Ustalenie i charakterystyka organoidów żołądkowych pochodzących od pacjenta z biopsji łagodnego ciała żołądka i nabłonka antralnego

Podsumowanie

Organoidy pochodzące od pacjentów żołądkowych znajdują coraz większe zastosowanie w badaniach, jednak brakuje formalnych protokołów do generowania ludzkich organoidów żołądkowych z jednokomórkowych trawień o standaryzowanej gęstości wysiewu. W protokole przedstawiono szczegółową metodę wiarygodnego tworzenia organoidów żołądka z tkanki biopsyjnej uzyskanej podczas endoskopii górnego odcinka kręgosłupa.

Streszczenie

Organoidy pochodzące od pacjentów żołądkowych (PDO) oferują unikalne narzędzie do badania biologii i patologii żołądka. W związku z tym te PDO znajdują coraz większe zastosowanie w szerokim zakresie zastosowań badawczych. Istnieje jednak niedobór opublikowanych podejść do produkcji gastrycznych PDO z trawienia pojedynczych komórek przy zachowaniu znormalizowanej początkowej gęstości wysiewu komórek. W tym protokole nacisk położono na inicjację organoidów żołądkowych z izolowanych pojedynczych komórek oraz zapewnienie metody przekazywania organoidów przez fragmentację. Co ważne, protokół pokazuje, że ustandaryzowane podejście do początkowej gęstości wysiewu komórek konsekwentnie daje organoidy żołądka z łagodnej tkanki biopsji i pozwala na standaryzowaną kwantyfikację wzrostu organoidów. Wreszcie, dowody potwierdzają nową obserwację, że gastryczne PDO wykazują różne tempo powstawania i wzrostu w zależności od tego, czy organoidy pochodzą z biopsji ciała, czy z obszarów antralnych żołądka. W szczególności wykazano, że zastosowanie tkanki biopsji antralnej do inicjacji organoidów skutkuje większą liczbą powstałych organoidów i szybszym wzrostem organoidów w okresie 20 dni w porównaniu z organoidami generowanymi z biopsji ciała żołądka. Opisany w niniejszym dokumencie protokół oferuje badaczom terminową i powtarzalną metodę skutecznego generowania i pracy z PDO żołądka.

Wprowadzenie

Organoidy to miniaturowe trójwymiarowe (3D) struktury komórkowe, które przypominają architekturą i funkcjonalność organów, z których pochodzą^1,2. Te wyhodowane w laboratorium modele są tworzone przez hodowlę komórek macierzystych lub komórek specyficznych dla tkanek w kontrolowanym środowisku, które pozwala tym komórkom na samoorganizację i różnicowanie się w różne typy komórek^1,2,3. Jedną z kluczowych zalet organoidów jest ich zdolność do dokładniejszego odwzorowania biologii człowieka niż tradycyjne dwuwymiarowe (2D) hodowle komórek^1,2,3. W szczególności wykazano, że ludzkie organoidy zachowują różnorodność genetyczną swojej tkanki pochodzenia^3,4,5. Organoidy oferują wyjątkową okazję do badania rozwoju ludzkich narządów, modelowania chorób i testowania potencjalnych środków terapeutycznych w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Co więcej, organoidy można uzyskać z indywidualnych próbek pacjentów, co umożliwia spersonalizowane podejście do medycyny i potencjalny rozwój zindywidualizowanych metod leczenia^3,6,7.

Badacze wykorzystali ludzkie organoidy żołądkowe do zbadania różnych aspektów biologii i patologii żołądka. Wybitnymi przykładami są wykorzystanie organoidów pochodzących od pacjentów (PDO) do przewidywania odpowiedzi na chemioterapię raka żołądka^8,9,10 i modelowanie odpowiedzi nabłonkowej na zakażenie Helicobacter pylori^11,12,13. Ludzkie organoidy żołądkowe składają się z różnych typów komórek znajdujących się w żołądku, w tym komórek szyi, komórek jam i innych komórek pomocniczych^11,14. Organoidy żołądka mogą być generowane z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) lub komórek macierzystych bezpośrednio wyizolowanych z tkanki żołądka uzyskanej za pomocą biopsji lub z próbek do resekcji żołądka^11,14. Izolacja komórek macierzystych żołądka z tkanki żołądka jest zwykle wykonywana poprzez izolację i hodowlę gruczołów żołądkowych lub enzymatyczne trawienie próbek tkanek w celu uwolnienia pojedynczych komórek^9,13,15. Co ważne, wykazano, że różnicowanie komórek w organoidach żołądka wygenerowanych przy użyciu którejkolwiek z tych technik jest podobne¹³. Opisany w niniejszym dokumencie protokół koncentruje się na trawieniu jednokomórkowym.

