Artykuł metodologiczny

Obrazowanie na żywo wapnia zakażonych wirusem monowarstw organoidów jelitowych ludzkich przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66132

⸱

19 stycznia 2024

 ,  ,  , 
1Alkek Center for Metagenomics and Microbiome Research, Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje podejście do wykonywania obrazowania wapnia w zakażonych wirusem ludzkich organoidach jelitowych i oferuje podejście do analizy.

Streszczenie

Sygnalizacja wapniowa jest integralnym regulatorem prawie każdej tkanki. W nabłonku jelitowym wapń bierze udział w regulacji aktywności wydzielniczej, dynamice aktyny, reakcjach zapalnych, proliferacji komórek macierzystych i wielu innych niescharakteryzowanych funkcjach komórkowych. W związku z tym mapowanie dynamiki sygnalizacji wapniowej w nabłonku jelitowym może zapewnić wgląd w homeostatyczne procesy komórkowe i ujawnić unikalne reakcje na różne bodźce. Ludzkie organoidy jelitowe (HIO) są wysokoprzepustowym, pochodzącym od człowieka modelem do badania nabłonka jelitowego, a tym samym stanowią użyteczny system do badania dynamiki wapnia. W tym artykule opisano protokół stabilnej transdukcji HIO z genetycznie kodowanymi wskaźnikami wapnia (GECI), wykonywania mikroskopii fluorescencyjnej na żywo i analizy danych obrazowych w celu sensownego scharakteryzowania sygnałów wapniowych. Jako reprezentatywny przykład, trójwymiarowe HIO zostały transdukowane lentiwirusem w celu stabilnej ekspresji GCaMP6s, cytozolowego GECI opartego na zielonym fluorescencyjnym białku. Zmodyfikowane HIO zostały następnie rozproszone w jednokomórkowej zawiesinie i wysiane jako monowarstwy. Po różnicowaniu monowarstwy HIO zostały zakażone rotawirusem i/lub potraktowane lekami, o których wiadomo, że stymulują odpowiedź wapniową. Mikroskop epifluorescencyjny wyposażony w nawilżoną komorę do obrazowania na żywo o kontrolowanej temperaturze pozwolił na długotrwałe obrazowanie zakażonych lub leczonych lekami monowarstw. Po zobrazowaniu uzyskane obrazy zostały przeanalizowane za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania analitycznego ImageJ. Ogólnie rzecz biorąc, prace te ustanawiają elastyczny potok do charakteryzowania sygnalizacji komórkowej w HIO.

Wprowadzenie

Wapń jest powszechnie konserwowanym drugim przekaźnikiem, który odgrywa kluczową rolę w regulacji fizjologii komórkowej1. Ze względu na silny ładunek, niewielkie rozmiary i wysoką rozpuszczalność w warunkach fizjologicznych, wapń jest idealnym manipulatorem konformacji białek. To sprawia, że wapń jest potężnym środkiem do przekształcania sygnałów elektrochemicznych w zmiany enzymatyczne, transkrypcyjne lub potranskrypcyjne. Ścisłe gradienty stężenia wapnia w siateczce endoplazmatycznej (ER) i błonach plazmatycznych tworzą dużą siłę napędową, która pozwala na szybkie zmiany stężenia wapnia w cytozolu. Wiele mechanizmów, w tym zarówno buforowanie, jak i transport aktywny, ściśle utrzymuje ten gradient. Chociaż jest to konieczne dla normalnych funkcji komórkowych, to utrzymanie jest energetycznie kosztowne, co czyni je szczególnie podatnym w stanach stresu 2.

W związku z tym, rozregulowanie wapnia w cytozolu jest niemal uniwersalnym sygnałem wielu rodzajów stresu komórkowego. Zaburzenia metaboliczne, toksyny, patogeny, uszkodzenia mechaniczne i zaburzenia genetyczne mogą zakłócać sygnalizację wapniową. Niezależnie od bodźca, na poziomie całej komórki, utrzymujący się, niekontrolowany wzrost cytozolowego wapnia może sprzyjać apoptozie i ostatecznie martwicy3,4. Zmiany poziomu wapnia cytozolowego o mniejszej amplitudzie lub wyższej częstotliwości mają jednak różne skutki2. Podobnie, wyniki wahań wapnia mogą się różnić w zależności od mikrodomeny przestrzennej, w której występują5. Monitorowanie poziomu wapnia może zatem zapewnić wgląd w dynamiczne procesy sygnalizacyjne, ale wymaga to pobierania próbek ze stosunkowo wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną.

Genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) są potężnymi narzędziami do ciągłego pobierania próbek w systemach żywych komórek6. Niektóre z najczęściej stosowanych GECI to reagujące na wapń białka fluorescencyjne na bazie GFP, znane jako GCaMPs7. Kanoniczny GCaMP to fuzja trzech odrębnych domen białkowych: kołowo permutowanego GFP (cpGFP), kalmoduliny i M136. Domena kalmoduliny ulega zmianie konformacji po związaniu wapnia, co umożliwia jej interakcję z M13. Interakcja kalmodulina-M13 indukuje zmianę konformacyjną w cpGFP, która zwiększa jego emisję fluorescencyjną po wzbudzeniu. W związku z tym wzrost stężenia wapnia koreluje ze wzrostem intensywności fluorescencji GCaMP. Czujniki te mogą być cytozolowe lub ukierunkowane na określone organelle8.

Podobnie jak w większości tkanek, wapń reguluje różne funkcje w obrębie nabłonka przewodu pokarmowego. Nabłonek jelitowy jest integralną częścią wchłaniania składników odżywczych i płynów, ale musi również tworzyć ścisłą barierę i interfejs immunologiczny, aby uniknąć inwazji patogenów lub toksycznych urazów. Szlaki zależne od wapnia wpływają na prawie wszystkie te funkcje życiowe9,10,11. Jednak sygnalizacja wapniowa w nabłonku jelitowym pozostaje niedostatecznie zbadaną granicą z obiecującym potencjałem jako cel terapeutyczny. Podczas gdy monitorowanie dynamiki wapnia w nabłonku jelitowym in vivo nadal stanowi wyzwanie, ludzkie organoidy jelitowe (HIO) oferują adaptowalny system ex vivo do eksperymentów12. HIO są trójwymiarowymi (3D) sferoidami pochodzącymi z ludzkich jelitowych komórek macierzystych i, po różnicowaniu, podsumowują dużą część różnorodności komórkowej natywnego nabłonka jelitowego12.

Ten protokół opisuje kompleksowe metody inżynierii HIO, które wyrażają GECI, a następnie przygotowują zmodyfikowane HIO jako monowarstwy do obrazowania wapnia w żywych komórkach. Oferuje infekcję wirusową jako przykład patologicznej manipulacji, która zakłóca sygnalizację wapnia i zapewnia analityczne podejście do ilościowego określenia tych zmian.

Protokół

Wszystkie ludzkie organoidy jelitowe (HIOs) wykorzystane w tym protokole oraz w reprezentatywnych eksperymentach pochodziły z ludzkiej tkanki pozyskanej i utrzymywanej przez Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core. Wszystkie próbki zostały pobrane zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Institutional Review Board w Baylor College of Medicine.

