Artykuł metodologiczny

Transformacja i regeneracja korzeni owłosionych u Arabidopsis thaliana i Brassica napus

5.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66223

⸱

22 grudnia 2023

 ,  ,  ,  , 
1Hormonal Crosstalk in Plant Development, Mendel Center for Plant Genomics and Proteomics, CEITEC MU-Central European Institute of Technology, Masaryk University, 2PSI - Photon Systems Instruments

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół opisuje indukcję owłosionych korzeni za pomocą łodyg kwiatostanu Arabidopsis i hipokotyli Brassica napus. Owłosione korzenie mogą być hodowane i wykorzystywane jako eksplantaty do regeneracji roślin transgenicznych.

Streszczenie

Transformacja owłosionego korzenia stanowi wszechstronne narzędzie do biotechnologii roślin u różnych gatunków. Zakażenie szczepem Agrobacterium przenoszącym plazmid indukujący korzenie (Ri) indukuje tworzenie się owłosionych korzeni w miejscu zranienia po przeniesieniu T-DNA z plazmidu Ri do genomu rośliny. W protokole szczegółowo opisano procedurę indukcji owłosionych korzeni korzeniowych w postaci iniekcji u Brassica napus DH12075 i Arabidopsis thaliana Col-0. Owłosione korzenie mogą być wykorzystane do analizy interesującego nas transgenu lub przetworzone w celu wytworzenia roślin transgenicznych. Pożywka regeneracyjna zawierająca cytokininę 6-benzyloaminopurynę (5 mg/L) i kwas auksyno-1-naftalenooctowy (8 mg/L) skutecznie wywołuje tworzenie pędów u obu gatunków. Protokół obejmuje genotypowanie i selekcję regenerantów i roślin T1 w celu uzyskania roślin przenoszących interesujący nas transgen i wolnych od T-DNA z plazmidu Ri. Przedstawiono również alternatywny proces prowadzący do powstania rośliny kompozytowej. W tym przypadku owłosione korzenie są utrzymywane na pędzie (zamiast naturalnych korzeni), co umożliwia badanie transgenu w owłosionych kulturach korzeniowych w kontekście całej rośliny.

Wprowadzenie

Transformacja roślin jest wąskim gardłem każdego badania genetycznego w biologii roślin. Bakteria przenoszona przez glebę, Agrobacterium tumefaciens, jest szeroko stosowana jako środek dostarczania genów przez zanurzenie kwiatowe lub hodowlę tkankową w celu wytworzenia transformantów. A. tumefaciens infekuje rośliny w miejscu zranienia i powoduje nowotwory w wyniku transferu i integracji T-DNA z plazmidu indukującego nowotwór (Ti) do genomu rośliny gospodarza. Zmodyfikowane szczepy A. tumefaciens ze zmodyfikowanym plazmidem Ti bez T-DNA typu dzikiego i wektorem binarnym ze sztucznym T-DNA i miejscami klonowania w celu wstawienia interesującego genu są powszechnie stosowane jako wydajny system transformacji roślin1. Jednak wiele modelowych gatunków i roślin uprawnych jest opornych na zanurzanie się w kwiatach lub regenerację roślin in vitro lub ma długie cykle wzrostu, co wpływa na wydajność tego systemu przemian.

Agrobacterium rhizogenes powoduje powstawanie korzeni przybyszowych lub owłosionych w miejscu zranienia po zakażeniu rośliny żywicielskiej. Podobnie jak A. tumefaciens, A. rhizogenes przenosi T-DNA z plazmidu indukującego korzenie (Ri) do genomu rośliny żywicielskiej, powodując rozwój transgenicznych owłosionych korzeni. Proces ten jest kontrolowany głównie przez geny onkogennych loci korzenia (rol)2,3. Wykorzystując szczepy agrobakteryjne przenoszące zarówno plazmid Ri, jak i sztuczny wektor binarny kodujący interesujący gen, owłosione kultury korzeniowe wykorzystano do produkcji rekombinowanych białek, analizy funkcji promotorów lub genów lub edycji genomów za pomocą Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)4,5,6.

Nasz protokół wykorzystuje transkoniugowany szczep A. tumefaciens C58C1 przenoszący plazmid Ri pRiA4b7. T-DNA plazmidu Ri składa się z dwóch regionów, prawego i lewego T-DNA (odpowiednio TR-DNA i TL-DNA), które mogą niezależnie integrować się z genomem roślinnym8. Wykorzystując ten system, zoptymalizowano długotrwały proces transformacji eksplantacji odmiany Brassica napus DH120759. Opisany poniżej protokół pozwala na regenerację wybranych linii korzeni owłosionych i uzyskanie roślin T1 będących nosicielami interesującego transgenu i wolnych od genów rol w ciągu około 1 roku. Transformacja owłosionego korzenia oparta na iniekcjach może być stosowana u innych gatunków Brassicaceae, jak pokazano na przykładzie transformacji Arabidopsis thaliana Col-0. Podczas gdy hipokotyl jest używany do przekształcania B. napus, A. thaliana jest wstrzykiwany do pierwotnej łodygi kwiatostanu.