Organoidy reprezentują innowację naukową, która wypełnia lukę między tradycyjną hodowlą komórkową a całymi organami. Wraz z postępem badań w tej dziedzinie, organoidy mogą przyczynić się do opracowania skuteczniejszych metod leczenia i terapii dla szerokiego zakresu zastosowań. Biorąc pod uwagę rosnące wykorzystanie gastrycznych ChNP, istnieje aktualna potrzeba ustandaryzowanego podejścia do ich wytwarzania. W tym miejscu opisano protokół generowania PDO ludzkiego żołądka z pojedynczych komórek wyizolowanych z tkanki łagodnej biopsji żołądka pozyskanej podczas endoskopii górnego odcinka żołądka. Co ważne i wyjątkowe, do wysiewu określa się standaryzowaną liczbę pojedynczych komórek, aby niezawodnie generować PDO w żołądku i umożliwić późniejszą charakterystykę. Za pomocą tej techniki wykazano wiarygodne różnice w tworzeniu i wzroście organoidów generowanych z biopsji ciała żołądka lub antrum żołądka.

Protokół

Wszystkie ludzkie tkanki użyte w tym protokole zostały pobrane od osób, które wyraziły świadomą zgodę na pobranie tkanek poprzez badanie pobierania tkanek żołądka zatwierdzone przez University of Pennsylvania Institutional Review Board (IRB #842961). Uczestnicy tego badania musieli poddać się endoskopii górnego odcinka kręgosłupa w ramach rutynowej opieki, mieć ukończone 18 lat i być w stanie wyrazić świadomą zgodę. Wszystkie przeprowadzone badania były zgodne z wytycznymi określonymi przez University of Pennsylvania.

1. Przygotowanie eksperymentalne

1. Przygotuj kondycjonowany nośnik L-WRN zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁶. Chociaż nie jest to obowiązkowe, stężenia Wnt-3A, R-spondyny i nogginy zawartych w kondycjonowanych pożywkach można sprawdzić za pomocą dostępnych na rynku zestawów ELISA zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
2. Przygotuj antybiotyki RPM (RPMI-ABX), antybiotyki PBS (PBS-ABX), PBS-DITIOTREITOL (PBS-DTTT), bufor wytrawiający i pożywki z organoidów żołądkowych (szczegółowy skład znajduje się w tabeli uzupełniającej 1). Pożywka organoidowa żołądka jest stabilna przez 1 tydzień w temperaturze 4 °C.
3. Kleszcze do autoklawów, drobne nożyczki preparacyjne i probówki 1,5 ml.
4. Rozpocznij rozmrażanie macierzy błony podstawnej (Matrigel) na lodzie.
5. Rozpocząć rozmrażanie buforu wytrawiającego i trypsyny-EDTA w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
6. Ustawić wytrząsarkę orbitalną inkubatora na 37 °C i 200 obr./min.

