Protokół krok po kroku do wytwarzania siatek powinowactwa streptawidyny jest dostępny do wykorzystania w badaniach strukturalnych trudnych próbek makromolekularnych za pomocą mikroskopii krioelektronowej.
Artykuł metodologiczny
Wytwarzanie siatki powinowactwa do streptawidyny do przygotowania próbek z mikroskopii krioelektronowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Siatki powinowactwa streptawidyny dostarczają strategii do pokonania wielu powszechnie spotykanych wyzwań związanych z przygotowaniem próbek z mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM), w tym denaturacji próbki i preferencyjnych orientacji, które mogą wystąpić ze względu na interfejs powietrze-woda. Siatki powinowactwa do streptawidyny są jednak obecnie wykorzystywane przez kilka laboratoriów krio-EM, ponieważ nie są dostępne na rynku i wymagają starannego procesu wytwarzania. Dwuwymiarowe kryształy streptawidyny są hodowane na biotynylowanej monowarstwie lipidowej, która jest nakładana bezpośrednio na standardowe dziurowęglowe siatki krio-EM. Interakcja o wysokim powinowactwie między streptawidyną a biotyną pozwala na późniejsze wiązanie biotynylowanych próbek, które są chronione przed granicą faz powietrze-woda podczas przygotowywania próbek krio-EM. Ponadto siatki te zapewniają strategię koncentracji próbek dostępnych w ograniczonych ilościach i oczyszczania interesujących kompleksów białkowych bezpośrednio na siatkach. W tym miejscu przedstawiono krok po kroku, zoptymalizowany protokół do solidnego wytwarzania siatek powinowactwa streptawidyny do stosowania w eksperymentach krio-EM i barwienia ujemnego. Dodatkowo dołączony jest przewodnik rozwiązywania problemów dla często doświadczanych wyzwań, aby korzystanie z siatek powinowactwa streptawidyny było bardziej dostępne dla większej społeczności krio-EM.
Wprowadzenie
Kriomikroskopia elektronowa (cryo-EM) zrewolucjonizowała dziedzinę biologii strukturalnej, umożliwiając makromolekularne określanie struktury dużych, elastycznych i niejednorodnych próbek, które wcześniej były niedostępne dla krystalografii rentgenowskiej lub magnetycznego rezonansu jądrowego1. Metoda ta polega na błyskawicznym zamrażaniu makrocząsteczek w roztworze w celu wytworzenia cienkiej warstwy szklistego lodu, którą można następnie zobrazować za pomocą mikroskopu elektronowego. W ostatnich latach znaczące postępy zarówno w sprzęcie mikroskopowym, jak i oprogramowaniu do przetwarzania obrazu jeszcze bardziej rozszerzyły rodzaje próbek odpowiednich do określania struktury w wysokiej rozdzielczości za pomocą cryo-EM.
Niemniej jednak, przygotowanie cienkich, zeszklonych próbek pozostaje jednym z najbardziej krytycznych etapów w określaniu struktury makromolekularnej za pomocą cryo-EM. Próbki biologiczne są często dynamiczne, kruche, podatne na denaturację, a czasami są dostępne tylko w niewielkich ilościach do badań krioelektromagnetycznych. Podczas procesu blottingu cząstki te oddziałują z hydrofobowym interfejsem powietrze-woda, co może skutkować preferowanymi przez cząstki orientacjami, demontażem delikatnych kompleksów, częściową lub całkowitą denaturacją próbki i agregacją2,3,4. Stosowanie detergentów lub innych środków powierzchniowo czynnych, sieciowanie chemiczne i adsorpcja próbek do warstw nośnych są powszechnymi strategiami konserwacji próbek biologicznych podczas procesu zamrażania. Warstwy nośne, takie jak tlenek grafenu5,6,7 lub węgiel amorficzny8 również działają w celu koncentracji cząstek na siatce poprzez adsorpcję, gdy próbka jest dostępna w ograniczonych ilościach. Metody te nie są jednak ani ogólne, ani niezawodne, a optymalizacja przygotowania sieci może być niezwykle czasochłonna lub całkowicie się nie powiedzieć.
siatki powinowactwa streptawidyny9,10 zostały opracowane w celu przezwyciężenia tych niedociągnięć i zapewnienia łagodnej i ogólnie stosowanej metody sekwestracji kompleksu zainteresowania i ochrony go przed interfejsem powietrze-woda. Siatki te wykorzystują dwuwymiarową (2D) sieć krystaliczną streptawidyny wyhodowaną na monowarstwie biotynylowanych lipidów na siatce. Po tym, jak same próbki zostaną poddane biotynylacji (często rzadko i losowo, co oznacza średnio jedną biotynę na kompleks), można je nałożyć na siatkę pokrytą streptawidyną. Ponieważ adsorpcja próbki opiera się na niezwykle wysokim powinowactwie między streptawidyną a biotyną, z tymi siatkami można stosować stężenia próbek tak niskie, jak 10 nM. Dostępne na rynku zestawy do biotynylacji białek i biotynylowane startery do kompleksów zawierających DNA sprawiają, że stosunkowo łatwo jest dołączyć niezbędne ugrupowania biotyny do większości interesujących nas próbek. Oprócz zagęszczenia próbki i trzymania jej z dala od szkodliwego interfejsu powietrze-woda podczas blottingu, losowa biotynylacja jednej lub tylko kilku reszt lizyny może znacznie poprawić zakres orientacji cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania na siatce krio-EM, jak wykazano w wielu badaniach11. Podczas gdy sygnał z leżącego pod spodem kryształu streptawidyny jest obecny na surowych obrazach, schematy przetwarzania danych obejmujące filtrację Fouriera ostrych odbić Bragga od kryształu można łatwo usunąć podczas wczesnego przetwarzania danych, co ostatecznie umożliwia rekonstrukcję próbki o wysokiej rozdzielczości11,12,13. W tym przypadku zapewniony jest zoptymalizowany protokół krok po kroku do solidnej produkcji siatek powinowactwa streptawidyny i późniejszego wykorzystania w eksperymentach krio-EM. Oczekuje się, że dostarczony protokół zostanie ukończony w ciągu 2 tygodni (Rysunek 1A). Pierwsze części protokołu opisują przygotowanie odczynników, wstępną obróbkę siatek i pierwsze etapy odparowywania węgla. Następnie opisano instrukcje dotyczące przygotowania monowarstwy lipidowej i wzrostu kryształów streptawidyny na siatkach EM. Dodatkowo podano instrukcje dotyczące stosowania siatek powinowactwa do streptawidyny w eksperymentach z barwieniem ujemnym i krio-EM. Na koniec przedstawiono procedury usuwania sygnału streptawidyny z mikrofotografii po uzyskaniu danych kriogenicznych.
