Wykorzystanie obrazowania żywych komórek do pomiaru wpływu patologicznych białek na transport aksonalny w pierwotnych neuronach hipokampa

Podsumowanie

Tutaj pokazujemy, jak połączyć transfekcję pierwotnych neuronów gryzoni hipokampa z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek, aby przeanalizować patologiczne efekty wywołane przez białka na transport aksonalny i zidentyfikować szlaki mechanistyczne pośredniczące w tych efektach.

Streszczenie

Dwukierunkowy transport ładunków wzdłuż aksonu jest kluczowy dla utrzymania funkcjonalnych synaps, połączeń neuronowych i zdrowych neuronów. Transport aksonalny jest zakłócony w wielu chorobach neurodegeneracyjnych, a neurony projekcyjne są szczególnie wrażliwe ze względu na konieczność transportu materiałów komórkowych na duże odległości i utrzymania znacznej masy aksonalnej. Patologiczne modyfikacje kilku białek związanych z chorobą negatywnie wpływają na transport, w tym tau, β amyloidu, α-synukleiny, dysmutazy ponadtlenkowej i huntingtyny, zapewniając potencjalny wspólny mechanizm, za pomocą którego patologiczne białka wywierają toksyczność w chorobie. Metody badania tych toksycznych mechanizmów są niezbędne do zrozumienia zaburzeń neurodegeneracyjnych i identyfikacji potencjalnych interwencji terapeutycznych.

Tutaj hodowane pierwotne neurony hipokampa gryzoni są współtransfekowane z wieloma plazmidami w celu zbadania wpływu patologicznych białek na szybki transport aksonalny za pomocą obrazowania konfokalnego żywych komórek fluorescencyjnie znakowanych białek ładunku. Zaczynamy od zbioru, dysocjacji i hodowli pierwotnych neuronów hipokampa od gryzoni. Następnie dokonujemy kotransfekcji neuronów za pomocą plazmidowych konstruktów DNA w celu ekspresji znakowanego fluorescencyjnie białka ładunkowego i tau typu dzikiego lub zmutowanego (używanego jako przykład patologicznych białek). Aksony są identyfikowane w żywych komórkach za pomocą przeciwciała, które wiąże zewnątrzkomórkową domenę neurofaszyny, białko początkowego segmentu aksonu, a obszar aksonalny będący przedmiotem zainteresowania jest obrazowany w celu pomiaru fluorescencyjnego transportu ładunku.

Korzystając z KymoAnalyzer, swobodnie dostępnego makra ImageJ, szczegółowo charakteryzujemy prędkość, częstotliwość pauz i kierunkową gęstość ładunku w transporcie aksonalnym, na wszystkie te czynniki może mieć wpływ obecność patologicznych białek. Dzięki tej metodzie identyfikujemy fenotyp zwiększonej częstotliwości pauzy ładunku związany z ekspresją patologicznego białka tau. Dodatkowo, wyciszające geny konstrukty shRNA mogą zostać dodane do mieszanki transfekcyjnej w celu przetestowania roli innych białek w pośredniczeniu w zakłóceniach transportu. Protokół ten można łatwo dostosować do stosowania z innymi białkami związanymi z chorobami neurodegeneracyjnymi i jest powtarzalną metodą badania mechanizmów, w jaki sposób białka te zakłócają transport aksonalny.

Wprowadzenie

Neurony polegają na dwukierunkowym transporcie ładunku wzdłuż aksonu, aby utrzymać funkcjonalne synapsy i łączność neuronową. Uważa się, że deficyty transportu aksonalnego są kluczowymi czynnikami przyczyniającymi się do patogenezy kilku chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Alzheimera (AD) i innych tauopatii, choroby Parkinsona, stwardnienia zanikowego bocznego i choroby Huntingtona^1,2,3. Rzeczywiście, patologiczne modyfikacje kilku białek związanych z chorobą negatywnie wpływają na transport (przegląd w ⁴). Opracowanie metod badania mechanizmów, za pomocą których patologiczne białka wywierają toksyczność w chorobie, jest niezbędne do zrozumienia zaburzeń neurodegeneracyjnych i zidentyfikowania potencjalnych celów interwencji terapeutycznej.

