Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Multipleksowa cykliczna immunohistochemia fluorescencyjna

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66136

⸱

26 stycznia 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, The Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University & Yunnan Cancer Hospital, 2Department of Gastroenterology, Wu Han NO.1 Hospital, 3Department of Neurosurgery, The Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University & Yunnan Cancer Hospital, 4Departments of Biomedical Research Center, The Affiliated Calmette Hospital of Kunming Medical University & The First Hospital of Kunming, 5School of Medical, Yunnan University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Multipleksowa cykliczna immunohistochemia pozwala na wykrywanie in situ wielu markerów jednocześnie przy użyciu wielokrotnej inkubacji przeciwciał antygenowych, skanowania obrazu oraz dopasowywania i integracji obrazu. W tym miejscu przedstawiamy protokół operacyjny identyfikacji substratów komórek odpornościowych za pomocą tej technologii w próbkach raka płuc i sparowanych próbkach przerzutów do mózgu.

Streszczenie

Mikrośrodowisko guza obejmuje interakcje między komórkami gospodarza, komórkami nowotworowymi, komórkami odpornościowymi, komórkami zrębu i naczyniami krwionośnymi. Charakterystyka i przestrzenna organizacja podzbiorów komórek odpornościowych i białek docelowych ma kluczowe znaczenie dla celów prognostycznych, takich jak te. Doprowadziło to do opracowania multipleksowanych metod barwienia immunohistochemicznego. Immunohistochemia fluorescencji multipleksowej umożliwia jednoczesne wykrywanie wielu markerów, ułatwiając kompleksowe zrozumienie funkcji komórek i interakcji międzykomórkowych. W tym artykule opisano przebieg pracy wielopierścieniowego cyklicznego testu immunohistochemicznego fluorescencji i jego zastosowanie w analizie ilościowej podzbiorów limfocytów. Multipleksowe cykliczne barwienie immunohistochemiczne fluorescencyjne przebiega zgodnie z podobnymi krokami i odczynnikami jak standardowa immunohistochemia, obejmując pobieranie antygenu, cykliczną inkubację przeciwciał i barwienie na szkiełku tkankowym zatopionym w parafinie (FFPE) utrwalonym w formalinie. Podczas reakcji antygen-przeciwciało przygotowuje się mieszaninę przeciwciał różnych gatunków. Warunki, takie jak czas pobierania antygenu i stężenie przeciwciał, są optymalizowane i walidowane w celu zwiększenia stosunku sygnału do szumu. Technika ta jest powtarzalna i służy jako cenne narzędzie do badań nad immunoterapią i zastosowań klinicznych.

Wprowadzenie

Przerzuty do mózgu (BM) reprezentują najczęstsze nowotwory ośrodkowego układu nerwowego (OUN), występujące w prawie połowie przypadków niedrobnokomórkowego raka płuc (NSCLC), ze złym rokowaniem1. Szacuje się, że u 10%-20% pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca występuje już BM w momencie wstępnej diagnozy, a u około 40% przypadków NDRP rozwinie się BM w trakcie leczenia2. Mikrośrodowisko guza (TME) jest ściśle związane z występowaniem NSCLC i BM, w tym z różnymi składnikami, takimi jak naczynia krwionośne, fibroblasty, makrofagi, macierz zewnątrzkomórkowa (ECM), limfoidy, komórki odpornościowe pochodzące ze szpiku kostnego i cząsteczki sygnałowe3,4. Mikrośrodowiskowe komórki odpornościowe odgrywają kluczową rolę we wpływie na wzrost i rozwój komórek rakowych. Przerzuty do mózgu stanowią wiele potencjalnych celów leczenia charakteryzujących się złożonymi mikrośrodowiskami immunologicznymi i procesami sygnalizacyjnymi. Na przykład inhibitory PD-1 wykazały skuteczność kliniczną u pacjentów z przerzutami raka płuc do mózgu (LCBM) jako inhibitor immunologicznych punktów kontrolnych (ICI). Jednak częstość odpowiedzi na terapię PD-1 różni się między pierwotnym NSCLC a LCBM5, co sugeruje, że mikrośrodowisko immunologiczne guza działa jako krytyczny regulator ICI.

