Method Article

Multipleksowa cykliczna immunohistochemia fluorescencyjna

DOI:

10.3791/66136

⸱

January 26th, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, The Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University & Yunnan Cancer Hospital, 2Department of Gastroenterology, Wu Han NO.1 Hospital, 3Department of Neurosurgery, The Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University & Yunnan Cancer Hospital, 4Departments of Biomedical Research Center, The Affiliated Calmette Hospital of Kunming Medical University & The First Hospital of Kunming, 5School of Medical, Yunnan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multipleksowa cykliczna immunohistochemia pozwala na wykrywanie in situ wielu markerów jednocześnie przy użyciu wielokrotnej inkubacji przeciwciał antygenowych, skanowania obrazu oraz dopasowywania i integracji obrazu. W tym miejscu przedstawiamy protokół operacyjny identyfikacji substratów komórek odpornościowych za pomocą tej technologii w próbkach raka płuc i sparowanych próbkach przerzutów do mózgu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrośrodowisko guza obejmuje interakcje między komórkami gospodarza, komórkami nowotworowymi, komórkami odpornościowymi, komórkami zrębu i naczyniami krwionośnymi. Charakterystyka i przestrzenna organizacja podzbiorów komórek odpornościowych i białek docelowych ma kluczowe znaczenie dla celów prognostycznych, takich jak te. Doprowadziło to do opracowania multipleksowanych metod barwienia immunohistochemicznego. Immunohistochemia fluorescencji multipleksowej umożliwia jednoczesne wykrywanie wielu markerów, ułatwiając kompleksowe zrozumienie funkcji komórek i interakcji międzykomórkowych. W tym artykule opisano przebieg pracy wielopierścieniowego cyklicznego testu immunohistochemicznego fluorescencji i jego zastosowanie w analizie ilościowej podzbiorów limfocytów. Multipleksowe cykliczne barwienie immunohistochemiczne fluorescencyjne przebiega zgodnie z podobnymi krokami i odczynnikami jak standardowa immunohistochemia, obejmując pobieranie antygenu, cykliczną inkubację przeciwciał i barwienie na szkiełku tkankowym zatopionym w parafinie (FFPE) utrwalonym w formalinie. Podczas reakcji antygen-przeciwciało przygotowuje się mieszaninę przeciwciał różnych gatunków. Warunki, takie jak czas pobierania antygenu i stężenie przeciwciał, są optymalizowane i walidowane w celu zwiększenia stosunku sygnału do szumu. Technika ta jest powtarzalna i służy jako cenne narzędzie do badań nad immunoterapią i zastosowań klinicznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przerzuty do mózgu (BM) reprezentują najczęstsze nowotwory ośrodkowego układu nerwowego (OUN), występujące w prawie połowie przypadków niedrobnokomórkowego raka płuc (NSCLC), ze złym rokowaniem1. Szacuje się, że u 10%-20% pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca występuje już BM w momencie wstępnej diagnozy, a u około 40% przypadków NDRP rozwinie się BM w trakcie leczenia2. Mikrośrodowisko guza (TME) jest ściśle związane z występowaniem NSCLC i BM, w tym z różnymi składnikami, takimi jak naczynia krwionośne, fibroblasty, makrofagi, macierz zewnątrzkomórkowa (ECM), limfoidy, komórki odpornościowe pochodzące ze szpiku kostnego i cząsteczki sygnałowe3,4. Mikrośrodowiskowe komórki odpornościowe odgrywają kluczową rolę we wpływie na wzrost i rozwój komórek rakowych. Przerzuty do mózgu stanowią wiele potencjalnych celów leczenia charakteryzujących się złożonymi mikrośrodowiskami immunologicznymi i procesami sygnalizacyjnymi. Na przykład inhibitory PD-1 wykazały skuteczność kliniczną u pacjentów z przerzutami raka płuc do mózgu (LCBM) jako inhibitor immunologicznych punktów kontrolnych (ICI). Jednak częstość odpowiedzi na terapię PD-1 różni się między pierwotnym NSCLC a LCBM5, co sugeruje, że mikrośrodowisko immunologiczne guza działa jako krytyczny regulator ICI.