Protokół
1. Przygotowanie odczynników
- Rozcieńczyć zakupioną w handlu streptawidynę do końcowego stężenia 0,5 mg/ml w buforze krystalizacyjnym (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trehalozy). Upewnij się, że końcowe stężenie trehalozy wynosi 10%. Porcje 25–50 μl należy błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
- Rozpuścić sól sodową 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-(biotynylo) w rozpuszczalniku chloroformu/metanolu/wody w proporcji 65:35:8 v/v/v/v, aby uzyskać końcowe stężenie lipidów 1 mg/ml. Jednorazowe porcje 20-30 μl w temperaturze -80 °C należy przechowywać w szklanych fiolkach.
UWAGA: Przygotowanie rozpuszczalnika jest dokładniejsze, jeśli odbywa się go wagowo. Najpierw połącz 1,85 g ultraczystej wody z 6,41 g metanolu klasy HPLC o wysokiej wydajności chromatografii cieczowej (HPLC) i dodaj to do 22,42 g chloroformu, aby przygotować rozpuszczalnik.
UWAGA: Przed rozpoczęciem niniejszego protokołu należy przeczytać i zrozumieć karty charakterystyki producentów oraz zalecane instrukcje dotyczące obchodzenia się i utylizacji rozpuszczalników organicznych chloroformu i metanolu. Unikać bezpośredniego kontaktu metanolu ze skórą.
2. Wstępna obróbka siatek
- Umyj folię węglową na siatkach ze złotymi siatkami, zanurzając dwukrotnie w 100% chloroformie i raz w 100% etanolu. Umieść kratki na czystej bibule filtracyjnej do wyschnięcia. Powtórz proces prania, w sumie trzy cykle.
UWAGA: Powtarzalny sukces osiągnięto dzięki dostępnym na rynku siatkom z folii węglowej, które mają warstwę węglową o grubości 10-12 nm węgla (patrz lista materiałów) o rozmiarach otworów w zakresie 0,6-2 μm. Z powodzeniem zastosowano również dostępne na rynku siatki ze złotej folii oraz domowe siatki z dziurawego węgla przygotowane zgodnie z protokołem nanofabrykacji Laboratorium Rubinsteina14. Mniej powtarzalne wyniki uzyskano przy użyciu dostępnych na rynku siatek, które mają cieńsze warstwy węglowe. Nie używaj siatek miedzianych, ponieważ miedź reaguje z jakimikolwiek aminami organicznymi, które mogą znajdować się w próbce. - Po wyschnięciu siatek odparuj warstwę węgla o grubości 2,5-5 nm po stronie węglowej siatek z włókna węglowego. Grubość węgla jest kontrolowana za pomocą pomiaru grubości warstwy kryształu kwarcu, który jest wbudowany w parownik węglowy dostarczony w pliku Tabela materiałów.
- Pozwól nowo odparowanemu węglowi starzeć się (tj. stawać się bardziej hydrofobowym) przez 1 tydzień.
3. Przygotowanie sieci streptawidyny
UWAGA: Aby wyhodować kryształy streptawidyny 2D na dziurawo-węglowych siatkach EM, najpierw nakłada się biotynylowaną monowarstwę lipidową na otwory filmu węglowego (Rysunek 1B) metodą transferu Langmuira-Schaefera. Monowarstwa lipidowa jest tworzona zgodnie z kolejnymi krokami (Rysunek 2). Talk w proszku tworzy granicę między olejem rycynowym a szalką Petriego, a cienka warstwa oleju rycynowego pomaga utrzymać stałe ciśnienie powierzchniowe podczas tworzenia monowarstwy lipidowej. Strona zawierająca odparowany węgiel z kroku 2.2 jest używana do zbierania monowarstwy, nadmiar lipidów jest wypłukiwany za pomocą buforu krystalizacyjnego, a roztwór streptawidyny jest inkubowany na siatce w celu krystalizacji.
- Wyczyść powierzchnię stołu 70% etanolem.
- Przepłukać kilkakrotnie szklaną strzykawkę o pojemności 5 μl chloroformem, aby ją oczyścić. Przed użyciem należy pozostawić strzykawkę do całkowitego wyschnięcia.
- Kratki odparowane węglem należy umyć ponownie, tj. tuż przed użyciem, zanurzając je w 100% etanolu. Pozostaw kratki do wyschnięcia na czystej bibule filtracyjnej.
- Podczas suszenia kratek umyj każdą pęsetę antykapilarną 100% chloroformem i 100% etanolem. Pozostaw pęsetę do całkowitego wyschnięcia.
- Po czystej stronie parafilmu przygotuj trzy krople buforu krystalizacyjnego o pojemności 50 μl (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trehalozy) dla każdej siatki, która zostanie wykonana.
- Napełnić pokrywę niepowlekanej szalki Petriego o średnicy 35 mm buforem krystalizacyjnym (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trehalozy). Oczyść powierzchnię papierem do soczewek.
- Rozsyp talk klasy naukowej na obwodzie szalki Petriego. To z kolei służy jako wskaźnik, w następnym kroku, jak daleko rozprzestrzenił się olej rycynowy. Dodaj tyle talku, aby stworzyć barierę, która chroni olej rycynowy przed dotknięciem krawędzi szalki Petriego. Dodanie zbyt dużej ilości talku ogranicza dostępną przestrzeń do wytworzenia monowarstwy lipidowej.
- Zanurz końcówkę pipety o pojemności 200 μl w oleju rycynowym, aby uzyskać średniej wielkości kroplę (około 20 μl), która zwisa z końcówki pipety. Przyłóż tę kroplę do powierzchni buforu na szalce Petriego, gdzie rozprzestrzeni się, tworząc jednolity film. Powstała w ten sposób cienka warstwa oleju służy jako tłok15, który utrzymuje stałe ciśnienie powierzchniowe, gdy tworzy się monowarstwa lipidowa (krok 3.10).
UWAGA: Ważne jest, aby dodać tyle oleju rycynowego, a nie za mało, i lepiej jest dodać jedną kroplę. Poczekaj, aż olej rycynowy całkowicie się rozprowadzi przed utworzeniem monowarstwy lipidowej. - Przepłukać szklaną strzykawkę o pojemności 5 μl jeden lub dwa razy rozpuszczonym lipidem przed pobraniem podwielokrotności do użycia. Należy unikać tworzenia pęcherzyków powietrza w lipidie wypełniającym strzykawkę.