2. Izolowanie pojedynczych komórek z tkanki biopsji

1. Pobranie biopsji żołądka podczas endoskopii górnego odcinka kręgosłupa¹⁷ zgodnie z instytucjonalnym protokołem klinicznym, prawdopodobnie z użyciem kleszczy jumbo. Użyj igły, aby pobrać próbki tkanek z kleszczy i umieść je w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej podłoże RPMI-ABX. Trzymaj probówkę na lodzie w celu szybkiego przeniesienia do laboratorium.
   UWAGA: Należy pobrać co najmniej 2-4 biopsje.
2. Pozwól, aby tkanka biopsyjna osiadła na dnie stożkowej rurki. Za pomocą pipety odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć biopsje 1 ml buforu PBS-ABX. Nie ma potrzeby wirowania, ponieważ kawałki tkanki osadzają się naturalnie w stożkowej probówce.
3. Przenieść co najmniej 20 mg tkanki biopsyjnej do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml PBS-DTT.
4. Użyj drobnych nożyczek do preparowania, aby pociąć tkankę na kawałki o wielkości 1-2 mm lub mniejsze.
5. Użyj miniwirówki stołowej przez 15 sekund, aby zagregować kawałki tkanki na dnie probówki i zassać jak najwięcej supernatantu. Dopuszczalna jest niewielka objętość resztkowa PBS-DTT.
6. Dodać 5 ml świeżo podgrzanego buforu wytrawiającego do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Aby przenieść małe kawałki tkanki bez utraty tkanki, należy pobrać 500 μl buforu do wytrawiania i dodać go do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej tkankę. Następnie zmodyfikuj końcówkę końcówki pipety o pojemności 1000 μl za pomocą nożyczek, aby zwiększyć średnicę końcówki, co pozwoli na łatwe zasysanie i przenoszenie kawałków tkanek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej bufor do wytrawiania.
7. Inkubować bufor wytrawiający i mieszaninę tkanek w temperaturze 37 °C przez 30 minut z wytrząsaniem orbitalnym z prędkością 200 obr./min.
8. Dodać 5 ml podgrzanej trypsyny z 0,25% EDTA do buforu wytrawiającego i inkubować przez dodatkowe 10 minut w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem orbitalnym przy 200 obr./min.
9. Zneutralizować bufor wytrawiający i trypsynę, dodając równą objętość pożywki Advanced (Adv.) DMEM/F12 i przepuścić roztwór przez sitko komórkowe o wielkości 70 μm.
10. Osadzać komórki przez odwirowanie w temperaturze 1400 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C. W zależności od początkowego rozmiaru tkanki pobranej z biopsji, osad z małych komórek może, ale nie musi być widoczny.
11. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki Adv. DMEM/F12 i policzyć liczbę żywotnych komórek za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru.
12. Ponownie zagnieździć komórki przez odwirowanie w temperaturze 1400 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
    UWAGA: Rysunek 1 przedstawia schematyczne przedstawienie procesu izolowania pojedynczych komórek z tkanki biopsji.

3. Osadzanie pojedynczych komórek w macierzy membrany podstawnej "kopule"

1. Na podstawie zliczonej liczby żywotnych komórek obliczyć objętość macierzy błony podstawnej wymaganą do osiągnięcia końcowego stężenia 10-5 żywotnych komórek na 50 μl macierzy błony podstawnej.
2. Wykonaj szybko następujące czynności, aby zapobiec polimeryzacji matrycy membrany podstawnej przed posiewem. Usunąć rozmrożoną matrycę błony podstawnej z lodu, dodać wcześniej obliczoną objętość matrycy błony podstawnej do komórek i delikatnie wymieszać, pipetując w górę iw dół przez około 10 s.
   UWAGA: Na tym etapie bardzo ważne jest, aby unikać tworzenia się pęcherzyków. Nie rozcieńczać matrycy błony podstawnej.
3. Szybko odpipetować 50 μl porcji mieszaniny macierzy/komórki błony podstawnej do środka poszczególnych studzienek na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.
4. Natychmiast przykryj płytkę 24-dołkową i jednym płynnym ruchem odwróć płytkę do góry nogami. Umieścić odwróconą płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C na 35 minut, aby umożliwić polimeryzację macierzy błony podstawnej.
   UWAGA: Odwrócenie płytki jest niezbędne, aby zapobiec opadaniu komórek na dno płytki i umożliwić polimeryzację matrycy błony podstawnej do kształtu "kopuły" 3D.
5. Dodaj 500 μl wstępnie podgrzanego podłoża z organoidów żołądkowych do każdej studzienki, upewniając się, że górna część każdej "kopuły" jest całkowicie zanurzona w pożywce. Dozuj pożywkę po boku każdej studzienki, aby uniknąć zakłócenia "kopuły".
6. Zmieniaj nośnik co 2-3 dni.