Kilka ważnych spostrzeżeń na temat transportu aksonów, w tym odkrycie konwencjonalnej kinezyny, zależnych od kinaz i fosfataz szlaków regulujących białka motoryczne oraz mechanizmów, za pomocą których patologiczne białka zakłócają regulację transportu aksonów, zostało dokonanych przy użyciu modelu izolowanej aksoplazmy kałamarnicy^4,5. Perfuzja aksoplazmy kałamarnicy z patologicznymi formami białka tau hamuje następczy szybki transport aksonalny (FAT), efekt zależny od ekspozycji domeny aktywującej fosfatazę tau, która aktywuje fosfatazę białkową 1 (PP1)^6,7,8. PP1 aktywuje kinazę syntazy glikogenu 3 (GSK3), która z kolei fosforyluje łańcuchy lekkie kinezyny, powodując uwolnienie ładunku. Innym patologicznym białkiem w chorobie Alzheimera jest β amyloidu. Oligomeryczne formy β amyloidu hamują dwukierunkowy FAT poprzez kinazę kazeinową 2, która fosforyluje łańcuchy lekkie kinezyny⁹. Co więcej, patologiczne białko huntingtyny zawierające ekspansję poliglutaminy i rodzinny mutant SOD1 sprzężony z ALS zakłócają transport aksonalny w aksoplazmie kałamarnicy poprzez odpowiednio N-końcową kinazę c-Jun i aktywność kinazy białkowej aktywowanej mitogenem p38^10,11.

Chociaż model aksoplazmy kałamarnicy nadal jest cennym narzędziem w zrozumieniu wpływu patologicznych białek na transport aksonalny, ograniczony dostęp do sprzętu i próbek uniemożliwia jego szersze zastosowanie. Opracowaliśmy test transportu z wykorzystaniem obrazowania pierwotnych neuronów pierwotnych gryzoni (myszy i szczurów) za pomocą mikroskopii konfokalnej żywych komórek. Model ten reprezentuje łatwe w adaptacji i manipulację podejście oparte na neuronach ssaków, wykorzystujące powszechnie dostępne źródła komórek i systemy mikroskopowe. Na przykład różne patologiczne białka (np. zawierające modyfikacje związane z chorobą) są wyrażane w celu określenia, w jaki sposób określone modyfikacje tych białek wpływają na transport w aksonach. Podobnie, różne fluorescencyjnie znakowane białka ładunkowe mogą być wykorzystane do zbadania zmian specyficznych dla ładunku. Co więcej, podstawowe mechanizmy molekularne są badane stosunkowo łatwo poprzez ukierunkowanie na ekspresję (tj. knockdown lub nadekspresję) wybranych białek, które mogą pośredniczyć w tych efektach. Metodę tę można również łatwo dostosować do pierwotnych neuronów pochodzących z szerokiej gamy modeli zwierzęcych.

Przedstawiamy szczegółowy protokół opisujący test transportu aksonów przez żywe komórki, który był wcześniej używany w pierwotnych neuronach hipokampa, aby pokazać, że zmutowane białka tau są związane z otępieniami płata czołowo-skroniowego (FTLD; P301L lub R5L tau) zwiększają częstotliwość pauz znakowanych fluorescencyjnie białek ładunkowych dwukierunkowo¹². Co więcej, powalenie izoformy PP1γ uratowało efekty pauzy¹². Zapewnia to wsparcie dla modelu patologicznego zakłócenia wywołanego przez tau, w którym pośredniczy nieprawidłowa aktywacja szlaku sygnałowego zainicjowanego przez PP1, jak opisano powyżej^6,7,12. W osobnym badaniu wykazaliśmy, że pseudofosforylacja tau w S199 / S202 / T205 (patogenny fosfoepitop AT8 istotny dla tauopatii) zwiększyła częstotliwość pauzy ładunku i prędkość odcinka następczego. Efekty te były zależne od N-końcowej domeny aktywującej fosfatazę tau¹³. Przykłady te podkreślają użyteczność tego modelu w identyfikacji mechanizmów tego, jak patologiczne białka zakłócają transport aksonów w neuronach ssaków.

Ten artykuł zawiera szczegółowy opis metody, zaczynając od zbierania, dysocjacji i hodowli pierwotnych mysich neuronów hipokampa, następnie transfekcji neuronów z białkami cargo połączonymi z białkiem fluorescencyjnym, a na końcu obrazowania żywych komórek i analizy obrazu. Pokazujemy, w jaki sposób ta metoda jest wykorzystywana do badania wpływu zmodyfikowanego tau na dwukierunkowy transport białka związanego z pęcherzykami, synaptofizyny, jako przykładu. Istnieje jednak elastyczność w białku patogennym i białku ładunku transportowego, co sprawia, że jest to wszechstronne podejście do badania transportu aksonalnego.

Protokół

Te protokoły zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Michigan. Protokół ten został z powodzeniem zastosowany do myszy Tau Knockout w tle C57BL / 6J i szczurów Sprague Dawley typu dzikiego. Inne szczepy również powinny być dopuszczalne.