Protokół

1. Przygotowanie pożywek i roztworów

  1. Przygotować roztwory podstawowe hormonów.
    1. W celu przygotowania 50 ml roztworu podstawowego kwasu 1-naftalenooctowego (NAA), 6-benzyloaminopuryny (BAP) i kwasu indolo-3-masłowego (IBA) o stężeniu 5 mg/ml, rozpuścić 250 mg sproszkowanego hormonu w 2 ml 1 M wodorotlenku sodu (NaOH) i dostosować objętość do 50 ml ultraczystą wodą.
    2. Aby przygotować 50 ml kwasu giberelinowego (GA3) o stężeniu 1 mg/ml, rozpuść 50 mg sproszkowanego hormonu w 2 ml etanolu i dostosuj objętość do 50 ml ultraczystej wody.
    3. Przefiltrować roztwór za pomocą sterylnego filtra strzykawkowego o wielkości porów 0,22 μm i rozprowadzić go do sterylnych probówek o pojemności 2 ml do przechowywania. Roztwór należy przechowywać w temperaturze -20 °C lub 4 °C, w zależności od zaleceń producenta.
  2. Przygotuj podstawowe roztwory antybiotyków. Na 50 ml cefotaksymu i tikarcyliny roztworu podstawowego disodu o stężeniu 100 mg/ml rozpuścić 0,5 g sproszkowanego antybiotyku w 40 ml ultraczystej wody i dostosować do końcowej objętości 50 ml. Przefiltrować roztwór za pomocą sterylnego filtra strzykawkowego o wielkości porów 0,22 μm i rozprowadzić go do sterylnych probówek o pojemności 2 ml do przechowywania. Przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Do schłodzonego podłoża zawsze dodaje się antybiotyki i hormony.
  3. Przygotować 1 l bulionu Luria (LB), dodając 10 g baktootryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego i 5 g chlorku sodu (NaCl) w cylindrze miarowym o pojemności 1 l i dostosować objętość do 1 litra wodą podwójnie destylowaną. Dostosuj pH do 7,0 za pomocą KOH za pomocą pH-metru (postępując zgodnie z instrukcjami producenta). Przenieść roztwór do butelki o pojemności 1 l i dodać 15 g agaru bakteriologicznego (1,5%), jeśli przygotowane jest stałe podłoże i autoklawować pożywkę. W razie potrzeby dodać odpowiednie antybiotyki (oporność bakteryjna jest przenoszona na wektorze binarnym) do schłodzonego podłoża.
    UWAGA: Użyj autoklawu do sterylizacji roztworu. Włóż butelkę do koszyka, zamknij pokrywkę i sterylizuj przez 20 minut w temperaturze 121 °C i 98,9 kPa. Protokół ten jest zawsze używany do autoklawowania roztworów w dalszych krokach.
  4. Przygotuj 1 l pożywki z ekstraktu drożdżowego wołowiny (YEB), mieszając 5 g ekstraktu wołowego, 1 g ekstraktu drożdżowego, 5 g peptonu, 5 g sacharozy i 0,5 g chlorku magnezu (MgCl2) z podwójnie destylowaną wodą. Dostosuj objętość do 1 l. Przenieś roztwór do butelki o pojemności 1 l. Podłoże należy sterylizować w autoklawie.
  5. Przygotować 1 l podłoża do kiełkowania nasion, mieszając 2,2 g proszku Murashige i Skoog (MS), 10 g sacharozy (1%) i 0,5 g soli sodowych kwasu 2-(N-Morfolino)etanosulfonowego (MES) z wodą podwójnie destylowaną. Dostosuj objętość do 1 l, wymieszaj i dostosuj pH do 5,8 za pomocą KOH. Przenieś roztwór do butelki o pojemności 1 l i dodaj 8 g agaru roślinnego (0,8%). Podłoże należy sterylizować w autoklawie.
  6. Przygotuj 1 l pożywki dla roślin, mieszając 2,2 g proszku MS, 5 g sacharozy (0,5%) i 0,5 g soli MES z podwójnie destylowaną wodą. Dostosuj objętość do 1 l, wymieszaj i dostosuj pH do 5,8 za pomocą KOH. Przenieść roztwór do butelki o pojemności 1 l i dodać 8 g agaru roślinnego (0,8%). Podłoże należy sterylizować w autoklawie.
  7. Przygotuj 1 l owłosionej pożywki do korzeni, mieszając 4,4 g MS + B5 witamin w proszku, 30 g sacharozy (3%) i 0,5 g soli MES z podwójnie destylowaną wodą. Dostosuj objętość do 1 l, wymieszaj i dostosuj pH do 5,8 za pomocą KOH, a następnie przenieś roztwór do butelki o pojemności 1 l. Dodać 3 g środka żelującego (0,3%) i przelać pożywkę w autoklawe. Dodać cefotaksym i tikarcylinę disodową do końcowego stężenia odpowiednio 100 - 200 mg/l i 100 - 500 mg/l. W razie potrzeby dodaj odpowiednie antybiotyki (oporność wynika z T-DNA wektora binarnego).
  8. Przygotuj 1 l złożonej pożywki do wzrostu roślin, mieszając 2,2 g MS + B5 witamin w proszku, 10 g sacharozy (1%) i 0,5 g soli MES z podwójnie destylowaną wodą. Dostosuj objętość do 1 l, wymieszaj i dostosuj pH do 5,8 za pomocą KOH i przenieś roztwór do butelki o pojemności 1 l. Dodać 6 g środka żelującego (0,6%) i przelać pożywkę w autoklawe. Dodać cefotaksym i tikarcylinę disodową do końcowego stężenia odpowiednio 200 mg/l i 500 mg/l. W razie potrzeby dodaj odpowiednie antybiotyki (oporność wynika z T-DNA wektora binarnego).
  9. Przygotuj 1 l pożywki regeneracyjnej, mieszając 4,4 g MS + witaminy B5 w proszku, 30 g sacharozy (3%) i 0,5 g soli MES z podwójnie destylowaną wodą. Dostosuj objętość do 1 l, wymieszaj i dostosuj pH do 5,8 za pomocą KOH. Przenieść roztwór do butelki o pojemności 1 l i dodać 3 g środka żelującego (0,3%). Podłoże należy sterylizować w autoklawie. Dodać NAA i BAP do końcowego stężenia odpowiednio 8 mg/l i 5 mg/l, a tikarcylinę disodową do końcowego stężenia 100 mg/l.
  10. Przygotuj 1 l pożywki do wydłużania pędów, mieszając 4,4 g sproszkowanych witamin MS + B5, 20 g sacharozy (2%) i 0,5 g soli MES z podwójnie destylowaną wodą. Dostosuj objętość do 1 l, wymieszaj i dostosuj pH do 5,8 za pomocą KOH. Przenieś roztwór do butelki o pojemności 1 l i dodaj 3 g agaru roślinnego (0,3%). Podłoże należy sterylizować w autoklawie. Dodać BAP i GA3 do końcowego stężenia odpowiednio 0,5 mg/L i 0,03 mg/L, a cefotaksym do końcowego stężenia 100 mg/L.
  11. Przygotuj 1 l pożywki do indukcji korzeni, mieszając 2,2 g MS + B5 witamin w proszku, 10 g sacharozy (1%) i 0,5 g soli MES z podwójnie destylowaną wodą. Dostosuj objętość do 1 l, wymieszaj i dostosuj pH do 5,8 za pomocą KOH. Przenieść roztwór do butelki o pojemności 1 l i dodać 3 g środka żelującego (0,3%). Podłoże należy sterylizować w autoklawie. Dodać IBA i cefotaksym do końcowego stężenia odpowiednio 0,5 mg/l i 100 mg/l.
  12. Przygotować 1 l buforu bromku cetyltrimetyloamoniowego (CTAB), dodając 20 g CTAB (2% w/v final), 100 ml 1M Tris-HCl o pH 8,0 (100 mM final), 40 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 (20 mM final), 81,8 g NaCl (1,4 M final) i 5 g PVP40 (0,5% w/v final). Dostosować do 1 l z podwójnie destylowaną wodą. Autoklaw roztworu. Roztwór należy przechowywać do 1 roku w temperaturze pokojowej.

