Artykuł metodologiczny

Ustalenie i charakterystyka organoidów żołądkowych pochodzących od pacjenta z biopsji łagodnego ciała żołądka i nabłonka antralnego

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66094

⸱

26 stycznia 2024

 ,  ,  ,  , 
1Division of Gastroenterology and Hepatology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 2Department of Surgery, Columbia University Irving Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Organoidy pochodzące od pacjentów żołądkowych znajdują coraz większe zastosowanie w badaniach, jednak brakuje formalnych protokołów do generowania ludzkich organoidów żołądkowych z jednokomórkowych trawień o standaryzowanej gęstości wysiewu. W protokole przedstawiono szczegółową metodę wiarygodnego tworzenia organoidów żołądka z tkanki biopsyjnej uzyskanej podczas endoskopii górnego odcinka kręgosłupa.

Streszczenie

Organoidy pochodzące od pacjentów żołądkowych (PDO) oferują unikalne narzędzie do badania biologii i patologii żołądka. W związku z tym te PDO znajdują coraz większe zastosowanie w szerokim zakresie zastosowań badawczych. Istnieje jednak niedobór opublikowanych podejść do produkcji gastrycznych PDO z trawienia pojedynczych komórek przy zachowaniu znormalizowanej początkowej gęstości wysiewu komórek. W tym protokole nacisk położono na inicjację organoidów żołądkowych z izolowanych pojedynczych komórek oraz zapewnienie metody przekazywania organoidów przez fragmentację. Co ważne, protokół pokazuje, że ustandaryzowane podejście do początkowej gęstości wysiewu komórek konsekwentnie daje organoidy żołądka z łagodnej tkanki biopsji i pozwala na standaryzowaną kwantyfikację wzrostu organoidów. Wreszcie, dowody potwierdzają nową obserwację, że gastryczne PDO wykazują różne tempo powstawania i wzrostu w zależności od tego, czy organoidy pochodzą z biopsji ciała, czy z obszarów antralnych żołądka. W szczególności wykazano, że zastosowanie tkanki biopsji antralnej do inicjacji organoidów skutkuje większą liczbą powstałych organoidów i szybszym wzrostem organoidów w okresie 20 dni w porównaniu z organoidami generowanymi z biopsji ciała żołądka. Opisany w niniejszym dokumencie protokół oferuje badaczom terminową i powtarzalną metodę skutecznego generowania i pracy z PDO żołądka.

Wprowadzenie

Organoidy to miniaturowe trójwymiarowe (3D) struktury komórkowe, które przypominają architekturą i funkcjonalność organów, z których pochodzą1,2. Te wyhodowane w laboratorium modele są tworzone przez hodowlę komórek macierzystych lub komórek specyficznych dla tkanek w kontrolowanym środowisku, które pozwala tym komórkom na samoorganizację i różnicowanie się w różne typy komórek1,2,3. Jedną z kluczowych zalet organoidów jest ich zdolność do dokładniejszego odwzorowania biologii człowieka niż tradycyjne dwuwymiarowe (2D) hodowle komórek1,2,3. W szczególności wykazano, że ludzkie organoidy zachowują różnorodność genetyczną swojej tkanki pochodzenia3,4,5. Organoidy oferują wyjątkową okazję do badania rozwoju ludzkich narządów, modelowania chorób i testowania potencjalnych środków terapeutycznych w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Co więcej, organoidy można uzyskać z indywidualnych próbek pacjentów, co umożliwia spersonalizowane podejście do medycyny i potencjalny rozwój zindywidualizowanych metod leczenia3,6,7.

Badacze wykorzystali ludzkie organoidy żołądkowe do zbadania różnych aspektów biologii i patologii żołądka. Wybitnymi przykładami są wykorzystanie organoidów pochodzących od pacjentów (PDO) do przewidywania odpowiedzi na chemioterapię raka żołądka8,9,10 i modelowanie odpowiedzi nabłonkowej na zakażenie Helicobacter pylori11,12,13. Ludzkie organoidy żołądkowe składają się z różnych typów komórek znajdujących się w żołądku, w tym komórek szyi, komórek jam i innych komórek pomocniczych11,14. Organoidy żołądka mogą być generowane z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) lub komórek macierzystych bezpośrednio wyizolowanych z tkanki żołądka uzyskanej za pomocą biopsji lub z próbek do resekcji żołądka11,14. Izolacja komórek macierzystych żołądka z tkanki żołądka jest zwykle wykonywana poprzez izolację i hodowlę gruczołów żołądkowych lub enzymatyczne trawienie próbek tkanek w celu uwolnienia pojedynczych komórek9,13,15. Co ważne, wykazano, że różnicowanie komórek w organoidach żołądka wygenerowanych przy użyciu którejkolwiek z tych technik jest podobne13. Opisany w niniejszym dokumencie protokół koncentruje się na trawieniu jednokomórkowym.

