Method Article

Analiza ilościowa stabilizacji błony retikulum endoplazmatycznego (MAM) związanej z mitochondriami w neuronalnym modelu choroby Alzheimera (AD)

DOI:

10.3791/66129

⸱

January 10th, 2025

 ,  ,  , 
1Genetics and Aging Research Unit, MassGeneral Institute for Neurodegenerative Disease, Henry and Allison McCance Center for Brain Health, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Alzheimer's Disease Research Laboratory, Department of Neuroscience, Tufts University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy pomiar szybkości transportu aksonów konstytutywnych stabilizatorów błon retikulum endoplazmatycznego (ER) związanych z mitochondriami (MAM) poprzez zwiększanie lub utrzymywanie neurotoksycznego generowania β-amyloidu (Aβ) z neuronów choroby Alzheimera (AD) w czasie rzeczywistym, aby służyć jako bezpośredni i ilościowy wskaźnik do pomiaru stabilizacji MAM i wspomagania rozwoju terapii AD.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda ilościowego określania stabilizacji błon retikulum endoplazmatycznego związanych z mitochondriami (MAM) w trójwymiarowym (3D) modelu neuronowym choroby Alzheimera (AD) jest przedstawiona tutaj. Na początek świeże ludzkie neuroprogenitorowe komórki ReN z ekspresją białka prekursorowego β-amyloidu (APP) zawierające rodzinną chorobę Alzheimera (FAD) lub naiwne komórki ReN są hodowane na cienkich (1:100) płytkach do hodowli tkankowych pokrytych Matrigelem. Po osiągnięciu przez komórki konfluencji, są one elektropostowane plazmidami ekspresyjnymi kodującymi sekwencję wiążącą mitochondria sprzężoną z białkiem czerwonej fluorescencji (RFP) AKAP1 (34-63) (Mito-RFP), która wykrywa mitochondria lub konstytutywne stabilizatory MAM 1X lub MAM 9X, które stabilizują odpowiednio ciasne (6 nm ± 1 nm szerokości szczeliny) lub luźne (24 nm ± 3 nm szerokości szczeliny). Po 16-24 godzinach komórki są zbierane i wzbogacane przez aktywowany fluorescencją sorter komórek (FACS). Taką samą liczbę komórek wzbogaconych w FACS umieszcza się w trójwymiarowej matrycy (1:1 Matrigel) i pozwala się im różnicować w dojrzałe neurony przez 10 dni. Obrazy żywych komórek 10-dniowych zróżnicowanych komórek wykazujących ekspresję stabilizatorów MAM sprzężonych z RFP są rejestrowane pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w komorę do obrazowania żywych komórek, utrzymującą CO2 (5%), temperaturę (37 °C) i wilgotność (~90%). W tym celu przeprowadziliśmy obrazowanie żywych komórek i analizy kymograficzne w celu zmierzenia ruchliwości wolnych mitochondriów znakowanych mitochondriami związanymi z Mito-RFP lub ER o ciasnych lub luźnych szerokościach szczelin stabilizowanych odpowiednio przez MAM 1X lub MAM 9X, w najbardziej rozbudowanym procesie neuronalnym każdego neuronu ReN GA, który ma co najmniej 500 nm długości, biorąc pod uwagę je jako aksony.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pojawiające się dowody sugerują, że wyspecjalizowane kontakty retikulum endoplazmatycznego związane z mitochondriami (MERCs), biochemicznie zbierane jako błony ER związane z mitochondriami, często określane jako MAMs1,2 odgrywają rolę w kilku chorobach neurodegeneracyjnych, w tym AD3,4. Te MAM składają się z bogatych w cholesterol mikrodomen lipidowych podobnych do tratwy w ER i zewnętrznej błonie mitochondriów połączonych szeregiem białek, które tworzą strukturalne i funkcjonalne zróżnicowanie między MAMs5,6,7. Niedawno sformułowana hipoteza MAM zakłada, że wzrost MAM prowadzi do zwiększonej produkcji Aβ i patogennej kaskady AD, w tym tworzenia się splątania neurofibrylarnego (NFT), dyshomeostazy wapnia i zapalenia nerwów3,8. Około 5%-20% mitochondriów nawiązuje fizyczny kontakt z ER, tworząc MAMs9. Szerokość szczeliny MAM jest określana przez gładki i szorstki ER (odpowiednio sER i rER). Zmienna szerokość przerwy między mitochondriami sER (10-50 nm) a mitochondriami rER (50-80 nm) sugeruje, że szerokość szczeliny MAM ma długie spektrum, które waha się od ciasnego (~10 nm) do luźnego (~80 nm)10,11,12,13. Szerokość szczeliny MAM określa funkcje MAM, takie jak homeostaza wapnia i transport lipidów1,14. Niedawny raport wykazał, że MAM utworzone między ściśle (~10 nm) połączonymi ER a mitochondriami, zwane pełnymi MAM, są apoptotyczne. W przeciwieństwie do tego, MAM utworzone między luźno połączonym (~25 nm) ER a mitochondriami, określane jako wadliwe lub średnie MAM, są antyapoptotyczne14,15,16. Stabilizacja MAM o szerokości szczeliny 6 nm ± 1 nm zwiększyła generowanie Aβ z nowatorskiego trójwymiarowego (3D) modelu kultury neuronowej AD. Natomiast stabilizacja MAM o szerokości szczeliny 24 nm ± 3 nm nie ma wpływu na generowanie Aβ17. Odkrycie to sugeruje po raz pierwszy, że regulacja stopnia stabilizacji MAM, ale nie destabilizacja MAM, jest kluczem do regulacji wytwarzania Aβ. Próba całkowitej destabilizacji MAM może mieć niepożądane konsekwencje, ponieważ MAM utrzymują kilka zdarzeń komórkowych krytycznych dla przeżycia komórki12.