2. Transformacja Agrobacterium za pomocą wektora binarnego

  1. Przygotuj DNA zweryfikowanego plazmidu binarnego zawierającego kasetę T-DNA, który ma zostać zintegrowany z genomem rośliny. Upewnij się, że plazmidowe DNA zawiera niską zawartość soli, aby uniknąć iskier elektrycznych podczas stosowania elektroporacji. Zaleca się użycie wybranego zestawu do ekstrakcji plazmidowego DNA.
  2. Przygotować elektrokompetentne komórki Agrobacterium tumefaciens C58C1 zawierające plazmid indukujący korzeń owłosiony pRiA4b, zaszczepiając 200 ml płynu podgrzanego wstępnie (28 °C) YEB 8 ml świeżej kultury na noc. Inkubować kulturę w temperaturze 28 °C, wytrząsając, aż gęstość optyczna przy długości fali 600 nm (OD600) wyniesie około 0,5, co odpowiada środkowej fazie logarytmicznej. Zajmuje to około 4 - 5 godzin.
  3. Podzielić kulturę Agrobacterium na cztery wstępnie schłodzone, sterylne probówki wirówkowe o pojemności 50 ml. Wirować przez 15 minut w temperaturze 4 °C przy 3 200 x g.
    UWAGA: Od tego kroku ogniwa powinny być utrzymywane w niskiej temperaturze.
  4. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić osad w (4x) 2,5 ml zimnej (4 °C) 10% glicerolu. Dodaj kolejne 47,5 ml zimnego 10% glicerolu i delikatnie wymieszaj.
  5. Granulki w temperaturze 3 200 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w (4x) 10 ml zimnej 10% glicerolu.
  6. Ponownie otocz komórki i ponownie zawieś je w (4x) 0,75 ml zimnego 10% glicerolu. Zebrać zawartość wszystkich czterech probówek w jedną (całkowita objętość = 3 ml).
  7. Podzielić roztwór agrobakteryjny na 50 μl podwielokrotności we wstępnie schłodzonych, sterylnych mikroprobówkach o pojemności 1,5 ml. Zamrozić podwielokrotności na suchym lodzie lub ciekłym azocie. Przechowuj probówki w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
  8. Umieścić jedną probówkę z kompetentnymi komórkami (50 μl) na lodzie, wymieszać z 5 μl plazmidowego DNA (łącznie 1 μg, od kroku 2.1), przenieść mieszaninę do kuwety do elektroporacji (odstęp 0,2 cm) i inkubować przez 5 minut na lodzie.
  9. Umieść kuwetę w elektroporatorze i naelektryzuj ogniwa z następującymi ustawieniami: pojemność 25 μFD, rezystancja 400 Ω, napięcie elektryczne 2,5 kV, czas trwania impulsu 9,7 ms.
  10. Dodać 950 μl płynnego podłoża LB do komórek, które następnie hoduje się w temperaturze 28 °C przez 2 godziny przy 300 obr./min w termomikserze. Umieścić 50 μl kultury komórkowej na stałym podłożu LB z odpowiednim selektywnym antybiotykiem. Hodować płytki przez 2 dni w temperaturze 28 °C.
    UWAGA: Zaleca się podawanie różnych kultur komórkowych (10 μL - 100 μL) na płytkę, aby określić odpowiednią objętość kultury i uniknąć nadmiernego rozwoju bakterii.
  11. Przygotuj płynne kultury z kilku wybranych kolonii w 5 ml płynnej pożywki LB z antybiotykami. Hodować bakterie przez noc w temperaturze 28 °C, wstrząsając. Użyj tych kultur do wywaru glicerolu, mieszając 0,5 ml płynnej kultury bakterii i 0,5 ml 40% glicerolu.
    UWAGA: Kolonie te są weryfikowane pod kątem obecności transgenu za pomocą PCR kolonii. W tym celu dodaj niewielką ilość kolonii z płytki do głównej mieszanki PCR zawierającej bufor, dNTP i wybraną polimerazę Taq, wraz ze starterami amplifikującymi część T-DNA z wektora binarnego. Inokulum z zapasów glicerolu jest używane do przekształcania roślin.