Immunohistochemia (IHC) jest nieocenionym narzędziem w dziedzinie biologii, medycyny podstawowej i patologii6. Ta metoda wykrywania wizualizuje ekspresję antygenu poprzez interakcję antygen-przeciwciało na szkiełku tkankowym7. IHC służy do diagnozowania markerów predykcyjnych, oceny markerów prognostycznych, kierowania terapiami celowanymi i badania biologicznych funkcji komórek nowotworowych8. Jednak tradycyjna metoda IHC może wykryć tylko jeden biomarker na raz. Aby rozwiązać ten problem, innowacja w technologii immunohistochemicznej doprowadziła do opracowania immunohistochemii fluorescencji multipleksowej (mfIHC), która pozwala na jednoczesną identyfikację wielu markerów białkowych na tym samym szkiełku tkankowym, zarówno w jasnym polu, jak i w polu fluorescencyjnym9. Postęp ten zapewnia dokładną analizę składu komórkowego i interakcji molekularnych między komórkami zrębu, komórkami odpornościowymi i komórkami nowotworowymi w obrębie TME.

W tym badaniu prezentujemy protokół dla multipleksowej cyklicznej immunohistochemii do analizy przestrzennego rozkładu komórek odpornościowych. Do inkubacji jednocześnie wybiera się dwa przeciwciała pierwszorzędowe różnych gatunków, takie jak królik i szczur, a następnie przeciwciała drugorzędowe znakowane fluorescencyjnie. Pobieranie antygenu odbywa się po każdej rundzie reakcji antygen-przeciwciało. Autofluorescencja jest zablokowana, a do barwienia jąder stosuje się 4', 6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI). Panel obejmuje sekwencyjne wykrywanie CD3, CD8, CD20 i CK, komórki są podzielone na kategorie według markerów: komórki nowotworowe (CK+), dojrzałe limfocyty T (CD3+), cytotoksyczne limfocyty T (CD3+CD8+), limfocyty B (CD20+)10,11.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania zostały zatwierdzone przez komisję etyki medycznej Szpitala Onkologicznego w Yunnan/Trzeciego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Medycznego w Kunming. Wszyscy uczestnicy/opiekunowie prawni podpisali świadomą zgodę.

1. Przygotowanie slajdów

  1. Wytnij skrawki sparowanych bloków parafiny zawierających pierwotny guz płuc lub raka płuc przerzuty do mózgu o grubości 4 μm za pomocą mikrotomu. Wyjmij skrawki do wody i oddziel pęsetą, wybierz najlepszą i przyklej ją do szkiełka pokrytego polilizyną.
  2. Umieścić szkiełka chusteczek w piecu w temperaturze 65 °C na 30 minut, aby zwiększyć przyczepność tkanek.
  3. Zanurz szkiełka w ksylenie w trzech zmianach, z których każda trwa 10 minut.
  4. Stopniowo zmniejszaj stężenie alkoholu i inkubuj szkiełka w 100% etanolu przez 5 min, 90% etanolu przez 5 min, 75% etanolu przez 5 min i w wodzie dejonizowanej przez 3 min.

2. Pobieranie epitopów pod wpływem ciepła (HIER)

  1. Rozcieńczyć 100x roztwór buforowy cytrynianu sodu (pH 6,0) do 1x (10 mM) w wodzie dejonizowanej, przygotowując wystarczającą ilość roztworu buforowego, aby całkowicie zanurzyć szkiełka.
  2. Umieść szkiełka w szybkowarze, poddając je działaniu wysokiej temperatury (100 °C) i ciśnienia (~30 psi) przez 2 minuty. Po podgrzaniu pozwól szkiełkom ostygnąć do temperatury pokojowej w wodzie destylowanej przez 3 minuty.
  3. Rozpuścić jedno opakowanie 52 g soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; sproszkowanej) w 5 l wody dejonizowanej w celu przygotowania roztworu buforowego PBS (pH 7,0). Umieść szkiełka w roztworze buforowym PBS na 5 minut, z 3 zmianami.