1. Przygotowanie materiałów i odczynników

  1. Do utrzymania organoidów przygotować płytki 24-dołkowe traktowane do hodowli komórkowej, macierz błony podstawnej (BMM), probówki stożkowe 15 mL oraz probówki stożkowe 1.5 mL. 
    1. Aby przygotować pełną pożywkę bez czynników wzrostu (CMGF-), do 500 mL Advanced DMEM F12 dodać 5 mL 1M HEPES, 5 mL 100x antybiotyku-antymykotyku oraz 5 mL 100x suplementu glutaminy.
    2. Aby przygotować pożywkę zawierającą Wnt, R-spondynę i Noggin (WRNE), zmieszać równe części CMGF- i pożywki warunkowanej Wnt, dodać pożywkę warunkowaną Noggin (10% objętościowo), pożywkę warunkowaną R-spondyną (20% objętościowo), 50 ng/mL ludzkiego czynnika wzrostu naskórka, 10 mM nikotynamidu, 10 nM [Leu15]-Gastrin I, 500 nM A-83-01, 10 µM SB202190, 1x suplement B27, 1x suplement N2 oraz 1 mM N-acetylocysteiny.
  2. Do transdukcji lentiwirusowej przygotować płodową surowicę bydlęcą (FBS), 0.05% trypsynę-EDTA w 1x solance fosforanowej (PBS), CMGF- z 10% FBS, sterylny 1x PBS, poliubren, 10 µM Y-27632, lentiwirusa oraz High Wnt WRNE + 10 µM Y-27632.
  3. Do generowania monowarstw organoidów przygotować szkiełka do hodowli komórkowej z dnem szklanym 10-dołkowe, FBS, kolagen IV (1 mg/mL w wodzie dejonizowanej (di)H2O), macierz błony podstawnej, 0.5 mM EDTA w 1x PBS, 5 mM EDTA w 1x PBS, bufor do dysocjacji enzymatycznej, CMGF- z 10% FBS oraz WRNE + 10 µM Y-27632.
  4. Do infekcji wirusowej monowarstw organoidów przygotować trypsynę, zapas rotawirusa, CMGF-, igłę 25G, sterylny 1x PBS oraz pożywkę różnicującą bez czerwieni fenolowej.
    1. Aby przygotować pożywkę różnicującą bez czerwieni fenolowej, odmierzyć 500 mL pożywki do hodowli komórkowej bez czerwieni fenolowej, dodać 5 mL 100x nieessentialnych aminokwasów MEM, 5 mL 100x L-glutaminy, 5 mL 100 nM pirogronianu sodu oraz 7.5 mL 1M HEPES.
  5. Do barwienia immunofluorescencyjnego organoidów przygotować 4% formaldehyd (16% formaldehyd rozcieńczony w 1x PBS), Triton X-100 (0.1% Triton X-100 w 1x PBS), albuminę surowiczą bydlęcą (3% albuminy surowiczej bydlęcej w 1x PBS), roztwór NH4Cl (50 mM) oraz DAPI (roztwór 1 µg/mL DAPI w 1x PBS).

2. Modyfikacja organoidów w celu ekspresji genetycznie kodowanych czujników wapnia

UWAGA: Niniejszy protokół opisuje kolejne kroki transdukcji pojedynczej studni z trójwymiarowymi ludzkimi organoidami jelitowymi, wysianymi w 30 μL Basement Membrane Matrix (BMM) na płytce 24-dołkowej13. Większość linii zawiera około 400 000 komórek na studnię. W celu kontroli należy uwzględnić drugą, nietransdukowaną studnię. Wszystkie odczynniki i zawiesiny komórkowe należy przechowywać w lodzie.

  1. Po 2-5 dniach od ostatniego pasażowania usuń z dwóch dołków z HIO podłoże do utrzymania WRNE. Zastąp je 300 μL 0,05% Trypsyny-EDTA na dołek i delikatnie pipetuj w górę i w dół 5 razy, aby odspoić BMM od płytki. Umieść w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 4 min.
  2. Dodaj 500 μL CMGF- + 10% FBS na dołek. Powlekaj końcówkę pipety o objętości 1 mL typu low-bind za pomocą FBS, pipetując 1 mL FBS w górę i w dół 2 razy. FBS można wykorzystać ponownie do wielu końcówek. Za pomocą powlekanej końcówki pipetuj HIO w górę i w dół 10 razy.
  3. Przenieś zawartość każdego dołka do osobnej, powlekanej probówki do mikrocentryfugi o objętości 1,5 mL. Przepłucz każdy dołek dodatkowymi 500 μL CMGF- i dodaj płuczkę do odpowiedniej probówki.
  4. Wiruj probówki przy 100 x g w wirówce z koszykiem z wahadłowymi uchwytami przez 5 min w temperaturze 4 °C. Usuń supernatant i wszelkie pozostałości BMM.
  5. Resuspenduj w 1 mL 1x PBS. Podziel zawartość każdej probówki do dwóch probówek do mikrocentryfugi, aby uzyskać łącznie 4 probówki. Wiruj probówki przy 100 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Usuń supernatant.
  6. Resuspenduj każdą probówkę raz jeszcze w 1x PBS i wiruj przy 100 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
  7. Przygotuj 400 µL podłoża do transdukcji oraz podłoża kontrolnego (Tabela 1). Resuspenduj 2 probówki w 200 µL podłoża kontrolnego, a 2 probówki w 200 µL podłoża do transdukcji.
  8. Inkubuj w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C przez 24 h. Resuspenduj, pipetując w górę i w dół powlekaną końcówką okresowo (np. 2 h po transdukcji (hpt), 12 hpt, 18 hpt), aby zapewnić jednorodną transdukcję.
  9. Po 24 h wiruj probówki przy 100 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Usuń supernatant.
  10. Resuspenduj osad w 500 µL 1x PBS w celu przemycia. Wiruj przy 100 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Usuń supernatant.
  11. Używając schłodzonej do temperatury lodowej końcówki pipety o objętości 200 µL, resuspenduj każdy z 4 osadów w 30 µL BMM. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby równomiernie rozprowadzić materiał.
  12. Przenieś zawartość każdej probówki do osobnego dołka na płytce 24-dołkowej. Inkubuj przez 10 min w 37 °C, aby umożliwić zestalenie BMM przed dodaniem 500 μL HighWnt WRNE + 10 μM Y-27632.
  13. Pozostaw transdukowane HIO do wzrostu na 1 tydzień, odświeżając podłoże (HighWnt WRNE + 10 μM Y-27632) co drugi dzień. Po tygodniu sprawdź ekspresję wskaźnika fluorescencyjnego za pomocą mikroskopii. Jeśli sygnał jest silny, rozpocznij selekcję lekową. Jeśli sygnał jest słaby, powtórz transdukcję zgodnie z powyższym opisem.
  14. Po ustanowieniu linii zweryfikuj działanie wskaźnika fluorescencyjnego poprzez traktowanie agonistą. 100 nM ADP jest niezawodnym agonistą do walidacji GCaMP. Przetestuj organoidy 3D w celu wstępnej walidacji zgodnie z opisem poniżej.
    1. Po pasażowaniu wysiej jeden (lub kilka) dołków organoidów w BMM na osobnej płytce z dnem do obrazowania. Wysiej organoidy przy około 1/3 normalnej gęstości, aby uniknąć nadmiernego nakładania się podczas obrazowania. Nie kontynuuj pasażowania tych HIO po traktowaniu agonistą, ponieważ trudno jest zapewnić sterylność.
    2. Pozostaw HIO na 2-3 dni w celu regeneracji po pasażowaniu. Przed obrazowaniem zmień podłoże na podłoże różnicujące bez czerwieni fenolowej.
    3. Używając mikroskopu fluorescencyjnego, ustaw pomiar trwający 3 min z akwizycją obrazów co 5 s przy wzbudzeniu 488 nm i zestawie filtrów FITC/GFP. Po 30 s obrazowania dodaj 100 nM ADP lub kontrolę nośnikiem. Kontynuuj obrazowanie, aż sygnał powróci do poziomu bliskiego bazowemu, ok. 2 min. Przejściowy, ok. 2-krotny wzrost fluorescencji GCaMP po traktowaniu ADP wskazuje na udaną transdukcję i prawidłowe działanie biosensora. Aby uzyskać dokładniejszą ocenę wydajności transdukcji, powtórz test z agonistą, obrazując monowarstwy wytworzone zgodnie z procesem opisanym w części 3.