3. Przemiana owłosionego korzenia Brassica napus DH12075

  1. Umieść nasiona Brassica napus DH12075 w mikroprobówkach i wysterylizuj je w skrzynce przepływowej. Najpierw odtłuść nasiona wodą i 0,1% detergentem, potrząsając przez 60 s. Następnie opłucz nasiona wodą, a następnie 70% etanolem, oba przez 60 sekund.
  2. Wysterylizuj nasiona za pomocą 10% roztworu dostępnego w handlu wybielacza zawierającego podchloryn sodu. Potrząsaj nasionami w tym roztworze przez 20 minut.
  3. Umyj nasiona 4x sterylną wodą przez 60 s każde. Umieść je na szalkach Petriego zawierających pożywkę do kiełkowania nasion. Rozwarstwić nasiona na zimno w temperaturze 4 °C przez noc i przenieść talerze do pomieszczenia uprawowego (21 °C, 16 godzin światła / 8 godzin ciemności).
  4. Przenieś 5-dniowe sadzonki do pudełek z kulturami roślinnymi zawierających pożywkę dla roślin .
    UWAGA: Najlepszą wydajność przemian w DH12075 stwierdzono dla siewek 18-dniowych. Wiek siewek może być zoptymalizowany pod kątem lokalnych warunków wzrostu lub innych odmian.
  5. Zaszczepić płynną kulturę Agrobacterium tumefaciens C58C1 przenoszącą owłosiony plazmid indukujący korzenie pRiA4b i wektor binarny do transformacji (od kroku 2.11) za pomocą pętli inokulacyjnej. Użyj 5 ml pożywki LB. Uprawiaj tę kulturę przez noc w temperaturze 28 °C, aż osiągnie OD600 = 0,9 - 1,
    UWAGA: Agrobacterium zawierające tylko plazmid Ri stosuje się, jeśli wytwarzane są owłosione korzenie typu dzikiego.
  6. Wstrzyknąć niewielką ilość kultury (około 50 μl) za pomocą strzykawki insulinowej do hipokotylu 18-dniowej sadzonki (od kroku 3.4.). Nakłuć hipokotyl igłą 26G zamontowaną na strzykawce na wysokości około 1 cm nad powierzchnią podłoża. Wstrzyknąć płyn do rany. Tkanka na powierzchni hipokotylu może być również zarysowana przez strzykawkę.
    UWAGA: Liczba zaszczepionych sadzonek musi być dostosowana do potrzeb eksperymentatora.
  7. Rośliny należy umieścić w pomieszczeniu uprawowym w temperaturze 21 °C na 2 do 4 tygodni, aż w miejscu zranienia utworzy się kalus i owłosione korzenie.
  8. Odetnij kalus z wyłonionymi owłosionymi korzeniami z hipokotylu i umieść go na szalce Petriego z owłosioną pożywką dla korzeni zawierającą selektywne antybiotyki (przenoszone przez T-DNA) oraz cefotaksym (200 mg / L) i tikarcylinę (500 mg / L) w celu zahamowania wzrostu agrobakterii. Uszczelnij szalki Petriego taśmą przepuszczającą gaz. Hodowla owłosionych korzeni w temperaturze 24 °C w ciemności.
    UWAGA: Właściwe stężenie określonych antybiotyków stosowanych do selekcji funkcjonalnej musi być testowane na owłosionych korzeniach typu dzikiego. W przypadku B. napus DH12075 owłosionych korzeniach odpornych na kanamycynę stosuje się stężenie 25 mg/l kanamycyny.
    UWAGA: W tym kroku możliwe jest wygenerowanie rośliny złożonej składającej się z pędów typu dzikiego i transgenicznych owłosionych korzeni wspomagających wzrost takiej rośliny. Zamiast odcinać owłosione korzenie od łodygi, usuwa się rodzime korzenie rośliny. Roślinę z pojawiającymi się owłosionymi korzeniami przenosi się do pudełka do hodowli roślin z kompozytową pożywką roślinną zawierającą cefotaksym (200 mg/l) i tikarcylinę (500 mg/l) w celu zahamowania wzrostu agrobakterii oraz selektywny antybiotyk (przenoszony przez T-DNA).
  9. Po 1-2 tygodniach odizoluj owłosione korzenie na szalce Petriego od kalusa i zindywidualizuj je na płytkach z tą samą pożywką hodowlaną. Przenoś kulturę na świeży talerz co 4 do 5 tygodni. Dodać 0,25 mg/L IBA, aby zwiększyć rozgałęzianie korzeni.
  10. Stężenie cefotaksymu i tikarcyliny należy stopniowo zmniejszać przy każdym przeniesieniu o 100 mg/l (tj. pożywka do pierwszej zmiany zawiera 100 mg/l cefotaksymu i 400 mg/l tikarcyliny; dla drugiej zmiany 300 mg/l tikarcyliny itd.). Po 3-4 miesiącach należy wyhodować owłosione korzenie na owłosionym podłożu z 100 mg/l tikarcyliny i selektywnym antybiotykiem.

