Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Prosta, szybka i skuteczna metoda analizy ksenotransplantacji guza w przezroczystych zarodkach danio pręgowanego

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66164

⸱

12 lipca 2024

 ,  ,  , 
1Nuclear Dynamics and Cancer Program, Fox Chase Cancer Center

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy protokół ksenotransplantacji do żółtka przezroczystych zarodków danio pręgowanego, który jest zoptymalizowany za pomocą prostej, szybkiej metody oceny poziomu. Analizy po wstrzyknięciu obejmują przeżycie i ocenę obciążenia chorobowego ksenoprzeszczepionymi komórkami za pomocą cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Badania in vivo zachowania guza są podstawą badań nad rakiem; jednak wykorzystanie myszy stanowi poważne wyzwanie pod względem kosztów i czasu. Tutaj przedstawiamy larwy danio pręgowanego jako model do przeszczepu, który ma wiele zalet w porównaniu z modelami mysimi, w tym łatwość obsługi, niski koszt i krótki czas trwania eksperymentu. Co więcej, brak adaptacyjnego układu odpornościowego w stadiach larwalnych eliminuje potrzebę generowania i wykorzystywania szczepów z niedoborem odporności. Chociaż istnieją ustalone protokoły ksenotransplantacji w zarodkach danio pręgowanego, przedstawiamy tutaj ulepszoną metodę obejmującą ocenę stopnia zarodka w celu szybszego transferu, analizy przeżycia i zastosowania cytometrii przepływowej do oceny obciążenia chorobą. Zarodki są klasyfikowane w celu ułatwienia szybkiego wstrzyknięcia komórek do żółtka larw i znakowania komórek w celu monitorowania konsystencji wstrzykniętego bolusa komórkowego. Po wstrzyknięciu ocenia się przeżycie zarodków do 7 dni po wstrzyknięciu (dpi). Wreszcie, obciążenie chorobą ocenia się również poprzez znakowanie przenoszonych komórek białkiem fluorescencyjnym i analizę za pomocą cytometrii przepływowej. Cytometria przepływowa jest możliwa dzięki znormalizowanej metodzie przygotowywania zawiesin komórkowych z zarodków danio pręgowanego, które można również wykorzystać do ustanowienia pierwotnej kultury komórek danio pręgowanego. Podsumowując, opisana tutaj procedura pozwala na szybszą ocenę zachowania komórek nowotworowych in vivo przy większej liczbie zwierząt w grupie badania i w sposób bardziej opłacalny.

Wprowadzenie

Analiza zachowania nowotworów w odpowiedzi na zmiany genetyczne lub leczenie farmakologiczne in vivo jest niezbędnym elementem badań nad rakiem1,2,3,4. Takie badania najczęściej obejmują wykorzystanie modeli myszy z obniżoną odpornością (Mus musculus)5; Jednak badania nad ksenotransplantacją na myszach są ograniczone pod wieloma względami, w tym ograniczoną wydajnością, wydłużonym czasem trwania, znacznymi kosztami i zapotrzebowaniem na zaawansowany sprzęt do obrazowania do monitorowania postępu nowotworów wewnętrznych6,7. Z kolei model danio pręgowanego (Danio rerio) umożliwia większą wydajność, krótszy czas trwania, niższe koszty oraz, dzięki swojej przejrzystości, proste monitorowanie postępu choroby8,9.

Danio pręgowany to dobrze rozwinięty system modelowy kręgowców z rozwojem ex-utero i wysoką płodnością, z pojedynczymi samicami produkującymi ponad 100 zarodków10. Co więcej, zarodki danio pręgowanego są przezroczyste, co umożliwia łatwą wizualizację procesów rozwojowych przy użyciu technik związanych z fluorescencją, takich jak reportery. Wreszcie, zachowanie krytycznych procesów rozwojowych sprawia, że są one idealnym modelem dla wielu rodzajów badań, w tym zachowania przeszczepionych komórek nowotworowych11,12. Zarodki danio pręgowanego typu dzikiego rozwijają melanocyty, które sprawiają, że stają się optycznie nieprzezroczyste w wieku 2 tygodni, ale zostało to przezwyciężone przez generowanie zarodków kacpra (Roya9; MitfaW2), które pozostają przezroczyste przez cały okres użytkowania13. Ze względu na swoje właściwości optyczne, danio pręgowany jest idealnym biorcą przeszczepionych komórek nowotworowych14,15,16. Ksenotransplantacja komórek nowotworowych u danio pręgowanego zyskała na znaczeniu w ciągu ostatnich 2 dekad17,18,19,20,21. Zarodki danio pręgowanego mają wrodzoną odporność; Brakuje im jednak odporności adaptacyjnej w stadium larwalnym, co sprawia, że mają funkcjonalnie obniżoną odporność, co pozwala im służyć jako skuteczni gospodarze dla przeszczepionych ksenoprzeszczepów nowotworowych22.