Organoidy reprezentują innowację naukową, która wypełnia lukę między tradycyjną hodowlą komórkową a całymi organami. Wraz z postępem badań w tej dziedzinie, organoidy mogą przyczynić się do opracowania skuteczniejszych metod leczenia i terapii dla szerokiego zakresu zastosowań. Biorąc pod uwagę rosnące wykorzystanie gastrycznych ChNP, istnieje aktualna potrzeba ustandaryzowanego podejścia do ich wytwarzania. W tym miejscu opisano protokół generowania PDO ludzkiego żołądka z pojedynczych komórek wyizolowanych z tkanki łagodnej biopsji żołądka pozyskanej podczas endoskopii górnego odcinka żołądka. Co ważne i wyjątkowe, do wysiewu określa się standaryzowaną liczbę pojedynczych komórek, aby niezawodnie generować PDO w żołądku i umożliwić późniejszą charakterystykę. Za pomocą tej techniki wykazano wiarygodne różnice w tworzeniu i wzroście organoidów generowanych z biopsji ciała żołądka lub antrum żołądka.

Protokół

Wszystkie ludzkie tkanki użyte w tym protokole zostały pobrane od osób, które wyraziły świadomą zgodę na pobranie tkanek poprzez badanie pobierania tkanek żołądka zatwierdzone przez University of Pennsylvania Institutional Review Board (IRB #842961). Uczestnicy tego badania musieli poddać się endoskopii górnego odcinka kręgosłupa w ramach rutynowej opieki, mieć ukończone 18 lat i być w stanie wyrazić świadomą zgodę. Wszystkie przeprowadzone badania były zgodne z wytycznymi określonymi przez University of Pennsylvania.

1. Przygotowanie eksperymentalne

  1. Przygotuj kondycjonowany nośnik L-WRN zgodnie z wcześniejszym opisem16. Chociaż nie jest to obowiązkowe, stężenia Wnt-3A, R-spondyny i nogginy zawartych w kondycjonowanych pożywkach można sprawdzić za pomocą dostępnych na rynku zestawów ELISA zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
  2. Przygotuj antybiotyki RPM (RPMI-ABX), antybiotyki PBS (PBS-ABX), PBS-DITIOTREITOL (PBS-DTTT), bufor wytrawiający i pożywki z organoidów żołądkowych (szczegółowy skład znajduje się w tabeli uzupełniającej 1). Pożywka organoidowa żołądka jest stabilna przez 1 tydzień w temperaturze 4 °C.
  3. Kleszcze do autoklawów, drobne nożyczki preparacyjne i probówki 1,5 ml.
  4. Rozpocznij rozmrażanie macierzy błony podstawnej (Matrigel) na lodzie.
  5. Rozpocząć rozmrażanie buforu wytrawiającego i trypsyny-EDTA w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  6. Ustawić wytrząsarkę orbitalną inkubatora na 37 °C i 200 obr./min.

