Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Trzy strategie wywoływania neurotroficznego zapalenia rogówki i regeneracji nerwów w rogówce myszy

3.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66182

⸱

8 grudnia 2023

 ,  ,  , 
1Institute for Neurosciences of Montpellier, University of Montpellier, INSERM, 2Department of Ophthalmology, Gui de Chauliac Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj proponujemy trzy różne metody uszkadzania włókien czuciowych unerwiających rogówkę. Metody te ułatwiają badanie regeneracji aksonów u myszy. Te trzy metody, które można dostosować do innych modeli zwierzęcych, są idealne do badania fizjologii i regeneracji unerwienia rogówki.

Streszczenie

Rogówka to przezroczysta tkanka, która zakrywa oko i jest kluczowa dla wyraźnego widzenia. Jest to najbardziej unerwiona tkanka w organizmie. To unerwienie zapewnia czucie i funkcję troficzną oku oraz przyczynia się do zachowania integralności rogówki. Patologiczne zaburzenie tego unerwienia określa się mianem neurotroficznego zapalenia rogówki. Może to być wywołane urazem oka, zabiegiem chirurgicznym lub chorobą. W tym badaniu proponujemy trzy różne protokoły uszkadzania unerwienia w sposób, który podsumowuje trzy typy przypadków ogólnie spotykanych w klinice.

Pierwsza metoda polega na wykonaniu ścierania nabłonka za pomocą zadzioru okulistycznego. Polega ona na usunięciu warstwy nabłonkowej, wolnych zakończeń nerwowych oraz splotu podpodstawnego w sposób podobny do operacji fotorefrakcyjnej keratektomii wykonywanej w klinice. Druga metoda jest ukierunkowana tylko na unerwienie poprzez przecięcie go na obrzeżach za pomocą stempla biopsyjnego, zachowując integralność nabłonka. Metoda ta jest podobna do pierwszych etapów keratoplastyki blaszkowej i prowadzi do zwyrodnienia unerwienia, a następnie odrostu aksonów w centralnej rogówce. Ostatnia metoda uszkadza unerwienie transgenicznego modelu myszy za pomocą mikroskopu wielofotonowego, który specyficznie lokalizuje miejsce kauteryzacji fluorescencyjnych włókien nerwowych. Ta metoda powoduje takie same szkody, jak fotozapalenie rogówki, nadmierna ekspozycja na światło UV.

To badanie opisuje różne opcje badania fizjopatologii unerwienia rogówki, szczególnie degeneracji i regeneracji aksonów. Wspomaganie regeneracji jest kluczowe dla uniknięcia takich powikłań jak ubytki nabłonka, a nawet perforacja rogówki. Proponowane modele mogą pomóc w testowaniu nowych cząsteczek farmakologicznych lub terapii genowej, które wspomagają regenerację nerwów i ograniczają postęp choroby.

Wprowadzenie

Rogówka, która jest przezroczystą powierzchnią oka, składa się z trzech odrębnych warstw: nabłonka, zrębu i śródbłonka. Narząd ten ma największą gęstość unerwienia w organizmie i składa się głównie z włókien czuciowych (typu Aδ i C) pochodzących z gałęzi ocznej zwoju nerwu trójdzielnego. Włókna czuciowe przenikają przez obrzeża rogówki w środkowym zrębie w postaci dużych wiązek, które rozgałęziają się, aby pokryć powierzchnię. Następnie rozwidlają się, aby przebić błonę Bowmanna i utworzyć splot podpodstawny, który można łatwo rozpoznać po utworzeniu wiru w środku rogówki. Włókna te kończą się jako wolne zakończenia nerwowe na zewnętrznej powierzchni nabłonka. Są w stanie przekazywać bodźce termiczne, mechaniczne i chemiczne oraz uwalniać czynniki troficzne, które są niezbędne dla homeostazy nabłonka1,2. Neurotroficzne zapalenie rogówki (NK) jest chorobą zwyrodnieniową wpływającą na unerwienie czuciowe rogówki. Ta rzadka choroba wynika ze zmniejszenia lub utraty wrażliwości rogówki, co skutkuje mniejszą produkcją łez i słabymi właściwościami leczniczymi rogówki3. NK przechodzi przez trzy dobrze opisane etapy, od etapu 1, w którym pacjenci cierpią na wady nabłonka, do etapu 3, w którym dochodzi do topnienia zrębu i/lub perforacji rogówki4.