Modulacja MAM to nowy obszar badań z potencjalnymi implikacjami dla różnych zaburzeń, w tym raka, zaburzeń metabolicznych i chorób neurodegeneracyjnych18. Pomimo dostępności wielu modulatorów MAM, do tej pory nie podjęto żadnej poważniejszej próby przetestowania ich zdolności do destabilizacji MAM i obniżania patologii AD, głównie dlatego, że różnorodność strukturalna MAM sprawia, że są one bardzo złożonym systemem, który można obrać za cel w celu odkrywania leków. Jednak nowo opracowana farmakologia systemów strukturalnych, która uwzględnia specyficzne właściwości celów leków i ich środowisko18,19 powinna przezwyciężyć trudności i opracować bardzo silne leki ukierunkowane na MAM lub białka związane z MAM w AD. Jednak poszukiwanie skutecznego modulatora stabilizacji MAM wymaga metod pozwalających na precyzyjne ilościowe określenie stopnia stabilizacji MAM. Tradycyjne techniki, takie jak mikroskopia elektronowa (EM) lub mikroskopia superrozdzielcza, mają ograniczenia w określaniu stabilizacji MAM. Pokonanie tych wyzwań prawdopodobnie wymagałoby opracowania nowatorskich, bardziej dynamicznych technik obrazowania lub testów biochemicznych, które mogą dostarczyć ilościowych pomiarów stabilizacji MAM w żywych komórkach. Mikroskopia elektronowa ze skaningiem wiązki jonów (FIB-SEM) pierwotnych neuronów wykazała, że ER ma tendencję do tworzenia sieci wokół mitochondriów, co prawdopodobnie ogranicza ruchliwość mitochondriów20,21. Zakłócenie mitochondrialnych systemów transportowych, zarówno wstecznych, następczych, jak i obu, miało głęboki wpływ na funkcje synaptyczne i neuronalne22. W związku z tym nowatorskie obrazowanie żywych komórek i oparta na kymografii analiza prędkości aksonalnej mitochondriów związanych z ER, opisana tutaj jako metryka do ilościowego pomiaru stabilizacji MAM, ułatwi identyfikację modulatora (modulatorów) MAM, który może zmienić próg stabilizacji MAM na taki, który utrzymuje lub ewentualnie obniża, w przeciwieństwie do zwiększonego wytwarzania Aβ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AD modele hodowli neuronalnej: W tym badaniu wykorzystano neurony pochodzące z ludzkich neuronalnych komórek progenitorowych ReN [naiwne ReN (Millipore)] lub komórek ReN wyrażających rodzinne mutacje AD (fAD) w genie białka prekursorowego amyloidu (APP) (APPSwe/Lon), komórkach ReN GA. Trójwymiarowy (3D) system hodowli ReN-GA podsumowuje patologię AD, a mianowicie splątki neurofibrylarne sterowane oligomerami Aβ (NFT) 23,24. Naiwne ogniwa ReN są dostępne na rynku. Linie ReN GA uzyskano od dr Doo Y. Kima, profesora nadzwyczajnego, Massachusetts General Hospital (MGH)23,24,25.