Opracowano protokoły do wszczepiania guzów u embrionów danio pręgowanych, jak również u dorosłych, które uwzględniały wiele różnych zmiennych23,24,25,26,27. Zbadali oni liczne miejsca odkładania się guzów u danio pręgowanego, w tym zastrzyki do żółtka, przestrzeni okołowitelowej i serca oraz na różnych etapach rozwoju16,28. Temperatura otoczenia w akwakulturze w przypadku ksenoprzeszczepów danio pręgowanego jest również ważna, ponieważ hodowla danio pręgowanego odbywa się zwykle w temperaturze 28 °C, podczas gdy komórki ssaków rosną w temperaturze 37 °C. W związku z tym należy zastosować kompromisową temperaturę, która jest tolerowana przez ryby, ale wspiera wzrost guza, a 34 °C wydaje się spełniać oba cele29. Analiza zachowania i progresji nowotworów po ksenotransplantacji jest kolejnym ważnym obszarem zainteresowania, a to obejmuje zastosowanie różnych metod obrazowania, a także analizę przeżycia30. Jedną z głównych zalet modelu danio pręgowanego jest dostępność dużej liczby badanych zwierząt, które zapewniają ogromną moc statystyczną w badaniach in vivo zachowania guza; Jednak poprzednie podejścia poważnie ograniczały ten potencjał ze względu na wymóg żmudnych procedur montażu wstrzyknięć.

Tutaj rozwiązujemy to ograniczenie poprzez opracowanie prostej, szybkiej metody etapowania zarodków, która umożliwia wysoką przepustowość i monitorowanie jakości iniekcji za pomocą przezroczystej żyłki danio pręgowanego. Wiąże się to z wstrzyknięciem ksenoprzeszczepów do woreczka żółtkowego zarodków danio pręgowanego Casper po 2 dniach od zapłodnienia (dpf). Przeżywalność zarodków po ksenotransplantacji obserwujemy w ramach analizy zachowania guza. Następnie pokazujemy ocenę obciążenia chorobą po ksenotransplantacji, wykonując zawiesiny pojedynczych komórek i analizując za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Utrzymanie, karmienie i hodowla danio pręgowanego odbywały się w standardowych warunkach akwakultury w temperaturze 28,5 °C, zgodnie z opisem31. Wszystkie eksperymenty związane z danio pręgowanym przeprowadzono w tej temperaturze; jednakże po ksenotransplantacji zwierzęta hodowano w temperaturze 34 °C przez cały czas trwania doświadczenia, zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania (IACUC).

1. Hodowla (3 dni przed wstrzyknięciem)

  1. Na tydzień przed hodowlą należy dostarczyć parom ryb suchą paszę (dodatkowa karma; 5-6 granulek na rybę), aby zmaksymalizować zdrowie zwierząt i zwiększyć liczbę zarodków produkowanych przez pary hodowlane.
  2. Wieczorem przed zbiorem zarodków należy umieścić zwierzęta hodowlane w zbiornikach hodowlanych z przegrodą oddzielającą samce i samice ryb, stosując haremowe krycia 2 samic na każdego samca.
    UWAGA: W przypadku eksperymentów z 4 ramionami po 100 zwierząt na ramię, należy zatrudnić 20 par hodowlanych w każdym eksperymencie. Aby określić liczbę potrzebnych par lęgowych, dobrym oszacowaniem jest 50 zarodków na parę lęgową kacpra. Inną opcją jest zastosowanie bardziej wytrzymałego, pigmentowanego szczepu danio pręgowanego i potraktowanie go 1-fenylo 2-tiomocznikiem (PTU), aby zapobiec pigmentacji31. W praktyce eksperyment powinien być skalowany w taki sposób, aby mieć wystarczającą liczbę zarodków, aby wstrzyknąć dwa razy więcej niż pożądano w 1 dniu po wstrzyknięciu (dpi).