3. Blokowanie peroksydazy

  1. Przykryj skrawki 3% nadtlenkiem wodoru i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przepłukać szkiełka w PBS, 3x po 5 minut każda.
  2. Użyj bibuły filtracyjnej, aby wchłonąć nadmiar wody z dala od obwodu tkanki. W międzyczasie upewnij się, że chusteczka jest wilgotna.

4. Inkubacja przeciwciał pierwotnych dla pierwszej rundy

  1. Przygotować mieszaninę roboczą przeciwciał pierwszorzędowych dla CD8 (przeciwciało monoklonalne królika, klon SP16) i CD20 (mysie przeciwciało monoklonalne, klon L26), rozcieńczoną w stosunku 1:50 w rozcieńczalniku przeciwciał pierwszorzędowych Bond.
  2. Dodać kompleks przeciwciał na skrawki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  3. Przygotować roztwór 0,1% soli fizjologicznej/buforowanej fosforanem: 1 ml Tween w 1 l roztworu buforowego PBS.
  4. Umyj sekcje 0,1% soli fizjologicznej/buforowanej fosforanem, 3x po 5 minut. Użyj bibuły filtracyjnej, aby odciągnąć nadmiar wody od obwodu tkanki, w międzyczasie upewnij się, że tkanka jest wilgotna.

5. Drugorzędowa inkubacja przeciwciał dla pierwszej rundy

  1. Przygotować mieszaninę znakowanego fluorescencyjnie koziego przeciwciała anty-króliczego (wzbudzenie (Ex): 495 nm) i koziego przeciwciała anty-mysiego (Ex: 578 nm), rozcieńczoną w stosunku 1:50 w roztworze soli fizjologicznej buforu fosforanowego. Przeciwciało przeciwko królikowi kozie przyłącza się do pierwszorzędowego przeciwciała CD8, a kozie przeciwciało anty-mysie przyłącza się do pierwszorzędowego przeciwciała CD20.
  2. Dodawać kroplami mieszaninę przeciwciał drugorzędowych i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.

6. Pobieranie epitopów i blokowanie peroksydazy pod wpływem ciepła

  1. Rozcieńczyć 100x cytrynian sodu (pH 6,0) do 1x (10 mM) w wodzie dejonizowanej, przygotowując wystarczającą ilość roztworu buforowego, aby całkowicie zanurzyć szkiełka.
  2. Umieść szkiełka w szybkowarze i poddaj je działaniu wysokiej temperatury (100 °C) i ciśnienia (~30 psi) przez 1 minutę. Po podgrzaniu umieść szkiełka w wodzie destylowanej, aby ostygły do temperatury pokojowej przez 3 minuty.
  3. Wykonaj blokowanie peroksydazy zgodnie z opisem w kroku 3.

7. Inkubacja przeciwciał pierwotnych do drugiej rundy

  1. Przygotować mieszaninę roboczą pierwszorzędowych przeciwciał przeciwko CD3 (przeciwciało monoklonalne królika, klon SP7) i CK (mysie przeciwciało monoklonalne, MX005), rozcieńczoną w stosunku 1:50 w rozcieńczalniku przeciwciał pierwszorzędowych.
  2. Dodać kompleks przeciwciał na skrawki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  3. Przemyć 0,1% solą fizjologiczną/buforowaną fosforanem, 3x po 5 minut. Użyj bibuły filtracyjnej, aby odciągnąć nadmiar wody od obwodu tkanki, w międzyczasie upewnij się, że tkanka jest wilgotna.