Plazmidy ekspresji: AKP1 (34-63) i sekwencja ukierunkowana na ER białek Ubc 6 (283-303) połączonych bezpośrednio z RFP (Mito-RFP-ER oznaczanych jako MAM 1X) lub zawierających łącznik 9 aminokwasów (Mito-9X-RFP-ER oznaczony jako MAM 9X) przeznaczony do stabilizacji MAM o szerokości szczeliny odpowiednio 6 nm ± 1 nm lub 24 nm + 3 nm15,26 (Rysunek 1A).

1. Elektroporacja

  1. Transfekcja komórek stabilizatorami MAM (1-2 h)
    UWAGA: Postępuj zgodnie z protokołem opisanym przez producenta zestawu nucleofector (Tabela materiałów). Przed rozpoczęciem należy przygotować 6-dołkowe naczynia hodowlane ze szklanym dnem wstępnie pokryte DMEM/F12 zawierającym 1% Matrigelu (odtąd określanego jako matryca błony podstawnej [BMM]). Użyj 2 ml BMM, aby pokryć każdą studzienkę. Inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C. BMM, pożywka, końcówki do pipet i pipety powinny być wstępnie schłodzone przed zmieszaniem, aby zapobiec zastygnięciu BMM.
    1. Odessać mieszaninę BMM. Zastąp 2 ml DMEM/F12 o temperaturze pokojowej (RT) w każdym dołku.
    2. Połączyć Nucleofector z suplementem 1 w stosunku 4,5:1 (82 μL:18 μL stosunku Nucleofector/Supplement na 100 μL roztworu). Do każdej pożądanej transfekcji potrzebne jest 100 μl Nucleofectora.
    3. Wirowe DNA. Następnie dodaj 1-5 μg DNA (na zabieg) do 1 ml probówek wirówkowych dla każdej transfekcji.
    4. Użyj akustazy, aby zebrać płytkę zdrowych komórek ReN-GA.
      UWAGA: Płytki w pożywce ekspandandcyjnej (Tabela 1) w 100 mm szalkach do hodowli tkankowych i poczekaj, aż konfluencja osiągnie 70-80%.
      1. Odessać istniejące podłoże i przemyć raz 10 ml PBS.
      2. Dodać 1 ml akutazy bezpośrednio do komórek i inkubować przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C.
      3. Usuń komórki z naczynia, delikatnie stukając w bok naczynia. Sprawdź pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki są rozluźnione i swobodnie przepływają.
      4. Zneutralizować akutazę za pomocą 10 ml DMEM/F12 i przenieść do czystej probówki o pojemności 15 ml.
      5. Odwirować wymaganą liczbę komórek przy 274 x g przez 5 minut i odessać supernatant w celu usunięcia martwych komórek. Następnie ponownie zawiesić osad w 10 ml DMEM/F12.
    5. Policz komórki, aby określić gęstość.
      UWAGA: W tym badaniu do zliczenia liczby komórek użyto automatycznego licznika komórek. Na elektroporację potrzebne jest 3-5 X 106 komórek (np. 5 zabiegów wymagałoby 15-25 X 106 komórek).