2. Pobranie zarodków (2 dni przed wstrzyknięciem)

  1. Następnego ranka usuń przegrody, pozwalając rybom się rozmnażać.
  2. Wizualizuj zarodki w zbiornikach 20 minut (min) po usunięciu przegród.
  3. Zebrać zarodki za pomocą sita na szalce Petriego o średnicy 90 mm zawierającej wodę z zarodków, wykonaną zgodnie z opisem w The Zebrafish Book31.
    1. Aby zrobić wodę z zarodka, dodaj 1,5 ml soli bulionowych do 1 l wody destylowanej i błękitu metylenowego do 0,1% końcowego. Przygotować podstawowy roztwór soli, rozpuszczając 40 g soli morskich (tabela materiałów) w 1 litrze wody destylowanej. Skład jonowy wody zarodka to K+ (0,68 mg/L), Cl− (31,86 mg/L), Na+ (17,77 mg/L), SO4− (4,47 mg/L), Mg2+ (2,14 mg/L) i Ca2+ (0,68 mg/L).
  4. Pozwól danio pręgowanemu rozmnażać się przez dodatkową godzinę i zbierz powstałe zarodki.
  5. Zbierz zarodki do eksperymentu.
  6. Wieczorem usuń wszystkie niezapłodnione lub martwe zarodki, które można rozpoznać po nieprawidłowej morfologii, i zapewnij świeżą wodę zarodkowi.

3. Utrzymanie zarodków i przygotowanie narzędzi do iniekcji (1 dzień przed wstrzyknięciem)

  1. Następnego ranka usuń wszelkie dodatkowe martwe zarodki i zapewnij świeżą wodę z zarodków.
  2. Przygotować płytkę agarozową, podgrzewając 1,5% agarozy w wodzie z zarodków i wlać podgrzaną mieszaninę do płytki Petriego o średnicy 90 mm. Jedna miska 90 mm wymaga 30-35 ml mieszanki.
  3. Wyciągnij igły bez włókien ze szklanych kapilar (borokrzemianowych) za pomocą ściągacza do igieł. Igły są ciągnięte (pod ciśnieniem ciepła), tworząc zamknięty koniec; Przypnij je kleszczami, aby wygenerować optymalny otwór. Ocenić przydatność otworu igły, określając objętość płynu przemieszczanego w jednostce czasu (patrz poniżej sekcja 6.3).
    UWAGA: Kapilary szklane można kupić z żarnikami centralnymi lub bez. Kapilary pozbawione centralnych włókien są preferowane do wstrzykiwań komórkowych.
  4. Umieść igły w pokrytej 90 mm płytce Petriego w rowkach wykonanych z gliny (plastelina dla dzieci) do czasu użycia (Rysunek 2A).

4. Przygotowanie i znakowanie komórek białaczkowych za pomocą CM-Dil (dzień wstrzyknięcia)

  1. Utrzymuj komórki, które mają zostać przeszczepione, w warunkach optymalnych dla ich wzrostu. Zastosowane tu komórki białaczki mysiej były albo wystarczające (M82; Rpl22+/+) lub niedostateczny (M109; Rpl22-/-) dla białka rybosomalnego Rpl22, które działa jako supresor nowotworu32.
  2. Komórki w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Policzyć, a następnie odwirować przy 300 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
    UWAGA: Liczba potrzebnych komórek będzie podyktowana zakresem i warunkami eksperymentu, ale 1 x 106 komórek jest dobrym punktem wyjścia.
  3. Wykonaj barwienie CM-Dil
    UWAGA: Barwienie CM-Dil umożliwia monitorowanie bolusa iniekcyjnego.
    1. Sporządzić roztwór podstawowy CM-Dil przez ponowne zawieszenie 50 μg fiolki CM-Dil w 50 μl dimetylosulfotlenku (DMSO; 1 mg/ml lub ~1 mM final).
    2. Wytworzyć roztwór roboczy, rozcieńczając wywar (4,8 μl barwie/ml) w 1% płodowej surowicy bydlęcej (FBS)/zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS) zawierającym wszelkie suplementy wspomagające potrzebne komórkom, które mają być użyte.
  4. Zawiesić komórki w skatach 1 x 106/100 μl w roztworze roboczym barwnika.
  5. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 min.
    UWAGA: Warunki barwienia muszą być zoptymalizowane pod kątem zastosowanych komórek (czas itp.). Użyte tutaj komórki wymagały dwóch oddzielnych 10-minutowych inkubacji w różnych temperaturach, aby uzyskać optymalne barwienie.
  6. Umyć 10 ml 1x HBSS w temperaturze pokojowej (RT).
  7. Komórki osadu (odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej), zdekantować supernatant, następnie ponownie zawiesić z 10 ml HBSS i powtórzyć to samo dla drugiego przemycia.
  8. Ponownie zawiesić barwione komórki nowotworowe w stężeniu 40 000 komórek/μl w 1% FBS/PBS i wszelkich potrzebnych suplementach wspomagających i utrzymać zawiesinę komórek w temperaturze 34 °C do momentu wstrzyknięcia.
    UWAGA: Suplementy wspomagające były wymagane do utrzymania linii komórkowych użytych w tym badaniu (np. 1% FBS i cytokiny). Suplementy i ksenotransplantacja mogą wymagać dostosowania do konkretnych badanych linii komórkowych. PBS został tutaj wybrany zamiast pożywki, aby uniknąć potencjalnej toksyczności żółtka.