Klinicznie, pochodzenie tej choroby może być różnorodne. Pacjenci mogą stracić unerwienie rogówki po fizycznym urazie oka, operacji lub w wyniku chorób przewlekłych, takich jak cukrzyca5,6. Do tej pory proces patogenezy NK pozostaje słabo poznany, a możliwości terapeutyczne w przypadku tego zagrażającego wzrokowi schorzenia są bardzo ograniczone. Dlatego potrzebne jest lepsze zrozumienie charakterystyki defektów nabłonka, aby lepiej zrozumieć mechanizmy stojące za regeneracją tych włókien i potencjalnie je promować. W tym miejscu proponujemy kilka modeli uszkodzenia rogówki, które indukują NK u myszy.

Pierwszy model to ścieranie warstwy nabłonkowej rogówki za pomocą zadzioru oka. Model ten był badany głównie w kontekście regeneracji nabłonka u różnych zwierząt, takich jak gryzonie i ryby7,8,9, oraz w celu przetestowania cząsteczek wspomagających gojenie rogówki10,11. Fizjologicznie potrzeba 2-3 dni, aby komórki nabłonka zamknęły ranę. Fizjologiczny wzorzec unerwienia potrzebuje jednak więcej niż czterech tygodni, aby dojść do siebie po ścieraniu12,13. Podczas operacji zadzior gałki ocznej usuwa warstwę nabłonkową rogówki, która zawiera splot podpodstawny i wolne zakończenia nerwowe włókien. Procedura ta może być klinicznie porównana z pacjentami po fotorefrakcyjnej keratektomii (PRK) w celu skorygowania wad refrakcyjnych oka. Zabieg polega na usunięciu nabłonka rogówki, a następnie zmianie kształtu zrębu za pomocą lasera14. Pacjenci mogą doświadczyć kilku skutków ubocznych po takiej operacji, takich jak zmniejszenie gęstości nerwu rogówki przez 2 lata i zmniejszenie wrażliwości przez okres od 3 miesięcy do jednego roku po operacji15. Biorąc pod uwagę, że operacja wywołuje kruchość mikrośrodowiska rogówki, model ten może pomóc w zbadaniu tych skutków ubocznych i opracowaniu podejść terapeutycznych, które sprzyjałyby szybszemu unerwieniu, zmniejszając w ten sposób omawiane skutki uboczne.

Drugi model polega na przecięciu aksonów na obrzeżach rogówki za pomocą stempla biopsyjnego, wywołując wallerowskie zwyrodnienie centralnego unerwienia 16. Klinicznie metodę tę można porównać do keratoplastyki blaszkowatości przedniej, w której chirurg realizuje częściową trepanację rogówki w celu usunięcia części przedniej grubości rogówki i zastąpienia jej przeszczepem dawcy 17. Po keratoplastyce blaszkowej pacjenci mogą cierpieć na szereg objawów, w tym suchość oka, utratę unerwienia rogówki i odrzucenie przeszczepu18. Ten model aksotomii wykonany na nerwach rogówki może dostarczyć informacji na temat mechanizmów degeneracji włókien, która następuje po przeszczepie, a następnie regeneracji aksonów.

Trzecia metoda uszkadza nerwy rogówki za pomocą lasera. Za pomocą mikroskopu wielofotonowego na rogówce znieczulonych zwierząt indukuje się zwyrodnienie nerwów zlokalizowanych w polu optycznym w wyniku tworzenia się reaktywnych form tlenu (ROS), co prowadzi do uszkodzenia DNA i kawitacji komórkowej19. Ta metoda podsumowuje fotouszkodzenia rogówki wywołane nadmierną ekspozycją na naturalne promieniowanie UV (oparzenie słoneczne), które również wyzwala tworzenie ROS, prowadząc do uszkodzenia DNA20. Pacjenci, którzy cierpią z powodu oparzeń słonecznych rogówki, odczuwają duży ból, ponieważ pogorszenie stanu komórek nabłonka pozbawia wszystkie włókna rogówki.