      1. Pobrać 10 μl zawieszonych komórek i dodać na stronę A komory do liczenia komórek. Następnie dodać 10 μl do boku B.
        UWAGA: Dodaj zawiesinę komórek, przechylając pipetę na bok. Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza, nie przekraczając pierwszego oporu na tłoku pipety.
      2. Przenieś napełnioną komorę liczącą do licznika komórek i włóż stronę A do głównego otworu z przodu.
      3. Po naciśnięciu przycisku Measure (Zmierz) zanotuj liczbę komórek na ml.
      4. Wyjmij komorę, odwróć na stronę B i powtórz kroki 1.1.5.2-1.1.5.3.
      5. Dodaj te dwie liczby do siebie, a następnie podziel przez 4 (jeśli nie używasz błękitu trypanowego), a następnie pomnóż liczbę przez mililitry płynu, w którym zawieszone są komórki, aby uzyskać całkowitą liczbę komórek w zawiesinie.
    6. Odwirować wymaganą liczbę komórek przy sile 274 x g przez 5 minut i odessać supernatant.
    7. Zawiesić osad w 100 μl mieszanki Nucleofector na elektroporację. (np. 500 μL na 5 zabiegów).
      UWAGA: Pozostawienie komórek w roztworze Nucleofector na dłużej niż 15 minut może zmniejszyć żywotność komórek i ogólną skuteczność.
    8. Dodać 100 μl zawiesiny komórkowej do jednej z probówek zawierających DNA i wymieszać pipetując.
    9. Przenieś mieszaninę DNA do kuwety elektroporacyjnej i zamknij dołączoną pokrywką. Aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków, pochyl kuwetę w dół i powoli pipetuj.
    10. Wybierz program Nucleofector odpowiedni dla używanego urządzenia. W przypadku urządzenia użytego w tym badaniu należy użyć programu A-033 do transfekcji. Aby zoptymalizować, wypróbuj wszystkie 5 programów Nucleofector aby określić najbardziej odpowiedni dla każdego typu komórki.
      UWAGA: Potwierdzeniem udanej elektroporacji jest widoczna piana na wierzchu mieszanki.
    11. Natychmiast, za pomocą dostarczonych sterylnych pipet, dodaj ~500 μL DMEM z wstępnie napełnionej płytki 6-dołkowej do kuwety. Delikatnie wymieszaj raz, a następnie przenieś elektroporowane ogniwa i pożywkę do odpowiedniego dołka.
      UWAGA: Po elektroporacji ogniwa są niezwykle wrażliwe, dlatego niezbędne jest szybkie przenoszenie pożywki i staranne pipetowanie.
    12. Powtórzyć kroki 1.1.8-1.1.11 dla wszystkich pozostałych zabiegów DNA.
    13. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w obecności CO2 (5%) przez noc.
    14. Następnego dnia należy wymienić pożywkę na świeżą pożywkę różnicującą (Tabela 2) i pozwolić komórkom różnicować się przez 10 dni. Co 2-3 dni wymieniaj na świeże podłoże.