2. Izolowanie pojedynczych komórek z tkanki biopsji

  1. Pobranie biopsji żołądka podczas endoskopii górnego odcinka kręgosłupa17 zgodnie z instytucjonalnym protokołem klinicznym, prawdopodobnie z użyciem kleszczy jumbo. Użyj igły, aby pobrać próbki tkanek z kleszczy i umieść je w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej podłoże RPMI-ABX. Trzymaj probówkę na lodzie w celu szybkiego przeniesienia do laboratorium.
    UWAGA: Należy pobrać co najmniej 2-4 biopsje.
  2. Pozwól, aby tkanka biopsyjna osiadła na dnie stożkowej rurki. Za pomocą pipety odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć biopsje 1 ml buforu PBS-ABX. Nie ma potrzeby wirowania, ponieważ kawałki tkanki osadzają się naturalnie w stożkowej probówce.
  3. Przenieść co najmniej 20 mg tkanki biopsyjnej do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml PBS-DTT.
  4. Użyj drobnych nożyczek do preparowania, aby pociąć tkankę na kawałki o wielkości 1-2 mm lub mniejsze.
  5. Użyj miniwirówki stołowej przez 15 sekund, aby zagregować kawałki tkanki na dnie probówki i zassać jak najwięcej supernatantu. Dopuszczalna jest niewielka objętość resztkowa PBS-DTT.
  6. Dodać 5 ml świeżo podgrzanego buforu wytrawiającego do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Aby przenieść małe kawałki tkanki bez utraty tkanki, należy pobrać 500 μl buforu do wytrawiania i dodać go do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej tkankę. Następnie zmodyfikuj końcówkę końcówki pipety o pojemności 1000 μl za pomocą nożyczek, aby zwiększyć średnicę końcówki, co pozwoli na łatwe zasysanie i przenoszenie kawałków tkanek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej bufor do wytrawiania.
  7. Inkubować bufor wytrawiający i mieszaninę tkanek w temperaturze 37 °C przez 30 minut z wytrząsaniem orbitalnym z prędkością 200 obr./min.
  8. Dodać 5 ml podgrzanej trypsyny z 0,25% EDTA do buforu wytrawiającego i inkubować przez dodatkowe 10 minut w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem orbitalnym przy 200 obr./min.
  9. Zneutralizować bufor wytrawiający i trypsynę, dodając równą objętość pożywki Advanced (Adv.) DMEM/F12 i przepuścić roztwór przez sitko komórkowe o wielkości 70 μm.
  10. Osadzać komórki przez odwirowanie w temperaturze 1400 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C. W zależności od początkowego rozmiaru tkanki pobranej z biopsji, osad z małych komórek może, ale nie musi być widoczny.
  11. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki Adv. DMEM/F12 i policzyć liczbę żywotnych komórek za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru.
  12. Ponownie zagnieździć komórki przez odwirowanie w temperaturze 1400 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
    UWAGA: Rysunek 1 przedstawia schematyczne przedstawienie procesu izolowania pojedynczych komórek z tkanki biopsji.

3. Osadzanie pojedynczych komórek w macierzy membrany podstawnej "kopule"

  1. Na podstawie zliczonej liczby żywotnych komórek obliczyć objętość macierzy błony podstawnej wymaganą do osiągnięcia końcowego stężenia 10-5 żywotnych komórek na 50 μl macierzy błony podstawnej.
  2. Wykonaj szybko następujące czynności, aby zapobiec polimeryzacji matrycy membrany podstawnej przed posiewem. Usunąć rozmrożoną matrycę błony podstawnej z lodu, dodać wcześniej obliczoną objętość matrycy błony podstawnej do komórek i delikatnie wymieszać, pipetując w górę iw dół przez około 10 s.
    UWAGA: Na tym etapie bardzo ważne jest, aby unikać tworzenia się pęcherzyków. Nie rozcieńczać matrycy błony podstawnej.
  3. Szybko odpipetować 50 μl porcji mieszaniny macierzy/komórki błony podstawnej do środka poszczególnych studzienek na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.
  4. Natychmiast przykryj płytkę 24-dołkową i jednym płynnym ruchem odwróć płytkę do góry nogami. Umieścić odwróconą płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C na 35 minut, aby umożliwić polimeryzację macierzy błony podstawnej.
    UWAGA: Odwrócenie płytki jest niezbędne, aby zapobiec opadaniu komórek na dno płytki i umożliwić polimeryzację matrycy błony podstawnej do kształtu "kopuły" 3D.
  5. Dodaj 500 μl wstępnie podgrzanego podłoża z organoidów żołądkowych do każdej studzienki, upewniając się, że górna część każdej "kopuły" jest całkowicie zanurzona w pożywce. Dozuj pożywkę po boku każdej studzienki, aby uniknąć zakłócenia "kopuły".
  6. Zmieniaj nośnik co 2-3 dni.