1. Pierwotne żniwo neuronów hipokampa

1. Pokryj 4-dołkowe szkiełko z dolną komorą przefiltrowaną 0,5 mg/ml poli-d-lizyny (PDL) w buforze boranowym (12,5 mM dekahydratu boranu sodu i 50 mM kwasu borowego). Dodać 750 μl/studzienkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez noc.
2. Umyj szkiełko komory 4x sterylną wodą dejonizowaną. Po ostatnim praniu wysuszyć na powietrzu i przechowywać w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego przechowywania (<1 tydzień).
   UWAGA: Nie pozwól, aby PDL wyschł na szkiełku przed i między praniami, ponieważ jest to toksyczne dla kultur. Odkryliśmy, że długotrwałe przechowywanie szkiełek pokrytych PDL może wpływać na zdrowie neuronów i że utrzymywanie stałych odstępów między powlekaniem a posiewem zmniejsza zmienność żywotności kultur między cyklami.
3. Uzyskaj ciężarną w czasie mysz lub szczura.
   UWAGA: Zwierzęta w ciąży w ciąży w czasie można zamawiać w różnych firmach lub hodować we własnym zakresie. Dzień zerowy embrionalny odnosi się do dnia, w którym znaleziono czop pochwowy i dzięki temu podejściu odnieśliśmy sukces w hodowli pierwotnych neuronów hipokampa i kory mózgowej myszy E16-18. Neurony szczurów są również pobierane w 18 dniu embrionalnym.
4. W dniu E18 poddać ciężarnej kobiecie eutanazji zatwierdzoną metodą. Przetnij ścianę brzucha i usuń dwa rogi macicy. Przenieś je na szalkę Petriego zawierającą lodowatą sól fizjologiczną o zawartości 0,9%. Płucz, aż sól fizjologiczna będzie czysta.
   UWAGA: Podajemy przedawkowanie pentobarbitalu sodu (co najmniej 100 mg/kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym.
5. Odetnij głowę szczeniętom. Zaczynając od otworu wielkiego (otwór w tylnej części czaszki), użyj nożyczek do mikrodysekcji, aby przeciąć skórę i czaszkę wzdłuż linii środkowej, ustawiając dolną końcówkę nożyczek pod kątem do wewnętrznej części czaszki, aby uniknąć uszkodzenia tkanki mózgowej.
6. Usuń leżącą na wierzchu skórę i ostrożnie usuń czaszkę, aby odsłonić mózg.
7. Użyj kleszczy, aby przytrzymać obszar ust/nosa i obróć czaszkę tak, aby mózg był skierowany w dół nad szalką Petriego wypełnioną 0,9% solą fizjologiczną. Wyłóż mózg z czaszki i przetnij nerwy i pień mózgu, aby uwolnić mózg do soli fizjologicznej.
8. Umieść szalkę Petriego pod mikroskopem preparacyjnym w celu wypreparowania hipokampa. Włóż nożyczki w linię środkową mózgu, ustaw je pod kątem tak, aby górne ostrze wypychało jedną z półkul mózgowych na zewnątrz i przetnij, aby oddzielić półkulę od obszarów podkorowych.
9. Wykonaj pionowe przecięcie przez korę tak, aby kora czołowa znajdowała się z przodu, a hipokamp z tyłu miejsca cięcia. Włóż dolną końcówkę nożyczek do powstałego otworu i ostrożnie przetnij wzdłuż wierzchołka kory, zatrzymując się na tylnym końcu.
10. Za pomocą kleszczy ostrożnie odchyl korę i zakończ tylne cięcie. Hipokamp powinien przypominać kształt półksiężyca. Ostrożnie przytnij pozostałą korę, aby hipokamp zachował swój zaokrąglony, półksiężycowy kształt.
11. Za pomocą kleszczy i nożyczek delikatnie usuń opony mózgowe z hipokampa.
    UWAGA: Ważne jest, aby usunąć wszystkie opony mózgowe z mózgu, aby zmniejszyć liczbę komórek nieneuronalnych, które są zbierane podczas powstrzymywania się od uszkodzenia lub rozerwania tkanki hipokampa.
12. Pokrój hipokamp na cztery równe części i umieść tkankę w stożkowej probówce o pojemności 15 ml wypełnionej lodowatym buforem bez wapnia i magnezu (CMF; PBS firmy Dulbecco z 0,1% glukozy, 2,5 μg/ml amfoterycyny B i 50 μg/ml gentamycyny).
    UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, zbierz hipokampy od 5-10 szczeniąt na dysocjację. Każdy hipokamp powinien dostarczać około 300 000 komórek dla myszy i 500 000 komórek dla szczurów.

