Artykuł metodologiczny

Przenośny papierowy test immunologiczny w połączeniu z aplikacją na smartfony do kolorymetrycznego i ilościowego wykrywania antygenu dengi NS1

2.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66130

⸱

26 stycznia 2024

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacy, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Universitas Islam Indonesia, 2School of Bioresources and Technology, King Mongkut's University of Technology Thonburi, 3Department of Otolaryngology, Phramongkutklao Hospital and College of Medicine, 4Sensor Technology Laboratory, Pilot Plant Development and Training Institute, King Mongkut's University of Technology Thonburi, 5Biosciences and Systems Biology Research Team, National Center for Genetic Engineering and Biotechnology, National Sciences and Technology Development Agency at King Mongkut's University of Technology Thonburi

W tym artykule

Podsumowanie

Wychodząc naprzeciw pilnym potrzebom diagnostycznym dengi, przedstawiamy zintegrowane z aplikacją na smartfony papierowe urządzenie analityczne Dengue NS1 (DEN-NS1-PAD) do ilościowego określania stężenia antygenu dengi NS1 w próbkach klinicznych surowicy/krwi. Ta innowacja usprawnia zarządzanie dengą, wspomagając podejmowanie decyzji klinicznych w różnych placówkach opieki zdrowotnej, nawet tych o ograniczonych zasobach.

Streszczenie

Zakażenie wirusem dengi (DENV), które jest przenoszone przez komary Aedes, jest głównym problemem zdrowia publicznego w krajach tropikalnych i subtropikalnych. Przy rocznej zapadalności wynoszącej około 10 milionów przypadków i 20 000-25 000 zgonów, szczególnie wśród dzieci, istnieje pilne zapotrzebowanie na praktyczne narzędzia diagnostyczne. Obecność niestrukturalnego białka dengi 1 (NS1) we wczesnym okresie infekcji została powiązana z uwalnianiem cytokin, wyciekiem naczyniowym i dysfunkcją śródbłonka, co czyni go potencjalnym markerem ciężkiej postaci dengi.

Papierowe testy immunologiczne, takie jak testy przepływu bocznego (LFA) i mikroprzepływowe urządzenia analityczne oparte na papierze (PADs) zyskały popularność jako testy diagnostyczne ze względu na ich prostotę, szybkość, taniość, specyficzność i łatwość interpretacji. Jednak konwencjonalne testy immunologiczne na papierze do wykrywania dengi NS1 zazwyczaj opierają się na oględzinach, dając tylko wyniki jakościowe. Aby rozwiązać to ograniczenie i zwiększyć czułość, zaproponowaliśmy wysoce przenośny test wykrywania dengi NS1 na papierowym urządzeniu analitycznym (PAD), a mianowicie DEN-NS1-PAD, który integruje aplikację na smartfony jako czytnik kolorymetryczny i ilościowy. System rozwoju umożliwia bezpośrednią kwantyfikację stężeń NS1 w próbkach klinicznych.

Próbki surowicy i krwi pobrane od pacjentów zostały wykorzystane do zademonstrowania działania prototypu systemu. Wyniki uzyskano natychmiast i można je wykorzystać do oceny klinicznej, zarówno w dobrze wyposażonych placówkach opieki zdrowotnej, jak i w placówkach o ograniczonych zasobach. To innowacyjne połączenie papierowego testu immunologicznego z aplikacją na smartfony stanowi obiecujące podejście do lepszego wykrywania i oznaczania ilościowego antygenu NS1 dengi. Zwiększając czułość w stopniu wykraczającym poza możliwości gołego oka, system ten ma ogromny potencjał w zakresie usprawnienia procesu podejmowania decyzji klinicznych w leczeniu gorączki denga, szczególnie w odległych lub niedostatecznie obsługiwanych obszarach.

Wprowadzenie

Zakażenie wirusem dengi (DENV) jest najszybciej rozprzestrzeniającą się chorobą przenoszoną przez komary1, a ponad 390 milionów ludzi jest zarażonych 96 milionami objawowych infekcji, 2 miliony przypadków ciężkiej choroby i ponad 25 000 zgonów rocznie występuje na świecie1,2. Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) szacuje się, że 3,9 miliarda ludzi jest zagrożonych dengą; ~70% mieszka w krajach Azji i Pacyfiku, głównie w Azji Południowo-Wschodniej3. W 2019 roku liczba przypadków dengi zgłoszonych do WHO wyniosła 4,2 miliona, a Tajlandia przyczyniła się do co najmniej 136 000 przypadków dengi i 144 przypadków zgonów z powodu zakażenia dengą4. Epidemia dengi w Tajlandii występuje w porze deszczowej, od kwietnia do grudnia, zarówno na obszarach miejskich, jak i wiejskich, zwłaszcza w obszarze północno-wschodnim.

Infekcje DENV mają różne objawy kliniczne, począwszy od objawów subklinicznych, łagodnej gorączki denga (DF) do ciężkiej gorączki krwotocznej dengi (DHF). Główną cechą ciężkiego stanu DHF jest zwiększona przepuszczalność naczyń krwionośnych, po której następuje wstrząs i dysfunkcja narządów1. Zrozumienie szlaku molekularnego, który może powodować przeciek naczyniowy, jest bardzo ważne w opracowywaniu skutecznych metod leczenia dengi. Niestrukturalne białko dengi 1 (NS1) jest glikoproteiną wydzielaną podczas wczesnej infekcji wirusowej5,6 i działa jako kofaktor replikacji wirusowego RNA7. NS1 może wyzwalać uwalnianie cytokin i przyczyniać się do przeciekania naczyń krwionośnych poprzez wiązanie się z receptorem toll-like 4 (TLR4) i glikokaliksem śródbłonkowym8,9. Badania in vitro wykazały, że NS1 oddziałuje z komórkami śródbłonka i indukuje apoptozę. Ten stan może przyczyniać się do dysfunkcji śródbłonka i nieszczelności naczyniowej10. Poziomy antygenu NS1, skorelowane z poziomami interleukiny (IL)-10 w surowicy, były znacznie zwiększone u pacjentów z ciężką chorobą kliniczną11. Denga NS1 przyczynia się również do patogenezy choroby poprzez indukcję IL-10 i tłumienie odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla DENV12,13. Ponadto białko NS1 dengi było związane z ciężką kliniczną chorobą, a stężenie NS1 > 600 ng mL-1 w pierwszych 3 dniach choroby było związane z rozwojem DHF14.