Trzy opisane tutaj metody mają na celu umożliwienie badania procesu patogenezy NK i regeneracji aksonów. Są łatwe do odtworzenia i precyzyjne. Ponadto umożliwiają szybką rekonwalescencję i łatwe monitorowanie zwierząt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Krajową Radę ds. Eksperymentów na Zwierzętach.

1. Przygotowania

  1. Przygotuj znieczulający roztwór ketaminy-ksylazyny do znieczulenia. Wstrzyknąć ketaminę w dawce 80 mg/kg i ksylazynę w dawce 10 mg/kg, rozcieńczając 200 μl ketaminy (100 mg/ml) i 125 μl ksylazyny (20 mg/ml) w 2,175 ml sterylnego 0,9% NaCl.
  2. Przygotować 0,02 mg/ml roztworu buprenorfiny jako roztwór przeciwbólowy, dodając 100 μl 0,3 mg/ml buprenorfiny do 1400 ml sterylnego 0,9% NaCl.
  3. Przygotuj fluorescencyjny roztwór barwiący.
    1. Za pomocą drobnej wagi zważyć 10 mg soli fluoresceiny i rozcieńczyć ją w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aby otrzymać 0,1% roztwór fluoresceiny.
    2. Chronić roztwór przed światłem i wstrząsać nim przez 5 minut. Do przefiltrowania roztworu należy użyć strzykawki o pojemności 10 ml i filtra strzykawkowego o wielkości 0,2 μm.
      UWAGA: Roztwór fluorescencyjny należy chronić przed światłem i można go przechowywać w temperaturze +4 °C przez 5 dni.
  4. Przygotowanie myszy
    1. Zważyć mysz i wywołać znieczulenie, wykonując dootrzewnowe wstrzyknięcie 10 μl/g masy myszy (MW) roztworu znieczulającego. Gdy mysz przestanie się poruszać, umieść ją na podgrzewanej płytce (37 °C) i sprawdź, czy jest całkowicie znieczulona, ściskając palce u stóp.
    2. Nałóż kroplę sztucznej łzy na oko poddawane operacji i kroplę żelu do oka na oko przeciwległe.
    3. Gdy mysz przestanie reagować na szczypanie, wstrzyknij środek przeciwbólowy (0,02 mg/ml buprenorfiny) w stężeniu 5 μl/g MW, aby dostarczyć 0,1 mg/kg buprenorfiny podskórnie w szyję.