2. Obrazowanie żywych komórek

  1. Przygotowanie komórek do mikroskopii żywych komórek (30 min)
    1. Przygotowanie komory żywej komórki (przed przeniesieniem komórek do komory)
    2. Upewnij się, że zbiornik CO2 i nawilżacz są podłączone do komory, zawory są otwarte, a zbiorniki są napełnione.
    3. Ustaw temperaturę na 37 °C, CO2 na 5%, a wilgotność na 95%. (Może to zająć trochę czasu, zanim poziomy się zrównoważą).
    4. Umieść 6-dołkową płytkę zawierającą komórki w komorze i dostosuj ostrość mikroskopu, aż komórki staną się widoczne.
    5. Włącz laser (Tabela materiałów).
    6. Aby przechwycić sygnał RFP, należy wzbudzić fluorofor za pomocą lasera o długości fali 594 nm i zastosować emisję 570-640 nm. W przypadku GFP należy użyć lasera o długości fali 488 nm do wzbudzenia i emisji 510-540 nm.
    7. Korzystając z wbudowanego filtra fluorescencyjnego, dostosuj intensywność sygnału, aż sygnał tła rozproszy się (powinien być prawie całkowicie).
  2. Przechwytywanie obrazu na żywo z aksonów (łącznie 10 h-15 h)
    UWAGA: Odwrócony mikroskop konfokalny Nikon C2 Eclipse Ti2 został użyty do wykonania obrazów fluorescencyjnych za pomocą oprogramowania NIS Element AR. Korzystaj z 60-krotnego powiększenia w rozdzielczości 512 pikseli, nagrywając filmy z prędkością 1 klatki na sekundę przez 3 minuty, aby uzyskać czystsze kimografy.
    1. Znajdź komórkę wyrażającą biosensory RFP. Wyeksportuj obraz komórki do późniejszego wykorzystania przed nagraniem wideo.
    2. Przytnij obszar skanowania, aby dopasować go do aksonu. Zastosowanie mniejszego obszaru skanowania skraca czas przetwarzania mikroskopu i znacznie ułatwia generowanie kymografii.
    3. Wyłącz wszystkie lasery, aby oprogramowanie działało płynniej. Należy pamiętać, że gdy program jest uruchomiony z aktywnymi wszystkimi laserami, nie wszystkie klatki są przechwytywane.
      UWAGA: Czerwony sygnał fluorescencyjny z somy jest znacznie jaśniejszy niż w aksonie. Dlatego soma jest wykluczona, aby zwiększyć ogólną intensywność sygnału w aksonie. Przejdź do zakładki Pomiar czasu.
    4. Ustaw interwał na 1 klatkę na sekundę i ustaw całkowity czas na 181 s.
    5. Kliknij przycisk Uruchom.
    6. Zapisz ten plik jako plik .nds (prawidłowo oznaczony) i powtórz proces ~10 razy dla każdego stabilizatora MAM (MAM 1X lub MAM 9X).
      UWAGA: Siła lasera czasami powodowała zauważalny efekt wybielania sygnału RFP, jeśli skanowano go zbyt długo. Należy wziąć pod uwagę szybką pracę w celu przechwytywania filmów.

3. Przetwarzanie końcowe (7 dni)

UWAGA: Do analizy transportu i generowania kymografów wykorzystano makra Fiji ImageJ. Pęcherzyki, które poruszały się z prędkością mniejszą niż 0,1 mm/s, zostały sklasyfikowane jako nieruchome. Częstotliwość ruchu cząstek obliczono, dzieląc liczbę cząstek poruszających się w danym kierunku (następczy, wsteczny) lub nieporuszających się (nieruchomych) przez całkowitą liczbę cząstek analizowanych w kimografie. Czas spędzony na zatrzymaniu się lub poruszaniu każdego pęcherzyka obliczono poprzez uśrednienie procentu czasu spędzonego w każdym stanie dla wszystkich pęcherzyków w każdym analizowanym neuronie. Rozkład częstotliwości dla prędkości i długości biegu obliczono przy użyciu tylko ruchomych pęcherzyków dla każdego warunku doświadczalnego. Analizę wykonywano na 100 mm odcinkach aksonalnych przez 3 min.

