
roztwór błękitu trypanowego 0,4%Gibco15-250-061
Ultrapure 0,5 M EDTA, pH 8,0 Invitrogen15575-038
352235F167370G01050575009521

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
  2. Boulais, P. E., Frenette, P. S. Making sense of hematopoietic stem cell niches. Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).
  3. Pinho, S., Frenette, P. S. Haematopoietic stem cell activity and interactions with the niche. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (5), 303-320 (2019).
  4. Kfoury, Y., Scadden, D. T. Mesenchymal cell contributions to the stem cell niche. Cell Stem Cell. 16 (3), 239-253 (2015).
  5. Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
  6. Bajaj, J., et al. Cd98-mediated adhesive signaling enables the establishment and propagation of acute myelogenous leukemia. Cancer Cell. 30 (5), 792-805 (2016).
  7. Konopleva, M. Y., Jordan, C. T. Leukemia stem cells and microenvironment: Biology and therapeutic targeting. J Clin Oncol. 29 (5), 591-599 (2011).
  8. Kim, Y. W., et al. Defective notch activation in microenvironment leads to myeloproliferative disease. Blood. 112 (12), 4628-4638 (2008).
  9. Walkley, C. R., et al. A microenvironment-induced myeloproliferative syndrome caused by retinoic acid receptor gamma deficiency. Cell. 129 (6), 1097-1110 (2007).
  10. Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating β-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
  11. Hanoun, M., et al. Acute myelogenous leukemia-induced sympathetic neuropathy promotes malignancy in an altered hematopoietic stem cell niche. Cell Stem Cell. 15 (3), 365-375 (2014).
  12. Raaijmakers, M. H., et al. Bone progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
  13. Frisch, B. J., et al. Functional inhibition of osteoblastic cells in an in vivo mouse model of myeloid leukemia. Blood. 119 (2), 540-550 (2012).
  14. Bajaj, J., Diaz, E., Reya, T. Stem cells in cancer initiation and progression. J Cell Biol. 219 (1), e201911053(2020).
  15. Sekeres, M. A., Taylor, J. Diagnosis and treatment of myelodysplastic syndromes: A review. Jama. 328 (9), 872-880 (2022).
  16. Zeisig, B. B., Kulasekararaj, A. G., Mufti, G. J., So, C. W. Snapshot: Acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 22 (5), 698-698.e1 (2012).
  17. Krivtsov, A. V., Armstrong, S. A. Mll translocations, histone modifications and leukaemia stem-cell development. Nat Rev Cancer. 7 (11), 823-833 (2007).
  18. Yoshimi, A., et al. Coordinated alterations in rna splicing and epigenetic regulation drive leukaemogenesis. Nature. 574 (7777), 273-277 (2019).
  19. Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. Nup98-hoxd13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia. Blood. 106 (1), 287-295 (2005).
  20. Kwon, H. Y., et al. Tetraspanin 3 is required for the development and propagation of acute myelogenous leukemia. Cell Stem Cell. 17 (2), 152-164 (2015).
  21. Bajaj, J., et al. An in vivo genome-wide crispr screen identifies the rna-binding protein staufen2 as a key regulator of myeloid leukemia. Nat Cancer. 1 (4), 410-422 (2020).
  22. Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by mll-af9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
  23. Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932.e16 (2019).
  24. Tikhonova, A. N., et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).
  25. Balderman, S. R., et al. Targeting of the bone marrow microenvironment improves outcome in a murine model of myelodysplastic syndrome. Blood. 127 (5), 616-625 (2016).
  26. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. JoVE. 110, e53936(2016).
  27. JoVE Science Education Database. Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. , JoVE. (2023).
  28. Passaro, D., et al. Increased vascular permeability in the bone marrow microenvironment contributes to acute myeloid leukemia progression and drug response. Blood. 128 (22), 2662(2016).
  29. Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nat Commun. 9 (1), 2449(2018).
  30. Baccin, C., et al. Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization. Nat Cell Biol. 22 (1), 38-48 (2020).
  31. Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Arch Oral Biol. 93, 74-79 (2018).
  32. Abreu-Velez, A. M., Howard, M. S. Collagen IV in normal skin and in pathological processes. N Am J Med Sci. 4 (1), 1-8 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bone Marrow MicroenvironmentMyelodysplastic SyndromeAcute Myeloid LeukemiaMesenchymal Stromal CellsFlow CytometryMagnetic SeparationEndothelial CellsOsteolineage CellsHematopoietic Stem CellsCell Population Isolation

Related Articles