2. Pierwotna dysocjacja i poszycie neuronów hipokampa

1. Wyjmij CMF za pomocą pipety Pasteura i spłucz tkankę świeżym, zimnym CMF 4x, delikatnie obracając między płukaniami.
2. Usunąć CMF i dodać 3 ml przefiltrowanego 0,125% roztworu trypsyny (rozcieńczyć 2,5% trypsyny we wstępnie podgrzanym [37 °C] CMF). Inkubować tkankę dokładnie przez 15 minut w temperaturze 37 °C; Delikatnie mieszać co 5 minut
   UWAGA: Przygotuj roztwór trypsyny bezpośrednio przed użyciem.
3. Przygotować 5 ml roztworu do inaktywacji trypsyny (TIS; Zbilansowany roztwór soli Hanksa, 20% surowica nowonarodzonych cieląt i 1x roztwór DNazy I [10x zapas: 5 mM octanu sodu, 1 μM chlorku wapnia, 0,5 mg/ml DNazy I]).
4. Usuń roztwór trypsyny i przemyj 2x zimnym CMF. Dodaj 3 ml zimnego TIS.
5. Dysocjacja komórek poprzez rozcieranie za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml z igłami o coraz mniejszej średnicy: rozdziel 30 razy za pomocą igły 14 G, 30 razy za pomocą igły 15 G, 20 razy za pomocą igły 16 G, 20 razy za pomocą igły 18 G i 15 razy za pomocą igły 21 G. Wykonać 2 s zaciągnięć pierwszymi czterema igłami i 3 s pobrań igłą 21 G.
   UWAGA: Można również zastosować inne metody rozcierania (np. pipety ze szkła polerowanego ogniowo^14,15). Odkryliśmy, że stosowanie standardowych metalowych igieł strzykawkowych znacznie zmniejsza zmienność zlepiania się komórek i ich żywotności.
6. Za pomocą igły 21 G umieścić kroplę zawiesiny komórek na szkiełku mikroskopowym i sprawdzić, czy nie ma grudek komórek. Jeśli zaobserwuje się kilka grudek, rozcierać jeszcze trzy razy przez igłę 22 G i ponownie sprawdzić. Powtarzaj ten proces, aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny jednokomórkowej, uważając, aby delikatnie rozcierać przez cały proces.
7. Przefiltrować 5 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm. Delikatnie nałóż zawiesinę komórek na FBS w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Odwirować komórki (200 × g w temperaturze 4 °C) przez 5 minut.
8. Usuń jak najwięcej FBS bez zakłócania pelletu. Zawiesić w 1 ml ciepłej (37 °C) pożywki neuropodstawowej wolnej od antybiotyków (NBM; uzupełnionej 1x substytutem glutaminy i 1x B-27).
9. Rozcieńczyć zawiesinę komórek w błękitu trypanowym (0,4%) i uzyskać liczbę komórek.
   UWAGA: Rozcieńczenie 1:1 dobrze sprawdza się w przypadku automatycznego liczenia komórek i służy do ręcznego liczenia za pomocą hemacytometru rozcieńczenia 1:60. Aby kontynuować posiewanie komórek, żywotność neuronów powinna być w tym momencie wyższa niż 90%. To znacznie zwiększa prawdopodobieństwo zdrowej hodowli neuronów po dysocjacji.
10. Płytki komórek o gęstości 175 000 komórek/dołek (70 000 komórek/^mm2) we wstępnie podgrzanym, czterodołkowym szkiełku podstawowym pokrytym PDL w 750 μl NBM bez antybiotyków. Dodatkowo umieścić 200 000 komórek / basenik w czterech dołkach 24-dołkowej płytki pokrytej PDL w 1,5 ml NBM bez antybiotyków do użycia jako kondycjonowane podłoże w transfekcji opisanej w sekcji 3. Inkubować komórki w komorze o kontrolowanej wilgotności 37 °C i 5% CO_{2 .}
    UWAGA: Gęstość komórek można dostosować na podstawie wyników. Wysokie zagęszczenie może utrudnić obrazowanie neuronów, podczas gdy niskie zagęszczenie może negatywnie wpłynąć na zdrowie kultury i przeżycie neuronów. Z naszego doświadczenia wynika, że neurony szczurów mogą być powlekane o mniejszej gęstości w porównaniu z neuronami myszy.

3. Transfekcja neuronów

UWAGA: Neurony mogą być transfekowane na DIV 7 lub DIV 8 bez zauważalnych zmian w wydajności transfekcji lub wynikach transportu. Objętości te dotyczą czterech studzienek czterodołkowego szkiełka komorowego ze szklanym dnem o objętości 750 μl/studzienkę. Protokół ten opisuje transfekcję przy użyciu odczynników do transfekcji lipidów. Przed użyciem odczekać, aż pożywka i odczynniki do transfekcji ogrzeją się do temperatury pokojowej.