Trwałość antygenu NS1 dengi u pacjentów z DHF może być wykorzystana jako marker ciężkiej postaci dengi6. Istnieje kilka metod wykrywania NS1 w próbkach klinicznych, takich jak test immunoenzymatyczny (ELISA) i szybki test15. Złotym standardem pomiaru stężenia białek NS1 w warunkach klinicznych jest metoda ELISA. Jednak metoda ELISA jest kosztowna i wymaga wykwalifikowanego personelu oraz zaplecza laboratoryjnego16. W związku z tym nadal trwają prace nad technologią wykrywania i ilościowego oznaczania białek NS1 w teście przyłóżkowym (POCT). W ciągu ostatniej dekady testy immunologiczne oparte na papierze, takie jak testy przepływu bocznego (LFA) i mikroprzepływowe urządzenia analityczne oparte na papierze (μPADs), stały się popularne jako testy diagnostyczne ze względu na ich prostotę, szybkość, niekoszt i swoistość17,18,19. W papierowym teście immunologicznym do generowania sygnałów użyto kilku etykiet, takich jak nanocząstki złota (AuNPs)20, nanocząstki magnetyczne21,22, kropki kwantowe23 i materiały fluorescencyjne24,25. AuNP są najczęstszymi etykietami stosowanymi w papierowych testach immunologicznych ze względu na ich niedrogie koszty produkcji, łatwość wytwarzania, stabilność i prosty odczyt. Obecnie testy przepływu bocznego (LFA) dla dengi NS1 są powszechnie stosowane w warunkach klinicznych26,27. Jednak konwencjonalne wykrywanie etykiet LFA zwykle odbywa się gołym okiem i zapewnia tylko wyniki jakościowe.

W ciągu ostatniej dekady, ponad 5 miliardów smartfonów było szeroko używanych na całym świecie, a istnieje potencjał do rozwoju przenośnego wykrywania28,29. Smartfony mają wielofunkcyjne możliwości, takie jak wbudowane czujniki fizyczne, procesory wielordzeniowe, aparaty cyfrowe, porty USB, porty audio, łączność bezprzewodowa i oprogramowanie użytkowe, dzięki czemu nadają się do użytku na różnych platformach biosensorów30. Ponadto technologie bezprzewodowe umożliwiają szybkie przesyłanie danych i mogą być wykorzystywane do monitorowania w czasie rzeczywistym i na miejscu31. Mudanyali i in. połączyli papierowy test immunologiczny i smartfony, aby opracować przenośną, bezsprzętową, szybką, tanią i przyjazną dla użytkownika platformę POCT dla malarii, gruźlicy i HIV32. Ling i wsp. opisali test przepływu bocznego w połączeniu z kamerą smartfona w celu ilościowego wykrycia aktywności fosfatazy alkalicznej w mleku33. Hou i wsp. opracowali również oparty na smartfonie, dwumodalny system obrazowania dla ilościowych sygnałów z barwy lub fluorescencji w teście przepływu bocznego34. Ponadto użycie smartfona jako czytnika kolorymetrycznego i ilościowego może poprawić czułość, podczas gdy gołym okiem nie można z całą pewnością zgłosić obecności target35.

Prezentując przełom w diagnostyce dengi, DEN-NS1-PAD36,37,38 (zwane dalej urządzeniem) oferuje przenośne i wydajne rozwiązanie. Wykorzystując technologię opartą na papierze mikroprzepływowym drukowanym woskiem, urządzenie to określa ilościowo NS1 z wysoką czułością i swoistością poprzez przetwarzanie obrazu. Aby jeszcze bardziej zwiększyć jego użyteczność, opracowaliśmy przyjazną dla użytkownika aplikację na smartfony do odczytu kolorymetrycznego i ilościowego. Walidacja kliniczna z wykorzystaniem próbek pobranych od pacjentów ze szpitali w Tajlandii podkreśla jej natychmiastowy wpływ na ocenę pacjenta w czasie rzeczywistym. Nasza innowacja stanowi kluczowy postęp w usprawnionym zarządzaniu dengą w miejscu opieki nad pacjentem, obiecując zrewolucjonizowanie diagnostyki w środowiskach opieki zdrowotnej o ograniczonych zasobach.

Protokół

Komisja Etyki Komisji Rewizyjnej Instytucji, Departament Medyczny Królewskiej Armii Tajlandii, Szpital Phramongkutklao, Bangkok, Tajlandia (IRBRTA 1218/2562) wyraziła zgodę. Przeprowadzając to badanie, przestrzegaliśmy wszystkich niezbędnych przepisów etycznych.

1. Produkcja papierowego testu immunologicznego

UWAGA: Papierowy test immunologiczny został wyprodukowany zgodnie z wcześniej ustalonymi metodami36,37, oraz tajlandzki wniosek patentowy nr 19010081638.

  1. Projekt i rysunek wzoru: Zaprojektuj papierowe urządzenie analityczne (Rysunek 1A,B) z 18 wzorami woskowymi PAD na komputerze.
    UWAGA: Konstrukcja jest specyficzna i przeznaczona do papieru o rozmiarze A5. Liczba tabletów PAD jest zależna od rozmiaru papieru, zgodnie z wymaganiami użytkownika.
  2. Wydrukuj zaprojektowany wzór na papierze celulozowym za pomocą drukarki woskowej (Tabela materiałów).
  3. Papier zadrukowany woskiem należy roztopić w piecu laboratoryjnym przez 75 s w temperaturze 150 °C. Następnie przechowuj go w pudełku z krzemionką, aż będzie potrzebny do kolejnych kroków.
  4. Nałóż 0,5 μl 0,025% poli-L-lizyny (PLL) zarówno na obszar testowy, jak i kontrolny. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 2 minuty w pojemniku z krzemionką, a następnie podgrzewać w piecu w temperaturze 65 °C przez 5 minut.
  5. Nałożyć 0,5 μl z 1 μg μL-1 koziego przeciwciała anty-mysiego IgG na obszar kontrolny i 0,5 μl z 1 μg μL-1 przeciwciała wychwytującego na obszar testowy. Pozostaw krople do wyschnięcia w pudełku z żelem krzemionkowym w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  6. Nanieść 2 μl buforu blokującego na obszar próbki, 3 μl na obszar sprzężonego i 2 μl na obszar wykrywania. Pozostaw krople do wyschnięcia w temperaturze pokojowej w pudełku z żelem krzemionkowym przez 30 minut.
  7. Nanieść 2 μl roztworu kompleksu nanocząstka-przeciwciało złota (AuNPs-Ab) na obszar koniugatu i pozostawić do wyschnięcia w pudełku z żelem krzemionkowym w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

2. Montaż papierowego testu immunologicznego

  1. Ostrożnie usuń folię ochronną z odwrotnej strony samoprzylepnej plastikowej karty nośnej, aby odsłonić klej.
  2. Wyrównaj obrobiony papier celulozowy z samoprzylepną plastikową kartą podkładową i mocno dociśnij obie warstwy do siebie.
    UWAGA: Unikaj dotykania pola hydrofilowego, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia lub uszkodzenia urządzenia.
  3. Nałóż folię z tworzywa sztucznego, aby pokryć papier i dociśnij je do siebie.
  4. Wytnij żądany kawałek urządzeń za pomocą nożyczek z arkuszy całkowicie zmontowanych urządzeń.
  5. DEN-NS1-PADs (Rysunek 1C) są teraz gotowe do użycia. Aby zapewnić długotrwałą stabilność, przechowuj je w temperaturze 4 °C.