  1. Generowanie kimografu
    1. Otwórz plik .nds w Fiji ImageJ.
    2. Przejdź do zakładki Obraz i kliknij Właściwości. Zapisz stosunek pikseli do mikronów. Jest to potrzebne do późniejszych obliczeń.
    3. Kliknij Plik > Zapisz jako > Tiff, aby zapisać plik jako .tiff w swoim folderze (makro automatycznie zapisze wszystko, co zostało wygenerowane, w tym folderze).
    4. Przeciągnij makro Kymo do ImageJ. Kod znajduje się w Dodatkowym Pliku Kodowania 1. Kliknij przycisk Uruchom.
    5. Nie naciskaj OK. Przełącz się do okna MAX_raw. Ręcznie kliknij lewym przyciskiem myszy wzdłuż aksonu i kliknij dwukrotnie, aby zakończyć śledzenie.
      UWAGA: Upewnij się, że śledzisz akson z somy, aby terminal aksonu. W ten sposób obliczenia następcze i wsteczne będą poprawne.
    6. Naciśnij polecenie T lub Dodaj w menedżerze ROI.
    7. Teraz kliknij OK. Kymograf zostanie wygenerowany w utworzonym wcześniej folderze. (Oś X to długość aksonu w mikronach, a oś Y to czas w sekundach).
  2. Śledzenie kimografu
    1. Przeciągnij kimograf do Fiji Image J (powinien zostać automatycznie umieszczony w utworzonym wcześniej folderze).
    2. Przeciągnij makro Ścieżka na obraz J.
    3. W poniższym wierszu kliknij przycisk OK. Jeśli wznawiasz pracę od początku, wprowadź punkt liczbowy, od którego chcesz kontynuować, a następnie naciśnij przycisk OK.
    4. Za pomocą narzędzia Prostokąt w panelu Zaznaczanie zaznacz obszar w pobliżu środka kimografu o wysokości 60 pikseli i zawsze o średnicy 100 μm. Aby to zrobić, podziel 100 przez stosunek pikseli do mikropikseli, który został zarejestrowany w kroku 3.1.2.
    5. Po wybraniu obszaru naciśnij Ctrl T, aby dodać i t do ROI i zapisać ROI w folderze, w którym pracujesz (naciśnij Więcej w menu ROI, a następnie Zapisz).
      UWAGA: Odwrócenie zaznaczonego obszaru poprzez naciśnięcie Ctrl+Shift+I ułatwi jego śledzenie.
    6. Aby śledzić ruch pojedynczego pęcherzyka, przytrzymaj Ctrl i kliknij lewym przyciskiem myszy od góry do dołu.
    7. Aby to zrobić, przytrzymaj Ctrl podczas klikania prawym przyciskiem myszy, a pojawi się okno pokazujące, gdzie śledzone są aksony. Jeśli to wygląda dobrze, naciśnij OK.
    8. Aby kontynuować i wybrać inny pęcherzyk, kliknij Tak i powtórz proces z kroków 3.2.6-3.2.8. Po wyśledzeniu wszystkich widocznych pęcherzyków naciśnij przycisk Nie. Spowoduje to automatyczne zapisanie nakładki śledzonej przez rękę w tym samym folderze.
  3. Pomiar danych kimografu
    1. Utwórz nowy folder. Przeciągnij każdy wygenerowany plik tekstowy do folderu.
    2. Otwórz plik kimografu i zapisz wymiary.
    3. Przeciągnij makro Zmierz na obraz J.
    4. Wprowadź zarejestrowany wcześniej stosunek mikronów do pikseli w PixelScale.
    5. Zmień ograniczenie prędkości na 0,1. (Pęcherzyki poruszające się poniżej tej granicy są uważane za nieruchome).
    6. Wprowadź wcześniej zarejestrowane wymiary kimografu. Plik podsumowania zostanie automatycznie wygenerowany w utworzonym folderze tekstowym. Każde wypełnienie podsumowaniem będzie zawierało % przebytego czasu, prędkość całkowitą (μm/s), całkowitą odległość, średni przebyty segment, liczbę zatrzymań i liczbę cofnięć. Kod do generowania, śledzenia i pomiaru danych kimografu jest dostarczany jako Uzupełniający Plik Kodowania 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie żywych komórek i analizy kymograficzne zostały przeprowadzone w celu zmierzenia ruchliwości wolnych mitochondriów znakowanych mitochondriami Mito-RFP lub mitochondriami związanymi z ER o ciasnych (6 nm ± 1 nm) lub luźnych (24 nm ± 3 nm) szerokościach styku stabilizowanych odpowiednio przez MAM 1X lub MAM 9X, w najdłuższym procesie neuronalnym każdego neuronu ReN GA (AD) lub ReN (naiwnego), który ma co najmniej 500 nm długości, traktując to jako akson (Rysunek 1 i Rysun...