1. Przygotować podstawowy odczynnik do transfekcji, dodając 4,4 μl odczynnika do transfekcji do 127,6 μl pożywki o zredukowanej surowicy. Delikatnie kołysz ręcznie, aby wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
2. Przygotować zapasy DNA podczas inkubacji transfekcji lipidów. Dodać 200 ng fluorescencyjnego ładunku DNA (pFIN mApple-synaptofizyna; 12,112 par zasad) i 200 ng DNA w celu ekspresji interesującego białka (użyte plazmidy tau były konstruktami pCMV tau-Flag; 5,036 par zasad) do zredukowanej surowicy lub pożywki wolnej od surowicy do końcowej objętości 32 μL¹². Dodać 0,8 μl odczynnika wzmacniającego transfekcję (2 μl na μg DNA). Dobrze wymieszaj ręcznie.
   UWAGA: Uważamy, że najlepiej sprawdza się pochodna zapytania ofertowego (mApple lub mCherry), ale można również użyć GFP. Dodatkowo, konstrukt DNA do ekspresji małego RNA spinki do włosów (shRNA) wyciszającego gen może zostać włączony do testowania mechanizmów fenotypów obserwowanych przy ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania. Aby to zrobić, włącz 150 ng każdego z trzech konstruktów DNA do mieszanki DNA i odpowiednio dostosuj ilość odczynnika wzmacniającego transfekcję. Zmiana parametrów DNA lub odczynnika do lipofekcji może mieć wpływ na wydajność transfekcji i może być dostosowana w zależności od zapotrzebowania na mniej lub bardziej wydajne transfekcje.
3. Dodać 32 μl mieszanki do transfekcji lipidów do każdej probówki DNA. Delikatnie kołysz ręcznie, aby wymieszać. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
4. Powoli dodawać 64 μl mieszaniny DNA/odczynnika do transfekcji do komórek, umieszczając końcówkę pipety tuż pod powierzchnią pożywki i poruszając się serpentynowymi ruchami po całej studzience. Delikatnie kołysz szkiełkiem komory ręcznie 3x po dodaniu do wszystkich studzienek, aby dalej mieszać i umieść szkiełko komorowe w inkubatorze. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 2 h.
   UWAGA: Zminimalizuj czas, w którym neurony znajdują się poza inkubatorem, ponieważ są one bardzo wrażliwe na zmiany temperatury i pH, które mogą wystąpić szybko.
5. Wykonać połówkową zmianę podłoża 2 godziny po transfekcji z kondycjonowaną pożywką + przeciwciało neuroposzynowe. Bezpośrednio przed zmianą pożywki należy zebrać 1,5 ml kondycjonowanego, wolnego od antybiotyków NBM z komórek hodowanych na 24-dołkowej płytce. Dodać 0,75 μl przeciwciała Neurofascin 186 (NF-186) (500 ng/mL) do kondycjonowanej pożywki.
   UWAGA: Przeciwciało NF-186 wykrywa zewnątrzkomórkową domenę neurofaszyny, która jest wzbogacona w początkowy segment aksonu (AIS), aby ostatecznie zidentyfikować akson do obrazowania.
6. Wykonać pełną zmianę pożywki 18 godzin po transfekcji kondycjonowaną pożywką zawierającą przeciwciało drugorzędowe. Dodaj 1 μl koziego przeciwciała drugorzędowego przeciwko królikowi sprzężonego z AlexaFluor 647 do 3 ml kondycjonowanego NBM (bez antybiotyków) zebranego z 24-dołkowej płytki. Dobrze wymieszaj.