Immunohistochemia (IHC) jest nieocenionym narzędziem w dziedzinie biologii, medycyny podstawowej i patologii6. Ta metoda wykrywania wizualizuje ekspresję antygenu poprzez interakcję antygen-przeciwciało na szkiełku tkankowym7. IHC służy do diagnozowania markerów predykcyjnych, oceny markerów prognostycznych, kierowania terapiami celowanymi i badania biologicznych funkcji komórek nowotworowych8. Jednak tradycyjna metoda IHC może wykryć tylko jeden biomarker na raz. Aby rozwiązać ten problem, innowacja w technologii immunohistochemicznej doprowadziła do opracowania immunohistochemii fluorescencji multipleksowej (mfIHC), która pozwala na jednoczesną identyfikację wielu markerów białkowych na tym samym szkiełku tkankowym, zarówno w jasnym polu, jak i w polu fluorescencyjnym9. Postęp ten zapewnia dokładną analizę składu komórkowego i interakcji molekularnych między komórkami zrębu, komórkami odpornościowymi i komórkami nowotworowymi w obrębie TME.

W tym badaniu prezentujemy protokół dla multipleksowej cyklicznej immunohistochemii do analizy przestrzennego rozkładu komórek odpornościowych. Do inkubacji jednocześnie wybiera się dwa przeciwciała pierwszorzędowe różnych gatunków, takie jak królik i szczur, a następnie przeciwciała drugorzędowe znakowane fluorescencyjnie. Pobieranie antygenu odbywa się po każdej rundzie reakcji antygen-przeciwciało. Autofluorescencja jest zablokowana, a do barwienia jąder stosuje się 4', 6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI). Panel obejmuje sekwencyjne wykrywanie CD3, CD8, CD20 i CK, komórki są podzielone na kategorie według markerów: komórki nowotworowe (CK+), dojrzałe limfocyty T (CD3+), cytotoksyczne limfocyty T (CD3+CD8+), limfocyty B (CD20+)10,11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania zostały zatwierdzone przez komisję etyki medycznej Szpitala Onkologicznego w Yunnan/Trzeciego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Medycznego w Kunming. Wszyscy uczestnicy/opiekunowie prawni podpisali świadomą zgodę.

1. Przygotowanie slajdów

  1. Wytnij skrawki sparowanych bloków parafiny zawierających pierwotny guz płuc lub raka płuc przerzuty do mózgu o grubości 4 μm za pomocą mikrotomu. Wyjmij skrawki do wody i oddziel pęsetą, wybierz najlepszą i przyklej ją do szkiełka pokrytego polilizyną.
  2. Umieścić szkiełka chusteczek w piecu w temperaturze 65 °C na 30 minut, aby zwiększyć przyczepność tkanek.
  3. Zanurz szkiełka w ksylenie w trzech zmianach, z których każda trwa 10 minut.
  4. Stopniowo zmniejszaj stężenie alkoholu i inkubuj szkiełka w 100% etanolu przez 5 min, 90% etanolu przez 5 min, 75% etanolu przez 5 min i w wodzie dejonizowanej przez 3 min.

2. Pobieranie epitopów pod wpływem ciepła (HIER)

  1. Rozcieńczyć 100x roztwór buforowy cytrynianu sodu (pH 6,0) do 1x (10 mM) w wodzie dejonizowanej, przygotowując wystarczającą ilość roztworu buforowego, aby całkowicie zanurzyć szkiełka.
  2. Umieść szkiełka w szybkowarze, poddając je działaniu wysokiej temperatury (100 °C) i ciśnienia (~30 psi) przez 2 minuty. Po podgrzaniu pozwól szkiełkom ostygnąć do temperatury pokojowej w wodzie destylowanej przez 3 minuty.
  3. Rozpuścić jedno opakowanie 52 g soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; sproszkowanej) w 5 l wody dejonizowanej w celu przygotowania roztworu buforowego PBS (pH 7,0). Umieść szkiełka w roztworze buforowym PBS na 5 minut, z 3 zmianami.

3. Blokowanie peroksydazy

  1. Przykryj skrawki 3% nadtlenkiem wodoru i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przepłukać szkiełka w PBS, 3x po 5 minut każda.
  2. Użyj bibuły filtracyjnej, aby wchłonąć nadmiar wody z dala od obwodu tkanki. W międzyczasie upewnij się, że chusteczka jest wilgotna.

4. Inkubacja przeciwciał pierwotnych dla pierwszej rundy

  1. Przygotować mieszaninę roboczą przeciwciał pierwszorzędowych dla CD8 (przeciwciało monoklonalne królika, klon SP16) i CD20 (mysie przeciwciało monoklonalne, klon L26), rozcieńczoną w stosunku 1:50 w rozcieńczalniku przeciwciał pierwszorzędowych Bond.
  2. Dodać kompleks przeciwciał na skrawki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  3. Przygotować roztwór 0,1% soli fizjologicznej/buforowanej fosforanem: 1 ml Tween w 1 l roztworu buforowego PBS.
  4. Umyj sekcje 0,1% soli fizjologicznej/buforowanej fosforanem, 3x po 5 minut. Użyj bibuły filtracyjnej, aby odciągnąć nadmiar wody od obwodu tkanki, w międzyczasie upewnij się, że tkanka jest wilgotna.