4. Regeneracja owłosionych korzeni Brassica napus DH12075

  1. Przenieść niezależne owłosione linie korzeniowe na płytki z pożywką regeneracyjną w sterylnych warunkach za pomocą pęsety, podpalonej przed użyciem. Przenieść 5 - 10 korzeni na szalkę Petriego i hodować je w temperaturze 21 °C w fotoperiodzie długiego dnia (16 godzin światła / 8 godzin ciemności). Uszczelnij szalki Petriego taśmą przepuszczającą gaz.
  2. Co 3 do 4 tygodni przenieś owłosione korzenie na płytki ze świeżym podłożem regeneracyjnym. Należy pamiętać, że kalusy powstają po około 2 tygodniach. Kalus zaczyna strzelać po kolejnych 2 tygodniach do 8 - 9 tygodni po utworzeniu modzela.
  3. Zindywidualizuj pędy i przenieś je do pudełek do kultur roślinnych z podłożem do wydłużania pędów na 2 do 3 tygodni, aby przyspieszyć wydłużenie pędów.
  4. Przenieś wydłużone pędy do skrzynek do kultur roślinnych z pożywką do indukcji korzeni. Odświeżaj kulturę co 3-4 tygodnie. Skuteczność ukorzeniania w DH12075 wynosi 87% po 30 dniach i do 100% po 60 dniach.
  5. Przenieś ukorzenione rośliny do gleby po usunięciu wszelkich śladów środka żelującego, aby zapobiec infekcji grzybiczej. Upewnij się, że rośliny są najpierw zaaklimatyzowane w fitotronach (21 °C, fotoperiod długiego dnia, 150 μE), a następnie przenieś je do szklarni na kwitnienie (21 °C / 18 °C, fotoperiod dnia długiego, 150 μE).

5. Wybór roślin regeneracyjnych i T1

UWAGA: Owłosione linie korzeniowe można wybrać przed przejściem do procesu regeneracji. Rodzaj selekcji zależy od zawartości przenoszonej przez transgen. Próbki owłosionych korzeni można pobrać w celu ekstrakcji DNA i genotypowania lub wykrycia mutacji, ekstrakcji RNA z późniejszą syntezą cDNA i RT-qPCR w celu analizy poziomu ekspresji wybranego genu, mikroskopii w celu wykrycia fluorescencji lub leczenia w celu barwienia GUS.

  1. Po przeniesieniu do gleby należy ponownie genotypować rośliny regenerujące T0 (i siewki T1), aby uniknąć ucieczki z procedur selekcji. Rośliny T0 wykazują zmieniony fenotyp zwany fenotypem Ri: rozległy wzrost korzeni, kręcone liście i pędy karłowate spowodowane obecnością TL i / lub TR-DNA plazmidu Ri wprowadzonego do genomu rośliny.
  2. Aby przyspieszyć selekcję T1, do ratowania zarodków należy użyć nasion zawierających zielone dojrzałe zarodki (ok. 21 - 28 dni po zapyleniu DH12075 w przypadku zarodka torpedowego lub starszego) z roślin regenerujących T0 w celu ratowania zarodków.
    1. Pracuj w sterylnej skrzynce przepływowej. Zbierz krzemionki i wysterylizuj je powierzchniowo 70% etanolem.
    2. Umieść je na dwustronnej taśmie przyklejonej do pokrywki talerza lub szkiełka.
    3. Za pomocą lornetki stereo naciąć krzemionkę wzdłuż brzegów zaworu za pomocą igły 26G. Upewnij się, że cięcie nie uszkodzi nasion. Aby ułatwić chwytanie, zamontuj igłę na strzykawce o pojemności 1 ml.
    4. Otwórz słupki i przyklej je do taśmy. Zbierz niedojrzałe nasiona i przenieś je na talerze z podłożem do kiełkowania nasion. Uszczelnij płyty taśmą gazoprzepuszczalną.
    5. Umieść płytki w pomieszczeniu uprawowym (21 °C, 16 h światła / 8 h ciemności) do momentu wykiełkowania.
  3. Genotyp siewek T1 pod kątem obecności transgenu będącego przedmiotem zainteresowania i braku Ri TR/TL (Rysunek 1). Zbierz materiał liści i wyekstrahuj ich DNA przy użyciu wybranej metody. Metoda CTAB jest opisana tutaj:
    1. Zbierz materiał liściowy do mikroprobówki o pojemności 2 ml zawierającej dwa kulki ceramiczne. Zamrozić probówkę w ciekłym azocie.
    2. Zmiel materiał za pomocą młyna kulowego. Alternatywnie można użyć tłuczka i moździerza.
    3. Po szybkim odwirowaniu dodać 400 μl buforu CTAB do proszku. Krótko wirować, wirować w dół i inkubować w temperaturze 60 °C przez co najmniej 50 minut.
    4. Schłodzić roztwór do temperatury pokojowej przez 15 min. Dodać jedną objętość chloroformu i delikatnie wymieszać.
      UWAGA: Podczas stosowania chloroformu należy pracować pod strumieniem chemikaliów i używać rękawic do ochrony. Każdy roztwór zawierający chloroform należy wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na odpady.
    5. Wirować przez 5 minut przy 18 400 x g za pomocą wirówki stołowej. Przenieść 250 - 350 μl górnej fazy wodnej do nowej mikroprobówki. Pomiń interfazę.
    6. Dodaj jedną objętość izopropanolu, dobrze wymieszaj i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Wirować przez 40 minut przy 18 400 x g.
    7. Wylej płyn i dodaj 200 μl 70% etanolu. Umyć osad i odwirować przez 15 minut przy 18 400 x g.
    8. Wylej płyn. Wysuszyć granulat na powietrzu i dodać 50 - 100 μl ultraczystej wody. Pozostaw DNA rozpuszczone na 1 godzinę do nocy w lodówce.
  4. Wykonaj genotypowanie metodą PCR dla genu rolA (TL), genu aux1 (TR) i locus virC (Agrobacterium). Przygotować reakcję PCR przy użyciu przygotowanego DNA (z kroku 5.3.), starterów, buforu, dNTP i polimerazy Taq zgodnie z protokołem producenta. Wzmocnione fragmenty mają długość 200 - 500 pz.
    Podkłady specyficzne dla rolA:
    Dalej: GTTAGGCGTGCAAAGGCCAAG
    Rewers: TGCGTATTAATCCCGTAGGTC
    Podkłady specyficzne dla aux1:
    Dalej: CATAGGATCGCCTCACAGGT
    Rewers: CGTTGCTTGATGTCAGGAGA
    Startery specyficzne dla virC:
    Naprzód: AATGCGTCTCTCTCGTGCAT
    Rewers: AAACCGACCACTAACGCGAT
    Uwaga: Transfer i integracja T-DNA może być częściowa i tylko części TL i/lub TR mogą integrować się z genomem. Dlatego zaleca się analizę obecności innych ORF TL (np. rolB i rolC) i TR (aux2, mas1, ags1) w siewkach T1. Sekwencje starterów specyficzne dla tych loci są wymienione w Jedličková et al.9.
  5. Oceń reakcje PCR za pomocą elektroforezy żelowej.
    UWAGA: Włączenie kontroli dodatniej do tej analizy jest zalecane w celu upewnienia się, że DNA jest klasy PCR.
  6. Dokonać selekcji pod kątem obecności (lub braku) transgenu zgodnie z protokołami opartymi na zawartości tego transgenu.
  7. Przenieś wybrane sadzonki do gleby.