5. Dechorionacja

  1. Dechorionacja zarodków danio pręgowanego casper ręcznie przy 2 dpf za pomocą strzykawek do wstrzykiwań insuliny pod 2-krotnym powiększeniem w mikroskopie świetlnym. Przekłuć kosmówkę jedną igłą, używając drugiej igły do unieruchomienia kosmówki.
    UWAGA: Nie zaleca się stosowania pronazy do dechorionacji, ponieważ czasami powoduje to pogorszenie zdrowia zarodków. Dekorionacja zarodków w dawce 2 dpf jest preferowana, ponieważ jest łatwiejsza, a zarodki są mniej kruche niż we wcześniejszych okresach (1 dpf).
  2. Podczas dechorionacji należy uważać, aby nie dotykać zarodków igłami. Dotknięcie lub uszkodzenie żółtka zarodków przez przypadkowy kontakt z igłami może spowodować śmierć.
  3. Usunąć oczyszczoną kosmówkę, zmieniając wodę w zarodku.

6. Ustawianie mikrowtryskiwacza i igły

  1. Włączyć mikroiniektor i pompę i ustawić warunki odpowiednie do mikroiniekcji komórek. Ciśnienie wtrysku 9-11 psi i czas wstrzykiwania wynoszący 0,5 sekundy (s) są dobrym punktem wyjścia do przycięcia igły i ustawienia otworu.
  2. Ostrożnie załaduj zawiesinę linii komórek nowotworowych (~ 5 μL) do mikroigły w jednym przejściu, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza, które zakłócą przepływ komórek wewnątrz igły.
  3. Odetnij koniec igły kleszczami (Dumont numer 5), aby uzyskać otwór, który będzie wspierał wyrzucanie 10-15 nanolitrów (nL) zawiesiny komórek na 0,2-0,3 s,
    UWAGA: Powyższe obliczenie objętości nL odbywa się za pomocą kapilar kalibracyjnych, gdzie 1 mm = 30 nL. W skrócie ustaw czas na 0,5 s, a po każdym zaciśnięciu igły naciśnij wstrzyknięcie i zbierz objętość w kapilarze kalibracyjnej. Następnie długość pobranej objętości mierzy się za pomocą skali pod mikroskopem, a obcinanie igły zostaje zatrzymane po wstrzyknięciu 30 nL w ciągu 0,5 s. Następnie ustaw czas wstrzyknięć na 0,2-0,3 s. (wstrzyknięcie ~10-15 nL komórek)

7. Przygotowanie zarodka do wstrzyknięcia

  1. Wybierz zdrowe zarodki pod mikroskopem, usuwając wszystkie z anomaliami rozwojowymi, takimi jak obrzęk serca lub krótki lub zakrzywiony tułów.
  2. Znieczulać zarodki za pomocą metanosulfonianu trikainy (MS-222; 0,16 g/l wody z zarodka) przez 1 minutę na 90-milimetrowej płytce Petriego.
  3. Użyj szklanej pipety Pasteura, aby pobrać zarodki. Ułóż 10-15 zarodków w pozycji bocznej na 1,5% płytce agarozowej (Ryc. 2B-D).
  4. Usuń nadmiar wody za pomocą pipety Pasteura, pozostawiając minimalną ilość wody dla zarodków potrzebną do utrzymania zarodków przy życiu.

8. Procedura iniekcji

  1. Sprawdź pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że komórki zgromadziły się na końcówce igły.
  2. Wstrzyknąć zarodki za pomocą skalibrowanej igły przez 0,2-0,3 s (przy 10-15 nl odpowiadającym 400-600 komórkom) w żółtko zarodków.
  3. Powtórzyć wstrzyknięcie dla wszystkich zarodków, a następnie zebrać je w świeżej wodzie z zarodków.
    UWAGA: Ponieważ komórki mają tendencję do gromadzenia się na końcówce igły, końcówka będzie musiała być lekko odchylana co 15-20 wstrzyknięć. Będzie to również wymagało zresetowania ciśnienia i czasu przy każdym ponownym przycinaniu, aby upewnić się, że wstrzykiwana jest podobna objętość.
  4. Aby upewnić się, że porównanie zachowania dwóch odrębnych zestawów przenoszonych komórek jest prawidłowe, należy monitorować bolus przenoszonych komórek. W tym celu należy posortować zarodki na podstawie barwienia CM-Dil (w kanale RFP) po 1 godzinie od wstrzyknięcia (hpi), oddzielając te z optymalnym barwieniem ("dobry bolus") od tych z gorszym barwieniem ("dolny bolus"; Rysunek 3, żółta strzałka).
  5. Odrzuć zarodki z gorszym bolusem lub użyj ich do oceny wpływu innej dawki komórek na postęp choroby.
  6. Usuń martwe zarodki do końca dnia, ponieważ ich śmierć jest związana z urazem po wstrzyknięciu, a nie ze wzrostem guza. Z analizy należy usunąć zarodki, które nie zatrzymują komórek, ponieważ komórki prawdopodobnie wyciekły z miejsca wstrzyknięcia.
  7. Utrzymuj wstrzyknięte zarodki w temperaturze 34 °C przez cały czas trwania eksperymentu w naczyniu o średnicy 90 mm z ~60 zarodkami na płytkę.
    UWAGA: Po 5 dpf żółtko zostanie skonsumowane przez rosnące zarodki, dlatego zarodki muszą być zaopatrzone w pokarm z pantofelka na czas trwania eksperymentu. Aby zapewnić prawidłowe odżywianie, pantofelek powinien być podawany zarodkom codziennie od 6 dpf (4 dpi) do 9 dpf (7 dpi). Pantofelki rozmnaża się przez hodowlę w kolbach w optymalnych warunkach odżywiania i temperatury, zgodnie z opisem31.