4. Rutynowe przechodzenie organoidów przez fragmentację

  1. Gdy organoidy będą gotowe do pasażowania, usuń pożywkę z każdej wyznaczonej studzienki.
    UWAGA: Aby określić odpowiedni czas na zaliczenie, zapoznaj się z sekcją Reprezentatywne wyniki.
  2. Dozuj 1 ml lodowatego podłoża Adv. DMEM/F12 bezpośrednio na "kopułę" matrycy membrany podstawnej. Powinno to łatwo zainicjować rozpad "kopuły". Kontynuuj zasysanie i dozowanie, aż wszystkie fragmenty "kopuły" oderwą się od płytki.
  3. Transportować zarówno pożywkę, jak i rozdrobnioną matrycę błony podstawnej do następnego dołka, powtarzając ten proces dla wszystkich studzienek przeznaczonych do pasażowania. Po zdemontowaniu końcowej "kopuły" matrycy błony podstawnej, należy dozować pożywkę oraz mieszaninę organoidów i matrycy błony podstawnej do probówki o pojemności 1,5 ml.
  4. Podłącz końcówkę o pojemności 1000 μl do pipety P1000, a następnie włóż tę końcówkę do końcówki o pojemności 200 μl. W ten sposób powstanie końcówka pipety o wystarczająco małej średnicy, aby rozdrobnić organoidy, a jednocześnie umożliwić aspirację większej objętości.
  5. Energicznie pipetować mieszaninę organoidów i macierzy błony podstawnej w górę iw dół około 25 razy, aby rozdrobnić organoidy na małe kawałki.
  6. Odwirować rozdrobnioną mieszaninę organoidów za pomocą wirówki stołowej w temperaturze 4 °C przez 30 s przy 2000 x g. Spowoduje to powstanie osadu rozdrobnionych organoidów oddzielonych od macierzy błony podstawnej i pożywki. Za pomocą pipety odessać pożywkę i supernatant macierzy błony podstawnej. Nie używać podciśnienia do zasysania supernatantu, ponieważ osad jest luźny.
  7. Obliczyć objętość świeżo rozmrożonej matrycy membrany podstawnej wymaganej tak, aby liczba studzienek/kopuł była podzielona w stosunku 1:2 (50 μl/kopułę). Dodaj świeżą matrycę błony podstawnej i delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków.
  8. Szybko podwielokrotnić 50 μl mieszaniny fragmentów organoidów i macierzystej matrycy błony podstawnej do indywidualnych studzienek 24-dołkowej płytki.
  9. Przykryj płytkę, odwróć ją do góry nogami i umieść w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C na 35 minut, aby umożliwić polimeryzację macierzystej błony podstawnej.
  10. Do każdej studzienki dodać 500 μl wstępnie podgrzanego podłoża z organoidów żołądkowych.
    UWAGA: Rysunek 2 przedstawia schematyczny przegląd pasażowania organoidów pochodzących od pacjenta z żołądka poprzez fragmentację.

Wyniki

Kolejne reprezentatywne wyniki pochodzą z biopsji pobranych z łagodnego nabłonka zarówno z obszaru trzonu żołądka, jak i przedziału odźwiernika żołądka u pięciu różnych pacjentów poddawanych gastroskopii. W przypadku biopsji trzonu i przedziału odźwiernika żołądka, na każdego pacjenta przygotowano i przeanalizowano od dwóch do czterech „kopułek”/dołków. Organoidy zostały pomyślnie wygenerowane z tkanek biopsyjnych trzonu i przedziału odźwiernika żołądka u wszystkich pięciu pacjentów. Średnio w każdym „kopułku”/dołku przeanalizowano 41 organoidów. Wszystkie obrazy są projekcjami z, wykonanymi przy użyciu mikroskopu konfokalnego, a ilościowe określenie wielkości i sferyczności organoidów przeprowadzono przy użyciu dostępnego komercyjnie oprogramowania do analizy obrazu (patrz Tabela materiałów).

Organoidy są zazwyczaj możliwe do zidentyfikowania w ciągu 10 dni po wysianiu pojedynczych komórek (Rycyna 3A). Do 20. dnia organoidy osiągają duże rozmiary i zazwyczaj wymagają pasażowania. Chociaż liczba organoidów powstających po wysianiu pojedynczych komórek może być nieco zmienna, oczekiwane wyniki dotyczące liczby organoidów utworzonych z biopsji trzonu i odźwiernika żołądka przedstawiono na Rycynie 3B. Liczba organoidów trzonu i odźwiernika osiąga szczyt w 10. dniu po wysianiu. Choć nie jest to istotne statystycznie, całkowita liczba organoidów zaczyna spadać od 10. do 15. dnia oraz od 15. do 20. dnia. Wydaje się, że istnieje subpopulacja małych organoidów, które powstają do 10. dnia, a następnie przestają rosnąć i obumierają w ciągu kolejnych 10 dni, co wyjaśniałoby tę tendencję. Co ważne, wykazano, że liczba organoidów utworzonych z tkanki biopsyjnej odźwiernika jest znacząco wyższa niż w przypadku tkanki z trzonu w 10., 15. i 20. dniu. Liczba utworzonych organoidów odźwiernika była średnio 2-krotnie wyższa niż liczba organoidów utworzonych z trzonu.