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hamowanie receptora sigma-1 (S1R) obniżyło stabilizację MAM w procesach neuronalnych i radykalnie zmniejszyło (~90%) wytwarzanie Aβ z aksonów, ale nie z somy trójwymiarowego (3D) systemu hodowli ludzkich neuronalnych komórek progenitorowych (ReN) wyrażających rodzinne mutacje AD [FAD] w genie białka prekursorowego amyloidu [APP] (ReN GA)23,24,25,27. Stabilizatory MAM (MAM 1X i MAM 9X) ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. György Hajnóczky, profesorowi Uniwersytetu Thomasa Jeffersona w Filadelfii za hojne dostarczenie nam plazmidów ekspresyjnych kodujących RFP-Mito, MAM 1X, MAM 9X i MAM 18X. Specjalne podziękowania dla dr Lai Ding, starszego naukowca ds. obrazowania w Brigham and Women's Hospital za pomoc w napisaniu kodu do generowania, śledzenia i mierzenia danych kimografowych. Badanie to było wspierane przez Cure Alzheimer's Fund to RB i grant NIH 5R01NS045860-20 dla RET.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
6-dołkowa szklana płyta dolnaCellvisP06-1.5H-N
B-27 Suplement (50X), bez surowicyGibco/Thermo Fisher Scientific17504044
bFGFR& System D 233-FB
BSAFisher Scientific501781532
Countess Szkiełka komory do liczenia komórekInvitrogenC10283
DMEM/F12 z L-glutaminą Gibco/Thermo Fisher Scientific11320-033
EDTA   Life Technologies41116134
EGFSigma-Aldrich92090408
Falcon 6 Well Plates VWR International41122107
GAPDH Przeciwciało poliklonalneThermo Fisher ScientificPA1-988
Żelatyna VWR International9000-70-8
Graphpad Prism N/APrism 9, wersja 9.5.0N/A
HeparinSigma-Aldrich 
Oprogramowanie ImageJ ImageJ 1.53aN/A
Matrigel Matryca membrany podstawnej   Corning356234
mCherry Przeciwciało poliklonalneInvitrogenPA5-34974
MS Excel   Microsoft Excel, wersja 2302N/A
zestaw do testów elektrochemiluminescencyjnychDiagnostyka w skali Mezo (MSD)K15200E-2V-PLEX Aβ Zestaw Peptide Panel 1 (6E10)
NaCl   Fisher Scientific7647145
NuPAGE 4– 12% żel Bis-Tris   InvitrogenNP0321BOX
Penicylina/Streptomycyna/Amfoterycyna B Lonza  17-745E
PhotoshopAdobe Photoshop CC 20.0.10 Nie dotyczy
zestawu nukleofektorów Rat Neuron LonzaVPG-1003
StemPro Accutase GibcoA1110501
Tris-HCL, pH 7,6   Boston BioProducts42000000
Triton X-100   Sigma-AldrichT8787
Tween 20Fisher Scientific501657287
H0200000 Wielomacierzowy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Giacomello, M., Pellegrini, L. The coming of age of the mitochondria-ER contact: a matter of thickness. Cell Death Differ. 23 (9), 1417-1427 (2016).
  2. Degechisa, S. T., Dabi, Y. T., Gizaw, S. T. The mitochondrial associated endoplasmic reticulum membranes: A platform for the pathogenesis of inflammation-mediated metabolic diseases. Immun Inflamm Dis. 10 (7), e647(2022).
  3. Schon, E. A., Area-Gomez, E. Mitochondria-associated ER membranes in Alzheimer disease. Mol Cell Neurosci. 55, 26-36 (2013).
  4. Erpapazoglou, Z., Mouton-Liger, F., Corti, O. From dysfunctional endoplasmic reticulum-mitochondria coupling to neurodegeneration. Neurochem Int. 109, 171-183 (2017).
  5. Sala-Vila, A., et al. Interplay between hepatic mitochondria-associated membranes, lipid metabolism and caveolin-1 in mice. Sci Rep. 6, 27351(2016).
  6. Fujimoto, M., Hayashi, T. New insights into the role of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane. Int Rev Cell Mol Biol. 292, 73-117 (2011).