9. Analiza przeżycia

  1. Monitoruj zarodki przez następne 7 dpi, codziennie zmieniając wodę w zarodku. Podmiany wody mogą być dla wygody zmniejszone do co drugi dzień, jeśli badanie obejmuje leczenie farmakologiczne.
  2. Sprawdź stan zdrowia zarodka i oceń śmierć na czas trwania analizy.
    UWAGA: Czas trwania eksperymentu wynosił 7 dni w tym eksperymencie, ale może być krótszy lub dłuższy w zależności od agresywności guza po ksenotransplantacji.
  3. Użyj fluorescencji CM-Dil do oceny obciążenia chorobą (Rysunek 4A) i określ wpływ zmian genetycznych lub leczenia farmakologicznego na przeżycie za pomocą analizy Kaplana Meiera i zobrazuj graficznie (np. za pomocą GraphPad Prism; Rysunek 4B)33.

10. Jednokomórkowe zawieszenie zarodków do analizy metodą cytometrii przepływowej

UWAGA: Obciążenie chorobą można ocenić za pomocą analizy cytometrii przepływowej po ksenotransplantacji; jednak wymaga to nieusuwalnego oznakowania komórek nowotworowych. Białko czerwonej fluorescencji (RFP) lub mCherry dostarczane retrowirusowo lub lentiwirusowo jest skuteczne, ponieważ zapewnia dobry sygnał przez autofluorescencję komórek danio pręgowanego, co zasłania sygnał z białka zielonej fluorescencji.

  1. Wyizoluj zarodki na etapie wyboru dpi. W tym miejscu wyświetlana jest rozdzielczość 5 dpi (Rysunek 5).
  2. Na początek należy zebrać 30-40 zarodków na każdy stan, ale liczba zarodków może się różnić w zależności od stadium i agresywności przeszczepionych komórek. Znieczulij zarodki zgodnie z powyższym opisem.
    UWAGA: Zarodki mogą być dzielone na kontrpróby w celu zapewnienia istotności statystycznej, jak pokazano tutaj (Rysunek 5B).
  3. Przenieś zarodki do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.
  4. Użyj 100 μl bezwapniowego roztworu Ringera (recipe31) na próbkę, aby rozpuścić żółtko, ponieważ niski poziom wapnia zmiękcza tkanki embrionalne, umożliwiając bardziej efektywną dysocjację tkanek.
  5. Pipetować w górę i w dół z przerwami przez 5 minut, aby usunąć żółtko za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl.
  6. Podgrzej 0,05% trypsyny/PBS (bez wskaźnika czerwieni fenolowej) do 29 °C i uzupełnij 27 μl kolagenazy IV (100 mg/ml) na ml roztworu trypsyny. Na każdą próbkę zarodków potrzebna będzie objętość 1 ml roztworu.
  7. Dodać 1 ml roztworu trypsyny/kolagenazy do każdej próbki zarodków pozbawionych żółtka i inkubować w temperaturze 29 °C przez 30-35 minut.
  8. Pipetować zarodki w górę i w dół w tym roztworze za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml co 5 minut, aż struktura zarodków (kręgosłup) przestanie być widoczna.
  9. Zatrzymać reakcję za pomocą 200 μl FBS.
  10. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 29 °C przez dodatkowe 5 minut, aby zapewnić całkowitą inaktywację trypsyny.
    UWAGA: W protokole dysocjacji tkanek stosuje się temperaturę 29 °C, aby zapobiec śmierci komórek danio pręgowanego spowodowanej szokiem cieplnym, która następuje w temperaturze 37 °C; Jeżeli jednak nie jest wymagane zachowanie komórek danio pręgowanego, trawienie można przeprowadzić w temperaturze 37 °C.
  11. Zawiesinę komórek osadzać w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
  12. Zawiesić osad komórkowy w PBS o temperaturze 4 °C i osad jak wyżej.
  13. Powtórz pranie, a następnie przecedź komórki przez sitko o wielkości 70 μm.
  14. Osadzać i przystąpić barwienie do analizy metodą cytometrii przepływowej.
    UWAGA: Jeśli wymagana jest hodowla pierwotnych komórek danio pręgowanego, przemyć jeszcze dwukrotnie PBS o temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić w pożywce L15 (z antybiotykami i 10% FBS).

11. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS): Barwienie i sortowanie komórek po ksenotransplantacji

  1. Zawiesić zawiesinę komórek w podłożu barwiącym (HBSS z 1% FBS) i osadzać w stężeniu 300 x g przez 5 minut.
  2. Ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce barwiącej z przeciwciałem reagującym z przeszczepionymi komórkami, aby zapewnić drugi marker (oprócz RFP lub mCherry), za pomocą którego można odróżnić przeszczepione komórki od komórek danio pręgowanego. W tym przypadku zastosowano 50 μl anty-mysiego CD45 (APC-CD45) na próbkę w rozcieńczeniu 1:50 (Ryc. 5).
  3. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C, a następnie przemyć jak wyżej, 1 ml podłoża barwiącego w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała.
  4. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 μl podłoża barwiącego zawierającego ważny barwnik Helix NP Blue (1 μM), który umożliwi rozróżnienie żywych/martwych.
  5. Przenieś mieszaninę komórek do okrągłodennych probówek poliwęglanowych o pojemności 5 ml w celu analizy cytometrii przepływowej.
    UWAGA: Barwienie kontroli komórek nowotworowych równolegle zapewnia przejrzystość rysowania bramek podczas analizy cytometrii przepływowej.

12. Cytometria przepływowa

  1. Włącz cytometr przepływowy, który jest dostępny przy niskim natężeniu przepływu (500 zdarzeń na sekundę lub mniej), aby ustawić parametry.
  2. Użyj kontroli komórek nowotworowych (tych samych komórek, które są używane do ksenotransplantacji), aby ustawić napięcie dla kanałów FSC (rozproszenie do przodu), SSC (rozproszenie boczne), BV421/CasB (żywotność), CE-594 (mCherry) i APC (CD45.2).
    UWAGA: Pojedynczo barwione próbki będą wymagane do ustalenia ustawień kompensacji, które eliminują nakładanie się fluorochromu między różnymi plamami.
  3. Użyj próbki zarodka, w którą nie wstrzyknięto, aby ustalić warunki, które pomieszczą zarówno przeszczepione komórki, jak i komórki danio pręgowanego.
  4. Zwiększ natężenie przepływu do 8000 zdarzeń na sekundę i zarejestruj 1 milion zdarzeń dla każdej próbki.
  5. Przeanalizuj uzyskane dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania analitycznego, najpierw wybierając pojedyncze elementy, wykreślając FSC-H v/s FSC-A (powierzchnia wysokości v/s), a następnie wykres wyboru żywotnych komórek. Oprogramowanie FlowJo jest szeroko stosowane do takich analiz.
  6. Korzystając z kontroli komórek nowotworowych, narysuj bramkę wokół przeszczepionych komórek za pomocą FSC-A v/s SSC-A, a następnie użyj barwników wskaźnikowych, w tym przypadku CD45 i mCherry (Rysunek 5B).
    UWAGA: Bramka wielkości wybrana dla guza będzie również zawierać komórki danio pręgowanego, które stanowią podstawę do normalizacji i określenia obciążenia chorobą.
  7. Analizuj próbki zarodków przy użyciu tych samych ustawień bramki, co powyżej. Końcowy wykres barwnika nowotworowego i wskaźnika białka fluorescencyjnego zapewni miarę obciążenia chorobą (Rysunek 5C).