UWAGA: Szklaną strzykawkę przepłukuje się rozpuszczonym lipidem w przypadku, gdy pozostały resztki chloroformu z kroku 3.2. Resztkowy chloroform może wpływać na jakość powstałej monowarstwy. - Dozuj jak najmniejszą objętość (~0,5 μL) lipidu ze strzykawki i delikatnie przyłóż wiszącą kroplę do powierzchni filmu oleju rycynowego. Należy zauważyć, że roztwór lipidowy przebija się przez film oleju rycynowego w miejscu kontaktu i że powstała monowarstwa lipidowa tworzy okrąg w środku cienkiej warstwy oleju rycynowego.
- Dodaj kilka kropli lipidu sekwencyjnie lub dodaj więcej lipidu po utworzeniu kilku siatek, ale jeśli dodasz za dużo, lipid rozprzestrzeni się poza granicę oleju rycynowego i na obwód, w którym talk w proszku i wszelkie zanieczyszczające środki powierzchniowo czynne zostały odizolowane. W takim przypadku proces będzie musiał zostać ponownie uruchomiony.
- Podnieś siatkę za pomocą pęsety antykapilarnej tak, aby proste ramię pęsety i strona siatki odparowana przez węgiel były skierowane w stronę monowarstwy.
- Przenieś część monowarstwy na dziurawy węgiel, dotykając odparowanej przez węgiel strony siatki do monowarstwy przez 1-2 s.
UWAGA: Pomyślne przeniesienie jest sygnalizowane przez to, że powierzchnia siatki staje się hydrofilowa, powodując cienką, kulistą pokrywę buforową pokrywającą całą siatkę po jej podniesieniu z szalki Petriego. - Dotknąć kulistej pokrywy buforu, która teraz przylega do siatki, kolejno przez 1 s każda, do trzech kropli 50 μl buforu krystalizacyjnego, które zostały przygotowane na parafilmie w kroku 3.5.
UWAGA: Ten krok ma na celu usunięcie jak największej ilości nadmiaru lipidu, który pokrywa powierzchnię kulistej czapeczki (a nie poprzednio hydrofobowy film węglowy), aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków lipidowych podczas oglądania próbek w mikroskopie elektronowym. - Ostrożnie dodać 4 μl 0,5 mg/ml streptawidyny do pozostałej sferycznej czapeczki buforu krystalizacyjnego na siatce.
- Umieść kratkę w komorze wilgotnościowej. Powtórz kroki 3.11-3.14 dla całej partii siatek.
- Inkubować kratki w temperaturze pokojowej (RT) przez 2 godziny w komorze wilgotnościowej, aby uniknąć parowania.
UWAGA: Ważne jest, aby złota strona siatki nie uległa zamoczeniu w żadnym momencie po nałożeniu monowarstwy. - Po 2 godzinach inkubacji przygotować jedną 300 μl kropli buforu do płukania (10 mM HEPES, pH 7,5, 50 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trehalozy) dla każdej siatki po czystej stronie parafilmu.
UWAGA: Bufor płuczący zawiera 50 mM KCl zamiast 150 mM KCl, który znajduje się w buforze krystalizacyjnym używanym w krokach 3.5-3.6. - Przemyć nadmiar (niezwiązanej) streptawidyny, umieszczając siatkę na kropli 300 μl buforu do płukania. Wykonaj kroki 3.18-3.20 dla jednej siatki na raz. Unikaj pozostawiania kratek na kropli buforu płuczącego o pojemności 300 μl przez dłuższy czas.
UWAGA: Wykonuje się tylko jedno pranie, ponieważ kryształ/monowarstwa streptawidyny jest w tym momencie krucha. Za każdym razem, gdy siatka jest podnoszona z powierzchni kropli buforu do płukania, mostek cieczy między kratką a kroplą płukania zostaje rozerwany. W momencie pęknięcia do samonośnych kryształów monowarstwowych, które obejmują otwarte otwory filmu węglowego, przykładany jest przejściowy gradient ciśnienia (ciśnienie ssania). Oczekuje się, że to ciśnienie ssania spowoduje przejściowe wybrzuszenie kryształu monowarstwowego, któremu towarzyszy rozszerzanie się obszaru pokrytego przez kryształy. Jeśli wzrost obszaru przekroczy granicę sprężystości kryształu, kryształ może pęknąć lub ulec zaburzeniu. - Natychmiast osusz pęsetę antykapilarną niestrzępiącą się chusteczką, aby ułatwić uwolnienie siatki na bibułę filtracyjną w następnym kroku. Podnieś siatkę unoszącą się na kropli bufora do płukania, wsuwając w nią załamane ramię pęsety antykapilarnej.
- Nadmiar buforu delikatnie zeskrob z boku bibułą filtracyjną. Umieść siatkę na bibule filtracyjnej złotą stroną do dołu, powtórz kroki 3.18-3.20 dla każdej siatki i pozostaw kratki do wyschnięcia na 15-20 minut.
- Po wyschnięciu kratek odwróć je tak, aby złota strona była teraz skierowana do góry. Odparuj cienką warstwę węgla (o grubości około 0,5-2 nm) na złotą stronę siatek.
UWAGA: Przechowuj siatki przy stałej wilgotności, której wartość wydaje się nie mieć znaczenia, zauważając, że oczekuje się, że wielokrotne zmiany wilgotności względnej spowodują cykle rozszerzania i kurczenia się. Aby uzyskać najlepsze wyniki, pozwól siatkom leżakować przez 1 tydzień przed użyciem cryo-EM, ponieważ hydrofobowość tylnej strony siatki może być ważna dla stabilności monowarstwy. Siatki są stabilne przez długi czas, ale po 3 miesiącach węgiel z tyłu może stać się mniej hydrofobowy.
4. Sprawdzanie jakości partii siatki powinowactwa streptawidyny za pomocą negatywnego zabarwienia
- Przygotować dwie krople po 50 μl i jedną kroplę po 100 μl buforu próbki (50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM KCl, 0,5 mM TCEP) po czystej stronie parafilmu.
- Usunąć trehalozę i ponownie uwodnić siatki streptawidyny, dotykając dwóch kropli o pojemności 50 μl i pozwolić siatce unosić się na 100 μl kropli buforu próbki przez 10 min.
UWAGA: Najlepiej unikać używania detergentu podczas ponownego nawodnienia i kolejnych inkubacji wiążących próbkę. Bufor rozproszy się na złotą stronę siatek i ograniczy skuteczność płukania w celu usunięcia nadmiaru próbek. - Po ponownym nawodnieniu podnieś siatkę za pomocą pęsety antykapilarnej, tak aby załamane ramię pęsety antykapilarnej znalazło się w kropli.
- Delikatnie zetrzyj nadmiar buforu z boku i szybko ponownie nałóż 4 μl próbki o długości 75-100 nM (opcjonalnie).
UWAGA: Unikaj pozostawiania siatki do wyschnięcia po ponownym nawodnieniu. - Inkubować próbkę w komorze wilgotnościowej przez 1-5 min.