3. Przygotowanie koniugatu AuNPs-Ab

UWAGA: AuNPs-Ab został przygotowany zgodnie z wcześniejszym opisem Prabowo et al.36.

  1. Połącz 10 μl 1 mg przeciwciała anty-NS1 1 ml w PBS, 1 ml koloidu 40 nm AuNPs i 0,1 ml 0,1 M buforu boranowego (pH 8,5).
  2. Obracać mieszaninę z prędkością 50 obr./min przez 60 minut i inkubować w temperaturze pokojowej.
  3. Zastosuj 0,1 ml 10 mg mL-1 BSA w BBS, obracaj z prędkością 50 obr./min i inkubuj w temperaturze RT przez 15 minut.
  4. Odwirować roztwór o sile 20,187 × g i temperaturze 4 °C przez 30 minut.
  5. Ostrożnie odpipetować i oddzielić supernatant od wytrąconego AuNPs-Ab.
  6. Zawiesić AuNPs-Ab w 500 μl BBS i zdyspergować go za pomocą sonikacji.
  7. Powtórzyć wirowanie w temperaturze 20,187 × g i temperaturze 4 °C przez 30 min.
    UWAGA: Powtórz procesy dyspersji i wirowania 3x.
  8. Dodać 50 μl sprzężonego buforu do zawiesiny, przygotowując ją do nałożenia na obszar koniugatu.

4. Tworzenie aplikacji mobilnych

  1. Rozwój przetwarzania obrazów i uczenia maszynowego
    1. Zbierz zestaw danych dla nadzorowanego modelu obrazu, zbierając ponad 900 obrazów DEN-NS1-PAD z autofokusem, rejestrując różne warunki, takie jak różne stężenia, marki aparatów (12-13 megapikseli), obroty (90° i 180°) i ustawienia oświetlenia. Celuj w 30 obrazów w każdych określonych warunkach.
    2. Oznacz podstawową prawdę, identyfikując i dodając adnotacje do dwóch obszarów zainteresowania jako obszarów testowych i kontrolnych na zebranych obrazach do uczenia nadzorowanego.
    3. Zaprojektuj algorytm identyfikujący pasek tła. Zlokalizuj linię środkową między regionem testowym i kontrolnym, oblicz jej punkt środkowy i ustal kwadratowy obszar proporcjonalny do średniego rozmiaru dwóch głównych obszarów, zachowując tę samą orientację obrotową.
    4. Utwórz model segmentacji obrazu, korzystając z zestawu danych i etykiet prawdy podstawowej z kroków 4.1.1 i 4.1.2, aby wytrenować model segmentacji obrazu w celu identyfikacji obszarów zainteresowania.
  2. Algorytm aplikacji
    1. Zastosuj wytrenowany model segmentacji obrazu do nowych obrazów, aby automatycznie zlokalizować regiony testowe, kontrolne i tła.
    2. Użyj podstawowych technik przetwarzania obrazu, aby uzyskać pojedynczą wartość intensywności dla każdego z trzech obszarów zainteresowania (test, kontrola i tło).
    3. Przekształć obraz w reprezentację tablicy 3D (kanał y, x), aby uzyskać dostęp do wartości pikseli.
    4. Przekonwertuj obraz na skalę szarości, uśredniając wartości RGB i zastosuj odwrócenie za pomocą formuły (255-x).
    5. Znormalizuj wartości obszaru testowego i kontrolnego, odejmując wartość obszaru tła.
    6. Użyj wcześniej ustalonej krzywej kalibracyjnej, aby obliczyć stężenie NS1.
    7. Klasyfikuj wyniki jako dodatnie lub ujemne na podstawie wartości odcięcia 0,1103 uzyskanej ze znormalizowanej intensywności skali szarości37.

5. Krzywa kalibracyjna i czułość

  1. Przygotować próbkę NS1 w surowicy ludzkiej do kalibracji o stężeniach 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 i 1,0 μg mL-1.
  2. Upuść 50 μl każdego stężenia na obszar próbki i wykonaj pomiary w trzech egzemplarzach.
  3. Pozwól, aby próbki całkowicie wsiąkły do urządzenia, co może zająć 20-30 minut, aby uzyskać wyniki.
  4. Rób zdjęcia urządzenia za pomocą aparatu cyfrowego lub smartfona po 5 minutach inkubacji.
  5. Analizuj obszary testowe i kontrolne za pomocą ImageJ i niestandardowej aplikacji mobilnej.
  6. Skonstruuj krzywą kalibracyjną na podstawie danych z ImageJ i aplikacji mobilnej.
  7. Obliczyć granicę ślepej próby (LOB), granicę wykrywalności (LOD) i granicę oznaczalności (LOQ) za pomocą równań (1-3) poniżej:
    LOB = średnia danych zerowych + 1:645* ð (odchylenie standardowe danych zerowych) (1)
    LOD = LOB +1:645*ð (odchylenie standardowe danych dotyczących najniższego stężenia) (2)
    LOQ = średnia danych zerowych + 10*ð (odchylenie standardowe danych zerowych) (3)

6. Przeprowadzanie papierowego testu immunologicznego z próbkami klinicznymi

  1. Pobrać i przetworzyć 300 μl krwi obwodowej od 30 pacjentów w pierwszym dniu hospitalizacji do fioletowych górnych probówek EDTA, zgodnie z dobrymi praktykami klinicznymi.
  2. Odwirować krew o sile 2,884 × g i temperaturze 4 °C przez 20 minut.
  3. Przenieś płynny składnik (osocze) do czystej rurki polipropylenowej za pomocą pipety.
  4. Natychmiast przechowywać osocze w zamrażarce w temperaturze -20 °C w celu późniejszej analizy.
  5. Nanieś 20 μl osocza na obszar próbki na górze urządzenia. Następnie dodać 30 μl buforu do przemywania (0,05% v/v Tween 20 w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem).
  6. Pozwól, aby próbka całkowicie wsiąkła do urządzenia, co może zająć 20-30 minut, aby uzyskać wyniki.
  7. Rób zdjęcia urządzenia za pomocą aparatu cyfrowego lub smartfona po 5 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej.
  8. Analizuj obszary testowe i kontrolne za pomocą ImageJ i niestandardowej aplikacji mobilnej.