5. Drugorzędowa inkubacja przeciwciał dla pierwszej rundy

  1. Przygotować mieszaninę znakowanego fluorescencyjnie koziego przeciwciała anty-króliczego (wzbudzenie (Ex): 495 nm) i koziego przeciwciała anty-mysiego (Ex: 578 nm), rozcieńczoną w stosunku 1:50 w roztworze soli fizjologicznej buforu fosforanowego. Przeciwciało przeciwko królikowi kozie przyłącza się do pierwszorzędowego przeciwciała CD8, a kozie przeciwciało anty-mysie przyłącza się do pierwszorzędowego przeciwciała CD20.
  2. Dodawać kroplami mieszaninę przeciwciał drugorzędowych i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.

6. Pobieranie epitopów i blokowanie peroksydazy pod wpływem ciepła

  1. Rozcieńczyć 100x cytrynian sodu (pH 6,0) do 1x (10 mM) w wodzie dejonizowanej, przygotowując wystarczającą ilość roztworu buforowego, aby całkowicie zanurzyć szkiełka.
  2. Umieść szkiełka w szybkowarze i poddaj je działaniu wysokiej temperatury (100 °C) i ciśnienia (~30 psi) przez 1 minutę. Po podgrzaniu umieść szkiełka w wodzie destylowanej, aby ostygły do temperatury pokojowej przez 3 minuty.
  3. Wykonaj blokowanie peroksydazy zgodnie z opisem w kroku 3.

7. Inkubacja przeciwciał pierwotnych do drugiej rundy

  1. Przygotować mieszaninę roboczą pierwszorzędowych przeciwciał przeciwko CD3 (przeciwciało monoklonalne królika, klon SP7) i CK (mysie przeciwciało monoklonalne, MX005), rozcieńczoną w stosunku 1:50 w rozcieńczalniku przeciwciał pierwszorzędowych.
  2. Dodać kompleks przeciwciał na skrawki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  3. Przemyć 0,1% solą fizjologiczną/buforowaną fosforanem, 3x po 5 minut. Użyj bibuły filtracyjnej, aby odciągnąć nadmiar wody od obwodu tkanki, w międzyczasie upewnij się, że tkanka jest wilgotna.

8. Drugorzędowa inkubacja przeciwciał do drugiej rundy

  1. Przygotować mieszaninę kozich przeciwciał przeciwko królikom (np. 652 nm) i kozim przeciwciałom przeciwko mysim przeciwciałom (np. 590 nm), rozcieńczając 1:50 w roztworze soli fizjologicznej z buforu fosforanowego. Przeciwciało przeciwko królikowi kozy przyłącza się do pierwszorzędowego przeciwciała CD3, a kozie przeciwciało anty-mysie przyłącza się do pierwszorzędowego przeciwciała CK.
  2. Dodawać kroplami mieszaninę przeciwciał wtórnych, inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Przemyć 0,1% solą fizjologiczną/buforowaną fosforanem, 3x po 5 minut.

9. Wygaszanie autofluorescencji i barwienie DAPI

  1. Dodać odczynnik (0,15 M/L KMnO4) do przekroju tkanki na 1 min. Płukać pod bieżącą wodą przez 5 min.
    UWAGA: KMnO4 jest toksyczny i uszkadza skórę. Upewnij się, że nosisz rękawiczki podczas obsługi szkiełek. Jeśli płyn kapie na skórę, szybko zetrzyj go czystymi serwetkami i spłucz bieżącą wodą.
  2. Suszyć szkiełko rosnącym stężeniem alkoholu (70%, 90%, 100%) przez 3 minuty w każdym stężeniu.
  3. Dodaj DAPI i szkiełko nakrywkowe do obrazowania wielospektralnego. Ilość DAPI zależy od wielkości tkanki. Upewnij się, że tkanka jest całkowicie pokryta DAPI po dodaniu szkiełka nakrywkowego.