    UWAGA: W tym przypadku różnica w obciążeniu chorobą została wykreślona dla zarodków otrzymujących dobry bolus z wstrzykniętych komórek w porównaniu z tymi, które otrzymały gorszy bolus.
  8. W razie potrzeby posortuj komórki nowotworowe w zarodkach za pomocą cytometrii przepływowej w celu dalszej analizy molekularnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ksenotransplantacja
Kompleksowy przegląd całego eksperymentu i analizy przedstawiono na Rysunku 1, obejmując proces od produkcji embrionów po ocenę postępu choroby poprzez analizę przeżywalności oraz obciążenia chorobowego za pomocą cytometrii przepływowej. Podejście to wprowadza kilka ulepszeń, które zwiększają powtarzalność i skalowalność ksenotransplantacji, a także dodaje nowy sposób oceny obciążenia chorobowego. Sukces tych eksperymentów jest w dużym stopniu zależny...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ksenotransplantacja danio pręgowanego stała się szybką, solidną i opłacalną alternatywą dla badań na myszach12. Chociaż opisano kilka podejść do ksenotransplantacji danio pręgowanego, nasza adaptacja zaowocowała znaczną poprawą. Oprócz standaryzacji parametrów związanych z procedurą, ulepszenia te koncentrują się w szczególności na przyspieszeniu tempa, w jakim można wykonywać iniekcje do guza, umożliwiając w ten sposób zwiększenie liczby zwierząt na ramię badania i wykorzystanie znakowania guza d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty NIH R37AI110985 i P30CA006927, środki z Commonwealth of Pennsylvania, Leukemia and Lymphoma Society oraz Bishop Fund. Badanie to było również wspierane przez główne obiekty w Fox Chase, w tym hodowlę komórek, cytometrię przepływową i placówkę dla zwierząt laboratoryjnych. Dziękujemy dr Jennifer Rhodes za utrzymanie urządzenia do mikroiniekcji danio pręgowanego i mikroiniekcji w FCCC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-fenylo 2-tiomocznik (PTU)SigmaP7629
70-mikronowe sitko komórkoweCorning CLS431751-50EA
90 mm szalka PetriegoThermo Fisher ScientificS43565
AgarozaApex bioresearch20-102GP
APC APC przeciwciało anty-mysie CD45.2Biolegend109814
BD FACSymphony A5 Analizator komórekBD BiosciencesBD FACSymphony A5
kapilary kalibracyjneSigma P1424-1PAK
Cell tracker CM-dil dyeInvitrogenC7001
Collageanse IVGibco17104019
Kleszcze Dumont numer 55Narzędzia do nauki precyzyjnej11255-20
FBSCorning 35-015-CV
Mikroskop fluorescencyjnyModel NikonSMZ1500
Kapilary szklane (borokrzemianowe)Instrumenty precyzyjne świata1B100-4
HBSSCorning 21-023-CV
Helix NP BlueBiolegend425305
Instant Ocean Sea SaltInstant oceanSS15-10
Mikroskop świetlnyNikonmodel SMZ1000
Błękit metylenowySigmaM9140-100G
Mikroładowarka (długie końcówki do układania komórek)eppendorf930001007
P1000 ściągacz do mikropipetInstrumenty Suttermodel P-97
PM 1000 mikroiniektor komórkowyMicroData Instruments, Inc. (MDI)PM1000
Metanosulfan trikainy (metanosulfan 3-aminobenzoesanu etylu)SigmaE10521-10G
Trypsyna-EDTA (0,5%), bez czerwieni fenolowejGibco15400054
Dieta napromieniowana dla dorosłych zebry danio pręgowanego (sucha pasza)Zeigler388763