8. Drugorzędowa inkubacja przeciwciał do drugiej rundy

  1. Przygotować mieszaninę kozich przeciwciał przeciwko królikom (np. 652 nm) i kozim przeciwciałom przeciwko mysim przeciwciałom (np. 590 nm), rozcieńczając 1:50 w roztworze soli fizjologicznej z buforu fosforanowego. Przeciwciało przeciwko królikowi kozy przyłącza się do pierwszorzędowego przeciwciała CD3, a kozie przeciwciało anty-mysie przyłącza się do pierwszorzędowego przeciwciała CK.
  2. Dodawać kroplami mieszaninę przeciwciał wtórnych, inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Przemyć 0,1% solą fizjologiczną/buforowaną fosforanem, 3x po 5 minut.

9. Wygaszanie autofluorescencji i barwienie DAPI

  1. Dodać odczynnik (0,15 M/L KMnO4) do przekroju tkanki na 1 min. Płukać pod bieżącą wodą przez 5 min.
    UWAGA: KMnO4 jest toksyczny i uszkadza skórę. Upewnij się, że nosisz rękawiczki podczas obsługi szkiełek. Jeśli płyn kapie na skórę, szybko zetrzyj go czystymi serwetkami i spłucz bieżącą wodą.
  2. Suszyć szkiełko rosnącym stężeniem alkoholu (70%, 90%, 100%) przez 3 minuty w każdym stężeniu.
  3. Dodaj DAPI i szkiełko nakrywkowe do obrazowania wielospektralnego. Ilość DAPI zależy od wielkości tkanki. Upewnij się, że tkanka jest całkowicie pokryta DAPI po dodaniu szkiełka nakrywkowego.

10. Skanowanie slajdów

  1. Umieść szkiełka na tacy i dociśnij, aż nie będzie można jej dalej popchnąć.
  2. Aby uruchomić program, kliknij dwukrotnie ikonę programu na pulpicie. Podczas uruchamiania wyświetlane jest okno wyboru trybu. W oknie wyboru wyświetlane są dwa tryby jasnego pola i fluorescencji: tryb automatyczny i tryb ręczny. W trybie skanowania fluorescencyjnego kliknij opcję Automatic Mode (Tryb automatyczny).
  3. Najedź kursorem myszy na ? przycisk, aby wyświetlić informacje o ustawieniach. Kliknij Ustawienia filtru > Filtruj kanał, aby wybrać numer kanału > pseudokolor. Zdefiniuj kolor i zapisz.
  4. Kliknij opcję Routine Work (Praca rutynowa> tryb skanowania> Pełna automatyka. Kliknij opcję Praca rutynowa > Nazwa slajdu, aby zdefiniować nazwę slajdu dla danych wyjściowych. Kliknij opcję Routine Work > Channel Settings (Ustawienia kanału), aby wybrać filtry.
  5. Kliknij opcję Routine Work > Scan Options (Opcje skanowania), aby określić wynikową jakość i miejsce przechowywania wirtualnego slajdu.
  6. Kliknij przycisk Podgląd, aby ustawić próg i wybrać zakres do skanowania.
  7. Kliknij opcję Sprzęt > Filtry > Live > Auto Focus > Auto Exposure > Digital Gain > Tick użyj ręcznego czasu ekspozycji > Tick ograniczając zakres > Ustaw prąd.
  8. Kliknij opcję Routine Work (Praca rutynowa> rozpocząć skanowanie. Wybierz poziom powiększenia jako 20x lub 40x. Wybierz 20x, aby uzyskać odpowiednie rozmiary plików. Rozszerzenie MRXS jest definiowane przez skaner 3D Pannoramic MIDI. Rozszerzenie obrazu można również zmienić na obraz TIFF.
  9. Kliknij pozycję Przeglądarka slajdów > Przybornik multiwidoku, aby wybrać obraz do konfokalnej, a następnie wyrównaj i zintegruj obraz.