Na Rysunku 3C przedstawiono reprezentatywne wyniki wzrostu organoidów po wysiewaniu pojedynczych komórek pomiędzy 10. a 20. dniem. Choć organoidy z biopsji zarówno części od rogowej (antrum), jak i trzonu żołądka wykazywały stały wzrost od 10. do 20. dnia, organoidy wygenerowane z tkanki biopsyjnej antrum wykazały większą szybkość wzrostu w porównaniu do organoidów wygenerowanych z tkanki biopsyjnej trzonu. W szczególności w 20. dniu organoidy z antrum miały niemal 4-krotnie większą powierzchnię niż organoidy z trzonu.

U różnych pacjentów w obrębie pojedynczej „kopułki”/dołka zazwyczaj obserwuje się zróżnicowaną morfologię organoidów (Rycyna 4A). Niektóre organoidy są bardziej okrągłe lub sferyczne, podczas gdy inne wykazują bardziej nieregularną morfologię. Jednakże średnio sferyczność, będąca miarą stopnia sferyczności organoidu (gdzie wynik 1 = idealna sfera)18, wykazywała niewielkie różnice wewnątrz i pomiędzy organoidami wygenerowanymi z tkanki biopsyjnej trzonu lub przedżołądka (Rycina 4B). Zatem, pomimo różnic w tempie wzrostu, zazwyczaj nie występują istotne różnice morfologiczne między organoidami wygenerowanymi z tkanki biopsyjnej trzonu a przedżołądka żołądka.

Do 20. dnia po inicjacji organoidy żołądkowe są zazwyczaj gotowe do pasażowania. Kluczowymi sygnałami wskazującymi na konieczność pasażowania organoidów są: duży rozmiar organoidu (średnica ≥1500 µm) lub jego przyciemnione wnętrze (sugerujące rozległą wymianę komórkową) (Rysunek 5A). Organoidy, które przekroczą ten etap, mogą zacząć przekształcać się w monowarstwy 2D (Rysunek 5B), które po pasażowaniu nie odtwarzają w sposób niezawodny struktur organoidów, co może wskazywać na utratę żywotności lub właściwości macierzystych. Po pasażowaniu i ponownym wysianiu organoidów żołądkowych zgodnie z opisanym tutaj protokołem fragmentacji, w „kopułach” znajdzie się wiele fragmentów organoidów (Rysunek 5C), które zreorganizują się w znacznie większą liczbę organoidów i będą rosły znacznie szybciej w porównaniu do pierwotnego wysiewu pojedynczych komórek (Rysunek 5D). Jeśli w momencie pasażowania wzrost organoidów nadal wymaga charakterystyki i/lub standaryzacji, organoidy żołądkowe można zamiast tego poddać trawieniu do pojedynczych komórek, zgodnie z wcześniejszym opisem19.