UWAGA: Czasy koncentracji i inkubacji będą zależne od próbki i powinny być zoptymalizowane. Podane stężenie próbki i czas inkubacji są sugerowanymi punktami początkowymi. - Po czystej stronie parafilmu umieść cztery krople po 30 μl każda zarówno buforu próbki, jak i 1% barwnika mrówczanu uranylu (UF).
UWAGA: Przed wykonaniem tego kroku należy przeczytać i zrozumieć karty charakterystyki producenta oraz zalecane instrukcje dotyczące obchodzenia się i usuwania mrówczanu uranylu. Mrówczan uranylu jest związkiem toksycznym i radioaktywnym. Należy upewnić się, że uzyskałeś uprzednią zgodę instytucji na użycie materiału radioaktywnego. - Zmyć niezwiązaną próbkę, dotykając każdej z czterech kropli buforu do próbki.
- Wybarwić próbkę przy użyciu standardowych procedur barwienia ujemnego za pomocą UF. Delikatnie zetrzyj plamę UF z boku, pozostawiając bardzo grubą warstwę plamy na siatce. Po osuszeniu można nałożyć dodatkowe 0,5 μl bejcy na siatkę, aby w razie potrzeby plama była grubsza. Pozostaw ruszt do wyschnięcia na powietrzu.
UWAGA: Ponieważ siatki streptawidyny są bardzo hydrofilowe, barwienie ujemne ma tendencję do tworzenia wszędzie bardzo jednolitego filmu, w przeciwieństwie do tego, co jest powszechnie obserwowane przy użyciu ciągłych siatek węglowych poddanych działaniu wyładowań jarzeniowych. W związku z tym zaleca się pozostawienie grubszej warstwy roztworu bejcy.
5. Zamrażanie siatek powinowactwa streptawidyny z próbkami biotynylowanymi
UWAGA: Poniższa procedura jest przeznaczona dla jednostronnego automatycznego tłoka, który zawiera wewnętrzny czujnik blottingu (możliwe jest również jednostronne ręczne blotting w innych automatycznych aparatach do nurkowania)
- Przygotować dwie krople po 50 μl i jedną kroplę po 100 μl buforu do próbek (np. 50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM KCl, 0,5 mM TCEP) po czystej stronie parafilmu.
- Ponownie uwodnić siatki streptawidyny, dotykając dwóch kropli o pojemności 50 μl i pozwolić siatce unosić się na 100 μl kropli buforu próbki przez 10 minut.
- Po ponownym nawodnieniu podnieś siatkę za pomocą pęsety antykapilarnej, tak aby załamane ramię pęsety antykapilarnej znalazło się w kropli.
- Delikatnie zetrzyj nadmiar buforu z boku i szybko nałóż 4 μl próbki o długości 75-100 nM.
- Inkubować próbkę w komorze wilgotnościowej przez 1-5 minut.
UWAGA: Ponownie, czas koncentracji i inkubacji będzie zależny od próbki i powinien być zoptymalizowany. Podane stężenie próbki i czas inkubacji są sugerowanymi punktami początkowymi. W przypadku próbek o niskich stężeniach można inkubować przez dłuższy czas i/lub kilkakrotnie wiązać próbkę z siatkami. - Przygotować dwie krople buforu zamrażającego o pojemności 10 μl (np. 50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM KCl, 0,5 mM TCEP, 3% trehalozy, 0,01% NP40) po czystej stronie parafilmu. Po inkubacji przemyć niezwiązaną próbkę, dotykając rusztem pierwszej kropli buforu zamrażającego. Upuść siatkę na drugą kroplę bufora zamrażającego.
- Szybko chwyć krawędź siatki za pomocą pęsety przymocowanej do jednostronnego automatycznego tłoka. Delikatnie zetrzyj nadmiar buforu i szybko nałóż 4 μl buforu zamrażającego (50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM KCl, 0,5 mM TCEP, 3% trehalozy, 0,01% NP40) na siatkę.
- Przymocuj pęsetę do jednostronnego automatycznego tłoka. Najlepsze wyniki uzyskano przy użyciu czujnika blot, który wykrywa kroplę cieczy na siatce z czasem blot w granicach 4-6 s. Warunki będą się różnić w zależności od użytej próbki i buforu.
6. Przetwarzanie danych z filmów krio-EM zebranych z siatek powinowactwa streptawidyny
Zbieranie danych na temat siatek powinowactwa do streptawidyny może być wykonywane jak w przypadku standardowych siatek, bez konieczności specjalnego dostosowywania mikroskopu. Jednak opisana tutaj procedura usuwa sygnał streptawidyny dopiero po korekcji ruchu mikrofotografii. W związku z tym nie można niezawodnie wykonywać etapów przetwarzania danych, takich jak polerowanie cząstek, które opierają się na oryginalnych klatkach filmu. Odejmowanie sygnału streptawidyny (wymagane do wszystkich standardowych procesów podrzędnych z wyjątkiem estymacji CTF) wymaga tutaj Matlaba w wersji R2014b lub nowszej działającej w środowisku Linux. Odejmowanie sygnału opiera się na krystalicznej naturze warstwy streptawidyny, która pozwala na maskowanie pików, a tym samym usuwanie sygnału z transformaty Fouriera każdego mikrografu.
- Ustawianie skryptów przetwarzania
- Skopiuj wszystkie pliki z plików uzupełniających do dedykowanego folderu w katalogu projektu
- Przygotuj katalog o nazwie processing_scripts, który zawiera następujące pliki:
lsub.m (Uzupełniający plik kodowania 1; skrypt odejmowania)
process_subtration.sh (Supplemental Coding File 2; skrypt opakowujący, który zapętla wszystkie dostępne mikrofotografie, tworzy równoległe zadania i śledzi wejście i wyjście)
process_subtraction.cfg (Supplemental Coding File 3; plik konfiguracyjny zawierający parametry zadania odejmowania, patrz 6.2) - Przygotuj katalog o nazwie support_scripts, który zawiera następujące pliki:
bg_drill_hole.m (Uzupełniający plik kodowania 4)
bg_FastSubtract_standard.m (Uzupełniający plik kodowania 5)
bg_Pick_Amp_masked_standard.m (Uzupełniający plik kodowania 6)
bg_push_by_rot.m (Uzupełniający plik kodowania 7)
ReadMRC.m (Uzupełniający plik kodowania 8)
WriteMRC.m (Uzupełniający plik kodowania 9)
WriteMRCHeader.m (Uzupełniający plik kodowania 10)
- Dostosuj plik konfiguracyjny zgodnie z potrzebami (process_subtraction.cfg, (patrz Rysunek 3) zgodnie z potrzebami:
- Wejście: Ścieżka do katalogu, który zawiera mikrofotografie z korekcją ruchu w formacie mrc. Użyj katalogu lub wzorca zawierającego symbole wieloznaczne (?, *).