6. Transformacja i regeneracja owłosionych korzeni u Arabidopsis thaliana Col-0

  1. Nasiona A. thaliana sterylizuj powierzchniowo wybraną metodą (wybielacz, etanol lub chlor gazowy).
  2. Talerzyk sterylnych nasion na podłożu do kiełkowania nasion. Po 2 dniach zimnej stratyfikacji przenieś płytki do pomieszczenia uprawowego (21 °C z fotoperiodem długiego dnia i wilgotnością 50%).
  3. Przenieś 1-tygodniowe sadzonki do pudełka z kulturami roślinnymi z podłożem do wzrostu roślin.
  4. Przygotować kultury Agrobacterium zgodnie ze wskazówkami w kroku 3.5.
  5. Wstrzyknąć niewielką ilość kultury (około 50 μl) za pomocą igły umieszczonej na strzykawce insulinowej u podstawy łodygi kwiatostanu pierwotnego (około 1 - 2 cm powyżej rozety) 1-miesięcznych sadzonek rzodkiewnika. Tkanka na powierzchni pierwotnej łodygi może być również zarysowana przez strzykawkę.
  6. Po 2-4 tygodniach od wstrzyknięcia należy wyciąć pojawiające się owłosione korzenie i uprawiać je na szalkach Petriego z pożywką dla owłosionych korzeni uzupełnioną selektywnym antybiotykiem (przenoszonym przez T-DNA) oraz cefotaksymem (200 mg/L) i tikarcyliną (500 mg/L) w celu zahamowania wzrostu agrobakterii. Inkubować płytki w temperaturze 24 °C w ciemności.
  7. Po 1-2 tygodniach zindywidualizuj owłosione korzenie na płytkach z tym samym podłożem hodowlanym. Przenieś wybrane owłosione linie korzeniowe na świeże podłoże co 4 - 5 tygodni.
    UWAGA: Owłosione korzenie A. thaliana są cieńsze niż korzenie B. napus i należy zachować ostrożność podczas przenoszenia na świeże podłoża.
  8. Przenieś owłosione korzenie na płytki z pożywką regeneracyjną, aby wywołać tworzenie się kalusa. Hodować płytki w temperaturze 21 °C w fotoperiodze długiego dnia (16 godzin światła / 8 godzin ciemności).
  9. Pędy wyłaniają się z kalusa po 18 - 21 dniach uprawy. Odetnij pędy i przenieś je na podłoże wydłużające pędy na 2-3 tygodnie, aby przyspieszyć wzrost i wydłużenie.
  10. Przenieś wydłużone pędy na podłoże do indukcji korzeni.
  11. Przenieś ukorzenione rośliny do gleby. Rośliny T0 również prezentują fenotyp Ri. Przeprowadzić selekcję transgeniczną, zgodnie z opisem dla B. napus DH12075 (krok 5).

Wyniki

Wcześniej zoptymalizowaliśmy protokół indukcji korzeni włochatych metodą iniekcji u trzech odmian Brassica napus, a mianowicie DH12075, Topas DH4079 oraz Westar9. Aby zastosować ten protokół transformacji u gatunku modelowego A. thaliana, do głównych łodyg kwiatonośnych miesięcznych siewek wstrzyknięto inokulum agrobakterii. Korzenie włochate pojawiły się w miejscu iniekcji po 2-4 tygodniach. Korzenie włochate wycięto i hodowano na podłożu stałym. Porównanie tej metody u obu gatunków przedstawiono na Rysunku 1.

Wybrane linie korzeni włochatych przeniesiono na podłoże regeneracyjne w celu indukcji tworzenia pędów. W przypadku A. thaliana żółte kalusy zostały indukowane w ciągu 14 dni we wszystkich 10 badanych liniach korzeni włochatych. Pierwsze prymordia pędów, widoczne jako ciemnozielone punkty, pojawiły się w ciągu 3 tygodni po przeniesieniu na podłoże regeneracyjne (Rycina 2). Po 4 tygodniach hodowli pędy pokryły korzenie włochate w 9 z 10 linii (wydajność regeneracji 90%). W niektórych przypadkach z kalusa wyinducingowano korzenie przybyszowe (Rycina 2H). Jedna linia nie uległa regeneracji nawet po 3 miesiącach na podłożu regeneracyjnym (korzenie włochate przenoszono na świeże podłoże co 4 tygodnie). Zatem wydajność regeneracji korzeni włochatych A. thaliana przypomina wydajność B. napus DH120759.