Ekstrakcja biopsji, trawienie komórek, wysiew w kopułach 3D, formowanie organoidów; schemat hodowli organoidów.
Rycina 1: Generowanie organoidów żołądka pochodzących od pacjentów. Schematyczny przegląd przedstawiający proces generowania organoidów żołądka pochodzących od pacjentów z biopsji łagodnego nabłonka żołądka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Metoda hodowli organoidów; schemat; dozowanie pożywki, tryturacja, mieszanie macierzy, wysiewanie kopułek.
Rycina 2: Pasażowanie organoidów żołądkowych pochodzących od pacjentów. Schematyczny przegląd ilustrujący pasażowanie organoidów żołądkowych pochodzących od pacjentów poprzez fragmentację. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Porównanie wzrostu organoidów; obrazy mikroskopowe, wykres wzrostu, analiza statystyczna; powierzchnia organoidów, liczba.
Rycina 3Tworzenie i wzrost organoidów żołądka pochodzących od pacjenta. (A) Reprezentatywne obrazy z projekcją osi Z, przedstawiające wzrost organoidów żołądkowych w 10., 15. i 20. dniu po wysiewie pojedynczych komórek. Obrazy przedstawiają organoidy wygenerowane z tkanki biopsyjnej trzonu i przedniej części żołądka (antrum) tego samego pacjenta. Pasek skali = 1 mm. (B) Średnia liczba (±SD) organoidów trzonu i przedżołądka żołądka w zaznaczonych punktach czasowych po wysiewie pojedynczych komórek. (C) Średnia (±SD) powierzchnia (µm2) organoidów trzonu i przedżołądka żołądka w określonych punktach czasowych po wysiewie pojedynczych komórek. n = 5 pacjentów na grupę i punkt czasowy. * = różnica istotna statystycznie (p ≤ 0,05) w wskazanym punkcie czasowym. n.s. = brak statystycznie istotnej różnicy w wskazanym punkcie czasowym. Przeprowadzono porównania statystyczne poprzez Dwuczynnikowa analiza wariancji (ANOVA). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Etapy rozwoju organoidów żołądkowych; wykres analizy sferyczności porównujący regiony trzonu i przedżołądka.
Rycina 4: Morfologia organoidów żołądkowych pochodzenia pacjenta. (A) Reprezentatywne obrazy z projekcją osi Z różnych morfologii organoidów żołądkowych z pojedynczej kopułki/dołka organoidów pochodzących z trzonu żołądka w 15. dniu po wysiewaniu pojedynczych komórek. Pasek skali = 200 µm. (B) Średnia (±SD) sferyczność organoidów trzonu i przedżołądka żołądka (gdzie wartość 1 = idealna sfera). n = 5 pacjentów na grupę i punkt czasowy. n.s. = brak statystycznie istotnej różnicy w żadnym punkcie czasowym. Porównania statystyczne przeprowadzono za pomocą 2-way ANOVA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Porównanie wzrostu hodowli komórkowych w czasie; obraz mikroskopowy; przedstawia rozwój po wysianiu i pasażowaniu.
Rycina 5: Pasażowanie organoidów pochodzących od pacjenta z chorobami żołądka. (A) Reprezentatywny obraz organoidów gotowych do pasażowania w 20. dniu po wysianiu pojedynczych komórek. (B) Reprezentatywny obraz organoidów z przekroczonym terminem pasażowania w 25. dniu po wysianiu pojedynczych komórek. (C) Reprezentatywny obraz pofragmentowanych organoidów po ponownym wysianiu (Pasaż 1 – Dzień 0). (D) Reprezentatywny obraz wzrostu organoidów przez 5 dni po ponownym wysianiu (Pasaż 1 – Dzień 5). Wszystkie obrazy są projekcjami osi z. Paski skali = 1 mm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Tabela uzupełniająca 1: Składy roztworów i pożywek. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W niniejszym artykule przedstawiono szczegółowy protokół niezawodnego generowania ludzkich organoidów żołądkowych z pojedynczych komórek wyizolowanych z biopsji łagodnego nabłonka z ciała żołądka i antrum. Krytyczne kroki w protokole koncentrują się wokół czasu, a także obsługi macierzy membrany podstawnej. Aby zachować zdolność do życia, konieczne jest rozpoczęcie protokołu tak szybko, jak to możliwe po pobraniu tkanki biopsyjnej. Celem jest rozpoczęcie trawienia tkanki biopsji w ciągu 30 minut od wykonania biopsji. Obsługa matrycy membrany podstawnej może być również wyzwaniem. Po rozmrożeniu na lodzie pozostaje cieczą; jednak w temperaturach powyżej 4 °C ulega polimeryzacji. Dlatego szybkie przeniesienie macierzy błony podstawnej z lodu do zmieszania z pojedynczymi komórkami lub fragmentami organoidów w celu poszycia "kopuł" musi być wykonane szybko, ponieważ zaczyna ona polimeryzować w ciągu jednej minuty. Po polimeryzacji w probówce nie można go zassać do końcówki pipety. W takim przypadku probówkę można umieścić na lodzie, aż Matrigel ulegnie depolimeryzacji z powrotem do postaci cieczy. Podczas delikatnego pipetowania w górę i w dół w celu wymieszania pojedynczych komórek lub fragmentów organoidów z matrycą błony podstawnej, ważne jest również, aby uniknąć tworzenia pęcherzyków. Podczas gdy pęcherzyki w "kopule" macierzy błony podstawnej nie wydają się utrudniać tworzenia i wzrostu organoidów, mogą utrudniać wizualizację. Dodatkowo, po podaniu mieszaniny macierzy błony podstawnej/komórki do studzienki (studzienek) płytki do hodowli komórkowej, płytkę należy odwrócić i umieścić w inkubatorze. Ten krok ma kluczowe znaczenie, aby umożliwić polimeryzację macierzy błony podstawnej w kształt "kopuły" 3D i zapobiec opadaniu pojedynczych komórek lub fragmentów organoidów na dno płytki.