11. Ilościowa ocena gęstości komórek

  1. Określ ilościowo odsetek dodatnich komórek odpornościowych (CD3+, CD3+CD8+, CD20+) w obszarach guza i zrębu za pomocą oprogramowania skanera Halo 10. Zweryfikuj barwienie CK, aby zdefiniować tkankę nowotworową.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy protokół cyklicznego wykrywania antygenu za pomocą 5-kolorowej fluorescencji multipleksowej na jednym slajdzie. Dzięki naszej optymalizacji testu umożliwiamy inkubację dwóch przeciwciał z różnych gatunków (Rysunek 1). Niezbędne urządzenia do przeprowadzenia eksperymentu obejmują szybkowar i pudełko do barwienia immunologicznego (Rysunek 2A).

Po zakończeniu testu, definiujemy pseudo kolor czterech znaczników przed skanowaniem slajdów. Pseudokolory CD3, CD8, CD20 i CK to odpowiednio żółty, czerwony, zielony i cyjan. Jądra są oznaczone DAPI. Do analizy wybiera się reprezentatywne regiony guza i zrębu. Widmo fluorescencyjne przy 495 nm, 578 nm, 652 nm i 590 nm jest rejestrowane za pomocą automatycznego cyfrowego skanera slajdów 3D. Reprezentatywny obraz stosu i obrazy z pojedynczym znacznikiem w tkance przerzutów do mózgu raka płuc są pokazane w Rysunek 2B. Na podstawie obrazów zawierających sygnał fluorescencji pojedynczego markera, oprogramowanie skanera wyodrębniło cechy fenotypu komórki na podstawie pseudokoloru. Policzono również odpowiednią liczbę dodatnich komórek odpornościowych i całkowitą liczbę komórek odpornościowych. Każdy wybarwiony poziom białka jest oznaczany ilościowo w wykrytych tkankach poprzez obliczenie H-score12. Po tych procedurach liczy się i analizuje liczbę każdego typu limfocytów naciekających nowotwór oraz proporcję każdego typu komórek w całkowitej liczbie komórek docelowych. Proporcja każdego typu komórek odpornościowych przedstawia efektywny odsetek limfocytów naciekających nowotwór. Analizowano odsetek limfocytów T CD3 +, CD3 + CD8 + i limfocytów B CD20 + w przerzutach raka płuc do mózgu w porównaniu z pierwotnymi odcinkami raka płuc. Reprezentatywne wyniki są pokazane w Rysunek 3. Gęstość komórek odpornościowych (limfocyty T CD3 +, limfocyty T CD3 + CD8 +) jest niższa w przerzutach raka płuc do mózgu niż w pierwotnym raku płuc. Limfocyty B CD20 + są wyższe w grupie z przerzutami do mózgu niż w grupie pierwotnego raka płuc. Jednak wyniki nie różnią się znacząco między tymi dwiema grupami dla ograniczonych prób.