3. Przygotowanie monowarstw HIO do obrazowania fluorescencyjnego na żywo

  1. Pokryj wszystkie studzienki 10-dołkowego szkiełka z komorą do obrazowania kolagenem IV (Collagen IV). W tym celu wymieszaj 34 μL kolagenu IV o stężeniu 1 mg/mL z 960 μL sterylnej wody dejonizowanej. Do każdej studzienki dodaj 95 μL rozcieńczonego roztworu kolagenu IV i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 0,5-2 h.
  2. Usuń pożywkę utrzymującą WRNE z 4 studzienek z 3D HIOs. HIOs powinny być w 5-7 dniu od ostatniego pasażu.
    UWAGA: 1 płytka 10-dołkowa wymaga zazwyczaj ~1,25 x 106 komórek. Zazwyczaj wymaga to 2-4 studzienek z 3D HIOs wysianych w 30 μL BMM każda, ale wartość ta może się różnić w zależności od gęstości.
  3. Do każdej studzienki dodaj 500 μL 1x PBS + 0,5 mM EDTA. Za pomocą uprzednio pokrytego końcówki 1 mL, delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby odseparować BMM od płytki. Przenieś zawiesinę do uprzednio pokrytej probówki stożkowej 15 mL, łącząc zawartość analogicznych studzienek w jednej probówce.
  4. Przepłucz każdą studzienkę dodatkowymi 500 μL PBS + 0,5 mM EDTA. Wiruj przy 300 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Usuń nadsącz i pozostałości BMM.
  5. Za pomocą uprzednio pokrytej końcówki resuspenduj pozostały osad w 3 mL PBS + 5 mM EDTA (uwaga: jest to 10-krotnie większe stężenie EDTA niż podczas pierwszego płukania).
  6. Wiruj przy 300 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Usuń nadsącz i pozostałości BMM. Resuspenduj osad w 2 mL buforu do dysocjacji enzymatycznej.
  7. Inkubuj w łaźni wodnej/koralikowej w temperaturze 37 °C przez 5 min. Dodaj 3 mL CMGF- + 10% FBS i delikatnie pipetuj w celu wymieszania.
  8. Wiruj przy 300 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Usuń nadsącz. Dodaj 1 mL CMGF-.
  9. Intensywnie pipetuj w górę i w dół uprzednio pokrytą końcówką 80-100 razy, aby mechanicznie rozbić HIOs na pojedyncze komórki. Wiruj przy 300 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Usuń nadsącz.
  10. Resuspenduj w 1 mL WRNE + 10 µM Y-27632. Wykonaj pomiar liczby komórek w 1 mL zawiesiny.
  11. Rozcieńcz zawiesinę komórkową za pomocą WRNE + 10µM Y-27632, aby uzyskać stężenie 1,25 x 105 komórek/100 μL (1,25 x 106 komórek/mL).
  12. Za pomocą pipety 200 μL usuń roztwór kolagenu z płytki przygotowanej w kroku 1, ponieważ kolagen osiadł już na dnie studzienki. Unikaj dotykania dna studzienki końcówką pipety.
  13. Za pomocą uprzednio pokrytej końcówki pipety 200 μL dodaj 100 μL roztworu komórek z kroku 3.11 (1,25 x 105 komórek) do każdej studzienki.
  14. Inkubuj przez 24 h w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C. Po 24 h usuń pożywkę hodowlaną ze wszystkich studzienek i zastąp ją 100 μL pożywki różnicującej na każdą studzienkę.
    UWAGA: Na tym etapie komórki powinny przylegać do płytki. Należy zauważyć, że monowarstwa prawdopodobnie nie będzie konfluentna ani w pełni płaska.
  15. Umieść szkiełko z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C. Wymieniaj pożywkę różnicującą co 24 h, aż monowarstwa stanie się konfluentna. Zazwyczaj trwa to 3-5 dni od wysiania. Po tym czasie monowarstwy są gotowe do dalszych zastosowań.

4. Infekcja wirusowa monowarstw HIO

  1. Przygotować inokulum wirusa. Jeśli jest to konieczne, aktywować zapas wirusa trypsyną. W przypadku rotawirusa dodać 10 µg/mL Worthington's Trypsin do zapasów wirusa i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 h.
    1. Rozcieńczyć aktywowany zapas wirusa, stosując jedną z dwóch poniższych metod.
      1. W przypadku dążenia do uzyskania maksymalnej liczby zainfekowanych komórek przy użyciu tylko jednego szczepu wirusa, zmieszać 50 μL aktywowanego zapasu wirusa z 50 μL CMGF-.
      2. W przypadku porównywania wielu szczepów, przygotować inokula w celu uzyskania równoważnych wielokrotności infekcji (MOI). Użyć następującego wzoru, aby określić objętość zapasu wirusa na dołek niezbędną do uzyskania pożądanego MOI. Dodać CMGF- do obliczonej objętości zapasu wirusa, aby uzyskać końcową objętość 100 μL na dołek.
        Wzór na obliczenie miana wirusa, zastosowanie MOI, eksperyment wirusologiczny, schemat równania.
        UWAGA: Pojedyncza monowarstwa HIO wysiana w dołku o średnicy 5,46 mm (płytka 96-dołkowa) zawiera około 200 000 komórek. Ze względu na niską wydajność infekcji w monowarstwach preferowane jest wysokie MOI (od 100 do 1 miliona cząstek wirusa na komórkę). Optymalne MOI należy określić empirycznie.
    2. Zainfekować monowarstwy, delikatnie usuwając pożywkę z monowarstwy HIO za pomocą pipety 200 mL. Zastąpić ją 100 mL inokulum wirusa lub inokulum kontrolnego (mock).
      1. Ponieważ większość zapasów rotawirusa jest namnażana w komórkach MA104, do inokulum kontrolnego należy użyć lizatu niezinfekowanych komórek MA104. Użyć objętości odpowiadającej objętości zapasu wirusa użytej dla dołków zainfekowanych i dodać CMGF- do końcowej objętości 100 mL na dołek.
      2. W przypadku wirusów, które infekują komórki bazolateralnie, takich jak rotawirus14, użyć igły 25G do nacięcia monowarstwy. Najłatwiej jest wykonać pojedyncze nacięcie wzdłuż monowarstwy, od dołu do góry dołka. Delikatnie wcisnąć igłę w monowarstwę pod kątem, ściętą stroną do góry, przeciwnie do kierunku ruchu, i przeciągnąć ją wzdłuż monowarstwy, aby utworzyć bliznę (Rycina 2A).
    3. Inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 2 h. Usunąć inokulum wirusa oraz kontrolne. Przemyć monowarstwy raz 1x PBS.
    4. Dodać 100 μL pożywki różnicującej bez czerwieni fenolowej. Umieścić preparat w inkubatorze w temperaturze 37 °C do czasu rozpoczęcia obrazowania. Optymalne okno obrazowania będzie różnić się w zależności od kinetyki infekcji wirusowej. W przypadku rotawirusa rozpocząć obrazowanie 6-8 h po infekcji.