Regeneranty z korzeni włochatych B. napus oraz A. thaliana wykazują fenotyp karłowaty (Rycina 3), co jest typową cechą roślin pochodzących z korzeni włochatych2. Zaobserwowano również gęste systemy korzeniowe, pomarszczone liście oraz zmiany w czasie kwitnienia. Tak zwany fenotyp korzenia włochatego (lub Ri) jest spowodowany przez geny rol z plazmidu Ri wbudowanego w genom rośliny. Insercja T-DNA z Ri oraz transgenu zakodowanego na wektorze binarnym może być niezależna lub sprzężona. W związku z tym analiza segregacji potomstwa T1 powstałego w wyniku samozapylenia pomaga w identyfikacji roślin wolnych od genów rol, które wykazują ekspresję interesującego nas transgenu. Genotypowanie roślin T1 przeprowadza się za pomocą starterów PCR specyficznych dla ORF TL i TR oraz badanego transgenu. Brak kontaminacji agrobakteriami weryfikuje się poprzez brak produktów PCR dla starterów virC (Rycina 1).

Schemat procesu transgenezy roślin pokazujący transformację, indukcję HR, PCR, selekcję antybiotykową i genotypowanie.
Rysunek 1: Podsumowanie procedury u A. thaliana i B. napus. Iniekcja inokulum Agrobacterium do podkotylu lub łodygi głównego kwiatostanu indukuje rozwój włochatych korzeni. Włochate korzenie mogą zastąpić korzenie natywne, tworząc roślinę kompozytową, która zostanie poddana genotypowaniu i analizie (niebieskie strzałki). Hodowane włochate korzenie mogą zostać zregenerowane do roślin T0, rozmnożone w roślinach T1 i poddane genotypowaniu (zielone strzałki). Włochate korzenie mogą być również poddawane subkulturowaniu w celu analizy funkcjonalnej (czarna strzałka). Przedstawiono przykłady wyników genotypowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Zdjęcia mikroskopowe rozwoju korzeni w ciągu czterech tygodni, pokazujące wzrost i zmiany strukturalne.
Rycina 2: Regeneracja korzeni włochatych u A. thaliana. (A) Kultura korzeni włochatych 1 dzień po przeniesieniu na płytki. (B, C) Kalusy powstałe w ciągu 2 tygodni hodowli na podłożu regeneracyjnym. (D, E) Primordia pędów pojawiły się po 3 tygodniach hodowli. (G, H) Pędy uformowane po 4 tygodniach. (H) Korzenie przybyszowe powstałe z kalusa. (C, F, I) Linia korzeni włochatych niepodlegająca regeneracji. Paski skali oznaczają 1 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Regeneracja Arabidopsis i B. napus; porównanie wzrostu roślin; wyniki regenerantów pochodzących z korzeni.
Rycina 3: Reprezentatywne zdjęcia roślin typu dzikiego B. napus oraz A. thaliana i regenerantów pochodzących z włochatych korzeni (rośliny T0). Zwróć uwagę na fenotyp Ri regenerantów. Paski skali reprezentują 2 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Opracowaliśmy prosty protokół transformacji owłosionych korzeni i późniejszej regeneracji u B. napus i A. thaliana. Proces ten obejmuje indukcję owłosionych korzeni w hipokotylu (B. napus) lub pierwotnej łodydze kwiatostanowej (A. thaliana) za pomocą iniekcji. Metoda wstrzykiwania hipokotylu ze szczepem agrobakteryjnym C58C1 przenoszącym plazmid Ri była również skuteczna w rodzinie bobowatych10,11, oprócz członków Brassicaceae przedstawionych w tym badaniu.

Alternatywą dla metody opartej na iniekcji jest transformacja oparta na zanurzeniu, polegająca na zanurzeniu eksplantatu w zawiesinie bakteryjnej, a następnie współhodowli eksplantatu z agrobakteriami. Przewagą metody opartej na iniekcji nad metodą zanurzeniową jest oszczędność czasu wynikająca z braku niektórych etapów protokołu: przygotowania eksplantatu, badania czasu kouprawy oraz hodowli na pożywce zawierającej hormon do indukcji owłosionych korzeni. Chociaż oba podejścia są skuteczne w przypadku indukcji owłosionych korzeni, wyższą wydajność transformacji zaobserwowano u niektórych gatunków przy metodzie opartej na iniekcji w porównaniu z metodą zanurzenia w eksplantacji12,13. Co więcej, transformacja oparta na iniekcjach jest również przydatna do generowania roślin kompozytowych (transgeniczne owłosione korzenie i pędy typu dzikiego). Po odcięciu pierwotnych korzeni przekształconej rośliny, owłosione korzenie wspomagają wzrost rośliny, a transgen może być badany w kontekście całej rośliny.

Krytycznym etapem indukcji owłosionych korzeni jest wstrzyknięcie inokulum do hipokotylu, czyli łodygi pierwotnego kwiatostanu. Hipokotyle B. napus są łamliwe, a przecięcie całego hipokotylu może łatwo nastąpić. To samo można zaobserwować u A. thaliana ze względu na cienkość łodygi kwiatostanu. Jeśli wymagane jest porównanie wydajności przemiany różnych gatunków/odmian, zalecamy, aby jedna osoba przeprowadziła wszystkie eksperymenty, aby uniknąć błędu spowodowanego manipulacją i umiejętnością wstrzykiwania roślin.

Opracowaliśmy skuteczny protokół regeneracji cebulek owłosionych u B. napus DH12075 i A. thaliana Col-0. Ponieważ regeneracja jest bardzo zmiennym procesem, pewne modyfikacje protokołu mogą być stosowane do wybranego gatunku lub odmiany. Na przykład owłosione pędy wywodzące się z korzeni mogą być wywołane przez inny stosunek auksyny do cytokininy (1:1) w B. oleracea14. Alternatywnie zamiast BAP można zastosować cytokininę tidiazuron, tak jak w przypadku owłosionych korzeni B. campestris 15.