4. Obrazowanie neuronów

1. Przygotuj się do obrazowania 2 dni po transfekcji. Ogrzej nasadkę komory żywej komórki do mikroskopu konfokalnego do 37 °C (w tym olej do obiektywów i soczewek 60x) i zrównoważ komorę do 5% CO₂ .
2. Użyj obiektywu o dużym powiększeniu i komory na żywe komórki, aby zobrazować komórki.
   UWAGA: Używamy obiektywu 60x 1,40 NA w laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym, ale można również zastosować inne systemy mikroskopii konfokalnej (np. wirujący dysk) lub szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej, jeśli są one w stanie osiągnąć wysoką liczbę klatek na sekundę.
3. Wizualnie identyfikuj transfekowane neurony w kanale zawierającym białko ładunku za pomocą okularów. Następnie zobrazuj neurony, aby zidentyfikować AIS w kanale Cy5 (Rysunek 1).
4. Ustaw pole widzenia na prostokątne pole o wymiarach 32 piksele na 128 pikseli i przesuń je, aby zobrazować obszar aksonu ~50-150 μm dystalny do AIS. Zanotuj i zapisz kierunkowość transportu ładunku i orientację zwrotu z inwestycji. Kropki na polu pojawią się odpowiednio jako górna i prawa strona wszystkich kolejnych obrazów i filmów. Zapisz, która strona obrazu jest najbliżej ciała komórki, a która najbliżej końca aksonu, aby polilinia kimografu w kroku 5.1 mogła zostać narysowana w prawidłowej orientacji.
   UWAGA: Podczas wybierania obszaru zainteresowania, obrazowany obszar izolowanego aksonu powinien być względnie prosty i przecinać pole widzenia na każdym końcu. Cały segment powinien znajdować się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej. Obszar ten powinien być wyraźnie widoczny w miejscu aktywnego transportu ładunków. Nadmiernie jasne neurony zazwyczaj wyrażają białko ładunkowe i białka będące przedmiotem zainteresowania na poziomach, które mogą być toksyczne dla neuronu i należy ich unikać.
5. Ustaw moc lasera 561 na 1,40, otwór na 7,8, rozmiar na 128 px², a prędkość na 32 klatki/s. Dostosuj wzmocnienie, aby zobrazować transport pojedynczych pęcherzyków ładunkowych bez zasłaniania ich sygnałem tła (zwykle od 10 do 50 wyników w wysokiej jakości kimografach).
   UWAGA: Wyjątkowo niska moc lasera jest osiągalna dzięki bardzo czułym detektorom GaAsP i zapobiega potencjalnym efektom fototoksycznym i fotowybielaniu poruszających się ładunków. Rozmiar otworka jest ustawiony tak szeroko, jak to możliwe, aby zwiększyć głębokość ogniskowej i zapewnić, że cały zwrot z inwestycji jest obrazowany, ponieważ akson może nie leżeć idealnie płasko na powierzchni szkiełka.
6. Ustaw ROI, wybierając opcję Rysuj prostokątny ROI... z menu rozwijanego ROI. Narysuj ROI tak, aby obejmował całe pole widzenia. Kliknij prawym przyciskiem myszy ROI i wybierz Użyj jako stymulacji ROI: S1.
7. Przygotuj konfigurację ND, wykonując następujące czynności na karcie Ustawienia ND.
   UWAGA: Jest to pięcioetapowy protokół akwizycji, który jest konfigurowany raz, a następnie będzie wykonywany przez oprogramowanie za każdym razem, gdy filmy są zbierane.
   1. Uzyskaj obraz, aby zebrać obraz referencyjny przed stymulacją.
   2. stymulacja; Zwrot z inwestycji: S1; Interwał: NoDelay; Czas trwania 1,64 s, Pętle: 7. Ten krok wybiela fluorescencję tła za pomocą kilku impulsów lasera.
   3. Zdobądź obraz. Ten krok zbiera obraz referencyjny po stymulacji.
   4. Czekanie; Brak działania; 2 min. Ten krok zapewnia okres rekonwalescencji dla ładunku fluorescencyjnego w celu ponownego zaludnienia wybielonego zwrotu z inwestycji.
   5. nabycie; Interwał: NoDelay; Czas trwania 5 min, Pętle: 8,615. Ten krok zbiera obrazy z maksymalną szybkością przez 5-minutowy okres obrazowania.
8. Po skonfigurowaniu protokołu ND Setup kliknij przycisk Apply Stimulation Settings (Zastosuj ustawienia stymulacji) na karcie ND Setup (Ustawienia ND). Kliknij przycisk Uruchom teraz, gdy będzie gotowy do zobrazowania transportu ładunku. Spowoduje to zainicjowanie protokołu akwizycji ND z kroku 4.7.
   UWAGA: Chociaż liczba klatek na sekundę jest ustawiona na 32 klatki/s, praktyczna liczba klatek na sekundę może być mniejsza (~28,7 klatek/s). Wartość ta powinna być zapisana w celu dokładnej analizy kimografem w sekcji 5. Idealnie byłoby, gdyby obrazowanie transportu na żywo odbywało się z najszybszą możliwą liczbą klatek na sekundę (np. >25 klatek/s), aby lepiej rozszyfrować ruchy ładunku.
9. Zresetuj pole widzenia do całego obrazu, a następnie zbierz i zapisz obraz całego neuronu w kanałach 561 i 647 z dołączonym polem ROI. Zapisz współrzędne XY, w których wykonano obraz, w celu potwierdzenia ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania po fiksacji.
10. Zbierz filmy transportowe z co najmniej dwóch neuronów do analizy. Upewnij się, że każda niezależna replikacja pochodzi ze średnich zmiennych mierzonych z pojedynczego zbioru neuronów pierwotnych (tj. nie pojedynczych neuronów).
    UWAGA: Dla danego zbioru neuronów pierwotnych zbieramy filmy od 2 do 4 neuronów na warunek.
11. Napraw komórki, usuwając pożywkę i inkubując z podgrzanym 4% paraformaldehydem przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć bufor i przemywać komórki przez 3 x 5 min każda w TBS.
    UWAGA: Do wiązania paraformaldehydu używamy buforu cytoszkieletu, powszechnego buforu, który utrzymuje strukturę cytoszkieletu (10 mM kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego [MES], 138 mM KCl, 3 mM MgCl₂ i 4 mM EGTA, pH 6,1). Do utrwalania można również użyć innych (np. TBS, PBS).
12. Upewnij się, że analizowane neurony wyrażają zarówno białko będące przedmiotem zainteresowania, jak i fluorescencyjnie znakowane białko ładunku poprzez barwienie immunocytofluorescencyjne. Barwienie ludzkiego tau (Tau12) w celu potwierdzenia egzogennej ekspresji tau i tubuliny β-III (Tuj1) w celu sprawdzenia, czy neurony pozostały zdrowe przez cały proces obrazowania.
    UWAGA: Obserwujemy koekspresję obu konstruktów DNA w prawie wszystkich transfekowanych komórkach przy użyciu tych metod.