5. Obrazowanie Ca2+ w zakażonych monowarstwach

  1. Podgrzej inkubator stołowy do 37 °CPrzeprowadź przepływ nawilżonego CO22 przy przepływie 0,02 L/min. Umieścić preparat z zainfekowanymi monowarstwami w komorze inkubatora i szczelnie zamknąć pokrywę.
  2. Przy użyciu oświetlenia w polu jasnym (BF) i obiektywu 20x należy wybrać współrzędne X i Y pól widzenia w obrębie monowarstwy, które zostaną zobrazowane. Zaleca się wybór punktów, w których widoczny jest obszar nacięcia, ponieważ większość zainfekowanych komórek będzie znajdować się w pobliżu rysy.
  3. Zoptymalizuj parametry obrazowania i wykonaj obraz przy użyciu wzbudzenia 488 nm. Aby zminimalizować fototoksyczność, ustaw moc źródła światła na 50% przy czasie ekspozycji 50 ms. Odpowiednie parametry akwizycji mogą się różnić i powinny zostać zoptymalizowane poprzez wykonanie kilku serii pomiarów. Upewnij się, że żadne piksele nie są nasycone. W razie potrzeby dostosuj czas ekspozycji oraz moc światła, aby zapewnić możliwość wykrycia całego zakresu dynamicznego fluorescencyjnego czujnika wapnia.
  4. W przypadku stosowania innych fluoroforów (np. wirusów znakowanych fluorescencyjnie), należy powtórzyć optymalizację dla tych kanałów. Skonfiguruj pętlę obrazowania i wykonaj obraz w kanale 488 nm dla każdej wybranej współrzędnej X, Y w pętli trwającej 1 min. Obrazuj tę pętlę w sposób ciągły. Podczas stosowania wirusa znakowanego fluorescencyjnie, wykonuj obraz w odpowiednim kanale co 10th pętla (tj. 1 obraz/10 min).
  5. Nabywaj obrazy przez ok. 18 h. W przypadku stosowania wirusów bez znaczników fluorescencyjnych, utrwal monowarstwy i przeprowadź barwienie immunofluorescencyjne w celu zidentyfikowania zakażonych komórek. Czynność tę wykonaj po zakończeniu serii obrazowania, zgodnie z poniższym opisem.
    1. Usunąć medium obrazujące i zastąpić je 100 μL 4% formaldehydu w 1x PBS. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min.
    2. Usunąć utrwalacz i zneutralizować za pomocą 100 μL 50 mM NH4+4Cl przez 10 min. Usunąć NH4Permeabilizować monowarstwy za pomocą 100 μL 0,1% Triton X-100 w 1x PBS przez 1 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w temp. 4 °C.
    3. Usunąć bufor permeabilizujący. Zablokować za pomocą 100 μL 3% albuminy surowicy bydlęcej w 1x PBS przez 1 h.
    4. Usunąć roztwór blokujący. Dodać przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone do zalecanego/zoptymalizowanego stężenia w 1x PBS. Dodać 100 μL roztworu przeciwciał na dołek.
    5. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C przy delikatnym kołysaniu. Usunąć przeciwciała pierwotne. Przemyć 3 razy 1x PBS.
    6. Dodaj przeciwciała wtórne sprzężone z fluorochromem, rozcieńczone do zalecanego lub zoptymalizowanego stężenia w 1x PBS. Dodaj 100 μL na dołek. Inkubować przez 2 h w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: FPBase15 stanowi doskonałe źródło informacji pomagające w wyborze przeciwciał wtórnych, które zapobiegną przenikaniu sygnału (bleed-through) podczas multipleksowania. Większość przeciwciał wtórnych jest skuteczna przy rozcieńczeniu 1:1000 w 1x PBS.
    7. Usunąć przeciwciała wtórne. Przygotować 1 µg/mL roztwór DAPI w 1x PBS i dodać 100 μL na dołek. Inkubować przez 20 min. Usunąć DAPI. Przemyć 3 razy 1x PBS.
    8. Przechowywać utrwalone monowarstwy w 100 μL w 1x PBS do obrazowania. Umieść preparat ponownie na stoliku mikroskopu, wczytaj ponownie współrzędne X i Y z serii obrazowania na żywo i wykonaj zdjęcia każdego z punktów w kanale odpowiadającym przeciwciału wtórnemu użytemu do barwienia. Odnieś się do obrazów z serii obrazowania na żywo, aby upewnić się, że uchwycono te same punkty.

6. Ilościowe określenie międzykomórkowych fal wapniowych

  1. Upewnij się, że zainstalowano program Fiji (Just ImageJ), wyposażony w następujące wtyczki: Bio-Formats (powinien być fabrycznie zainstalowany w FIJI, ale nie ma go w ImageJ) oraz Cookbook; aby zainstalować tę ostatnią, z menu FIJI wybierz Help > Updates > Manage update sites, zaznacz Cookbook, a następnie uruchom ponownie FIJI.
  2. Podziel plik danych z sesji obrazowania na żywo na wiele plików, rozdzielając każdą współrzędną X, Y. W programie Nikon NES Elements wybierz File > Import/Export > Split Multipoints. Wybierz folder eksportu oraz odpowiedni prefiks.
  3. Uruchom FIJI. Wczytaj pojedynczy plik z podzielonych punktów wielokrotnych (multipoints). W przypadku obrazów wielokanałowych rozdziel kanały. Wybierz okno z obrazami z kanału 488 nm (GCaMP).
  4. Uruchom funkcję DeltaF Up, aby określić zmianę wartości każdego piksela między kolejnymi punktami czasowymi. W tym celu wybierz Cookbook > T-functions > Delta F Up.
  5. Przewijaj stos obrazów, aż znajdziesz obraz z falą wapniową. Gdy fala wapniowa będzie widoczna, ustaw próg, klikając Image > Adjust > Threshold. Dostosuj dolną granicę tak, aby zminimalizować ilość sygnału niebędącego częścią fali, który przekracza próg. Dla obrazów 16-bitowych pozyskanych przy użyciu parametrów opisanych powyżej, zacznij od dolnego progu 600 i dostosuj go w razie potrzeby.
  6. Uruchom analizator cząstek w celu segmentacji fal, klikając Analyze > Analyze Particles. Ustaw minimalny rozmiar fali w µm2, regulując zakres. Domyślnie jest on ustawiony na 0-nieskończoność. Dla obrazów komórek MA104 pozyskanych za pomocą obiektywu 20x, zacznij od zwiększenia dolnej granicy do 10 000 µm2 i dostosuj ją w zależności od potrzeb.
  7. Zaznacz pola Display results oraz Clear results. Z menu rozwijanego „Show” wybierz Outlines, a następnie kliknij OK. Powinno to przynieść dwa wyniki: okno „Results” z listą każdej wykrytej fali, jej powierzchnią oraz wartościami intensywności średniej, minimalnej i maksymalnej (na podstawie delta F) oraz okno zatytułowane „Drawing of [nazwa pliku]”, zawierające nowy stos z konturami zsegmentowanych fal. Użyj go do weryfikacji wykrywania fal. W razie potrzeby dostosuj wartości progu i zakres rozmiaru, a następnie ponownie sprawdź identyfikację fal.
  8. Do przetwarzania wsadowego wykorzystaj dołączony skrypt makra (Supplementary Coding File 1). Aby go użyć, postępuj zgodnie z poniższymi krokami:
    1. Podziel punkty wielokrotne na pojedyncze pliki zgodnie z opisem w kroku 6.2. Uruchom FIJI. Wybierz Process > Batch > Macro. W polu „input” podaj ścieżkę do folderu zawierającego podzielone pliki multipoint. Pozostaw pole „output” puste.
    2. Wklej skrypt z Supplementary Coding File 1 do pola tekstowego. Dostosuj próg intensywności i próg rozmiaru w skrypcie, aby odzwierciedlały zoptymalizowane parametry z kroków 6.5 i 6.6.
    3. Kliknij Process. W zależności od liczby punktów wielokrotnych i szybkości procesora komputera, przetworzenie wszystkich obrazów może zająć 30 min lub więcej. Po zakończeniu dane zostaną zapisane w nowym pliku arkusza o nazwie „Rename me after writing” na Pulpicie. Plik wyjściowy powinien zawierać dla każdego punktu wielokrotnego liczbę fal oraz metryki fal (powierzchnię, średnią intensywność, intensywność minimalną i maksymalną oraz gęstość intensywności).