7. Kwantyfikacja za pomocą aplikacji mobilnej

UWAGA: Intensywność papierowego testu immunologicznego jest analizowana w aplikacji mobilnej (Rysunek 2).

  1. Otwórz opracowaną aplikację mobilną na smartfonie.
  2. Wybierz opcję Użyj aparatu lub Przekaż z galerii, aby wybrać lub przekazać źródło danych. Zrób to, przechwytując kamerę lub wybierając obraz z galerii urządzenia.
  3. Przejdź do sekcji analitycznej i dotknij przycisku Analizuj na ekranie.
  4. Poczekaj, aż aplikacja przeanalizuje dane i wyświetli wyniki.

Wyniki

Wybór metody wykonania jest kluczowy dla zapewnienia powtarzalnych wyników analiz w papierowych urządzeniach do testów immunoenzymatycznych. W naszym badaniu przeanalizowano różne procesy produkcyjne i materiały w kontekście demonstracji papierowego testu immunoenzymatycznego. Wybrana przez nas metoda wykorzystuje system druku woskowego do tworzenia barier hydrofobowych w papierowych urządzeniach mikroprzepływowych. Podejście to wyróżnia się prostotą, szybkością i spójnymi wynikami. Warto zauważyć, że oferuje ono zaletę w postaci uniknięcia stosowania odczynników fotorezystowych, które mogą zakłócać adsorpcję białek i zwiększać hydrofobowość papieru celulozowego. Ponadto druk woskowy zapewnia spójne wymiary kanałów przepływowych, co przyczynia się do powtarzalności wyników analizy.

Po utworzeniu barier hydrofobowych, na powierzchnię papieru celulozowego naniesiono niezbędne odczynniki do analizy immunologicznej. Dzięki adsorpcji elektrostatycznej, PLL wspomógł immobilizację biomolekuł poprzez oddziaływanie zarówno z dodatnim ładunkiem grup funkcyjnych amin, jak i ujemnie naładowanym przeciwciałem. Krok ten ułatwia modyfikację i immobilizację przeciwciał oraz nakładanie koniugatów znakownik-przeciwciało podczas procesów wytwarzania. Co istotne, etap ten może być przeprowadzany równolegle. Montaż urządzeń do papierowych analiz immunologicznych (DEN-NS1-PAD, pokazany na Rysunku 1A) kończy się przez nałożenie zmodyfikowanego papieru na klejącą plastikową kartę podkładową i zalaminowanie go folią plastikową.

Głównym celem niniejszego badania jest opracowanie przyjaznej dla użytkownika metody wykorzystującej smartfon do pomiaru stężeń białka NS1. Podejście to mogłoby zostać zastosowane jako urządzenie do testów w punkcie opieki (POCT) zarówno w warunkach domowych, jak i klinicznych. Biorąc pod uwagę szeroki zakres stężeń NS1 w surowicy pacjentów, na podstawie wyników tych eksperymentów zastosowano proste modele liniowe. Dla każdego stężenia NS1 przygotowano zestaw danych obejmujący trzy urządzenia testowe. Zdjęcia urządzeń wykonano za pomocą smartfona przy standardowych ustawieniach i optymalnych warunkach oświetlenia, co wyeliminowało potrzebę stosowania ciemnej komory. Strefa testowa PAD zawiera mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko NS1 wirusa denga, natomiast strefa kontrolna zawiera kozie przeciwciało anty-mysie IgG. W formacie testu kanapkowego (sandwich assay) wyższym stężeniom NS1 w próbkach odpowiada zwiększona intensywność czerwonego koloru w strefie testowej. W przeciwieństwie do niej, intensywność koloru w strefie kontrolnej pozostaje stosunkowo stała. Rycina 1B przedstawia nieprzetworzone obrazy ze smartfona, które umożliwiają korzystną obserwację wizualną bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu.

Za pomocą dedykowanej aplikacji mobilnej znormalizowaliśmy intensywności i obliczyliśmy proste modele liniowe dla stężeń dodanego białka NS1 w próbkach surowicy – współczynnik korelacji (r2) uzyskany z aplikacji mobilnej. Współczynnik korelacji (r2) uzyskany z aplikacji mobilnej wyniósł 0,92 (Rysunek 3), co było zgodne z oczekiwaniami. Podejście oparte na smartfonie okazało się skuteczniejsze od obserwacji gołym okiem, znacząco zwiększając czułość o 178%. Dodatkowo, dla znormalizowanych intensywności obliczono granicę tła (LoB), granicę wykrywalności (LoD) oraz granicę oznaczalności (LoQ), jak przedstawiono w Tabeli 1.

W celu wykazania praktycznej funkcjonalności urządzeń DEN-NS1-PAD w warunkach klinicznych wykorzystano rzeczywiste próbki kliniczne. Papierowy test immunochemiczny generował jakościowe odczyty kolorystyczne w ciągu 20-30 min, co pozwalało na wizualne określenie wyników negatywnych lub pozytywnych. Do urządzenia wprowadzono próbki surowicy od pacjentów z podejrzeniem dengi. Rysunek 4 ilustruje i porównuje wyniki uzyskane za pomocą urządzenia oraz komercyjnego szybkiego testu diagnostycznego (RDT). Tabela 2 podsumowuje wyniki odczytów wizualnych oraz systemu opartego na smartfonie. Komercyjny RDT oraz badane urządzenie dały podobne wyniki, z siedmioma wynikami pozytywnymi i 23 negatywnymi w odczycie wizualnym. Z kolei system odczytu oparty na smartfonie, zastosowany wyłącznie do urządzenia, wykazał dziewięć wyników pozytywnych i 21 negatywnych w próbkach klinicznych.