2. Ścieranie rogówki

  1. Wykonaj krok 1.3, aby przygotować fluorescencyjny roztwór barwiący.
  2. Wykonaj krok 1.4, aby przygotować mysz.
  3. Przed wykonaniem ścierania zanurz zadzior oczny w 70% EtOH, a następnie w PBS, aby go wyczyścić.
  4. Umieść mysz na podgrzewanej płytce (37 °C) z boku, aby łatwo uzyskać dostęp do oka poddawanego zabiegowi.
    1. Użyj bawełnianego wacika, aby wchłonąć sztuczną łzę i odczep rzęsy bez dotykania oka.
    2. Włącz zadzior oczny, otwórz powiekę myszy dwoma palcami i jednocześnie zablokuj wibrysy, aby uniknąć utknięcia w zadziorze.
  5. Zlokalizuj źrenicę lub środek oka i nałóż zadzior oczny na powierzchnię oka i wykonuj okrężne ruchy. Przyglądając się uważnie, można zaobserwować powierzchnię usuniętego nabłonka. W przeciwnym razie wykonaj około 20 okrężnych ruchów na rogówce.
  6. Połóż mysz z powrotem na brzuchu i sprawdź, czy żel oczny jest nadal obecny w przeciwległym oku.
  7. Nałóż kroplę fluorescencyjnego roztworu barwiącego na starte oko i odczekaj 20 sekund. Kroplę należy wchłonąć chusteczką higieniczną bez dotykania oka i przepłukać kroplą sztucznej łzy. Wchłoń kroplę sztucznej łzy chusteczką i oświetl oko niebieską lampą kobaltową.
    UWAGA: Ścieranie musi mieć okrągły kształt. Aby go uzyskać, wymaga to pewnego treningu.
  8. Nałóż kroplę żelu do oczu na starte oko i pozwól myszy obudzić się na rozgrzanej podkładce. Gdy mysz porusza się sama, umieść ją z powrotem w klatce.
  9. Sprawdź samopoczucie zwierzęcia przez kolejne 2 dni.
  10. Po użyciu zadzioru ocznego użyj miękkiej tkanki, aby usunąć komórki nabłonkowe wbite w głowę zadzioru i zanurz go w 70% EtOH, a następnie PBS.
    UWAGA: Po usunięciu komórek nabłonka za pomocą tkanki miękkiej upewnij się, że żadne kawałki tkanki nie utknęły w główce zadzioru.

3. Aksotomia nerwów rogówkowych

  1. Wykonaj krok 1.4, aby przygotować mysz.
  2. Umieść mysz pod lupą lornetkową z boku, aby uzyskać dostęp do oka poddawanego operacji. Umieść spód szalki Petriego pod głową myszy tak, aby oko było poziome.
    UWAGA: Poniższe kroki zostaną wykonane, patrząc przez lupę lornetkową.
  3. Usuń sztuczną łzę za pomocą bawełnianego wacika i usuń rzęsy bez dotykania oka.
  4. Umieść gładkie, zakrzywione szczypce pod okiem zwierzęcia, aby wyskoczyć z orbity. Upewnij się, że zacisnąłeś szczypce na tyle, aby oko nie było w stanie wrócić na orbitę po przyłożeniu nacisku, ale nie nadmiernie, aby zapobiec uszkodzeniu nerwu wzrokowego.
  5. Nałóż stempel do biopsji o średnicy 2,5 mm pionowo na oko bez nacisku, aby zapewnić całkowity kontakt stempla z powierzchnią rogówki.
    UWAGA: Po przyłożeniu stempla do rogówki, ręka eksperymentatora może zakłócać pole widzenia.
  6. Następnie zacznij wywierać nacisk i kilkakrotnie przekręć stempel.
    UWAGA: W zależności od ciśnienia liczba skrętów może się różnić, ale generalnie wynosi około 5. Wymaga treningu, aby poczuć odpowiedni nacisk i ruch. Jeśli zostanie przyłożony zbyt duży nacisk, oko pęka. W takim przypadku można zaobserwować, jak płyn wydostaje się ze zmiany, a oko mięknie. Zwierzę musi zostać złożone w ofierze.
  7. Usunąć stempel do biopsji. Na rogówce, w miejscu, w którym zastosowano stempel do biopsji, musi być widoczne kółko.
    UWAGA: Kolejne kroki nie wymagają lupy lornetkowej.
  8. Sprawdź, czy w przeciwległym oku nadal znajduje się żel do oczu i nałóż go na oko po aksotomii.
  9. Pozwól myszy obudzić się na rozgrzanej podkładce (37 °C) i umieść ją z powrotem w klatce, gdy porusza się samodzielnie.
  10. Sprawdź samopoczucie zwierzęcia przez kolejne 2 dni.