Korzystając z tego protokołu, organoidy żołądkowe można zidentyfikować w ciągu 10 dni od wysiewu pojedynczych komórek. Doświadczenie pokazuje, że bardzo niewiele nowych organoidów żołądkowych powstaje po 10 dniu, a w rzeczywistości ogólna liczba organoidów może nieznacznie się zmniejszyć od 10 do 20 dnia. Dotyczy to organoidów generowanych zarówno z ciała żołądka, jak i antrum. Jednak całkowita liczba organoidów powstałych w wyniku biopsji antralnej żołądka jest znacznie wyższa niż w przypadku biopsji żołądka. Co więcej, wzrost organoidów antralnych znacznie przewyższa organoidy ciała między 10-20 dniami po wysiewie pojedynczych komórek. Różnica ta może być przypisana różnicom w czułości Wnt. Niedawne badanie wykazało, że PDO ciała żołądka wykazują lepszy wzrost przy niższej aktywacji Wnt, podczas gdy PDO antrum żołądka rozwijają się przy wyższej aktywacji Wnt20. Lokalizacja biopsji żołądka stosowanych do generowania PDO żołądka nie jest zwykle określona w literaturze. Różnice te powinny być brane pod uwagę w przyszłych badaniach z wykorzystaniem gastrycznych PDO generowanych z biopsji żołądka z różnych obszarów żołądka.

Innym kluczowym aspektem tego protokołu jest ustanowienie znormalizowanej liczby pojedynczych komórek do wysiewu na "kopułę"/studzienkę w celu niezawodnego generowania gastrycznych PDO. Podczas gdy poprzednie badanie wykazało standaryzowaną liczbę gruczołów żołądkowych do wysiewu w celu wytworzenia PDO, żadne wcześniejsze badania wykorzystujące metodę trawienia pojedynczej komórki nie wspominały o liczbie wysianych komórek lub o tym, czy liczba ta była spójna w różnych liniach PDO. Brak standaryzacji liczby wysiewanych komórek może skutkować bardzo zmienną liczbą komórek macierzystych wysiewanych na "kopułę"/dołek. Ponieważ komórki macierzyste są głównym źródłem tworzenia organoidów żołądkowych, może to prowadzić do zmiennego tempa powstawania i wzrostu organoidów. W związku z tym wykorzystanie niestandaryzowanej liczby pojedynczych komórek może zakłócić interpretacje porównań powstawania lub wzrostu na różnych liniach PDO żołądka. Tutaj wykazano, że standaryzacja liczby komórek wysianych do 105 komórek na "kopułę" / studnię niezawodnie generuje PDO żołądka z biopsji zarówno ciała, jak i obszarów antralnych żołądka.

Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem wykorzystania świeżej tkanki biopsji żołądka. W związku z tym sukces tego protokołu może się różnić w przypadku użycia zamrożonej tkanki lub tkanki zakonserwowanej w inny sposób. Ponadto nie ma danych na temat tego, jak długo świeże biopsje zachowują żywotność, ponieważ tkanka biopsyjna jest przetwarzana tak szybko, jak to możliwe po usunięciu z żołądka pacjenta. Przypuszczalnie, im dłużej świeża tkanka pozostaje przed przetworzeniem, tym mniej żywych komórek zostanie wyizolowanych.

Pasażowanie PDO żołądka poprzez fragmentację, jak opisano w tym protokole, zapewnia łatwą metodę rutynowego pasażowania. Podczas gdy PDO żołądka zostały pomyślnie pasażowane do 4 razy przy użyciu tej techniki, nie podjęto prób określenia, ile razy można je przejść przy zachowaniu stałego wzrostu i żywotności. Niektóre doniesienia wskazują, że wzrost organoidów żołądkowych może spowolnić po 5 lub więcej pasażach21,22, podczas gdy inne zaobserwowały niezawodny wzrost do 10 pasaży23.

Pożywki organoidowe żołądka użyte w tym protokole zawierają Wnt-3A, nogginę i R-spondynę pochodzącą z kondycjonowanych pożywek komórek L-WRN. Do wytworzenia kondycjonowanej pożywki wykorzystuje się protokół opisany przez Miyoshi i Stappenbecka16. Alternatywnie, Wnt-3A, noggin i R-spondyna mogą być zakupione osobno jako białka rekombinowane. Zakup poszczególnych komponentów osobno jest idealny, aby uniknąć potencjalnych efektów wsadowych, które mogą wystąpić podczas korzystania z kondycjonowanych pożywek z ogniw L-WRN. Jednak zakup rekombinowanych białek jest drogi i może być zbyt kosztowny dla badaczy, którzy często pracują z organoidami.

Biorąc pod uwagę rosnące wykorzystanie gastrycznych PDO w różnych zastosowaniach, konieczne i właściwe jest ustanowienie ustandaryzowanych podejść do generowania łagodnych gastrycznych PDO. Opisany tutaj protokół oferuje wiarygodną metodę dla przyszłych badań z wykorzystaniem PDO żołądka. Z naszego doświadczenia wynika, że protokół ten z powodzeniem wygenerował organoidy z biopsji łagodnej błony śluzowej żołądka w ponad 90% przypadków.