Schemat chromatografii ilustrujący proces przepływu z oznaczonymi strefami aplikacji próbki.
Rysunek 1: Zdjęcia zaprojektowanego i wykonanego urządzenia DEN-NS1-PAD. (A,B) Pojedynczy kanał z hydrofobowej bariery z woskowego wzoru przedstawiony w trzech stanach (C) przed oraz (D,E) po wprowadzeniu roztworu próbki do wyznaczonego obszaru, pokazujący odpowiednio (D) wynik negatywny i (E) wynik dodatni. Roztwór próbki przemieszcza się przez kanał (patrz strzałka), wchodząc w interakcję ze składnikami w kluczowych miejscach: AuNPs-Ab w strefie koniugatu, przeciwciałem anty-NS1 w strefie testowej (co wskazuje na dodatni wynik badania NS1 w kierunku dengi) oraz anty-mysim IgG w strefie kontrolnej. Wyniki są łatwo widoczne gołym okiem i mogą być ilościowo określone za pomocą przetwarzania obrazu z użyciem skanera płaskiego lub kamery smartfona. Skrót: AuNPs-Ab = koniugat nanocząsteczek złota z przeciwciałem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Ekrany aplikacji Dengue NS1 PAD przedstawiające analizę krok po kroku i wyniki: od wprowadzania danych do wyświetlania wyników.
Rycina 2: Zrzuty ekranu telefonu z aplikacji mobilnej. (A) Ekran użytkownika aplikacji na system Android uruchomionej na urządzeniu mobilnym, (B) wyświetlanie ekranu aplikacji, (C) menu główne aplikacji, w którym użytkownicy mogą wybrać korzystanie z aparatu lub przesłanie obrazu z galerii, (D) wyświetlanie powiązanego obrazu do testowania, (E) wyświetlanie czasu odliczania do analizy, (F) wyświetlanie wyników testu, w tym intensywności strefy testowej i kontrolnej, decyzji o zakażeniu (dodatni/ujemny) oraz stężenia NS1 w próbce. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres regresji liniowej znormalizowanego sygnału w funkcji stężenia NS1, y=0,3701x+0,0128, r²=0,9248.
Rysunek 3: Liniowa krzywa kalibracyjna dla detekcji NS1 w surowicy. Urządzenie zostało wykorzystane, a obrazy zinterpretowano poprzez przetwarzanie za pomocą aplikacji opartej na danych ze smartfona. Słupki błędów przedstawiają ±1 odchylenie standardowe, n = 3. Skróty: T = obszar testowy; C = obszar kontrolny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki chromatografii; test jodowo-skrobiowy; diagramy i wykres słupkowy przedstawiający analizę częstotliwości.
Rysunek 4: Obraz DEN-NS1-PAD z analizy próbek klinicznych. W papierowym immunoanalizie wykorzystano surowicę (50 µL). (A) przykład wyniku negatywnego, (B) wyniki pozytywne, (C) wyniki ogólne i porównanie testu RDT z immunoanalizą na podłożu papierowym. Skróty: RDT = szybki test diagnostyczny; Pos = pozytywny; Neg = negatywny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

ParametrGołym okiemAplikacja mobilna
Granica pustej próby (LoB)-43,15 ng mL-1-1
Granica wykrywalności (LoD)200 ng mL-1112,19 ng/mL-1
Granica ilościowego oznaczania (LoQ)-373,58 ng/mL-1

Tabela 1: LoB, LoD i LoQ uzyskane za pomocą ImageJ oraz aplikacji mobilnej dla wzorca kalibracji danych NS1 w surowicy.Skróty: LoB = granica tła; LoD = granica wykrywalności; LoQ = granica oznaczalności.

Nr pacjentaGołym okiemAplikacja smartfonaImageJ
RDTPapierowy test immunoanalizy
1----
2----
3----
4----
5----
6----
7----
8----
9++++
10--++
11----
12++++
13----
14----
15----
16++++
17++++
18----
19----
20----
21++++
22++++
23----
24++++
25----
26----
27----
28----
29----
30--++

Tabela 2: Porównanie wyników odczytu wizualnego i systemu odczytu opartego na smartfonie dla próbek surowicy. (+) i (-) oznaczają odpowiednio pozytywną i negatywną interpretację wyników.

Dyskusja

Jednym z ważnych parametrów konstrukcyjnych systemu czytników opartego na smartfonach jest możliwość zapewnienia powtarzalnego przetwarzania obrazowego próbek. W tym badaniu, dla uproszczenia i wygody, obrazy zostały wykonane z trzech różnych marek smartfonów z aparatami 12-13 MP bez użycia pudełka do obrazowania lub akcesoriów. Zmienne warunki przechwytywania obrazu, takie jak rozdzielczość aparatu, czas robienia obrazu, warunki oświetleniowe i środowisko, mogą wpływać na intensywność kolorów punktów testowych i kontrolnych na urządzeniu. Wpływ różnych czasów przechwytywania obrazu na oświetlenie i suszenie PAD na intensywność sygnału urządzeń został zminimalizowany dzięki zastosowaniu znormalizowanych intensywności sygnału, które pozostały spójne na obrazach zarejestrowanych w różnych momentach36. Odejmowanie sygnału tła pojawiło się jako strategia mająca na celu zwiększenie dokładności pomiarów intensywności kolorów, skutecznie łagodząc wpływ warunków oświetleniowych. Nasze odkrycie jest zgodne z wcześniejszymi badaniami podkreślającymi skuteczność technik odejmowania linii bazowej lub tła w minimalizowaniu skutków środowiskowych39,40.

Trwająca debata na temat wyższości stosowania urządzenia do obrazowania lub metody bez akcesoriów ma implikacje dla przetwarzania obrazu39,41. Skrzynka do obrazowania może zwiększyć niezawodność wyników przetwarzania obrazowania poprzez zminimalizowanie zmian w warunkach obrazowania 41,42,43. W tym badaniu wykorzystaliśmy aplikację mobilną opartą na uczeniu maszynowym w chmurze do przetwarzania obrazu. To podejście wykorzystuje uczenie maszynowe w ramach platformy opartej na chmurze do automatycznego klasyfikowania, wyodrębniania i wzbogacania danych obrazu. Aplikacja skutecznie zidentyfikowała i przetworzyła obszar zainteresowania na obrazach, obejmujący tło, strefy testowe i kontrolne. Ten krok miał kluczowe znaczenie dla rozróżnienia między tymi strefami38. Wcześniejsze badania sugerują, że przetwarzanie obrazów z wykorzystaniem uczenia maszynowego daje lepszą klasyfikację wyników dla próbek kontrolnych i testowych 43,44,45. W tym badaniu zastosowanie stałej lokalizacji i odejmowania tła wygenerowało spójny sygnał tła z celulozy μPADs, zwiększając spójność i dokładność klasyfikacji odczytów dostarczanych przez aplikację mobilną40,43.

Jeśli chodzi o konsekwentne wyniki w demonstrowaniu testu immunologicznego opartego na papierze, metoda wytwarzania odgrywa ważną rolę. W poprzednim badaniu36 zbadano kilka warunków optymalizacji metody projektowania i wytwarzania DEN-NS1-PAD, takich jak stężenia PLL, substancji blokującej i przeciwciała NS1. Urządzenie z powodzeniem przetestowało NS1 w buforze, hodowli komórkowej i surowicy ludzkiej, zarówno pod względem jakościowym, jak i ilościowym.