figure-results-1
Rysunek 1: Przebieg pracy cyklicznego barwienia immunohistochemicznego multipleksowej fluorescencji. Sekcje o grubości 4 μm są cięte i przyklejane na szkiełku samoprzylepnym. Wykonywane są następujące etapy operacyjne: deparafinowanie i ponowne uwodnienie, pobranie antygenu, pobranie antygenu, blokowanie antygenu, inkubacja mieszaniny przeciwciał pierwotnych, inkubacja przeciwciał wtórnych, następnie powtórzenie etapów pobierania antygenu, blokowania antygenu, inkubacji mieszaniny przeciwciał pierwotnych i inkubacji przeciwciał wtórnych, a następnie redukcja autofluorescencji, wybór odpowiedniego filtra do skanowania preparatów i analiza wyników. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Metody działania barwienia immunohistochemicznego fluorescencji multipleksowej. Leczenie antygenowe odbywa się poprzez podgrzanie sekcji w szybkowarze. (A) Szybkowar służy do pobierania epitopów pod wpływem ciepła. W procesie inkubacji przeciwciał szkiełka umieszcza się w pojemniku do barwienia immunologicznego. (B) Reprezentatywne złożone i pojedynczo barwione obrazy dla panelu stosowanego w tkance z przerzutami do mózgu raka płuc. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Proporcja komórek odpornościowych w pierwotnym raku płuc i przerzutach raka płuc do mózgu. Proporcja komórek odpornościowych CD3+, CD3+CD8+, CD20+ w czterech tkankach przerzutów raka płuc do mózgu jest niższa niż w sparowanych tkankach pierwotnego raka płuc (słupki błędu: odchylenie standardowe). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisaliśmy proces barwienia immunohistochemicznego multipleksowej cyklicznej fluorescencji. Pierwszorzędowy wybór przeciwciał jest kluczowym aspektem testu immunohistochemicznego fluorescencji, a przeciwciała monoklonalne są zalecane w celu uzyskania lepszej swoistości i powtarzalności. Aby zoptymalizować stężenie robocze przeciwciała pierwotnego, za pomocą eksperymentów immunohistochemicznych przetestowano serię rozcieńczeń. Zarówno kontrole pozytywne (w celu oceny ekspresji antygenu docelowego), jak i kontrole ujemne (brak inkubacji przeciwciał pierwotnych) są niezbędne i powinny zostać ustanowione.

W tym protokole przeciwciała pierwszorzędowe są rozcieńczane i przygotowywane do mieszaniny różnych gatunków. Przeciwciała drugorzędowe znakowane fluorescencją są również łączone i inkubowane w ten sam sposób, pochodzące od różnych gatunków. Tak więc krytycznym krokiem jest wybór gatunku dla różnych przeciwciał pierwszorzędowych na podstawie antygenów, a przeciwciało monoklonalne jest preferowane w porównaniu z przeciwciałem poliklonalnym. Mogą one zapewnić, że połączenie przeciwciała pierwszorzędowego i przeciwciała drugorzędowego jest specyficzne. Zmieszana ciecz powinna osiągnąć stężenie robocze dla obu przeciwciał pierwszorzędowych, a reaktywność krzyżowa nie powinna występować między tymi dwoma przeciwciałami jednocześnie. Jeśli przeciwciała pierwszorzędowe są tego samego gatunku, najpierw inkubuje się jedno przeciwciało drugorzędowe, a następnie drugie. Przy określaniu sekwencji inkubacji przeciwciał pierwotnych w panelu pierwszeństwo należy przyznać przeciwciałom, które są wrażliwe na reakcję antygen-przeciwciało, w przypadku antygenów o niskiej ekspresji intensywność wzrosłaby podczas drugiego pobrania epitopu. Przed drugą rundą inkubacji przeciwciał powtórzenie pobrania antygenu zajmuje mniej czasu (1 min) w porównaniu z pierwszą operacją (2 min). Intensywność fluorescencji z poprzednich cyklicznych barwień nie zmniejszy się, nawet jeśli skrawki zostaną dwukrotnie poddane ekstrakcji wywołanej ciepłem. Aby uniknąć nieswoistej immunoreaktywności, należy zoptymalizować warunki inkubacji, w tym stężenie robocze przeciwciał, czas inkubacji i temperaturę otoczenia.

W ostatnich dziesięcioleciach opracowano różne metody pozyskiwania epitopów, przede wszystkim podzielone na odzyskiwanie epitopów indukowane ciepłem (HIER) i odzyskiwanie epitopów indukowane proteazą (PIER). Ogrzewanie jest skuteczną metodą odzyskiwania antygenu, która odsłania epitopy antygenu, dzięki czemu są one skuteczniej wykrywane przez przeciwciała13. Dwie główne opcje pobierania antygenu opierają się na buforze cytrynianowym i buforze EDTA o wysokim pH14. Zoptymalizowany warunek pobierania jest identyfikowany na podstawie docelowego antygenu.

