Trzy strategie wywoływania neurotroficznego zapalenia rogówki i regeneracji nerwów w rogówce myszy

Podsumowanie

Tutaj proponujemy trzy różne metody uszkadzania włókien czuciowych unerwiających rogówkę. Metody te ułatwiają badanie regeneracji aksonów u myszy. Te trzy metody, które można dostosować do innych modeli zwierzęcych, są idealne do badania fizjologii i regeneracji unerwienia rogówki.

Streszczenie

Rogówka to przezroczysta tkanka, która zakrywa oko i jest kluczowa dla wyraźnego widzenia. Jest to najbardziej unerwiona tkanka w organizmie. To unerwienie zapewnia czucie i funkcję troficzną oku oraz przyczynia się do zachowania integralności rogówki. Patologiczne zaburzenie tego unerwienia określa się mianem neurotroficznego zapalenia rogówki. Może to być wywołane urazem oka, zabiegiem chirurgicznym lub chorobą. W tym badaniu proponujemy trzy różne protokoły uszkadzania unerwienia w sposób, który podsumowuje trzy typy przypadków ogólnie spotykanych w klinice.

Pierwsza metoda polega na wykonaniu ścierania nabłonka za pomocą zadzioru okulistycznego. Polega ona na usunięciu warstwy nabłonkowej, wolnych zakończeń nerwowych oraz splotu podpodstawnego w sposób podobny do operacji fotorefrakcyjnej keratektomii wykonywanej w klinice. Druga metoda jest ukierunkowana tylko na unerwienie poprzez przecięcie go na obrzeżach za pomocą stempla biopsyjnego, zachowując integralność nabłonka. Metoda ta jest podobna do pierwszych etapów keratoplastyki blaszkowej i prowadzi do zwyrodnienia unerwienia, a następnie odrostu aksonów w centralnej rogówce. Ostatnia metoda uszkadza unerwienie transgenicznego modelu myszy za pomocą mikroskopu wielofotonowego, który specyficznie lokalizuje miejsce kauteryzacji fluorescencyjnych włókien nerwowych. Ta metoda powoduje takie same szkody, jak fotozapalenie rogówki, nadmierna ekspozycja na światło UV.

To badanie opisuje różne opcje badania fizjopatologii unerwienia rogówki, szczególnie degeneracji i regeneracji aksonów. Wspomaganie regeneracji jest kluczowe dla uniknięcia takich powikłań jak ubytki nabłonka, a nawet perforacja rogówki. Proponowane modele mogą pomóc w testowaniu nowych cząsteczek farmakologicznych lub terapii genowej, które wspomagają regenerację nerwów i ograniczają postęp choroby.

Wprowadzenie

Rogówka, która jest przezroczystą powierzchnią oka, składa się z trzech odrębnych warstw: nabłonka, zrębu i śródbłonka. Narząd ten ma największą gęstość unerwienia w organizmie i składa się głównie z włókien czuciowych (typu Aδ i C) pochodzących z gałęzi ocznej zwoju nerwu trójdzielnego. Włókna czuciowe przenikają przez obrzeża rogówki w środkowym zrębie w postaci dużych wiązek, które rozgałęziają się, aby pokryć powierzchnię. Następnie rozwidlają się, aby przebić błonę Bowmanna i utworzyć splot podpodstawny, który można łatwo rozpoznać po utworzeniu wiru w środku rogówki. Włókna te kończą się jako wolne zakończenia nerwowe na zewnętrznej powierzchni nabłonka. Są w st....

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Krajową Radę ds. Eksperymentów na Zwierzętach.