4. Przetwarzanie całego montażu rogówki

  1. Pobieranie i utrwalanie próbek.
    1. Zważyć mysz i wywołać znieczulenie, wykonując dootrzewnowe wstrzyknięcie 10 μl/g masy myszy (MW) roztworu znieczulającego.
    2. Kiedy mysz przestaje się poruszać i nie ma odruchów przez szczypanie palców, wykonaj zwichnięcie szyjki macicy.
    3. Wysuń oko z oczodołu za pomocą dwóch palców i wyłuszczej oko, przecinając nerw wzrokowy za pomocą zakrzywionych nożyczek.
    4. Umieść oko w plastikowej probówce o pojemności 2 ml zawierającej PBS.
    5. Napraw oko, zastępując PBS 4% paraformaldehydem i umieszczając go na wytrząsarce (30 obr./min) w temperaturze pokojowej (RT) na 20 minut.
    6. Płukać 3 razy przez 10 minut PBS przy temperaturze RT na wytrząsarce (30 obr./min).
  2. Wypreparowanie rogówki
    1. Umieść kroplę PBS na kawałku parafilmu wewnątrz szalki Petriego.
    2. Umieścić oko w tej kropli PBS.
    3. Umieść szalkę Petriego pod lupą lornetkową
      4. .
    4. Wypreparuj rogówkę za pomocą nożyczek do mikrodysekcji i kleszczy. Wytnij nad ciałem rzęskowym, aby utrzymać rąbek.
    5. Usuń soczewkę, ciało rzęskowe i tęczówkę za pomocą drobnych kleszczyków.
    6. Umieść rogówkę z powrotem w plastikowej tubie o pojemności 2 ml.
  3. Protokół immunofluorescencji
    1. Inkubuj rogówkę w 2 ml 2,5% żelatyny ze skóry rybnej, 5% koziej surowicy i 0,5% detergentu w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce (30 obr./min).
    2. Inkubować rogówkę w 150 μl roztworu 2,5% żelatyny ze skóry ryby, 5% surowicy koziej i 0,1% detergentu w PBS zawierającym przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w stosunku 1/1000 (przeciwciało anty βIII tubuliny) przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce (30 obr./min).
    3. Płukać 3 razy przez 1 godzinę 0,1% detergentem w PBS przy temperaturze RT na wytrząsarce (30 obr./min).
    4. Inkubować rogówkę w tym samym roztworze, co w kroku 4.3.2, zawierającym przeciwciało drugorzędowe rozcieńczone w stosunku 1:500 przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce (30 obr./min).
    5. Płukać 3 razy przez 1 godzinę PBS w temperaturze RT na wytrząsarce (30 obr./min).
    6. Inkubować rogówkę przez 10 minut ze 150 μl interkalatora DNA rozcieńczonego w stosunku 1/5000 w temperaturze pokojowej na wytrząsarce (30 obr./min).
    7. Płukać 2 razy przez 5 minut za pomocą PBS.
  4. Montaż rogówki
    1. Umieść rogówkę na szkiełku, nabłonek skierowany w stronę szkiełka i użyj skalpela, aby utworzyć cztery sekcje bez sięgania do środka.
      UWAGA: Wykonaj sekcje naprzeciwko siebie, aby utworzyć kształt kwiatu.
    2. Umieść śródbłonek rogówki przodem do szkiełka i usuń PBS wokół rogówki za pomocą chusteczki.
      UWAGA: Nie usuwaj PBS pod rogówką; W przeciwnym razie mogą pojawić się pęcherzyki powietrza. Jeśli tak, dodaj PBS do rogówki i usuń pęcherzyki powietrza. Następnie uruchom ponownie od kroku 4.3.2.
    3. Dodaj pastę modelu w czterech rogach prostokątnego szkiełka nakrywkowego.
      UWAGA: Pasta modelowa podnosi szkiełko nakrywkowe, ponieważ rogówka jest grubą tkanką.
    4. Upuść 50 μl podłoża montażowego na rogówkę i ostrożnie połóż szkiełko nakrywkowe powyżej, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.
    5. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci.
  5. Obrazowania
    1. Umieść szkiełko pod mikroskopem epifluorescencyjnym.
    2. Określ rozmiar mozaiki i głębię obrazu, a następnie rozpocznij akwizycję.
    3. Zastosuj program do usuwania rozmycia i dekonwolucji na uzyskanym obrazie.
      UWAGA: Krok 4.6.3 to opcja wybrana w oprogramowaniu do akwizycji (Large Volume Computational Clearing [LVCC])