5. Generowanie i analizowanie kymografów

UWAGA: Kimografy mogą być generowane i analizowane za pomocą wielu różnych programów. Pokrótce opisujemy dostępne bezpłatnie oprogramowanie KymoAnalyzer (v. 1.01) wykorzystujące sześć wtyczek ImageJ (v. 1.51n): ¹⁶. Wtyczki te można pobrać od programistów ze strony internetowej laboratorium Encalada (https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer). Bardziej szczegółowe instrukcje dotyczące korzystania z tego oprogramowania można znaleźć na tej stronie.

1. Pogrupuj filmy wygenerowane w kroku 4.9 na podstawie warunków eksperymentalnych i powtórz je. Uruchom makro BatchKymographGeneration i wybierz odpowiedni folder. Narysuj polilinię kimograficzną, aby prześledzić akson zaczynający się od bliższego końca na tym konkretnym obrazie. Wynikowe kimografy są przechowywane w wybranym folderze (Rysunek 2).
2. Ścieżki można przypisać ręcznie, uruchamiając makro Ścieżki, zaznaczając pojedynczy folder z filmem, wybierając opcję tak, aby dodać ścieżkę, a następnie klikając, aby śledzić trajektorię każdej cząstki. Wykonaj początkowe kliknięcie w górnej części ścieżki i kliknij ponownie w każdym punkcie, w którym cząstka zmienia prędkość lub kierunek, tak aby polilinia nałożyła się na ślad cząstki na kimografie. Po ułożeniu polilinii na całej ścieżce kliknij przycisk OK. Powtarzaj, aż wszystkie ścieżki zostaną przypisane.
3. Uruchom pozostałe makra, przypisując liczbę klatek na sekundę i rozmiar pikseli na podstawie parametrów obrazowania. Najpierw uruchom polecenie CargoPopulation, następnie NetCargoPopulation, a następnie Segments. Wprowadź rozmiar pikseli i liczbę klatek na sekundę filmów po wyświetleniu monitu (odpowiednio 0,22 μm i 28,7 klatki/s przy tych ustawieniach). Na koniec uruchom makro poolData, aby obliczyć i zebrać dane parametrów transportu ze wszystkich kymografów w wybranym folderze.
4. Wykreśl wyniki z plików danych i porównaj różne warunki z niezależnymi powtórzeniami reprezentowanymi przez średnie wartości wszystkich analizowanych neuronów w warunkach eksperymentalnych dla pojedynczego zbioru neuronów.

Wyniki

Korzystając z tych metod, scharakteryzowaliśmy transport aksonalny w obecności dzikich lub związanych z chorobą form białka tau, aby zbadać potencjalne mechanizmy patologicznej neurotoksyczności wywołanej przez tau w chorobie^12,13. Oprogramowanie KymoAnalyzer oblicza i łączy różne parametry ze wszystkich kimografów w danym folderze. Stawki transportowe są obliczane tylko wtedy, gdy ładunek jest w ruchu (prędkość odcinkowa), a także stawka ogółem, z uwzględnieniem...