Wyniki

Rysunek 1A przedstawia kopułę BMM zawierającą trójwymiarowe ludzkie organoidy jelita, które zostały przetransdukowane w celu stabilnej ekspresji GCaMP6s. Rysunek 1B przedstawia tę samą linię organoidów wysianą jako monowarstwa w 24, 48 i 72 h po wysianiu. Aby zweryfikować funkcję GCaMP6s, monowarstwę obrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej co 2 s przez 4 min, a po około 20 s do medium dodano 100 nM ADP. ADP wywołuje uwalnianie wapnia z retikulum endoplazmatycznego, zwiększając stężenie wapnia w cytozolu. Intensywność fluorescencji wykryta w kanale 488 nm przy każdej ekspozycji została przedstawiona na Rysunku 1C. Krzywa wykazuje stabilną podstawową intensywność fluorescencji, po której następuje gwałtowny wzrost po dodaniu ADP, a następnie stopniowy powrót do poziomu bazowego. Uwzględniono kontrolę z nośnikiem, aby potwierdzić, że odpowiedź jest rzeczywistym zdarzeniem sygnałowym, a nie jedynie zmianą intensywności fluorescencji, która mogłaby wynikać z dodania medium.

Nacinanie monowarstwy HIO zwiększa wydajność infekcji rotawirusem. Chociaż techniki nacinania są zróżnicowane, najłatwiej jest uzyskać spójną infekcję, wykonując pojedyncze nacięcie wzdłuż długości monowarstwy, jak pokazano na Rysunku 2A. Przy użyciu rekombinowanych szczepów rotawirusa wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych, infekcję można zweryfikować podczas obrazowania na żywo (Rysunek 2B). W przypadku stosowania szczepu, który nie wykazuje ekspresji markera, infekcję można wykryć za pomocą immunofluorescencji po obrazowaniu. Ze względu na ruchliwość komórek w monowarstwach HIO często trudno jest śledzić pojedynczą zainfekowaną komórkę w czasie. Zamiast tego należy zastosować barwienie końcowe jako metodę weryfikacji infekcji i potwierdzenia, że wielokrotność infekcji jest jednakowa w różnych polach widzenia (Rysunek 2C).

Międzykomórkowe fale wapnia w HIO można obserwować jakościowo, jak przedstawiono na Ryc. 3A. Jednak określenie częstotliwości fal wapnia w danym polu widzenia wymaga analizy ilościowej. Etapy prawidłowej segmentacji, opisane w kroku 6 powyższego protokołu, zilustrowano na Ryc. 3A. Rysunek przedstawia obraz surowy (Ryc. 3Ai), obraz po odjęciu intensywności pikseli z poprzedniej klatki (Ryc. 3Aii), a następnie zsegmentowaną falę wapnia (Ryc. 3Aiii).

Po segmentacji i ilościowym określeniu fal wapniowych dla każdego pola widzenia w trakcie całego procesu obrazowania, często pomocne jest porównanie częstotliwości fal w monowarstwach poddanych różnym warunkom. Wykres słupkowy na Rysunku 3B przedstawia całkowitą liczbę fal wapniowych na pole widzenia w monowarstwach kontrolnych (mock) oraz zaszczepionych rotawirusami. Ten przykład obejmuje dwa szczepy RV: szczep ludzkiego rotawirusa (Ito HRV) oraz rekombinowany szczep małpiego rotawirusa SA11 wykazujący ekspresję mRuby (SA11-mRuby). Kontrolę mock przyjmuje się jako bazową częstotliwość fal wapniowych, nieleczone monowarstwy zainfekowane rotawirusami służą jako kontrole pozytywne, natomiast zainfekowane rotawirusami i leczone monowarstwy stanowią warunki eksperymentalne. Monowarstwy kontrolne oraz zainfekowane RV, leczone lekami, w tym inhibitorem receptora ADP – BPTU, mogą następnie zostać porównane z obiema grupami kontrolnymi za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (one-way ANOVA). Dane sugerują, że BPTU skutecznie zmniejsza częstotliwość międzykomórkowych fal wapniowych.