Przykład:
input="/ścieżka/do/project_directory/mikrografie/"
lub
input="/ścieżka/do/project_directory/mikrofotografii/*.mrc" - output_dir: Ścieżka do katalogu, do którego mają być zapisane mikrofotografie odjęte kratkowo.
- only_do_unfinished: Określ (prawda|fałsz), czy istniejące wcześniej odjęte mikrografie powinny zostać nadpisane lub pominięte. Ten parametr jest przydatny do uruchamiania skryptu odejmowania kraty w trakcie sesji mikroskopu (domyślnie: true).
- num_parallel_jobs: Określ liczbę zadań równoległych. Liczba ta zależy od specyfikacji sprzętowej używanej do przetwarzania i nie powinna być wyższa niż liczba dostępnych rdzeni. W systemach z 32 rdzeniami i sieciowym systemem plików optymalną wydajność osiągnięto przy użyciu 14 równoległych zadań. Aby uzyskać najlepszą wydajność, zoptymalizuj tę wartość za pomocą podzestawu mikrofotografii.
- Pad_Origin_X: 200 dla detektora K3 w orientacji pionowej (szerokość obrazu < wysokość obrazu) lub w przypadku korzystania z detektora kwadratowego (Falcon III, Falcon IV, K2), 1000 dla detektora K3 w orientacji poziomej (szerokość obrazu > wysokość). FFT jest wykonywany w kwadratowych pudełkach i wyściółka jest wymagana, jeśli czujnik ma wymiary inne niż kwadratowe.
- Pad_Origin_Y: 1000 dla detektora K3 w orientacji pionowej (szerokość obrazu < wysokość obrazu), 200 w przypadku korzystania z detektora kwadratowego (Falcon III, Falcon IV, K2) lub w przypadku korzystania z detektora K3 w orientacji poziomej (szerokość obrazu > wysokość obrazu).
- Nie zmieniaj Inside_Radius_Ang (90) i Outside_Radius_Ang (3.0). Odejmowanie sieci odbywa się między dwiema rozdzielczościami (jednostką jest angstrem).
- Pixel_Ang: Podaj rozmiar piksela jako wartość zmiennoprzecinkową.
- Próg: Wartość odcięcia progu odejmowania w celu zastąpienia kraty tłem w przestrzeni Fouriera. Pomyślnie użyte wartości mieszczą się w przedziale 1,4-1,6. Użyj 1.42 jako punktu wyjścia.
- Nie zmieniaj expand_pixel (10) i pad_out_opt (0). expand_pixel jest wartością średnicy używaną do maskowania wokół pikseli o wartościach wyższych niż wartość odcięcia progu. pad_out_opt jest to opcja, która decyduje, czy obszar wypełniony ma być uwzględniony w danych wyjściowych.
- addpath_m: Ścieżka do skryptów pomocy technicznej.
- path_to_matlab_bin: Ścieżka do katalogu bin instalacyjnego systemu Matlab.
- path_matlab_script: Ścieżka do skryptu odejmowania matlab (lsub.m ), który został skopiowany powyżej w kroku 6.1.2.
- Wejście: Ścieżka do katalogu, który zawiera mikrofotografie z korekcją ruchu w formacie mrc. Użyj katalogu lub wzorca zawierającego symbole wieloznaczne (?, *).
- Po zapisaniu zmodyfikowanego skryptu uruchom skrypt (bash ./process_subtraction.sh ), aby odjąć sygnał streptawidyny od mikrografów wejściowych. Skrypt może zostać przerwany i/lub ponownie uruchomiony, jeśli parametr only_do_unfinished jest ustawiony na wartość true (patrz w kroku 6.2.3). Jeśli wystąpi błąd, przejrzyj parametry określone w skrypcie powłoki bash. Upewnij się, że nie ma niezamierzonych odstępów między zmiennymi parametrów a przypisanymi im wartościami, ponieważ jest to częste źródło błędów.
- Użyj obrazów odjętych kratowo do standardowego przetwarzania obrazu cryo-EM.
Wyniki
Po odparowaniu węgla w kroku 3.21 (zazwyczaj po jednym tygodniu), siatki powinowactwa do streptawidyny można wykorzystać do przygotowania próbek do cryo-EM lub barwienia negatywowego zgodnie z procedurami opisanymi w krokach 4 i 5. Na Rysunku 4A przedstawiono reprezentatywny mikrograf biotynilowanej próbki zamrożonej przy użyciu siatek powinowactwa do streptawidyny, wykonany za pomocą detektora K3 na Titan Krios przy powiększeniu 81 000X i rozmiarze piksela 1,05 Å. Pomyślne utworzenie sieci rozpoznaje się po ciągłym wzorze siatki pojawiającym się w tle obrazu. Można to łatwiej zaobserwować dzięki wzorowi dyfrakcyjnemu widocznemu w szybkiej transformacie Fouriera (FFT) przedstawionej na Rysunku 4A (po prawej). Po zebraniu danych, zgodnie z procedurą opisaną w kroku 6 niniejszego protokołu, sygnał pochodzący z sieci streptawidyny może zostać programowo zamaskowany w celu uzyskania mikrografu po odjęciu (Rysunek 4B), który można wykorzystać w kolejnych etapach przetwarzania danych. FFT na Rysunku 4B (po prawej) pokazuje, że wzór dyfrakcyjny zaobserwowany na Rysunku 4A (po prawej) został pomyślnie usunięty z oryginalnego obrazu.
Rycina 4C przedstawia przykładową mikrofotografię biotynilowanej próbki związanej z siatkami powinowactwa do streptawidyny i barwionej negatywnie za pomocą formatu uranylowego, wykonaną na mikroskopie Tecnai 12 przy powiększeniu 49 000x i rozmiarze piksela 1,6 Å. Siatki przygotowano zgodnie z procedurą opisaną w kroku 4 niniejszego protokołu, pozostawiając grubszą warstwę barwnika.