Oświadczenia

Autorzy nie ujawnili żadnych istotnych informacji.

Podziękowania

University of Pennsylvania Genomic Medicine T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), Men & BRCA Program at the Basser Center for BRCA (KHB, BWK), DeGregorio Family Foundation Grant Award (BWK).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% Trypsyna-EDTAGibco25200-056
A83-01R& D Systems2939
Advanced DMEM/F12Gibco12634-010
Amfoterycyna BInvitrogen15290018
B27Invitrogen17504044
BZ-X710Keyencen/a
cellSensOlympusn/a
Collagenase IIIWorthingtonLS004182
Dispase IISigmaD4693-1G
Dithiothreitol (DTT)EMSCO/FisherBP1725
DPBSGibco14200-075
FunginInvivoGenNC9326704
Gastrin ISigma AldrichG9145
GentamycynaInvitrogen1570060
GlutamaxGibco35050-061
hEGFPeprotechAF-100-15
HEPESInvitrogen15630080
hFGF-10Peprotech100-26
L-WRN Linia komórkowaATCCCRL-3276
MatrigelCorning47743-715
MetronidazolMP Biomedicals155710
Suplement N2Invitrogen17502048
Noggin ELISA KitNovus BiologicalsNBP2-80296
Pen StrepGibco15140-122
RPMI 1640Gibco11875-085
R-Spondin ELISA KitR& D SystemsDY4120-05
Wnt-3a Zestaw ELISA R& D SystemsDY1324B-05
Y-27632Sigma AldrichY0503

Bibliografia

  1. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  2. Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. A brief history of organoids. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 319 (1), C151-C165 (2020).
  3. Zhao, Z., et al. Organoids. Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 94(2022).
  4. Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (43), 13308-13311 (2015).
  5. Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
  6. Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
  7. Grönholm, M., et al. Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy. Cancer research. 81 (12), 3149-3155 (2021).
  8. Yan, H. H., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
  9. Yoon, C., et al. Patient-derived organoids from locally advanced gastric adenocarcinomas can predict resistance to neoadjuvant chemotherapy. Journal of Gastrointestinal Surgery. 27 (4), 666-676 (2023).
  10. Miao, X., et al. Establishment of gastric cancer organoid and its application in individualized therapy. Oncology Letters. 24 (6), 1-8 (2022).
  11. Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric organoids: an emerging model system to study Helicobacter pylori pathogenesis. Molecular Pathogenesis and Signal Transduction by Helicobacter pylori. 400, 149-168 (2017).
  12. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
  13. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  14. Seidlitz, T., Koo, B. K., Stange, D. E. Gastric organoids-an in vitro model system for the study of gastric development and road to personalized medicine. Cell Death & Differentiation. 28 (1), 68-83 (2021).
  15. Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter pylori. Journal of Visualized Experiments. 105, e53359(2015).
  16. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  17. Yang, H. J., et al. Sample collection methods in upper gastrointestinal research. Journal of Korean Medical Science. 38 (32), e255(2023).
  18. Kim, S., et al. Comparison of cell and organoid-level analysis of patient-derived 3D organoids to evaluate tumor cell growth dynamics and drug response. SLAS DISCOVERY: Advancing the Science of Drug Discovery. 25 (7), 744-754 (2020).
  19. Maru, Y., Tanaka, N., Itami, M., Hippo, Y. Efficient use of patient-derived organoids as a preclinical model for gynecologic tumors. Gynecologic Oncology. 154 (1), 189-198 (2019).
  20. McGowan, K. P., Delgado, E., Hibdon, E. S., Samuelson, L. C. Differential sensitivity to Wnt signaling gradients in human gastric organoids derived from corpus and antrum. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 325 (2), G158-G173 (2023).
  21. Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Reports. 34 (10), 108819(2021).
  22. Yang, R., et al. A quick and reliable image-based AI algorithm for evaluating cellular senescence of gastric organoids. Cancer Biology & Medicine. 20 (7), 519(2023).
  23. Skubleny, D., et al. Murine and Human gastric tissue establishes organoids after 48 hours of cold ischemia time during shipment. Biomedicines. 11 (1), 151(2023).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Organoidy pochodzenia pacjentapasa owanie organoid wtrawienie pojedynczych kom rekbiopsja o dkawzrost organoid wmacierz b ony podstawnejfragmentacja organoid w
Ustalenie i charakterystyka organoidów żołądkowych pochodzących od pacjenta z biopsji łagodnego ciała żołądka i nabłonka antralnego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.