Mikroskopia fluorescencyjna, porównanie sferoidów komórkowych, wykres fluorescencji GCaMP6s, analiza odpowiedzi na ADP.
Rycina 1: Walidacja ekspresji GCaMP6s w ludzkich organoidach jelita cienkiego (HIO) pochodzących z jelita czczego. (A) Po transdukcji lentiwirusowej HIO wykazujące ekspresję GCaMP poddano selekcji i wielokrotnym pasażom; przedstawiono je tutaj w 7. dniu od ostatniego pasażu. Po stymulacji laserem 488 nm ekspresja GCaMP6s jest widoczna w transdukowanych HIO wysianych w 15 μL matrycy błony podstawnej jako sferoidy trójwymiarowe (Ai). Obrazy z czasem ekspozycji 50 ms uzyskano przy 50% mocy lasera za pomocą obiektywu 20x, a następnie zszyto je w celu wizualizacji całej kopuły matrycy błony podstawnej. Analogiczny proces przeprowadzono, stosując 4 ms ekspozycji w jasnym polu (Aii). Na obrazie w jasnym polu ciemne HIO w centrum kopuły są wskazaniem, że kultury są gotowe do pasażowania. (B) HIO poddano trawieniu enzymatycznemu do zawiesiny pojedynczych komórek, a następnie wysiano ponownie z gęstością 150 000 komórek na studzienkę (o średnicy 5 mm) płytki do obrazowania z odpowiednim dnem, uprzednio pokrytego kolagenem IV. Po 72 h od wysiania monowarstwa była złączona i gotowa do dalszych zastosowań. Aby zwalidować funkcję GCaMP, obrazy pozyskano przy użyciu zestawu filtrów 488 nm z czasem ekspozycji 50 ms i 50% mocy lasera co 2 s przez 4 min. (C) Przedstawione tutaj ślady reprezentują intensywność fluorescencji całego pola znormalizowaną do pierwszej akwizycji w czasie trwania obrazowania. Około 20 s (strzałka), po dziesiątej ekspozycji, dodano 100 nM difosforanu adenozyny (ADP), aby wywołać skok poziomu wapnia cytozolowego (czerwony). Dodanie równiej objętości 1x PBS nie wywołało istotnej odpowiedzi (niebieski). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat równowagi statycznej z igłą; mikroskopia fluorescencyjna; obrazowanie i analiza komórkowa.
Rysunek 2: Nacinanie monowarstwy HIO w celu ułatwienia infekcji RV. (A) Rysunek przedstawia odpowiednią technikę nacinania monowarstwy przy użyciu igły 25G. (B) Monowarstwa HIO została zainfekowana rekombinowanym szczepem RV wykazującym ekspresję białka fluorescencyjnego mRuby (magenta, strzałka), co umożliwia identyfikację zainfekowanych komórek. Alternatywnie, w przypadku użycia naturalnie występującego szczepu RV, komórki zainfekowane można zidentyfikować za pomocą immunofluorescencji. (C) Przedstawione obrazy pochodzą z 4 różnych monowarstw HIO po fiksacji, barwieniu DAPI (niebieski) i znakowaniu przeciwciałami antygenu rotawirusa (magenta). Obie techniki ilustrują preferencyjną infekcję RV w pobliżu naciętej części monowarstwy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia fluorescencyjna i wykres słupkowy; analiza fal Ca²⁺ w badaniu HRV/BPTU; porównanie statystyczne.
Rycina 3: Segmentacja i kwantyfikacja indukowanych przez RV międzykomórkowych fal wapnia. Ekspozycje przy 488 nm zakażonych RV HIO wykazujących ekspresję GCaMP6s były rejestrowane co 1 min przez 16 h zgodnie z protokołem. (A) Rycina ilustruje proces segmentacji międzykomórkowych fal wapnia. Najpierw wartości pikseli z poprzedniego pomiaru (t-1) są odejmowane od każdego surowego obrazu (Ai), aby określić zmianę natężenia fluorescencji (Aii). Następnie stosowany jest próg oparty na eksperymentalnie zoptymalizowanym minimalnym wzroście natężenia w stosunku do poprzedniej klatki. Obrazy są następnie filtrowane pod kątem minimalnego ciągłego obszaru sygnału, aby wyselekcjonować międzykomórkowe fale wapnia (Aiii) i wykluczyć sygnały wapniowe pojedynczych komórek. Przetwarzanie to umożliwia kwantyfikację fal wapnia w każdym polu widzenia. W tym eksperymencie monowarstwy były albo zakażone pozornie, albo zakażone szczepem ITO ludzkiego rotawirusa (HRV), albo zakażone rekombinowanym szczepem rotawirusa małpiego kodującym mRuby w segmencie genu 7, w regionie downstream od białka niestrukturalnego 3 (SA11-mRuby). Zakażone monowarstwy były leczone inhibitorem receptorów ADP BPTU lub pozostawione bez leczenia. Następnie wykonano obrazowanie monowarstw w 8 różnych pozycjach, a fale wapnia w każdym polu widzenia skwantyfikowano przy użyciu procedury opisanej w tym protokole. Punkty na wykresie liniowym wskazują liczbę fal wapnia wykrytych w każdej pozycji, nałożone na wykres słupkowy oznaczający średnią i SD. Jednoczynnikowa analiza ANOVA, a następnie testy Dunnetta, wykazują, że choć oba szczepy RV zwiększają częstotliwość międzykomórkowych fal wapnia powyżej poziomu grupy niezakażonej, leczenie BPTU zapobiega indukowanemu przez RV wzrostowi częstotliwości fal wapnia. **p<0.01, ***p<0.001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

OdczynnikTransdukcjaKontrola
Y-27632 (stężenie zapasu 1 mM) 4 μL4 μL
Polybrene (1 mg/μL roztwór zapasowy)2 μL2 μL
Lentiwiruszmienna
HighWnt-WRNE *patrz uwagiProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 400 μLProszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. 400 μL

Tabela 1: Pożywka do transdukcji lentiwirusowej. Przygotować pożywki do transdukcji oraz pożywki kontrolne, łącząc odczynniki w objętościach wskazanych odpowiednio w drugiej i trzeciej kolumnie. Dążyć do uzyskania wielokrotności infekcji (MOI) na poziomie 10 jednostek transdukcyjnych lentiwirusa na komórkę. W przypadku LV pakowanych wewnętrznie zazwyczaj wymaga to ~25-50 μL skoncentrowanego LV. Miano większości komercyjnie pakowanych LV zostanie podane w Certyfikacie Analizy.

Uzupełniający plik z kodem 1: Skrypt makra ImageJ umożliwiający ilościowe określanie fal wapniowych poprzez przetwarzanie wsadowe. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Zmiany poziomu cytozolowego Ca2+ mogą być zarówno przyczyną, jak i skutkiem patologii w obrębie nabłonka 10,16,17. Wzrost cytozolowego wapnia może bezpośrednio napędzać wydzielanie poprzez aktywację zależnego od wapnia kanału chlorkowego TMEM16A 18,19. Aktywacja TMEM16A w odpowiedzi na Ca2+ pozwala na wierzchołkowy wypływ chlorku, ustanawiając gradient osmotyczny, który sprzyja wydzielaniu płynów20,21. Co więcej, wzrost Ca2 + w komórkach enteroendokrynnych wyzwala uwalnianie serotoniny, która stymuluje doprowadzające neurony czuciowe, które mogą modulować aktywność w jelitowym układzie nerwowym22. Sygnały Ca2 + mogą również modulować ścisłe połączenia, aby wpływać na funkcję bariery23,24 i regulować proliferację w jelitowych komórkach macierzystych25. Tak więc rozregulowanieCa2+ może mieć szerokie i dalekosiężne skutki.

Wiele wirusów manipuluje cytozolowym Ca2+, aby stworzyć środowisko komórkowe sprzyjające replikacji26. Rotawirus jest tego doskonałym przykładem w obrębie nabłonka jelitowego27. Białko niestrukturalne 4 rotawirusa (NSP4) jest kanałem przewodzącym Ca2 +, który umożliwia wypływ Ca2 + z retikulum endoplazmatycznego do cytozolu28,29. Stymuluje to autofagię i wspomaga montaż zewnętrznego kapsydu 30,31,32. Zakażenie rotawirusem indukuje również uwalnianie ADP, wyzwalając międzykomórkowe fale Ca2+, które przyczyniają się do patogenezy17. Inne wirusy jelitowe, w tym zarówno kaliciwirusy, jak i enterowirusy, kodują wiroporyny przewodzące Ca2 +, które wywołują podobną dysregulację Ca2 + w zakażonych komórkach33,34.

Obrazowanie żywych komórek Ca2+ ludzkich organoidów jelitowych stanowi wszechstronną platformę do badania sygnalizacji indukowanej przez wirusa w nabłonku. Jednak siła wniosków wyciągniętych z danych obrazowych zależy nierozerwalnie od stanu zdrowia i jakości HIO, odpowiednich parametrów obrazowania i solidnego podejścia analitycznego.

Wydajna transdukcja lentiwirusowa jest często krokiem ograniczającym przy tworzeniu nowych linii HIO, ale lentiwirus o wysokim mianie i transdukcje wielokrotne pomagają zapewnić wystarczającą ekspresję transgenu. Co ważne, będzie to musiało zostać zrównoważone z możliwością wystąpienia znacznego stresu komórkowego podczas transdukcji. Jest to najczęściej tymczasowe i ustępuje po selekcji i wielokrotnych przejściach. Niemniej jednak bardzo ważne jest, aby HIO zaprojektowane do ekspresji GECI wykazywały normalny wzrost i proliferację przed rozpoczęciem eksperymentów. Podobnie, rozpraszanie trójwymiarowych HIO i przekształcanie ich w monowarstwy indukuje stres komórkowy. Najlepszą praktyką jest pozostawienie trzech lub więcej dni na adaptację monowarstw po poszyciu. Powlekanie płytek kolagenem IV ma kluczowe znaczenie dla integralności monowarstwy35,36. Podawanie kolagenu dożylnie i przechowywanie w temperaturze -80 °C między użyciami pomaga zapewnić przyleganie jednej warstwy. Określenie optymalnej gęstości wysiewu dla każdej linii HIO może również pomóc w poprawie spójności. Wreszcie, włączenie odpowiednich kontroli i porównanie ich w różnych eksperymentach jest niezbędne, aby zapewnić, że każda obserwacja reprezentuje reakcję na daną zmienną, a nie techniczny czynnik zakłócający.