Występuje kilka typowych obserwacji w przypadku niepowodzenia procedury przygotowania siatek z streptawidyną, które zostały opisane szerzej w sekcji dyskusji i Tabela 1. Rycina 5 przedstawia kilka przykładów tych obserwacji. Rycina 5A przedstawia mikrografię negatywnie barwionej siatki powinowactwa do streptawidyny, pochodzącej z partii przygotowanej ponad sześć miesięcy wcześniej. Monowarstwa oddzieliła się od otworów w folii węglowej siatek Quantifoil i wykazuje wymiary zbliżone do średnicy otworów w siatce. Rysunek 5B przedstawia przykład kryształów streptawidyny o wysokiej mozaikowości, które ulegają łatwym zaburzeniom podczas procedur przygotowania próbek. Rycina 5C przedstawia reprezentatywną mikrofotografię z siatki powinowactwa do streptawidyny, na której warstwa węgla naniesiona metodą odparowania w kroku 3.21 jest zbyt cienka lub została pominięta. Sieć streptawidyny uległa fragmentacji podczas procesu przygotowania próbki do krio-EM. Rycina 5D przedstawia siatkę do powinowactwa streptawidynowego barwioną negatywnie, która jest zanieczyszczona pęcherzykami lipidowymi, co prawdopodobnie wynika z niewystarczających przemyć w kroku 3.13 lub zamoczenia złotej strony siatki podczas kroków 3.13-3.20. Należy odnieść się do sekcji dyskusji i Tabela 1 w celu opracowania strategii pozwalających przezwyciężyć te powszechne problemy.
Rysunek 1: Schemat procedury wytwarzania siatek powinowactwa do streptawidyny. (A) Ogólny harmonogram procedury wytwarzania siatek powinowactwa do streptawidyny. Cała procedura może zostać ukończona w ciągu dwóch tygodni, wymagając dwóch etapów naparowania węgla oraz jednego tygodnia przerwy po każdym z nich, aby węgiel mógł odpowiednio „dojrzeć”. (B) Powiększony widok pola siatki powinowactwa do streptawidyny, przedstawiający warstwy tworzące siatkę po zakończeniu procesu wytwarzania, w tym standardową siatkę do cryo-EM ze złotymi pręcikami i dziurkową folią węglową, pierwszą naparowaną warstwę węgla, monowarstwę lipidową, 2D-kryształ streptawidyny oraz naparowaną z tyłu warstwę wspierającą z węgla. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Krystalizacja monowarstwy lipidowej i streptawidyny (A) Zdjęcia demonstrujące sposób prawidłowego tworzenia monowarstwy lipidowej w małej płytce Petriego z wykorzystaniem talku do stworzenia bariery dla oleju rycynowego, co pozwala na utrzymanie stałego ciśnienia powierzchniowego podczas formowania monowarstwy lipidowej. (B) Zdjęcia demonstrujące sposób hodowli kryształów streptawidyny na siatkach do krio-EM. Najpierw stronę węglową siatek dotyka się do monowarstwy lipidowej, a następnie wykonuje trzy kolejne przemycia w buforze krystalizacyjnym. Dodaje się streptawidynę, a siatki inkubuje się w komorze wilgotnościowej przez 2 h. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Rysunek 3: Przykładowe parametry dla pliku process_subtraction.cfg służące do odejmowania sieci streptawidyny z mikrografii (krok 6). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 4: Reprezentatywne wyniki pomyślnego wykonania siatek powinowactwa do streptawidyny. (A) Mikrograf Cryo-EM kompleksów biotynilowanego białka/nukleosomu przygotowanych z użyciem własnoręcznie wykonanych siatek powinowactwa do streptawidyny. Po prawej stronie pokazano FFT, które przedstawia wzór dyfrakcyjny kryształu streptawidyny. (B) Ten sam mikrograf co w panelu A po zastosowaniu procedury odejmowania sieci w celu usunięcia sygnału z 2D kryształu streptawidyny z oryginalnego obrazu. (C) Przykład mikrografu uzyskanego z barwienia negatywowego biotynilowanej próbki związanej z siatkami powinowactwa do streptawidyny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 5: Reprezentatywne wyniki nieudanej preparatyki siatek z powinowactwem do streptawidyny. (A) Mikrograf pokazujący mobilizację monowarstwy streptawidyny z otworów siatki w przypadku siatek starszych niż sześć miesięcy. (B) Mikrograf pokazujący sieci streptawidyny o wysokiej mozaikowości, które są łatwo uszkadzane podczas procedur przygotowania próbek zarówno do cryo-EM, jak i do barwienia negatywowego. (C) Mikrograf pokazujący fragmentację sieci streptawidyny podczas przygotowania próbki do cryo-EM, gdy warstwa naparowania węgla w kroku 3.21 jest zbyt cienka lub została pominięta. (D) Reprezentatywny mikrograf zanieczyszczony pęcherzykami lipidowymi, prawdopodobnie w wyniku niewystarczającego przemywania w kroku 3.13 lub zamoczenia złotej strony siatki podczas kroków 3.13-3.20. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Tabela 1: Przewodnik rozwiązywania problemów w celu przezwyciężenia typowych trudności występujących podczas nieudanej produkcji siatek powinowactwa do streptawidyny. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Plik uzupełniający z kodem 1: lsub.m Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Pomocniczy plik kodu 2: process_subtration.sh Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Dodatkowy plik kodu 3: process_subtraction.cfg Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dodatkowy plik z kodem 4: bg_drill_hole.m Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dodatkowy plik z kodem 5: bg_FastSubtract_standard.m Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający z kodem 6: bg_Pick_Amp_masked_standard.m Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dodatkowy plik z kodem 7: bg_push_by_rot.m Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający z kodem 8: ReadMRC.m Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Pomocniczy plik kodu 9: WriteMRC.m Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik z dodatkowym kodem 10: WriteMRCHeader.m Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Nasz protokół opisuje, jak tworzyć i wykorzystywać siatki powinowactwa streptawidyny oraz jak przetwarzać dane zawierające sygnał dyfrakcyjny streptawidyny. W protokole znajduje się kilka krytycznych kroków, które wymagają szczególnej uwagi.
Nieudane partie siatki można przypisać kilku typowym błędom. Najczęstszym źródłem błędów jest stosowanie przestarzałych lub złej jakości odczynników. Szczególnie ważne jest przygotowanie biotynylowanego roztworu lipidowego dokładnie tak, jak opisano w protokole. Ponadto wszelkie zanieczyszczenia, takie jak pozostałości detergentów na sprzęcie laboratoryjnym lub naturalnie obecne oleje na skórze, mogą wpływać na jakość kryształów streptawidyny, a tym samym na jakość uzyskanych obrazów. Dlatego zaleca się wykonanie trzech cykli mycia kratek przed pierwszym odparowaniem węgla w celu usunięcia ewentualnych zanieczyszczeń środkami powierzchniowo czynnymi od producenta kratki (krok 2.1). Ponadto zaobserwowano, że zanieczyszczenie lub zanieczyszczenie oleju rycynowego utrudnia tworzenie się kryształów na siatce.
Tworzenie i zbieranie monowarstwy lipidowej to zadanie, które należy przećwiczyć kilka razy, aby wyczuć małe objętości lipidów. Nie jest niczym niezwykłym, że ten etap kończy się niepowodzeniem przez pierwsze dwa lub trzy razy, zanim będzie można wytworzyć odpowiednią monowarstwę lipidową, co ostatecznie znajduje odzwierciedlenie w jakości kryształów streptawidyny, które są widoczne w ujemnie barwionych siatkach (Figura 4C).