Efekty matrycowe wynikające ze składników surowicy mogą zakłócać granicę wykrywalności urządzenia podczas badania próbek surowicy. Wyniki wskazują jednak, że opracowany test immunologiczny może z powodzeniem wykrywać stężenia NS1 w próbkach surowicy, uzyskując wyniki porównywalne z komercyjnym RDT (Tabela 2). Zaobserwowano widoczne wyniki za pomocą oględzin i aplikacji mobilnej (ryc. 4), co podkreśliło skuteczność testu w testach surowicy. Chociaż wyższa lepkość surowicy może mieć wpływ na czas analizy, nie utrudnia interpretacji wyników36. Korzystanie z aplikacji mobilnej może zapewnić bardziej pozytywne wyniki testów próbek, ponieważ korzystanie z aplikacji mobilnej znacznie poprawia czułość testowania próbek46. Warto zauważyć, że potrzebne są dalsze porównania z testami molekularnymi, takimi jak RT-PCR 15,47,48 dla dengi NS1, aby określić potencjalne wyniki fałszywie dodatnie lub fałszywie ujemne.

Zauważalne ograniczenie tego badania pojawia się, gdy rozważa się bardziej złożoną matrycę próbki, taką jak krew. Składniki obecne we krwi mogą rzeczywiście zakłócać granicę wykrywalności urządzenia. W takich przypadkach zastosowanie dodatkowych wkładek chłonnych w celu zwiększenia absorpcji bufora biegowego stanowi potencjalne rozwiązanie. Ta modyfikacja może wspomagać krzepnięcie krwi, wykorzystując właściwości hemostylowe celulozy poprzez wpływ na płytki krwi49. Inne podejście polega na nałożeniu 4% (w/v) kropli soli fizjologicznej na podkładkę z próbką w celu poprawy krzepliwości krwi. Wcześniejsze badania wykazały, że sole takie jak chlorek wapnia i chlorek sodu indukują krzepnięcie czerwonych krwinek (RBC)50,51. Na+ może destabilizować zawieszenie erytrocytów we krwi poprzez tłumienie podwójnej warstwy elektrycznej na powierzchni erytrocytów i zmniejszanie odpychania ładunku między krwinkami czerwonymi. Ponadto wysokie stężenie soli indukuje również agregację krwi52. Co więcej, ładunek przeciwjonowo-walencyjny Na+ tłumi grubość naładowanej podwójnej warstwy RBC, prowadząc do agregacji opróżnionych RBC. Dodatek 4% (w/v) roztworu soli fizjologicznej (NaCl) ułatwia separację osocza na bibułie celulozowej51. Konieczna jest jednak staranna optymalizacja stężenia soli fizjologicznej, aby uniknąć wywoływania niepożądanych skutków dla agregacji krwi i agregacji nanocząstek złota53,54.

Komercyjne drukarki woskowe zapewniały idealne połączenie kosztów i prostoty prototypowania. Ponieważ drukarki te zostały wycofane z produkcji w 2016 r., wymagane były alternatywne metody wytwarzania, takie jak druk atramentowy55, sitodruk56 i fotolitografia57. Biurowa drukarka tonera jest dobrym kandydatem do produkcji μPAD. Żywica poliestrowa zawarta w tonerze tworzy hydrofobowe wzory w temperaturze 200 °C przez 60 minut w różnych wzorach58.

W badaniach wykorzystano przeciwciało NS1 serotyp drugi, zgodnie ze specyfikacją firmy. Odkryliśmy jednak, że przeciwciało to oddziałuje również ze wszystkimi serotypami36,37. Czułość wykrywania DENV-4 jest niższa (87,5%) w porównaniu z innymi serotypami. Czułość DENV-1 i DENV-2 wynosi około 88,89%, a dla DENV-3 100%37. Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi badaniami, które również wykazały niższą wrażliwość RDT na DENV-4 w porównaniu z innymi serotypami59. Ogólna czułość urządzenia wynosi ~88,89%, przy swoistości około 86,67%. Warto zauważyć, że rzeczywista czułość DEN-NS1-PAD może przewyższać komercyjną RDT. Jednak RDT wykazuje dodatnią wartość predykcyjną (PPV) na poziomie 84,62% i dokładność na poziomie 87,67%. Warto zauważyć, że DEN-NS1-PAD działał lepiej w wykrywaniu infekcji dengą w ciągu pierwszych 5-6 dni, podczas gdy RDT jest skuteczny tylko w ciągu pierwszych 5 dni37.

Podsumowując, połączenie przenośnego papierowego testu immunologicznego (DEN-NS1-PAD) z aplikacją na smartfony jest bardzo obiecujące w pomiarze dengi NS1. Aplikacja mobilna znacznie zwiększa czułość i skuteczność ilościowego oznaczania NS1 w próbkach surowicy w porównaniu z obserwacją gołym okiem. Korzyści płynące z aplikacji mobilnej obejmują skrócony czas analizy, łatwość obsługi i kompatybilność z różnymi urządzeniami smartfonów, pozycjami i warunkami oświetleniowymi. Potrzebne jest jednak dalsze ulepszenie, aby poprawić czułość i wydajność. Tymczasem modyfikacja papierowego testu immunologicznego jest konieczna, aby poprawić jego wydajność w przypadku próbek krwi. Ponadto wymagana jest kompleksowa ocena DEN-NS1-PAD w celu wykrywania dengi przy użyciu większej liczby serotypów pierwotnego zakażenia i wybranych próbek pobranych od różnych pacjentów (dzieci i dorosłych).