Dyskusja

Istnieje coraz więcej dowodów na to, że wiele patologicznych białek związanych z różnymi zaburzeniami neurodegeneracyjnymi zakłóca szybki transport aksonalny w neuronach. Stanowi to potencjalny wspólny mechanizm neurotoksyczności w tych chorobach. Aby lepiej zrozumieć proces, w którym białka te zakłócają transport, potrzebujemy narzędzi i modeli, które pozwolą nam odpowiedzieć na konkretne pytania. Opisana tutaj metoda pozwala na zbadanie mechanizmów zaangażowanych przez patologiczne białka w celu negatywnego wpływu na t...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,4% błękit trypanowy	Gibco	15250-061
1,7 ml probówki do mikrowirówek	DOT	RN1700-GMT
2,5% trypsyna	Gibco	15090-046
Strzykawka 3 ml z igłą 21 G	Fisher	14-826-84
10 ml plastikowa strzykawka	Fisher	14-823-2A
Igła 14 G	Fisher	14-817-203
Igła 15 G	Medline	SWD200029Z
16 G Fisher		14-817-104
Igła 18 G	Fisher	14-840-97
Igła 22 G	Fisher	14-840-90
32% paraformaldehyd	Fisher	50-980-495
AlexaFluor 647 kozia anty-królik IgG (H+L)	Invitrogen	A21244	RRID:AB_2535813
Amfoterycyna B	Gibco	15290-026
Kleszczyki do kapsułek Arruga Micro Embryonic, zakrzywione; 4"	do autoklawu	Roboz	RS-5163
(50x), bez surowicy	Gibco	A3582801
BioCoat 24-well Poly D lysine plates	Fisher	08-774-124
kwas borowy	Sigma	B6768-1KG
Chlorek wapnia	Sigma	C7902
Castroviejo 3 1/2 "Długie 8 x 0,15 mm Ostre nożyczki	Autoklaw Roboz	RS-5658
Urządzenie			automatyczne lub ręczne
Mikroskop konfokalny z mocowaniem	do komory żywych komórek
			do obrazowania konfokalnego
D-(+)-glukoza	Sigma	G7528
DNaza I (Worthington)	Fisher	NC9185812
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco	Gibco	14200-075
EGTA	Fisher	O2783-100
Fatal-Plus Rozwiązanie	Vortech Pharmaceuticals, LTD	NDC 0298-9373-68	pentobarbital sodu; można stosować inne zatwierdzone metody eutanazji
Płodowa surowica bydlęca	Invitrogen	16000044
Roztwór odczynnika gentamycyny	Gibco	15710-072
GlutaMAX	Gibco	35050-061	substytut glutaminy
Zbilansowany roztwór soli Hanksa	Gibco	24020-117
ImageJ wersja 1.51n	ImageJ		Life-Line wersja 2017 30 maja: https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (wersja 1.01)	Pakiet Encalada Lab		zawiera wszystkie 6 makr: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000	Invitrogen	100022050	Stosowanie z odczynnikiem zwiększającym transfekcję P3000
Chlorek magnezu	Fisher	AC223211000
Hydrat MES	Sigma	M8250
Mikronożyczki preparacyjne 3,5" proste ostre/ostre	autoklaw Roboz	RS-5910
medium	Gibco	A3582901
Neurofascin (A12/18) Mysz IgG2a	UC Davis/NIH NeuroMab	75-172	RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Działa w neuronach szczurów, NIE w neuronach myszy
Neurofascin 186 (D6G60) Sygnalizacja komórkowa IgG królika		15034	RRID: AB_2773024; 500 ng / ml; Działa w neuronach myszy, nie testowaliśmy na neuronach szczurów
surowica nowonarodzonych cieląt	Gibco	16010-167
Opti-MEM	Gibco	31985-062
P3000	Invitrogen	100022057
szalka Petriego, szkło 100 x 10 mm	Fisher	08-748B	Do preparacji; autoklaw
szalka Petriego, szkło 100 x 20 mm	Fisher	08-748D	Aby umieścić rogi macicy w; autoklaw
Poli-D-lizyna	Sigma	P7886-100MG
Polipropylenowe stożkowe probówki wirówkowe (15 ml)	Fisher	14-955-238
Polipropylenowe stożkowe probówki wirówkowe (50 ml)	Fisher	14-955-238
Chlorek potasu	Fisher	P217-500
Octan sodu	Sigma	S5636
dekahydrat boranu sodu	VWR	MK745706
Nożyczki operacyjne z prostym ostrzem Blunt/Sharp	Fisher	13-810-2	autoklaw
Filtry strzykawkowe, 0,22 i mikro; m	VWR	514-1263
Kleszczyki opatrunkowe do kciuków, ząbkowane, 4,5"	Autoklaw	Roboz RS-8100
i mikro-slajd 4-dołkowy szklane dno	Ibidi	80427