Podczas gdy nacinanie monowarstwy może powodować niepożądane uszkodzenia komórek, znacznie zwiększa infekcję RV 2D HIO. Ilustruje to rysunek 2 , ponieważ prawie wszystkie zainfekowane komórki przylegają bezpośrednio do rysy. Dowody eksperymentalne sugerują, że RV infekuje najskuteczniej na podstawno-bocznej powierzchni komórek nabłonka jelitowego37. W związku z tym przewiduje się, że nacinanie monowarstwy zwiększa zakaźność poprzez odsłonięcie powierzchni podstawno-bocznej. Skuteczną infekcję jednowarstwową można również osiągnąć poprzez posiewanie HIO na membranach poliwęglanowych zawieszonych w studzienkach zawierających pożywkę hodowlaną, które umożliwiają dostęp do powierzchni podstawno-bocznej. Jednak stosunkowo duża odległość między płytą a membraną poliwęglanową, sama membrana poliwęglanowa oraz plastikowa powierzchnia u podstawy studni sprawiają, że nie nadają się one do obrazowania epifluorescencyjnego. W związku z tym metoda punktacji opisana w tym protokole pozostaje preferowanym podejściem. Biorąc pod uwagę, że punktacja sama w sobie może prowadzić do perturbacji sygnalizacyjnych, włączenie niezainfekowanych, punktowanych kontroli ma kluczowe znaczenie dla interpretacji. W przypadku wirusów, takich jak norowirus ludzki, które skutecznie infekują przez błonę wierzchołkową, punktacja monowarstwy nie jest wymagana38.

Podobnie jak w przypadku każdego systemu obrazowania na żywo, fototoksyczność może łatwo zmylić eksperymenty z wykorzystaniem monowarstw HIO. W trakcie eksperymentu obrazowego ważne jest, aby monitorować nieoczekiwaną wakuolizację, pęcherzenie błony lub inne morfologiczne wskaźniki stresu39. Jeśli którykolwiek z tych objawów zostanie wykryty, czas trwania, częstotliwość lub moc wzbudzenia muszą zostać zmniejszone. Zwiększenie stosunku sygnału do szumu często odbywa się kosztem długoterminowego zdrowia komórek, dlatego empiryczna optymalizacja parametrów ma kluczowe znaczenie. Fotowybielanie, na co wskazuje spadek wyjściowej intensywności fluorescencji w czasie, jest zwiastunem stresu komórkowego i należy go unikać.

Wizualność danych obrazowych może skłonić badaczy do preferowania analiz jakościowych, a nie ilościowych. Jednak, jak w przypadku każdej innej modalności, powtarzalne wnioski wymagają oceny ilościowej. Ilościowa analiza obrazu jest znacznie bardziej złożona niż ta, którą można omówić w jednym manuskrypcie, ale warto zwrócić uwagę na kilka kluczowych punktów. Po pierwsze, konsekwentna kwantyfikacja wymaga konsekwentnego nabywania. Potok analizy opracowany dla danego zestawu parametrów akwizycji może nie być skuteczny w przypadku obrazów uzyskanych przy różnych częstotliwościach, czasach naświetlania, mocach lasera lub długościach fal. Po drugie, mnogość infekcji ma ogromny wpływ na częstotliwość indukowanych przez wirusa sygnałów wapniowych. W związku z tym ważne jest, aby ocenić liczbę zakażonych komórek w polu widzenia i zapewnić spójność we wszystkich warunkach leczenia. Alternatywnie, normalizacja częstotliwości sygnału do liczby zainfekowanych komórek na pole widzenia może pomóc w zmniejszeniu błędów. Wreszcie, podczas gdy niedawno opracowany wskaźnik wapnia oparty na mNG (NEMO) oferuje obiecujące podejście do określania bezwzględnych stężeń Ca2+ w komórkach40, większość bioczujników przekazuje tylko względne informacje o systemach biologicznych. W związku z tym odejmowanie tła, normalizacja i porównanie z kontrolą mają kluczowe znaczenie.

Chociaż protokół ten koncentruje się na obrazowaniu wapnia podczas infekcji wirusowej, ogólne podejście można łatwo dostosować. Infekcja wirusowa może być łatwo zastąpiona alternatywnym stanem leczenia, a istnieje stale rosnąca litania bioczujników do monitorowania wielu różnych szlaków i procesów komórkowych. Przy każdej adaptacji protokołu badacze muszą mieć na uwadze analizę, projektując eksperymenty z jasnymi, wymiernymi wynikami.

Ogólnie rzecz biorąc, obrazowanie na żywo zapewnia niezrównaną rozdzielczość czasową, poprawiając charakterystykę wysoce dynamicznych procesów. Włączenie organoidów do eksperymentów obrazowania na żywo pozwala na obserwację tych procesów w prawdziwie tkankowym, fizjologicznie istotnym modelu. Mamy nadzieję, że opisany tutaj protokół ułatwi projektowanie i optymalizację eksperymentów, umożliwiając naukowcom odkrycie nowych aspektów sygnalizacji komórkowej i tkankowej.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty R01DK115507 i R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) z National Institutes of Health (NIH). Wsparcie stażystów zapewnili F30DK131828 grantów NIH (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F. J. Scribano) i F32DK130288 (PI: K.A. Engevik). Chcielibyśmy podziękować Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core za dostarczenie pożywki do konserwacji organoidów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zaawansowany DMEM F12Gibco12634028
[Leu15]-Gastrin ISigma-AldrichG9145
0,05% Trypsyna EDTA Gibco 
0,05% Trypsyna EDTA Gibco 
Probówki mikrowirówkowe 1,5 mlFisherbrand5408137
15 ml probówki stożkoweThermofisher Scientific0553859A
Thermofisher Scientific28906
1M HEPESGibco15630080
1M HEPESGibco15630080
1X PBSCorning 21-040-CV
Igła o rozmiarze 25Thermofisher Scientific1482113D
A-83-01Tocris2939
ADPSigma-Aldrich A2754
Zaawansowany DMEM F12Gibco12634028
Antybiotyk-antyprątkowy Gibco15240062
Antybiotyk-antybiotyk przeciwgrzybiczy Gibco15240062
B27 SuplementGibco17504-044
Albumina surowicy bydlęcejFisherScientific 
Szkiełko do hodowli komórkowych CellView, PS, 75/25 MM, szklane dno, 10 przegródekGreiner543979
Collagen IVSigma AldrichC5533
DAPIThermofisher ScientificD1306
EDTACorning46-034-CI
Surowica bydlęca płodu Corning 35010CV
Surowica bydlęca płodowa Corning 35010CV
FluorobrytGibcoA1896701
GlutaMAX Gibco 
GlutaMAX Gibco 
Ludzki naskórkowy czynnik wzrostuProteinTechHZ-1326
LentivirusVectorBuilder(zmienna)
MatrigelBD Biosceicen356231/CB40230C
Suplement N2Gibco17502-048
N-acetylocysteinaSigma-AldrichA9165-5G
NH4ClSigma-Aldrich A9434
NikotynamidSigma-AldrichN0636
24-dołkowe płytki poddane hodowli komórek nuncThermofisher Scientific142475
PolybreneMilliporeSigmaTR1003G
SB202190Sigma-AldrichS70767
Triton X-100Fisher BioReagentsBP151100
Enzym TrypLE Express, bez czerwieni fenolowejThermofisher Scientific12604013
TrypsynaWorthington BiochemicalNC9811754
Y-27632Tocris1254
2530005425300054 16% formaldehydu BP16001003505007935050079