  7. Hung, V., et al. Proteomic mapping of cytosol-facing outer mitochondrial and ER membranes in living human cells by proximity biotinylation. eLife. 6, e24463(2017).
  8. Area-Gomez, E., Schon, E. A. On the pathogenesis of Alzheimer's disease: The MAM hypothesis. FASEB J. 31 (3), 864-867 (2017).
  9. Rizzuto, R., et al. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses. Science. 280 (5370), 1763-1766 (1998).
  10. Sukhorukov, V. S., et al. Molecular mechanisms of interactions between mitochondria and the endoplasmic reticulum: A new look at how important cell functions are supported. Mol Biol. 56 (1), 59-71 (2022).
  11. Zhang, P., Konja, D., Zhang, Y., Wang, Y. Communications between Mitochondria and endoplasmic reticulum in the regulation of metabolic homeostasis. Cells. 10 (9), 2195(2021).
  12. Ziegler, D. V., Martin, N., Bernard, D. Cellular senescence links mitochondria-ER contacts and aging. Commun Biol. 4 (1), 1323(2021).
  13. Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. J Cell Biol. 174 (7), 915-921 (2006).
  14. Cieri, D., et al. SPLICS: a split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition. Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).
  15. Carpio, M. A., et al. BOK controls apoptosis by Ca(2+) transfer through ER-mitochondrial contact sites. Cell Rep. 34 (10), 108827(2021).
  16. Prudent, J., et al. MAPL SUMOylation of Drp1 stabilizes an ER/mitochondrial platform required for cell death. Mol Cell. 59 (6), 941-955 (2015).
  17. Zellmer, J. C., Tarantino, M. B., et al. Stabilization of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes regulates Abeta generation in a three-dimensional neural model of Alzheimer’s disease. Alzheimer’s Dement. , 1-20 (2024).
  18. Magalhaes Rebelo, A. P., et al. Chemical modulation of mitochondria-endoplasmic reticulum contact sites. Cells. 9 (7), 1637(2020).
  19. Berger, S. I., Iyengar, R. Role of systems pharmacology in understanding drug adverse events. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 3 (2), 129-135 (2011).
  20. Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules. J Cell Biol. 190 (3), 363-375 (2010).
  21. Wu, Y., et al. Contacts between the endoplasmic reticulum and other membranes in neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (24), E4859-E4867 (2017).
  22. Cagin, U., et al. Mitochondrial retrograde signaling regulates neuronal function. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (44), E6000-E6009 (2015).
  23. Choi, S. H., et al. A three-dimensional human neural cell culture model of Alzheimer's disease. Nature. 515 (7526), 274-278 (2014).
  24. Kim, Y. H., et al. A 3D human neural cell culture system for modeling Alzheimer's disease. Nat Protoc. 10 (7), 985-1006 (2015).
  25. Kwak, S. S., et al. Amyloid-beta42/40 ratio drives tau pathology in 3D human neural cell culture models of Alzheimer's disease. Nat Commun. 11 (1), 1377(2020).
  26. Csordas, G., et al. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39 (1), 121-132 (2010).
  27. Bhattacharyya, R., et al. Axonal generation of amyloid-beta from palmitoylated APP in mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes. Cell Rep. 35 (7), 109134(2021).
  28. Tebo, A. G., Gautier, A. A split fluorescent reporter with rapid and reversible complementation. Nat Commun. 10 (1), 2822(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondria Associated MembranesMAM StabilizationAlzheimer s Disease ModelNeural Progenitor CellsLive Cell ImagingKymographic AnalysisElectroporation TechniqueFluorescence MicroscopyMito RFP LabelingAxonal Mitochondria Motility

Related Articles