5. Miejscowa laserowa ablacja nerwów rogówki

  1. Włącz pionowy mikroskop wielofotonowy i laser w połączeniu z optycznym oscylatorem parametrycznym. Aktywuj podgrzewany stolik mikroskopu (37 °C) i ustaw lasery na 850 nm i 1100 nm, odpowiadających wymaganym długościom fal dla modelu myszy.
  2. Użyj miernika mocy, aby jednocześnie ustawić moc laserów na około 20 mW.
  3. Wykonaj krok 1.4, aby przygotować mysz i nałożyć żel do oczu na obie oczy.
    UWAGA: Zwierzę użyte do tego protokołu musi pochodzić z transgenicznej linii myszy (MAGIC-Marker transgenic mouse21), która wyraża endogenny fluorofor we włóknach nerwowych rogówki.
  4. Zamontuj zwierzę w uchwycie na głowę. Obróć zwierzę o 90°, aby oko zainteresowania było skierowane w stronę sufitu.
  5. Opasuj wibrysy zwierzęcia, aby oczyścić okolice oczu. Opasuj ciało zwierzęcia, aby zmniejszyć ruchy głowy wywołane oddychaniem.
  6. Umieść okrągłe szkiełko nakrywkowe na oku nad żelem do oczu. Szkiełko nakrywkowe musi być ułożone poziomo. Nie wahaj się przesunąć głowy zwierzęcia, aby szkiełko nakrywkowe zostało prawidłowo umieszczone.
  7. Dodaj kroplę PBS powyżej szkiełka nakrywkowego. Ostrożnie umieść zwierzę na stoliku mikroskopu i ustaw wieżyczkę obiektywu w odpowiedniej odległości.
  8. Użyj wodnego obiektywu 20x i epifluorescencji, aby zlokalizować oko i unerwienie przez okular.
  9. Aktywuj lasery i określ głębokość, która ma zostać oświetlona.
  10. Uzyskuj obraz o rozdzielczości 1024 x 1024 pikseli z szybkością akwizycji 70%-85% maksymalnej prędkości skanowania.
  11. Po uzyskaniu obrazu zdejmij zwierzę z mikroskopu i usuń szkiełko nakrywkowe oraz paski. Wyjmij zwierzę z uchwytu na głowę, w razie potrzeby dodaj więcej żelu do oczu i pozwól mu obudzić się w klatce na podgrzewanej płycie.
    UWAGA: Zniszczenie unerwienia można zaobserwować 1 tydzień po obrazowaniu. Protokół ten można powtarzać raz w tygodniu przez kilka tygodni, aby zwiększyć uszkodzenia spowodowane przez lasery.
  12. Gdy zwierzę porusza się samodzielnie, umieść klatkę z powrotem w stajni i sprawdzaj jego samopoczucie przez kolejne 2 dni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejsze badanie proponuje kilka protokołów wywoływania uszkodzeń unerwienia rogówki u myszy. Choć podobne protokoły stosowano do badania fizjopatologii gojenia nabłonka, zdecydowaliśmy się zaadaptować i opracować nowe metody badania regeneracji unerwienia rogówki. Do obserwacji unerwienia wykorzystaliśmy dwie techniki. Po pierwsze, zastosowaliśmy technikę immunofluorescencji w celu barwienia włókien nerwowych przy użyciu przeciwciała pan-neuronalnego (BIII tubulin) oraz jąder komórkowych za pomocą interkalatora. Po dru...