Bibliografia

  1. Bootman, M. D., Bultynck, G. Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802(2020).
  2. Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
  3. Danese, A., et al. Cell death as a result of calcium signaling modulation: A cancer-centric prospective. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (8), 119061(2021).
  4. Harr, M. W., Distelhorst, C. W. Apoptosis and autophagy: Decoding calcium signals that mediate life or death. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a005579(2010).
  5. Barak, P., Parekh, A. B. Signaling through Ca2+ microdomains from store-operated CRAC channels. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (7), a035097(2020).
  6. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
  7. Erofeev, A. I., Vinokurov, E. K., Vlasova, O. L., Bezprozvanny, I. B. GCaMP, a family of single-fluorophore genetically encoded calcium indicators. J Evol Biochem Phys. 59 (4), 1195-1214 (2023).
  8. Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging. Biophys J. 111 (6), 1119-1131 (2016).
  9. Nászai, M., Cordero, J. B. Intestinal stem cells: Got calcium. Curr Biol. 26 (3), R117-R119 (2016).
  10. Barrett, K. E. Calcium-mediated chloride secretion in the intestinal epithelium: Significance and regulation. Curr Top Membr. 53, 257-282 (2002).
  11. Xu, J., et al. Calcium-sensing receptor regulates intestinal dipeptide absorption via Ca2+ signaling and IKCa activation. Physiol Rep. 8 (1), e14337(2020).
  12. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  13. Lin, S. C., Haga, K., Zeng, X. L., Estes, M. K. Generation of CRISPR–Cas9-mediated genetic knockout human intestinal tissue–derived enteroid lines by lentivirus transduction and single-cell cloning. Nat Protoc. 17 (4), 1004-127 (2022).
  14. Crawford, S. E., Ramani, S., Blutt, S. E., Estes, M. K. Organoids to dissect gastrointestinal virus-host interactions: What have we learned. Viruses. 13 (6), 999(2021).
  15. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nat Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  16. Lai, Y., et al. Inhibition of calcium-triggered secretion by hydrocarbon-stapled peptides. Nature. 603 (7903), 949-956 (2022).
  17. Chang-Graham, A. L., et al. Rotavirus induces intercellular calcium waves through ADP signaling. Science. 370 (6519), eabc3621(2020).
  18. Lee, B., et al. Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl− secretion induced by carbachol and cholera toxin. Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).
  19. Saha, T., et al. Intestinal TMEM16A control luminal chloride secretion in a NHERF1 dependent manner. Biochem Biophys Rep. 25, 100912(2021).
  20. Mroz, M. S., Keely, S. J. Epidermal growth factor chronically upregulates Ca2+-dependent Cl− conductance and TMEM16A expression in intestinal epithelial cells. J Physiol. 590 (8), 1907-1920 (2012).
  21. Sui, J., et al. Dual role of Ca2+-activated Cl− channel transmembrane member 16A in lipopolysaccharide-induced intestinal epithelial barrier dysfunction in vitro. Cell Death Dis. 11 (5), 404(2020).
  22. Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198.e16 (2017).
  23. Paradis, T., Bègue, H., Basmaciyan, L., Dalle, F., Bon, F. Tight junctions as a key for pathogens invasion in intestinal epithelial cells. Int J Mol Sci. 22 (5), 2506(2021).
  24. Samak, G., et al. Calcium/Ask1/MKK7/JNK2/c-Src signalling cascade mediates disruption of intestinal epithelial tight junctions by dextran sulfate sodium. Biochem J. 465 (3), 503-515 (2015).
  25. Deng, H., Gerencser, A. A., Jasper, H. Signal integration by Ca2+ regulates intestinal stem cell activity. Nature. 528 (7581), 212-217 (2015).
  26. Saurav, S., Tanwar, J., Ahuja, K., Motiani, R. K. Dysregulation of host cell calcium signaling during viral infections: Emerging paradigm with high clinical relevance. Mol Aspects Med. 81, 101004(2021).
  27. Chang-Graham, A. L., et al. Rotavirus calcium dysregulation manifests as dynamic calcium signaling in the cytoplasm and endoplasmic reticulum. Sci Rep. 9 (1), 10822(2019).
  28. Hyser, J. M., Collinson-Pautz, M. R., Utama, B., Estes, M. K. Rotavirus disrupts calcium homeostasis by NSP4 viroporin activity. mBio. 1 (5), e00265-e00310 (2010).
  29. Pham, T., Perry, J. L., Dosey, T. L., Delcour, A. H., Hyser, J. M. The Rotavirus NSP4 viroporin domain is a calcium-conducting ion channel. Sci Rep. 7, 43487(2017).
  30. Crawford, S. E., Hyser, J. M., Utama, B., Estes, M. K. Autophagy hijacked through viroporin-activated calcium/calmodulin-dependent kinase kinase-β signaling is required for rotavirus replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), E3405-E3413 (2012).
  31. Crawford, S. E., Criglar, J. M., Liu, Z., Broughman, J. R., Estes, M. K. COPII vesicle transport is required for Rotavirus NSP4 interaction with the autophagy protein LC3 II and trafficking to viroplasms. J Virol. 94 (1), e01341(2019).
  32. Pando, V., Iša, P., Arias, C. F., Ló Pez, S. Influence of calcium on the early steps of Rotavirus infection. Virology. 295 (1), 190-200 (2002).
  33. Hyser, J. M., Estes, M. K. Pathophysiological consequences of calcium-conducting viroporins. Annu Rev Virol. 2 (1), 473-496 (2015).
  34. Strtak, A. C., et al. Recovirus NS1-2 has viroporin activity that induces aberrant cellular calcium signaling to facilitate virus replication. mSphere. 4 (5), e00506-e00519 (2019).
  35. In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. J Vis Exp. (146), 59357(2019).
  36. Hirota, A., AlMusawi, S., Nateri, A. S., Ordóñez-Morán, P., Imajo, M. Biomaterials for intestinal organoid technology and personalized disease modeling. Acta Biomater. 132, 272-287 (2021).
  37. Cevallos Porta, D., López, S., Arias, C. F., Isa, P. Polarized rotavirus entry and release from differentiated small intestinal cells. Virology. 499, 65-71 (2016).
  38. Mirabelli, C., et al. Human Norovirus efficiently replicates in differentiated 3D-human intestinal enteroids. J Virol. 96 (22), e0085522(2022).
  39. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. Bioessays. 39 (8), 28749075(2017).
  40. Li, J., et al. Engineering of NEMO as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity. Nat Methods. 20 (6), 918-924 (2023).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ludzkie organoidy jelitowezakażenie rotawirusemżywa mikroskopia fluorescencyjnasygnalizacja wapniowamonowarstwy nabłonkowesygnalizacja parakrynowabarwienie immunofluorescencyjnemikroskopia epifluorescencyjna
Obrazowanie na żywo wapnia zakażonych wirusem monowarstw organoidów jelitowych ludzkich przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.