Autofluorescencja może zakłócać obrazowanie fluorescencyjne na skrawkach spowodowane przez endogenne fluorofory i odczynniki stosowane w przetwarzaniu tkanek15. Do elucji wymagane jest użycie odpowiedniego odczynnika. Fluorofory są wybierane z pikami emisji, unikając pików autofluorescencji (około 490 nm)16,17. Zgłaszano, że Sudan Black B i NaBH4 mają wpływ na autofluorescencję tkanek wygaszających18,19. Połączenie Sudan Black B i NaBH4 zmniejszyło tło fluorescencyjne w docelowej tkance zatopionej w parafinie utrwalonej w formalinienerkowej 20. W tym protokole leczenie tkankowe KMnO4 w stężeniu 0,15 M/L to oszczędność czasu o 1 minutę. KMnO4 pokrywa warstwę na tkance w celu osłony spontanicznej fluorescencji i zmniejsza fluorescencję tła, specyficzne barwienie wykrytego białka jest bardziej uwidocznione.

Całe preparaty są skanowane w czterech różnych kanałach filtrów, konieczna jest analiza wyrównania obrazu, dużym wyzwaniem jest wyrównanie lokalizacji struktur jednokomórkowych i subkomórkowych. W przypadku obrazów wielospektralnych z tej techniki potrzebny jest profesjonalny sprzęt do obrazowania światła i oprogramowanie do analizy ilościowej, aby uniknąć przesłuchów spektralnych. Wysoki koszt instrumentu ogranicza jego zastosowanie. Jednoczesna inkubacja dwóch przeciwciał oszczędza czas, zwłaszcza gdy mamy do czynienia z panelem 6-markerowym, który wymaga 3 cykli inkubacji. Technika ta służy do wizualizacji bardziej szczegółowej charakterystyki komórek odpornościowych w mikrośrodowiskach immunologicznych guza. W przyszłości metoda ta będzie stosowana do ilościowej analizy trzeciorzędowych struktur limfatycznych związanych z nowotworem.

Podsumowując, multipleksowa immunohistochemia fluorescencji cyklicznej umożliwia barwienie wielu celów za pomocą indywidualnie znakowanych fluoroforów na jednym szkiełku. Test ten zapewnia lepsze zrozumienie przestrzennego rozmieszczenia komórek w mikrośrodowisku immunologicznym guza, a przestrzenna bliskość komórek odpornościowych nowotworu przyczynia się do badań przesiewowych pacjentów, którzy odniosą korzyści z immunoterapii.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie są im znane żadne konkurencyjne interesy finansowe ani powiązania osobiste, które mogłyby mieć wpływ na pracę opisaną w tym artykule.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (NO.81860413, 81960455), Yunnan Science and Technology Department Fund (202001AY070001-080), Fundację Badań Naukowych Departamentu Edukacji Prowincji Yunnan (2019J1274).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,15 mol/L KmnO4Maixin Biotechnology Co. Ltd.MST-8005
100x cytrynian sodu Maixin Biotechnology Co., LtdMVS-0100
3% nadtlenek wodoruMaixin Biotechnology Co., LtdSP KIT-A1
3D Pannoramic MIDI3D histech LtdPannoramic MIDI 1.18
Alexa Fluor 488Abcamab150113
Alexa Fluor 568 Abcamab175701
Alexa Fluor 594Abcamab150116
Alexa Fluor 647Abcamab150079
Rozcieńczalnik przeciwciał pierwotnychLeciaAR9352
CD20Maixin Biotechnology Co., Ltdzestaw-0001
CD3Maixin Biotechnology Co., Ltd.  zestaw-0003
CD8 Maixin Biotechnology Co., LtdRMA-0514
CKMaixin Biotechnology Co. Ltd.MAB-0671,
DAPIsig-maD8417
etanolSinopharm Group Chemical reagent Co., LTD10009218
Histocore Multicutlecia2245
PBS (proszek)Maixin Biotechnology Co., LtdPBS-0061
wiwer do prowadnic 3D histech Ltd
ksylenSinopharm Group Odczynnik chemiczny Co., LTD10023418