10. Skanowanie slajdów

  1. Umieść szkiełka na tacy i dociśnij, aż nie będzie można jej dalej popchnąć.
  2. Aby uruchomić program, kliknij dwukrotnie ikonę programu na pulpicie. Podczas uruchamiania wyświetlane jest okno wyboru trybu. W oknie wyboru wyświetlane są dwa tryby jasnego pola i fluorescencji: tryb automatyczny i tryb ręczny. W trybie skanowania fluorescencyjnego kliknij opcję Automatic Mode (Tryb automatyczny).
  3. Najedź kursorem myszy na ? przycisk, aby wyświetlić informacje o ustawieniach. Kliknij Ustawienia filtru > Filtruj kanał, aby wybrać numer kanału > pseudokolor. Zdefiniuj kolor i zapisz.
  4. Kliknij opcję Routine Work (Praca rutynowa> tryb skanowania> Pełna automatyka. Kliknij opcję Praca rutynowa > Nazwa slajdu, aby zdefiniować nazwę slajdu dla danych wyjściowych. Kliknij opcję Routine Work > Channel Settings (Ustawienia kanału), aby wybrać filtry.
  5. Kliknij opcję Routine Work > Scan Options (Opcje skanowania), aby określić wynikową jakość i miejsce przechowywania wirtualnego slajdu.
  6. Kliknij przycisk Podgląd, aby ustawić próg i wybrać zakres do skanowania.
  7. Kliknij opcję Sprzęt > Filtry > Live > Auto Focus > Auto Exposure > Digital Gain > Tick użyj ręcznego czasu ekspozycji > Tick ograniczając zakres > Ustaw prąd.
  8. Kliknij opcję Routine Work (Praca rutynowa> rozpocząć skanowanie. Wybierz poziom powiększenia jako 20x lub 40x. Wybierz 20x, aby uzyskać odpowiednie rozmiary plików. Rozszerzenie MRXS jest definiowane przez skaner 3D Pannoramic MIDI. Rozszerzenie obrazu można również zmienić na obraz TIFF.
  9. Kliknij pozycję Przeglądarka slajdów > Przybornik multiwidoku, aby wybrać obraz do konfokalnej, a następnie wyrównaj i zintegruj obraz.

11. Ilościowa ocena gęstości komórek

  1. Określ ilościowo odsetek dodatnich komórek odpornościowych (CD3+, CD3+CD8+, CD20+) w obszarach guza i zrębu za pomocą oprogramowania skanera Halo 10. Zweryfikuj barwienie CK, aby zdefiniować tkankę nowotworową.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiamy protokół cyklicznej detekcji antygenów z wykorzystaniem 5-kolorowej multipleksowej fluorescencji na jednym preparacie. Dzięki optymalizacji testu umożliwiliśmy inkubację dwóch przeciwciał z różnych gatunków (Rysunek 1). Niezbędne urządzenia do przeprowadzenia procedury eksperymentalnej obejmują szybkowar oraz pudełko do immunostainingu (Rysunek 2A).

Po zakończeniu analizy, przed skanowaniem preparatów, definiujemy kolory...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisaliśmy proces barwienia immunohistochemicznego multipleksowej cyklicznej fluorescencji. Pierwszorzędowy wybór przeciwciał jest kluczowym aspektem testu immunohistochemicznego fluorescencji, a przeciwciała monoklonalne są zalecane w celu uzyskania lepszej swoistości i powtarzalności. Aby zoptymalizować stężenie robocze przeciwciała pierwotnego, za pomocą eksperymentów immunohistochemicznych przetestowano serię rozcieńczeń. Zarówno kontrole pozytywne (w celu oceny ekspresji antygenu docelowego), jak i kontrole ujemne (...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie są im znane żadne konkurencyjne interesy finansowe ani powiązania osobiste, które mogłyby mieć wpływ na pracę opisaną w tym artykule.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (NO.81860413, 81960455), Yunnan Science and Technology Department Fund (202001AY070001-080), Fundację Badań Naukowych Departamentu Edukacji Prowincji Yunnan (2019J1274).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,15 mol/L KmnO4Maixin Biotechnology Co. Ltd.MST-8005
100x cytrynian sodu Maixin Biotechnology Co., LtdMVS-0100
3% nadtlenek wodoruMaixin Biotechnology Co., LtdSP KIT-A1
3D Pannoramic MIDI3D histech LtdPannoramic MIDI 1.18
Alexa Fluor 488Abcamab150113
Alexa Fluor 568 Abcamab175701
Alexa Fluor 594Abcamab150116
Alexa Fluor 647Abcamab150079
Rozcieńczalnik przeciwciał pierwotnychLeciaAR9352
CD20Maixin Biotechnology Co., Ltdzestaw-0001
CD3Maixin Biotechnology Co., Ltd.  zestaw-0003
CD8 Maixin Biotechnology Co., LtdRMA-0514
CKMaixin Biotechnology Co. Ltd.MAB-0671,
DAPIsig-maD8417
etanolSinopharm Group Chemical reagent Co., LTD10009218
Histocore Multicutlecia2245
PBS (proszek)Maixin Biotechnology Co., LtdPBS-0061
wiwer do prowadnic 3D histech Ltd
ksylenSinopharm Group Odczynnik chemiczny Co., LTD10023418