4. Rutynowe przechodzenie organoidów przez fragmentację

1. Gdy organoidy będą gotowe do pasażowania, usuń pożywkę z każdej wyznaczonej studzienki.
   UWAGA: Aby określić odpowiedni czas na zaliczenie, zapoznaj się z sekcją Reprezentatywne wyniki.
2. Dozuj 1 ml lodowatego podłoża Adv. DMEM/F12 bezpośrednio na "kopułę" matrycy membrany podstawnej. Powinno to łatwo zainicjować rozpad "kopuły". Kontynuuj zasysanie i dozowanie, aż wszystkie fragmenty "kopuły" oderwą się od płytki.
3. Transportować zarówno pożywkę, jak i rozdrobnioną matrycę błony podstawnej do następnego dołka, powtarzając ten proces dla wszystkich studzienek przeznaczonych do pasażowania. Po zdemontowaniu końcowej "kopuły" matrycy błony podstawnej, należy dozować pożywkę oraz mieszaninę organoidów i matrycy błony podstawnej do probówki o pojemności 1,5 ml.
4. Podłącz końcówkę o pojemności 1000 μl do pipety P1000, a następnie włóż tę końcówkę do końcówki o pojemności 200 μl. W ten sposób powstanie końcówka pipety o wystarczająco małej średnicy, aby rozdrobnić organoidy, a jednocześnie umożliwić aspirację większej objętości.
5. Energicznie pipetować mieszaninę organoidów i macierzy błony podstawnej w górę iw dół około 25 razy, aby rozdrobnić organoidy na małe kawałki.
6. Odwirować rozdrobnioną mieszaninę organoidów za pomocą wirówki stołowej w temperaturze 4 °C przez 30 s przy 2000 x g. Spowoduje to powstanie osadu rozdrobnionych organoidów oddzielonych od macierzy błony podstawnej i pożywki. Za pomocą pipety odessać pożywkę i supernatant macierzy błony podstawnej. Nie używać podciśnienia do zasysania supernatantu, ponieważ osad jest luźny.
7. Obliczyć objętość świeżo rozmrożonej matrycy membrany podstawnej wymaganej tak, aby liczba studzienek/kopuł była podzielona w stosunku 1:2 (50 μl/kopułę). Dodaj świeżą matrycę błony podstawnej i delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków.
8. Szybko podwielokrotnić 50 μl mieszaniny fragmentów organoidów i macierzystej matrycy błony podstawnej do indywidualnych studzienek 24-dołkowej płytki.
9. Przykryj płytkę, odwróć ją do góry nogami i umieść w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C na 35 minut, aby umożliwić polimeryzację macierzystej błony podstawnej.
10. Do każdej studzienki dodać 500 μl wstępnie podgrzanego podłoża z organoidów żołądkowych.
    UWAGA: Rysunek 2 przedstawia schematyczny przegląd pasażowania organoidów pochodzących od pacjenta z żołądka poprzez fragmentację.

Wyniki

Kolejne reprezentatywne wyniki pochodzą z biopsji pobranych z łagodnego nabłonka zarówno z obszaru trzonu żołądka, jak i przedziału odźwiernika żołądka u pięciu różnych pacjentów poddawanych gastroskopii. W przypadku biopsji trzonu i przedziału odźwiernika żołądka, na każdego pacjenta przygotowano i przeanalizowano od dwóch do czterech „kopułek”/dołków. Organoidy zostały pomyślnie wygenerowane z tkanek biopsyjnych trzonu i przedziału odźwiernika żołądka u wszystkich pięciu pacjentów. Średnio w każdym „kopułku”/dołku prze...

Dyskusja

W niniejszym artykule przedstawiono szczegółowy protokół niezawodnego generowania ludzkich organoidów żołądkowych z pojedynczych komórek wyizolowanych z biopsji łagodnego nabłonka z ciała żołądka i antrum. Krytyczne kroki w protokole koncentrują się wokół czasu, a także obsługi macierzy membrany podstawnej. Aby zachować zdolność do życia, konieczne jest rozpoczęcie protokołu tak szybko, jak to możliwe po pobraniu tkanki biopsyjnej. Celem jest rozpoczęcie trawienia tkanki biopsji w ciągu 30 minut od wykonania biopsji. Obs...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,25% Trypsyna-EDTA	Gibco	25200-056
A83-01	R& D Systems	2939
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
Amfoterycyna B	Invitrogen	15290018
B27	Invitrogen	17504044
BZ-X710	Keyence	n/a
cellSens	Olympus	n/a
Collagenase III	Worthington	LS004182
Dispase II	Sigma	D4693-1G
Dithiothreitol (DTT)	EMSCO/Fisher	BP1725
DPBS	Gibco	14200-075
Fungin	InvivoGen	NC9326704
Gastrin I	Sigma Aldrich	G9145
Gentamycyna	Invitrogen	1570060
Glutamax	Gibco	35050-061
hEGF	Peprotech	AF-100-15
HEPES	Invitrogen	15630080
hFGF-10	Peprotech	100-26
L-WRN Linia komórkowa	ATCC	CRL-3276
Matrigel	Corning	47743-715
Metronidazol	MP Biomedicals	155710
Suplement N2	Invitrogen	17502048
Noggin ELISA Kit	Novus Biologicals	NBP2-80296
Pen Strep	Gibco	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-085
R-Spondin ELISA Kit	R& D Systems	DY4120-05
Wnt-3a Zestaw ELISA R	& D Systems	DY1324B-05
Y-27632	Sigma Aldrich	Y0503