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wanleenuwat, P., Iwanowski, P. Metastases to the central nervous system: Molecular basis and clinical considerations. J Neurol Sci. 412, 116755(2020).
  2. Schoenmaekers, J., Dingemans, A. C., Hendriks, L. E. L. Brain imaging in early stage non-small cell lung cancer: still a controversial topic. J Thorac Dis. 10, S2168-S2171 (2018).
  3. Vilariño, N., Bruna, J., Bosch-Barrera, J., Valiente, M., Nadal, E. Immunotherapy in NSCLC patients with brain metastases. Understanding brain tumor microenvironment and dissecting outcomes from immune checkpoint blockade in the clinic. Cancer Treat Rev. 89, 102067(2020).
  4. Babar, Q., Saeed, A., Tabish, T. A., Sarwar, M., Thorat, N. D. Targeting the tumor microenvironment: Potential strategy for cancer therapeutics. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1869 (6), 166746(2023).
  5. Goldberg, S. B., et al. Pembrolizumab for management of patients with NSCLC and brain metastases: long-term results and biomarker analysis from a non-randomised, open-label, phase 2 trial. Lancet Oncol. 21 (5), 655-663 (2020).
  6. Sukswai, N., Khoury, J. D. Immunohistochemistry Innovations for Diagnosis and Tissue-Based Biomarker Detection. Curr Hematol Malig Rep. 14 (5), 368-375 (2019).
  7. Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. Immunohistochemistry in Investigative and Toxicologic Pathology. Toxicol Pathol. 46 (5), 488-510 (2018).
  8. Torlakovic, E. E., Nielsen, S., Vyberg, M., Taylor, C. R. Getting controls under control: the time is now for immunohistochemistry. J Clin Pathol. 68 (11), 879-882 (2015).
  9. Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commun (Lond). 40 (4), 135-153 (2020).
  10. Wong, P. F., et al. Multiplex quantitative analysis of tumor-infiltrating lymphocytes and immunotherapy outcome in metastatic melanoma. Clin Cancer Res. 25 (8), 2442-2449 (2019).
  11. Sanchez, K., et al. Multiplex immunofluorescence to measure dynamic changes in tumor-infiltrating lymphocytes and PD-L1 in early-stage breast cancer. Breast Cancer Res. 23 (1), 2(2021).
  12. Zhang, W., et al. Multiplex immunohistochemistry indicates biomarkers in colorectal cancer. Neoplasma. 68 (6), 1272-1282 (2021).
  13. Salameh, S., Nouel, D., Flores, C., Hoops, D. An optimized immunohistochemistry protocol for detecting the guidance cue Netrin-1 in neural tissue. MethodsX. 5, 1-7 (2018).
  14. McClellan, P., Jacquet, R., Yu, Q., Landis, W. J. A Method for the immunohistochemical identification and localization of Osterix in periosteum-wrapped constructs for tissue engineering of bone. J Histochem Cytochem. 65 (7), 407-420 (2017).
  15. Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Arch Pathol Lab Med. 135 (10), 1335-1342 (2011).
  16. Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. J Immunother Cancer. 8 (1), 000155(2020).
  17. Clarke, G. M., et al. A novel, automated technology for multiplex biomarker imaging and application to breast cancer. Histopathology. 64 (2), 242-255 (2014).
  18. Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histol Histopathol. 25 (8), 1017-1024 (2010).
  19. Ahrens, M. J., Dudley, A. T. Chemical pretreatment of growth plate cartilage increases immunofluorescence sensitivity. J Histochem Cytochem. 59 (4), 408-418 (2011).
  20. Zhang, Y., et al. Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy. J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplex ImmunohistochemistryFluorescent ImmunohistochemistryTumor MicroenvironmentLymphocyte SubsetsAntigen RetrievalFormalin Fixed TissueBrain MetastasisTumor Infiltrating LymphocytesMulti Spectral ImagingAntibody Incubation

Related Articles