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Neurotroficzne zapalenie rogówki jest uważane za rzadką chorobę, dotykającą 5 na 10 000 osób. Jednak osoby cierpiące na NK z powodu obrażeń fizycznych, takich jak oparzenia chemiczne, lub zespoły takie jak cukrzyca lub stwardnienie rozsiane, nie są uwzględniane w tych statystykach3. Co więcej, stan ten pozostaje znacznie niezdiagnozowany22, a częstość występowania choroby jest niedoszacowana. Istnieje duże zapotrzebowanie na nowe metody leczenia i terapii, które promowałyby...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują dr Karine Loulier za dostęp do linii myszy transgenicznych MAGIC-Markers. Autorzy dziękują również ośrodku RAM-Neuro Animal Core oraz ośrodkowi obrazowania MRI, będącemu częścią krajowej infrastruktury France-BioImaging wspieranej przez francuską Narodową Agencję Badawczą (ANR-10-INBS-04, "Inwestycje w przyszłość"). Badania te były wspierane przez program ATIP-Avenir, Inserm, Région Occitanie, Uniwersytet w Montpellier, Francuską Narodową Agencję Badawczą (ANR-21-CE17-0061), Fundację Medycyny Regeneracyjnej FRM (REP202110014140) oraz Fundację Groupama.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 &mikro; m filtr seringowyCLEARLINE51733
0,5 mm odrdzewiaczAlger Equipment CompanyBU-5S
2 mL probówki plastikoweEppendrof 
Frez Algerbrush, Kompletny instrumentAlger Equipment CompanyBR2-5
Przeciwciało anty-beta III TubulinaAbcamab18207
AntygenfixDiapathP0016
Sztuczna łzaLarmes artificielles MartinetN/A
BuprecareAnimalcareN/A
Wacik bawełnianyDowolny dostawcaNie dotyczy
Narzędzia preparacyjneNarzędzia do naukiNie dotyczy
FluoresceinaMerck103887
Żelatyna ze skóry ryb zimnowodnychSigmaG7765
Serum kozieMerckS26
Uchwyt na głowęNarishigeSGM 4
Podgrzewana płytaInstrumenty BIOSEB LABBIO-HE002
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570
Imalgene 1000BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH FrancjaNie dotyczyNumer francuskiego pozwolenia na dopuszczenie do obrotu: FR/V/0167433 4/1992
Oprogramowanie LAS XLeicaN/AProces rozliczania obliczeń o dużej objętości (LVCC)
Laserowy kameleon Ultra IICoherentNie dotyczy
Miernik mocy laseraKoherentnyNie dotyczy
Leica Thunder Imager Mikroskop tkankowyLeicaN/A Wielofotonowy
mikroskop pionowy Zeiss LSM 7MPZeissN/A
Ocry-gelTVM labN/A
Oscylator parametrycznyKoherentneN/A Długopisy
z niebieskim kobaltowa nasadka filtrującaBernellALPEN
szalka PetriegoThermo Scientific150318Protokół aksotomii
PetridishThermo Scientific150288Przetwarzanie rogówki w całości
Rompun 2%ElancoN/ANumer pozwolenia na dopuszczenie do obrotu we Francji: FR/V/8146715 2/1980
Sterylny dziurkacz do biopsji 2,5 mmLCH medycznyLCH-PUK-25
Triton X-100VWR0694
VectashieldEuroBioSciencesH-1000Podłoże montażowe
30120094