1. Przygotowania

1. Przygotuj znieczulający roztwór ketaminy-ksylazyny do znieczulenia. Wstrzyknąć ketaminę w dawce 80 mg/kg i ksylazynę w dawce 10 mg/kg, rozcieńczając 200 μl ketaminy (100 mg/ml) i 125 μl ksylazyny (20 mg/ml) w 2,175 ml sterylnego 0,9% NaCl.
2. Przygotować 0,02 mg/ml roztworu buprenorfiny jako roztwór przeciwbólowy, dodając 100 μl 0,3 mg/ml buprenorfiny do 1400 ml sterylnego 0,9% NaCl.
3. Przygotuj fluorescencyjny roztwór barwiący.
   1. Za pomocą drobnej wagi zważyć 10 mg ....

Wyniki

Niniejsze badanie proponuje kilka protokołów wywoływania uszkodzeń unerwienia rogówki u myszy. Choć podobne protokoły stosowano do badania fizjopatologii gojenia nabłonka, zdecydowaliśmy się zaadaptować i opracować nowe metody badania regeneracji unerwienia rogówki. Do obserwacji unerwienia wykorzystaliśmy dwie techniki. Po pierwsze, zastosowaliśmy technikę immunofluorescencji w celu barwienia włókien nerwowych przy użyciu przeciwciała pan-neuronalnego (BIII tubulin) oraz jąder komórkowych za pomocą interkalatora. Po dru.......

Dyskusja

Neurotroficzne zapalenie rogówki jest uważane za rzadką chorobę, dotykającą 5 na 10 000 osób. Jednak osoby cierpiące na NK z powodu obrażeń fizycznych, takich jak oparzenia chemiczne, lub zespoły takie jak cukrzyca lub stwardnienie rozsiane, nie są uwzględniane w tych statystykach³. Co więcej, stan ten pozostaje znacznie niezdiagnozowany²², a częstość występowania choroby jest niedoszacowana. Istnieje duże zapotrzebowanie na nowe metody leczenia i terapii, które promowałyby.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,2 &mikro; m filtr seringowy	CLEARLINE	51733
0,5 mm odrdzewiacz	Alger Equipment Company	BU-5S
2 mL probówki plastikowe	Eppendrof
Frez Algerbrush, Kompletny instrument	Alger Equipment Company	BR2-5
Przeciwciało anty-beta III Tubulina	Abcam	ab18207
Antygenfix	Diapath	P0016
Sztuczna łza	Larmes artificielles Martinet	N/A
Buprecare	Animalcare	N/A
Wacik bawełniany	Dowolny dostawca	Nie dotyczy
Narzędzia preparacyjne	Narzędzia do nauki	Nie dotyczy
Fluoresceina	Merck	103887
Żelatyna ze skóry ryb zimnowodnych	Sigma	G7765
Serum kozie	Merck	S26
Uchwyt na głowę	Narishige	SGM 4
Podgrzewana płyta	Instrumenty BIOSEB LAB	BIO-HE002
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Imalgene 1000	BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH Francja	Nie dotyczy	Numer francuskiego pozwolenia na dopuszczenie do obrotu: FR/V/0167433 4/1992
Oprogramowanie LAS X	Leica	N/A	Proces rozliczania obliczeń o dużej objętości (LVCC)
Laserowy kameleon Ultra II	Coherent	Nie dotyczy
Miernik mocy lasera	Koherentny	Nie dotyczy
Leica Thunder Imager Mikroskop tkankowy	Leica	N/A Wielofotonowy
mikroskop pionowy Zeiss LSM 7MP	Zeiss	N/A
Ocry-gel	TVM lab	N/A
Oscylator parametryczny	Koherentne	N/A Długopisy
z niebieskim kobaltowa nasadka filtrująca	Bernell	ALPEN
szalka Petriego	Thermo Scientific	150318	Protokół aksotomii
Petridish	Thermo Scientific	150288	Przetwarzanie rogówki w całości
Rompun 2%	Elanco	N/A	Numer pozwolenia na dopuszczenie do obrotu we Francji: FR/V/8146715 2/1980
Sterylny dziurkacz do biopsji 2,5 mm	LCH medyczny	LCH-PUK-25
Triton X-100	VWR	0694
Vectashield	EuroBioSciences	H-1000	Podłoże montażowe

30120094