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

M.H.P. z wdzięcznością dziękuje za fundusz badawczy z Universitas Islam Indonesia (UII). Autorzy wyrażają wdzięczność panu Nutchanonowi Ninyawee za jego cenną wiedzę i pomoc w trakcie tworzenia aplikacji mobilnej oraz jego wkład w powstanie manuskryptu. Ponadto autorzy doceniają wsparcie finansowe udzielone przez Tajlandzki Fundusz Badań Naukowych i Innowacji (TSRI), Fundusz Badań Podstawowych: Rok podatkowy 2023 (nr projektu. FRB660073/0164) w ramach Programu Inteligentna Opieka Zdrowotna Uniwersytetu Technologicznego Króla Mongkuta w Thonburi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały
0,1 M sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS, pH 7,2) 
BBS zawierający 0,1% Tween 20, 10% sacharozy i 1% kazeiny   obszar sprzężony traktowany i blokujący bufor
soli fizjologicznej buforowanej boranem (BBS) (25 mM boranu sodu i 150 mM chlorku sodu o pH 8,2) uzupełniony 1% BSA bufor płuczący podczas procesu koniugacji AuNPs z przeciwciałem
Kwas borowyMerck10043-35-3
Surowica bydlęca frakcja albuminy V (BSA)   PAA Lab GmbH (Niemcy)K41-001 
KazeinaMerck9005-46-3
Bibuła chromatograficzna klasy 2 GE Opieka zdrowotna3002-911 
Przezroczysta folia laminowana3M (sklepy papiernicze)
Wodorofosforan disodowyMerck7558-79-4
Podwójna taśma bocznaSklepy papiernicze
Kozie przeciwciało anty-mysie IgG MyBiosource (USA)MBS435013
Nanocząstki złota (40 nm)   Serve Science Co., Ltd. (Tajlandia)
Ludzkie przeciwciało poliklonalne IgG   MerckAG711-M
Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko dendze NS1 MyBiosource (USA)MBS834415
Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko dendze NS1 MyBiosource (USA)MBS834236
Antygeny serotypu 2 NS1MyBiosource (USA)MBS 568697
PBS 1X zawierające 0,1% Tween 20 został użyty jakobufor elucyjny
Plastikowa karta nośna 10x30 cmPacific Biotech Co., Ltd. (Tajlandia)
Poli-L-lizyna (PLL)Sigma AldrichP4832
Chlorek potasuMerck104936
Monofosforan potasuMerck104877
Chlorek soduMerck7647-14-5
Tetraboran sodu Sigma Aldrich1303-96-4
SacharozaMerck57-50-1
Tween 20Sigma Aldrich9005-64-5
Instruments
CytationTM 5 czytnik wielomodowyBioTek
Telefony komórkoweHuawei Y7, iPhone 11, Samsung a20
Skaner fotograficznyEpson Perfection V30
PiekarnikMemmert
Drukarka woskowa Oprogramowanie Xerox ColorQube 8880-PS
Could AutoML Vision Object Detection DocumentationGoogle Cloud
ImageJNational Institute of Health, Bethesda, MD, USA
Oprogramowanie
Inkscape 0.91