Bibliografia

  1. Wanleenuwat, P., Iwanowski, P. Metastases to the central nervous system: Molecular basis and clinical considerations. J Neurol Sci. 412, 116755(2020).
  2. Schoenmaekers, J., Dingemans, A. C., Hendriks, L. E. L. Brain imaging in early stage non-small cell lung cancer: still a controversial topic. J Thorac Dis. 10, S2168-S2171 (2018).
  3. Vilariño, N., Bruna, J., Bosch-Barrera, J., Valiente, M., Nadal, E. Immunotherapy in NSCLC patients with brain metastases. Understanding brain tumor microenvironment and dissecting outcomes from immune checkpoint blockade in the clinic. Cancer Treat Rev. 89, 102067(2020).
  4. Babar, Q., Saeed, A., Tabish, T. A., Sarwar, M., Thorat, N. D. Targeting the tumor microenvironment: Potential strategy for cancer therapeutics. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1869 (6), 166746(2023).
  5. Goldberg, S. B., et al. Pembrolizumab for management of patients with NSCLC and brain metastases: long-term results and biomarker analysis from a non-randomised, open-label, phase 2 trial. Lancet Oncol. 21 (5), 655-663 (2020).
  6. Sukswai, N., Khoury, J. D. Immunohistochemistry Innovations for Diagnosis and Tissue-Based Biomarker Detection. Curr Hematol Malig Rep. 14 (5), 368-375 (2019).
  7. Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. Immunohistochemistry in Investigative and Toxicologic Pathology. Toxicol Pathol. 46 (5), 488-510 (2018).
  8. Torlakovic, E. E., Nielsen, S., Vyberg, M., Taylor, C. R. Getting controls under control: the time is now for immunohistochemistry. J Clin Pathol. 68 (11), 879-882 (2015).
  9. Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commun (Lond). 40 (4), 135-153 (2020).
  10. Wong, P. F., et al. Multiplex quantitative analysis of tumor-infiltrating lymphocytes and immunotherapy outcome in metastatic melanoma. Clin Cancer Res. 25 (8), 2442-2449 (2019).
  11. Sanchez, K., et al. Multiplex immunofluorescence to measure dynamic changes in tumor-infiltrating lymphocytes and PD-L1 in early-stage breast cancer. Breast Cancer Res. 23 (1), 2(2021).
  12. Zhang, W., et al. Multiplex immunohistochemistry indicates biomarkers in colorectal cancer. Neoplasma. 68 (6), 1272-1282 (2021).
  13. Salameh, S., Nouel, D., Flores, C., Hoops, D. An optimized immunohistochemistry protocol for detecting the guidance cue Netrin-1 in neural tissue. MethodsX. 5, 1-7 (2018).
  14. McClellan, P., Jacquet, R., Yu, Q., Landis, W. J. A Method for the immunohistochemical identification and localization of Osterix in periosteum-wrapped constructs for tissue engineering of bone. J Histochem Cytochem. 65 (7), 407-420 (2017).
  15. Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Arch Pathol Lab Med. 135 (10), 1335-1342 (2011).
  16. Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. J Immunother Cancer. 8 (1), 000155(2020).
  17. Clarke, G. M., et al. A novel, automated technology for multiplex biomarker imaging and application to breast cancer. Histopathology. 64 (2), 242-255 (2014).
  18. Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histol Histopathol. 25 (8), 1017-1024 (2010).
  19. Ahrens, M. J., Dudley, A. T. Chemical pretreatment of growth plate cartilage increases immunofluorescence sensitivity. J Histochem Cytochem. 59 (4), 408-418 (2011).
  20. Zhang, Y., et al. Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy. J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Multiplexowa immunohistochemiamikrośrodowisko guzasubpopulacje limfocytówodsłanianie antygenówtkanka utrwalona w formalinieprzerzuty do mózgulimfocyty naciekające guzobrazowanie wielospektralneinkubacja przeciwciał
Multipleksowa cykliczna immunohistochemia fluorescencyjna
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.