Ważne jest, aby nigdy nie dopuścić do zamoczenia tylnej strony (złota, strona lipidowa) siatki podczas procesu produkcji siatki (kroki 3.12-3.20). W przypadku, gdy tył ulegnie zamoczeniu, zaleca się wyrzucenie siatki. Może to spowodować pojawienie się dużych pęcherzyków lipidowych, które zaburzają jakość obrazu (ryc. 5D) (wiersz 3, tabela 1). Pęcherzyki lipidowe można również zaobserwować z powodu niewystarczającego mycia po nałożeniu monowarstwy lipidowej (krok 3.13). Zaleca się trzy kolejne płukania buforem krystalizacyjnym po dotknięciu monowarstwy lipidowej przed dodaniem streptawidyny.
Po odparowaniu cienkiej warstwy węgla na siatki osadzone w trehalozie, tylna strona siatki może być mokra bez szkody dla jakości sieci. Na przykład zwilżanie tylnej strony jest często obserwowane, gdy bufor próbki zawiera nawet minimalne ilości detergentu. Zwilżanie tylnej strony przez próbkę może powodować niespecyficzne wiązanie próbek z cienką warstwą węglową na odwrocie, co zmniejsza skuteczność zapobiegania dyfuzji cząstek do granicy faz powietrze-woda lub stosowanie wiązania powinowactwa do strategii oczyszczania w sieci. Jeśli to możliwe, dodać próbkę do siatki przy braku detergentu. Detergent i inne dodatki mogą być następnie dodawane podczas etapów mycia kratki lub dodawane w ostatnim etapie przed witryfikacją. Jest to jedno z ograniczeń w stosowaniu siatek powinowactwa do streptawidyny; Jeśli jednak celem jest poprawa orientacji preferencyjnej, przygotowanie próbki za pomocą, w tym detergentu, zostało przeprowadzone z powodzeniem11.
Częstym źródłem błędu może być wiek sieci w odniesieniu do obu etapów parowania węgla (etap 2.3 i etap 3.21). W tym protokole zalecany okres oczekiwania wynosi 5-7 dni po odparowaniu węgla z tyłu przed użyciem siatek streptawidyny do krio-EM. Gdy siatki są używane zbyt wcześnie po wyprodukowaniu, zaobserwowano, że sieć i monowarstwa lipidowa mobilizują się z otworów siatki. Podobną obserwację można poczynić, gdy siatki są zbyt stare i są używane po sześciu miesiącach (rysunek 5A) (wiersz 1, tabela 1). Stawiamy hipotezę, że tę obserwację tłumaczy się zmianami hydrofobowości nośnika węglowego, który jest stosowany do stabilizacji monowarstwy lipidowej i kryształów streptawidyny. Dodatkowo, sieci streptawidyny mogą wydawać się mozaikowe (Rysunek 5B) (Wiersz 3, Tabela 1) i pęknięte zarówno w barwieniu ujemnym, jak i krio-EM, jeśli monowarstwa zostanie nałożona na siatki, w których pierwsza warstwa parowania węgla (krok 2.3) nie zestarzała się wystarczająco.
Dodatkowym częstym źródłem błędu może być kruchość monowarstwy krystalicznej streptawidyny (monowarstwa lipidowa sama w sobie jest płynna i może odwracalnie rozszerzać się lub ściskać). Odparowanie węgla z tyłu (krok 3.21) zapewnia krytyczną stabilność zarówno monowarstwy, jak i sieci streptawidyny podczas procesu adsorpcji, płukania i krio-EM. W przypadku braku wystarczającego parowania węgla do tylnej strony siatki, sieci streptawidyny często wydają się rozdrobnione po osuszeniu/zamrożeniu (Rysunek 5C) (Wiersz 2, Tabela 1). W tym protokole sugerujemy użycie jednostronnej automatycznej zamrażarki wgłębnej do jednostronnego bibuły. Metoda ta pozwala uzyskać wysoce powtarzalne warunki blottingu, które zachowują sieć streptawidyny podczas procesu zamrażania i pozwalają na usprawnioną optymalizację parametrów aplikacji próbki i blottingu. Alternatywnie, w połączeniu z ręcznym osuszaniem zastosowano inne zautomatyzowane urządzenia do zamrażania wgłębnego. Aby to zrobić, rzeczywista funkcja blottingu jest wyłączona w ustawieniach urządzenia, a zamiast tego siatka jest osuszana, sięgając pęsetą trzymającą bibułę przez boczne wejście. Ta metoda może osiągnąć wysokiej jakości wyniki dla laboratoriów bez jednostronnego urządzenia do blottingu i zamrażania wgłębnego; Jednak odtwarzalność między sieciami jest wyzwaniem.
Chociaż stosowanie siatek powinowactwa do streptawidyny ma wiele zalet, należy wziąć pod uwagę pewne ograniczenia tej metody. Ze względu na charakter zabiegu, zwykle nie jest możliwa ocena jakości sieci streptawidyny, dopóki cały proces nie zostanie zakończony. Sugeruje się szybkie sprawdzenie jakości każdej partii za pomocą negatywnego zabarwienia przed zamrożeniem próbek. Ze względu na sygnał dostarczany przez sieć streptawidyny do surowych obrazów, w niektórych przypadkach może być trudno ocenić, na podstawie samych obrazów, czy istnieje wystarczająca liczba nienaruszonych, rozproszonych cząstek. Z tego samego powodu przetwarzanie w locie danych krio-EM podczas akwizycji danych nie jest możliwe, chyba że procedura odejmowania sygnału streptawidyny została włączona do potoku wstępnego przetwarzania danych. Ponieważ sygnał streptawidyny jest zwykle odejmowany od obrazów z korekcją ruchu, a nie od samych klatek, polerowanie bayesowskie, zaimplementowane w popularnych pakietach oprogramowania, może się nie powieść przy użyciu opisanych procedur odejmowania. W związku z tym zaleca się wykonywanie korekcji ruchu w wielu łatach, aby zminimalizować ruch cząstek od początku przetwarzania danych16.