Bibliografia

  1. Marfurt, C. F., Cox, J., Deek, S., Dvorscak, L. Anatomy of the human corneal innervation. Exp Eye Res. 90 (4), 478-492 (2010).
  2. Al-Aqaba, M. A., Dhillon, V. K., Mohammed, I., Said, D. G., Dua, H. S. Corneal nerves in health and disease. Prog Retin Eye Res. 73, 100762(2019).
  3. Dua, H. S., et al. Neurotrophic keratopathy. Prog Retin Eye Res. 66, 107-131 (2018).
  4. Bonini, S., Rama, P., Olzi, D., Lambiase, A. Neurotrophic keratitis. Eye. 17 (8), 989-995 (2003).
  5. Barrientez, B., et al. Corneal Injury: Clinical and molecular aspects. Exp Eye Res. 186, 107709(2019).
  6. Willmann, D., Fu, L., Melanson, S. W. Corneal Injury. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2023).
  7. Kalha, S., et al. Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing. Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).
  8. Park, J. W., et al. Potential roles of nitrate and nitrite in nitric oxide metabolism in the eye. Sci Rep. 10 (1), 13166(2020).
  9. Ikkala, K., Stratoulias, V., Michon, F. Unilateral corneal insult in Zebrafish results in a bilateral cell shape and identity modification, supporting wound closure. bioRxiv. , (2021).
  10. Yang, L., et al. Substance P promotes diabetic corneal epithelial wound healing through molecular mechanisms mediated via the Neurokinin-1 receptor. Diabetes. 63 (12), 4262-4274 (2014).
  11. Zhao, W., He, X., Liu, R., Ruan, Q. Accelerating corneal wound healing using exosome-mediated targeting of NF-κB c-Rel. Inflamm Regen. 43 (1), 6(2023).
  12. Downie, L. E., et al. Recovery of the sub-basal nerve plexus and superficial nerve terminals after corneal epithelial injury in mice. Exp Eye Res. 171, 92-100 (2018).
  13. He, J., Pham, T. L., Kakazu, A. H., Bazan, H. E. P. Remodeling of substance P sensory nerves and transient receptor potential melastatin 8 (TRPM8) cold receptors after corneal experimental surgery. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (7), 2449-2460 (2019).
  14. Bandeira, F., Yusoff, N. Z., Yam, G. H. -F., Mehta, J. S. Corneal reinnervation following refractive surgery treatments. Neural Regen Res. 14 (4), 557-565 (2019).
  15. Erie, J. C., McLaren, J. W., Hodge, D. O., Bourne, W. M. Recovery of corneal subbasal nerve density after PRK and LASIK. Am J Ophthalmol. 140 (6), 1059-1064.e1 (2005).
  16. Coleman, M. P., Freeman, M. R. Wallerian degeneration, WldS, and Nmnat. Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).
  17. Arenas, E., Esquenazi, S., Anwar, M., Terry, M. Lamellar corneal transplantation. Surv Ophthalmol. 57 (6), 510-529 (2012).
  18. Niederer, R. L., Perumal, D., Sherwin, T., McGhee, C. N. J. Corneal innervation and cellular changes after corneal transplantation: An in vivo confocal microscopy study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (2), 621-626 (2007).
  19. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003(2017).
  20. Volatier, T., Schumacher, B., Cursiefen, C., Notara, M. UV protection in the cornea: Failure and rescue. Biology. 11 (2), 278(2022).
  21. Loulier, K., et al. Multiplex cell and lineage tracking with combinatorial labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
  22. Dana, R., et al. Expert consensus on the identification, diagnosis, and treatment of neurotrophic keratopathy. BMC Ophthalmol. 21 (1), 327(2021).
  23. Matsumoto, Y., et al. Autologous serum application in the treatment of neurotrophic keratopathy. Ophthalmology. 111 (6), 1115-1120 (2004).
  24. Bonini, S., et al. Phase II randomized, double-masked, vehicle-controlled trial of recombinant human nerve growth factor for neurotrophic keratitis. Ophthalmology. 125 (9), 1332-1343 (2018).
  25. Aggarwal, S., Colon, C., Kheirkhah, A., Hamrah, P. Efficacy of autologous serum tears for treatment of neuropathic corneal pain. Ocul Surf. 17 (3), 532-539 (2019).
  26. Singh, N. P., Said, D. G., Dua, H. S. Lamellar keratoplasty techniques. Indian J Ophthalmol. 66 (9), 1239-1250 (2018).
  27. Gautier, B., et al. AAV2/9-mediated gene transfer into murine lacrimal gland leads to a long-term targeted tear film modification. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 1-16 (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Regeneracja nerwów rogówkiabrazyjne uszkodzenie rogówkiaksonotomia nerwumikroskopia wielofotonowaunerwienie rogówkidegeneracja aksonówablacja nerwuregeneracja nabłonka
Trzy strategie wywoływania neurotroficznego zapalenia rogówki i regeneracji nerwów w rogówce myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.