Bibliografia

  1. Sharma, G., Goyal, Y., Bhatia, S. Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. Preclinical Animal Models of Cancer: Applications and Limitations. , Springer. Singapore. (2022).
  2. Singhal, S. S., et al. Recent advancement in breast cancer research: Insights from model organisms-Mouse models to zebrafish. Cancers. 15 (11), 2961(2023).
  3. Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications. Signal Transduction and Targeted Therapy. 8 (1), 160(2023).
  4. Fuochi, S., Galligioni, V. Disease Animal Models for Cancer Research. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. , Springer, Humana. New York, NY. (2023).
  5. Shaw, T. J., Senterman, M. K., Dawson, K., Crane, C. A., Vanderhyden, B. C. Characterization of intraperitoneal, orthotopic, and metastatic xenograft models of human ovarian cancer. Mol Ther. 10 (6), 1032-1042 (2004).
  6. Deroose, C. M., et al. Multimodality imaging of tumor xenografts and metastases in mice with combined small-animal PET, small-animal CT, and bioluminescence imaging. J Nucl Med. 48 (2), 295-303 (2007).
  7. Zeng, M., et al. Generation, evolution, interfering factors, applications, and challenges of patient-derived xenograft models in immunodeficient mice. Cancer Cell Int. 23 (1), 120(2023).
  8. Adhish, M., Manjubala, I. Effectiveness of zebrafish models in understanding human diseases-A review of models. Heliyon. 9 (3), e14557(2023).
  9. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as a mainstream model for in vivo systems pharmacology and toxicology. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 63, 43-64 (2023).
  10. Choe, S. -K., Kim, C. -H. Zebrafish: A powerful model for genetics and genomics. Int J Mol Sci. 24 (9), 8169(2023).
  11. White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
  12. Al-Hamaly, M. A., Turner, L. T., Rivera-Martinez, A., Rodriguez, A., Blackburn, J. S. Zebrafish cancer avatars: A translational platform for analyzing tumor heterogeneity and predicting patient outcomes. Int J Mol Sci. 24 (3), 2288(2023).
  13. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  14. Hill, D., Chen, L., Snaar-Jagalska, E., Chaudhry, B. Embryonic zebrafish xenograft assay of human cancer metastasis. F1000Res. 7, 1682(2018).
  15. Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo. Br J Haematol. 153 (6), 786-789 (2011).
  16. Lin, J., et al. A clinically relevant in vivo zebrafish model of human multiple myeloma to study preclinical therapeutic efficacy. Blood. 128 (2), 249-252 (2016).
  17. Grissenberger, S., et al. High-content drug screening in zebrafish xenografts reveals high efficacy of dual MCL-1/BCL-XL inhibition against Ewing sarcoma. Cancer Lett. 554, 216028(2023).
  18. Baxi, D. Zebrafish: A Versatile Animal Model to Study Tumorigenesis Process and Effective Preclinical Drug Screening for Human Cancer Research. Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. , Springer. Singapore. (2022).
  19. Li, X., Li, M. The application of zebrafish patient-derived xenograft tumor models in the development of antitumor agents. Med Res Rev. 43 (1), 212-236 (2023).
  20. Yin, J., et al. Zebrafish patient-derived xenograft model as a preclinical platform for uveal melanoma drug discovery. Pharmaceuticals. 16 (4), 598(2023).
  21. Nakayama, J., Makinoshima, H., Gong, Z. In vivo drug screening to identify anti-metastatic drugs in Twist1a-ER(T2) transgenic zebrafish. Bio Protoc. 13 (10), e4673-e4673 (2023).
  22. Lam, S., Chua, H., Gong, Z., Lam, T., Sin, Y. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev Comp Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
  23. Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).
  24. Casey, M. J., et al. Transplantation of zebrafish pediatric brain tumors into immune-competent hosts for long-term study of tumor cell behavior and drug response. J Vis Exp. (123), e55712(2017).
  25. Soh, G. H., Kögler, A. C., Müller, P. A simple and effective transplantation device for zebrafish embryos. J Vis Exp. (174), e62767(2021).
  26. Martinez-Lopez, M., Póvoa, V., Fior, R. Generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis. J Vis Exp. (172), e62373(2021).
  27. Ren, J., Liu, S., Cui, C., Ten Dijke, P. Invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish. J Vis Exp. (122), e55459(2017).
  28. Zhao, C., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS One. 6 (7), e21768(2011).
  29. Cabezas-Sáinz, P., Pensado-López, A., Sáinz Jr, B., Sánchez, L. Modeling cancer using zebrafish xenografts: drawbacks for mimicking the human microenvironment. Cells. 9 (9), 1978(2020).
  30. Haraoka, Y., Akieda, Y., Ishitani, T. Live-imaging analyses using small fish models reveal new mechanisms that regulate primary tumorigenesis. Yakugaku Zasshi. 139 (5), 733-741 (2019).
  31. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Oregon. (2000).
  32. Rao, S., et al. Inactivation of ribosomal protein L22 promotes transformation by induction of the stemness factor, Lin28B. Blood. 120 (18), 3764-3773 (2012).
  33. Goel, M. K., Khanna, P., Kishore, J. Understanding survival analysis: Kaplan-Meier estimate. Int J Ayurveda Res. 1 (4), 274-278 (2010).
  34. Usai, A., Di Franco, G., Gabellini, C., Morelli, L., Raffa, V. Establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing. J Vis Exp. (195), e63744(2023).
  35. Murali Shankar, N., et al. Preclinical assessment of CAR-NK cell-mediated killing efficacy and pharmacokinetics in a rapid zebrafish xenograft model of metastatic breast cancer. Front Immunol. 14, 1254821(2023).
  36. Takahi, M., et al. Xenograft of human pluripotent stem cell-derived cardiac lineage cells on zebrafish embryo heart. Biochem Biophys Res Commun. 674, 190-198 (2023).
  37. Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).
  38. Regan, J. L., et al. RNA sequencing of long-term label-retaining colon cancer stem cells identifies novel regulators of quiescence. iScience. 24 (6), 102618(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

cytometria przepływowawstrzykiwanie komórekobciążenie choroboweanaliza przeżywalności embrionówfluorescencyjne znakowanie komórekprzygotowanie zawiesiny komórkowejtransplantacja komórek białaczkowychkinaza Ras MAP
Prosta, szybka i skuteczna metoda analizy ksenotransplantacji guza w przezroczystych zarodkach danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.