Pomimo tych ograniczeń, siatki powinowactwa do streptawidyny mają wiele zalet. Dwie główne zalety, jakie zapewniają siatki powinowactwa streptawidyny w porównaniu ze standardowymi kratkami krioelektromagnetycznymi z otwartymi otworami, to sposób ochrony próbek z granicy faz powietrze-woda i koncentracji próbek o niskiej obfitości (10-100 nM) na siatce. Inne warstwy nośne, takie jak węgiel i tlenek grafenu, mogą być również wykorzystywane jako strategie przezwyciężania tych wąskich gardeł związanych z przygotowaniem próbek. W jednym z przykładów siatki powinowactwa streptawidyny były jedynym rozwiązaniem pozwalającym uzyskać nienaruszoną rekonstrukcję interakcji białko-kwas nukleinowy, która była niezgodna z podejściami do sieciowania. 12
Kolejną ważną zaletą, jaką zapewniają siatki powinowactwa do streptawidyny, jest rozwiązanie dla próbek, które adsorbują się z innymi warstwami nośnymi, takimi jak węgiel lub tlenek grafenu, z preferowanymi orientacjami, które utrudniają uzyskanie rekonstrukcji 3D próbki będącej przedmiotem zainteresowania. Losowa biotynylacja próbek przy użyciu dostępnych na rynku zestawów pozwala na losowe przyłączenie próbki będącej przedmiotem zainteresowania do monowarstwy streptawidyny w celu uzyskania większej liczby potencjalnych widoków w celu pokonania tego wyzwania.
Ponadto siatki powinowactwa streptawidyny oferują zalety, które są unikalne dla siatek opartych na powinowactwie. Wysokie powinowactwo i swoistość interakcji streptawidyna-biotyna pozwala na sprzężenie siatek powinowactwa streptawidyny z innymi przepływami pracy, które obejmują biotynę w celu oczyszczenia kompleksów będących przedmiotem zainteresowania. W jednym z opublikowanych przykładów autorzy unieruchomili kompleks na siatkach powinowactwa do streptawidyny i inkubowali partnera wiążącego o nieznanej stechiometrii w dużym nadmiarze. Po zmyciu niezwiązanego białka otrzymano prawidłowo złożony superkompleks, który można było natychmiast przeanalizować za pomocą cryo-EM11. Jednym z możliwych przyszłych zastosowań może być połączenie znaczników białkowych wiążących streptawidynę, systemu Avi-tag lub metod znakowania zbliżeniowego z siatkami powinowactwa streptawidyny w celu ekstrakcji pojedynczych białek i/lub kompleksów białkowych bezpośrednio ze źródeł rekombinowanych lub endogennych bez standardowych skomplikowanych schematów oczyszczania.
Dostarczając ten protokół, laboratoria powinny być w stanie łatwo odtworzyć wytwarzanie siatek powinowactwa streptawidyny i ustalić je jako bardziej powszechnie używane narzędzie do analizy strukturalnej kompleksów białkowych za pomocą cryo-EM.
Podziękowania
T.C. był wspierany przez grant szkoleniowy z zakresu biofizyki molekularnej Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych GM-08295 oraz stypendium badawcze dla absolwentów National Science Foundation w ramach grantu numer DGE 2146752. R.G. i B.H. byli wspierani przez grant National Institute of Health R21-GM135666 przyznany R.G. i B.H. Praca ta została częściowo sfinansowana z grantu National Institute of General Medical Sciences R35-GM127018 przyznanego E.N. E.N. jest badaczem Instytutu Medycznego Howarda Hughesa.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sól sodowa 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-(biotynylo) | Avanti Polar Lipids | 870285P | Występuje w postaci proszku. Rozpuścić w stężeniu 1– 10 mg/ml w rozpuszczalniku chloroform/metanol/woda, 65:35:8 v/v i przechowywać w podwielokrotnościach jednorazowego użytku w temperaturze -80 °; C |
| 200 proof czysty etanol | Fisher Scientific | 07-678-005 | |
| 5 μ L Strzykawka Hamiltona | Hamilton | 87930 | 5 & mikro; L Strzykawka mikrolitrowa Model 75 RN, mała wyjmowana igła, 26 G, 2 cale, styl punktowy 2 |
| Olej rycynowy | Sigma Adrich | 259853 | |
| Naczynia do hodowli komórkowych nieobrobione (35 mm) | Bio Basic | SP22146 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 650471 | |
| D-(+)-trehaloza dwuwodny, ze skrobi, ≥ 99% | Sigma Aldrich | T9449 | |
| DUMONT Pęseta antykapilarna odwrócona (samozamykająca) Biologia Grade | Ted Pella | 510-5NM | |
| HPLC Grade Metanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Leica EM ACE600 Wysokopróżniowa powlekarka do napylania | Leica | ||
| Leica EM GP2 Automatyczna zamrażarka wgłębna | Leica | ||
| Quantifoil R 2/1 Au300 | Quantifoil | Q84994 | |
| Steptavidin | New England Bioscience | N7021S | Występuje w postaci roztworu 1 mg/ml. Rozcieńczyć do końcowego stężenia 0,5 mg / ml w buforze krystalizacyjnym o końcowym stężeniu trehalozy 10%. Może być zamrożony w 25– 50 μ Porcje L |
| Talk w proszku | Carolina | 896060 | |
| Bibuła filtracyjna Whatman Grade 1 | Cytiva | 1001-085 |
Bibliografia
- Glaeser, R. M., Nogales, E., Chiu, W. Single-particle Cryo-EM of Biological Macromolecules. IOP Publishing. , IOP Publishing. Bristol, UK. (2021).
- Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 74, 560-571 (2018).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle cryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, e34257(2018).
- Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
- Wang, F., et al. General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (39), 24269-24273 (2020).
- Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
- Williams, R. C., Glaeser, R. M. Ultrathin carbon support films for electron microscopy. Science. 175 (4025), 1000-1001 (1972).
- Han, B. -G., et al. Long shelf-life streptavidin support-films suitable for electron microscopy of biological macromolecules. Journal of Structural Biology. 195 (2), 238-244 (2016).
- Han, B. -G., et al. Electron microscopy of biotinylated protein complexes bound to streptavidin monolayer crystals. Journal of Structural Biology. 180 (1), 249-253 (2012).
- Domínguez-Martín, M. A., et al. Structures of a phycobilisome in light-harvesting and photoprotected states. Nature. 609 (7928), 835-845 (2022).
- Kasinath, V., et al. JARID2 and AEBP2 regulate PRC2 in the presence of H2AK119ub1 and other histone modifications. Science. 371 (6527), eabc3393(2021).
- Lahiri, I., et al. 3.1 structure of yeast RNA polymerase II elongation complex stalled at a cyclobutane pyrimidine dimer lesion solved using streptavidin affinity grids. Journal of Structural Biology. 207 (3), 270-278 (2019).
- Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. Fabrication of carbon films with ~ 500nm holes for cryo-EM with a direct detector device. Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).
- Levine, M. J., Schwarz, J. A. Experimental guidelines for producing molecular assemblies by Langmuir-Blodgett techniques. Journal of Chemical Education. 65 (7), 638(1988).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
Przedruki i uprawnienia