Bibliografia

  1. Cattarino, L., Rodriguez-Barraquer, I., Imai, N., Cummings, D. A. T., Ferguson, N. M. Mapping global variation in dengue transmission intensity. Science Translational Medicine. 12 (528), 1-11 (2020).
  2. World Health Organization (WHO). Treatment, prevention and control global strategy for dengue prevention and control. , WHO, Geneva. 1-34 (2012).
  3. WHO Dengue and severe dengue. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue (2020).
  4. Department of Disease Control Ministry of Health Thailand. Weekly Disease Forecast Dengue. , (2020).
  5. Malavige, G. N., Ogg, G. S. Pathogenesis of vascular leak in dengue virus infection. Immunology. 151 (3), 261-269 (2017).
  6. Paranavitane, S. A., et al. Dengue NS1 antigen as a marker of severe clinical disease. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 570(2014).
  7. Muller, D. A., Young, P. R. The flavivirus NS1 protein: Molecular and structural biology, immunology, role in pathogenesis and application as a diagnostic biomarker. Antiviral Research. 98 (2), 192-208 (2013).
  8. Modhiran, N., et al. Dengue virus NS1 protein activates cells via Toll-like receptor 4 and disrupts endothelial cell monolayer integrity. Science Translational Medicine. 7 (304), 304ra102(2015).
  9. Glasner, D. R., et al. Dengue virus NS1 cytokine-independent vascular leak is dependent on endothelial glycocalyx components. PLOS Pathogens. 13 (11), e1006673(2017).
  10. Lin, C. -F., et al. Antibodies from dengue patient sera cross-react with endothelial cells and induce damage. Journal of Medical Virology. 69 (1), 82-90 (2003).
  11. Adikari, T. N., et al. Dengue NS1 antigen contributes to disease severity by inducing interleukin (IL)-10 by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 184 (1), 90-100 (2016).
  12. Malavige, G. N., et al. Suppression of virus specific immune responses by IL-10 in acute dengue infection. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2409(2013).
  13. Malavige, G. N., et al. Serum IL-10 as a marker of severe dengue infection. BMC Infectious Diseases. 13 (1), 341(2013).
  14. Libraty, D. H., et al. High circulating levels of the dengue virus nonstructural protein NS1 early in dengue illness correlate with the development of dengue hemorrhagic fever. The Journal of Infectious Diseases. 186 (8), 1165-1168 (2002).
  15. World Health Organization (WHO) and the Special Programme for Research and Tropical Diseases (TDR). Dengue: guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control -- New edition. , https://www.who.int/publications-detail-redirect/9789241547871 (2009).
  16. Axelrod, T., Eltzov, E., Marks, R. S. Capture-layer lateral flow immunoassay: a new platform validated in the detection and quantification of dengue NS1. ACS Omega. 5 (18), 10433-10440 (2020).
  17. Kim, S. -W., Cho, I. -H., Lim, G. -S., Park, G. -N., Paek, S. -H. Biochemical-immunological hybrid biosensor based on two-dimensional chromatography for on-site sepsis diagnosis. Biosensors and Bioelectronics. 98, 7-14 (2017).
  18. Fu, Q., et al. Development of a novel dual-functional lateral-flow sensor for on-site detection of small molecule analytes. Sensors and Actuators B: Chemical. 203, 683-689 (2014).
  19. Dzantiev, B. B., Byzova, N. A., Urusov, A. E., Zherdev, A. V. Immunochromatographic methods in food analysis. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 55, 81-93 (2014).
  20. Hu, J., et al. Advances in paper-based point-of-care diagnostics. Biosensors and Bioelectronics. 54 (4), 585-597 (2014).
  21. Zhong, Y., et al. Gold nanoparticles based lateral flow immunoassay with largely amplified sensitivity for rapid melamine screening. Microchimica Acta. 183 (6), 1989-1994 (2016).
  22. Figueredo, F., Garcia, P. T., Cortón, E., Coltro, W. K. T. Enhanced analytical performance of paper microfluidic devices by using Fe 3 O 4 nanoparticles, MWCNT, and graphene oxide. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (1), 11-15 (2016).
  23. Bahadır, E. B., Sezgintürk, M. K. Lateral flow assays: Principles, designs and labels. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 82, 286-306 (2016).
  24. He, M., Liu, Z. Paper-based micro fluidic device with upconversion fluorescence assay. Analytical Chemistry. 85, 11691-11694 (2013).
  25. Derikvand, F., Yin, D. L. T., Barrett, R., Brumer, H. Cellulose-based biosensors for esterase detection. Analytical Chemistry. 88 (6), 2989-2993 (2016).
  26. Kumar, S., Bhushan, P., Krishna, V., Bhattacharya, S. Tapered lateral flow immunoassay-based point-of-care diagnostic device for ultrasensitive colorimetric detection of dengue NS1. Biomicrofluidics. 12 (3), 034104(2018).
  27. Sinawang, P. D., Rai, V., Ionescu, R. E., Marks, R. S. Electrochemical lateral flow immunosensor for detection and quantification of dengue NS1 protein. Biosensors and Bioelectronics. 77, 400-408 (2016).
  28. Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosensors and Bioelectronics. 75, 273-284 (2016).
  29. Preechaburana, P., Suska, A., Filippini, D. Biosensing with cell phones. Trends in Biotechnology. 32 (7), 351-355 (2014).
  30. Laksanasopin, T., et al. A smartphone dongle for diagnosis of infectious diseases at the point of care. Science Translational Medicine. 7 (273), 273re1(2015).
  31. Kim, J., et al. Noninvasive alcohol monitoring using a wearable tattoo-based iontophoretic-biosensing system. ACS Sensors. 1 (8), 1011-1019 (2016).
  32. Mudanyali, O., et al. Integrated rapid-diagnostic-test reader platform on a cellphone. Lab on a Chip. 12 (15), 2678(2012).
  33. Yu, L., Shi, Z., Fang, C., Zhang, Y., Liu, Y., Li, C. Disposable lateral flow-through strip for smartphone-camera to quantitatively detect alkaline phosphatase activity in milk. Biosensors and Bioelectronics. 69, 307-315 (2015).
  34. Hou, Y., et al. Smartphone-based dual-modality imaging system for quantitative detection of color or fluorescent lateral flow immunochromatographic strips. Nanoscale Research Letters. 12 (1), 291(2017).
  35. You, D. J., Park, T. S., Yoon, J. -Y. Cell-phone-based measurement of TSH using Mie scatter optimized lateral flow assays. Biosensors and Bioelectronics. 40 (1), 180-185 (2013).
  36. Prabowo, M. H., Chatchen, S., Rijiravanich, P. Dengue NS1 detection in pediatric serum using microfluidic paper-based analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412, 2915-2925 (2020).
  37. Prabowo, M. H., et al. Clinical evaluation of a developed paper-based Dengue NS1 rapid diagnostic test for febrile illness patients. International Journal of Infectious Diseases. 107, 271-277 (2021).
  38. Preparation and detection method for the diagnostic device of dengue NS1 detection in serum, cell medium, and buffer. Thai Patent. , 1901000816 (2019).
  39. Kong, T., et al. Accessory-free quantitative smartphone imaging of colorimetric paper-based assays. Lab on a Chip. 19 (11), 1991-1999 (2019).
  40. Jung, Y., Heo, Y., Lee, J. J., Deering, A., Bae, E. Smartphone-based lateral flow imaging system for detection of food-borne bacteria E. coli O157:H7. Journal of Microbiological Methods. 168, 105800(2020).
  41. Chen, G., et al. Improved analytical performance of smartphone-based colorimetric analysis by using a power-free imaging box. Sensors and Actuators B: Chemical. 281, 253-261 (2019).
  42. Kim, H., et al. Smartphone-based low light detection for bioluminescence application. Scientific Reports. 7 (1), 40203(2017).
  43. Kim, H., Awofeso, O., Choi, S., Jung, Y., Bae, E. Colorimetric analysis of saliva-alcohol test strips by smartphone-based instruments using machine-learning algorithms. Applied Optics. 56 (1), 84(2017).
  44. Qin, Q., et al. Algorithms for immunochromatographic assay: review and impact on future application. The Analyst. 144 (19), 5659-5676 (2019).
  45. Yan, W., et al. Machine learning approach to enhance the performance of MNP-labeled lateral flow immunoassay. Nano-Micro Letters. 11 (1), 7(2019).
  46. Srisa-Art, M., Boehle, K. E., Geiss, B. J., Henry, C. S. Highly sensitive detection of Salmonella typhimurium using a colorimetric paper-based analytical device coupled with immunomagnetic separation. Analytical Chemistry. 90 (1), 1035-1043 (2018).
  47. Santiago, G. A., et al. Performance of the Trioplex real-time RT-PCR assay for detection of Zika, dengue, and chikungunya viruses. Nature Communications. 9 (1), 1391(2018).
  48. Lanciotti, R. S., Calisher, C. H., Gubler, D. J., Chang, G. J., Vorndam, A. V. Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology. 30 (3), 545-551 (1992).
  49. Yang, X., et al. Design and development of polysaccharide hemostatic materials and their hemostatic mechanism. Biomaterials Science. 5 (12), 2357-2368 (2017).
  50. Li, H., Han, D., Pauletti, G. M., Steckl, A. J. Blood coagulation screening using a paper-based microfluidic lateral flow device. Lab Chip. 14 (20), 4035-4041 (2014).
  51. Nilghaz, A., Shen, W. Low-cost blood plasma separation method using salt functionalized paper. RSC Advances. 5 (66), 53172-53179 (2015).
  52. Ataullakhanov, F. I., Pohilko, A. V., Sinauridze, E. I., Volkova, R. I. Calcium threshold in human plasma clotting kinetics. Thrombosis Research. 75 (4), 383-394 (1994).
  53. Pamies, R., et al. Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media. Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), 2376(2014).
  54. Christau, S., Moeller, T., Genzer, J., Koehler, R., Von Klitzing, R. Salt-induced aggregation of negatively charged gold nanoparticles confined in a polymer brush matrix. Macromolecules. 50 (18), 7333-7343 (2017).
  55. Abe, K., Kotera, K., Suzuki, K., Citterio, D. Inkjet-printed paperfluidic immuno-chemical sensing device. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (2), 885-893 (2010).
  56. Sameenoi, Y., Nongkai, P. N., Nouanthavong, S., Henry, C. S., Nacapricha, D. One-step polymer screen-printing for microfluidic paper-based analytical device (µPAD) fabrication. The Analyst. 139 (24), 6580-6588 (2014).
  57. Mora, M. F., et al. Patterning and modeling three-dimensional microfluidic devices fabricated on a single sheet of paper. Analytical Chemistry. 91 (13), 8298-8303 (2019).
  58. Ng, J. S., Hashimoto, M. Fabrication of paper microfluidic devices using a toner laser printer. RSC Advances. 10 (50), 29797-29807 (2020).
  59. Pal, S., et al. Multicountry prospective clinical evaluation of two enzyme-linked immunosorbent assays and two rapid diagnostic tests for diagnosing dengue fever. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1092-1102 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wykrywanie bia ka NS1 wirusa dengidetekcja kolorymetrycznamikrofluidyczne urz dzenie papierowekoniugat nanocz steczek z otaanaliza pr bek krwitest przep ywu bocznegoanaliza obrazu

Powiązane artykuły