Wielokrotne inserkcje plazmidu Ri T-DNA do genomu rośliny stanowią potencjalne ograniczenie systemu transformacji i regeneracji owłosionych korzeni. W takich przypadkach po analizie segregacji siewek T1 nie odkrywa się żadnych roślin wolnych od TL/TR z plazmidu Ri . Dlatego zalecamy wygenerowanie kilku niezależnych linii owłosionych korzeni dla każdego transgenu.

Owłosione kultury korzeniowe są niezwykle potężnym narzędziem do badań funkcjonalnych genów, głównie ze względu na ich szybkie założenie i tanią konserwację (brak hormonów potrzebnych w podłożach uprawowych). Protokół ten obejmuje metody indukcji i regeneracji owłosionych korzeni u B. napus i A. thaliana, które mogą być wykorzystane do badania transgenu będącego przedmiotem zainteresowania bezpośrednio w owłosionych kulturach korzeniowych, w kontekście całej rośliny przy użyciu roślin kompozytowych lub po regeneracji roślin transgenicznych.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone bez jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Jiříemu Macasowi (Centrum Biologii CAS, Czeskie Budziejowice, Czechy) za dostarczenie szczepu agrobakteryjnego. Główny Zakład Nauk o Roślinach CEITEC MU jest znany ze wsparcia technicznego. Prace te były wspierane przez Ministerstwo Edukacji, Młodzieży i Sportu Republiki Czeskiej w ramach projektu Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego "SINGING PLANT" (nr 2). CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446) oraz projekt INTER-COST LTC20004.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki 1,50 mlEppendorf125.215
10% roztwór wybielacza komercyjnego SAVO
Kwas 1-naftalenooctowy (NAA) DuchefaN0903Pożywka regeneracyjna kalusa
2,0 ml probówkiEppendorf108.132/108.078
Taśma mikroporowa 3MMicropore
6-Benzylaminopurine (BAP) DuchefaB0904Pożywka regeneracyjna kalusa, Podłoże do wydłużania pędów 
70% etanol
agar bakteriologicznyHiMediaRM201LB medium
Pepton bakteriologicznyOxoidLP0037LB i YEB Pożywka
Ekstrakt z wołowinyRothX975.1YEB medium
ButelkiDURANL300025
Cefotaksym soduDuchefaC0111Podłoże do uprawy owłosionych korzeni, Pożywka do regeneracji kalusa, Pożywka do wydłużania pędów, Pożywka do indukcji korzeni
chloroformServa3955301
CTAB Bromek heksadecylotrimetyloamoniowySigma52365
dNTP mixThermo Fisher ScientificR0193
EDTA - Titriplex III, Kwas (etylenodinitrylo)tetraoctowy, Sól disodowa, DihydratSigmaES134-250G
agar do elektroforezy z kuwetą
peqGOLD uniwersalnaVWR732-2789
żelu do elektroforezyBIO-RAD
GenePulser XcellBIO-RAD
Kuwety elektroporacyjne AppliChem
Gene Pulser/MicroPulser, odstęp 0,2 cmBIO-RAD1652082
Gene Ruler Drabinka DNA mixThermo Fisher ScientificSM0331
Kwas giberelinowy (GA3)DuchefaG0907Medium do wydłużania pędów 
glicerolSigmaG5516-1L
HEPES (2-(4-(2-hydroksyetylo)-1-pirerazynylo)-etansulfoniqueMerck1101100250
kwas indolo-3-masłowy (IBA)DuchefaI0902Pożywka do indukcji korzeni
monosiarczan kanamycynyDuchefaK0126
Magenta GA-7 Pudełko do kultur roślinnych z pokrywkąPożywka roślinnaV8505-100
Cylinder
MES monohydratDuchefaM1503Podłoże do uprawy owłosionych korzeni, Pożywka do regeneracji kalusa, Pożywka do wydłużania pędów, Pożywka do indukcji korzeni, Pożywka do kiełkowania, Pożywka do uprawy roślin
Murashige i Skoog (MS)DuchefaM0237Pożywka do kiełkowania, Pożywka do uprawy roślin
Murashige i Skoog (MS) + witaminy B5 DuchefaM0231Owłosione podłoże do uprawy korzeni, Pożywka do regeneracji kalusa, Pożywka do wydłużania pędów, Pożywka do indukcji korzeni
igła Agani 26G x 1/2 - 0,45 x 13mm
PhytagelSigmaP8169Pożywka regenerująca kalus, Pożywka do indukcji korzeni, Pożywka do kiełkowania
9003-39-8
Polimeraza DNA Redtaq, Taq do rutynowego PCR z obojętnym barwnikiem, w zestawie bufor 10XSigmaD4309-250UN
Młyn RetshQiagen
chlorek soduLachner30093-APOLB średni
kwadrat Szalki PetriegoCorningGOSSBP124-05
sacharozaPenta24970-31000Pożywka do uprawy owłosionych korzeni, Pożywka do regeneracji kalusa, Pożywka do wydłużania pędów, Pożywka do indukcji korzeni, Pożywka do kiełkowania, Pożywka do uprawy roślin
Filtr strzykawkowyCarl RothP666.1Filtry strzykawkowe Rotylabo 0,22 i mikro; m wielkość porów
termomikserEppendorf
Ticarcillin disodowyDuchefaT0180Owłosione podłoże do uprawy korzeni
Tris(hydroksymetylo)aminometan Serva3719003
ultraczysta wodaMillipore Milli-Q woda oczyszczona 
Ekstrakt drożdżowyDuchefaY1333LB medium
elektryczną, komora do elektroforezy czytnik elektroporator BIO-RAD bromek etydyny miarowy Miernik pH Terumo PVP 40 (poliwinylopirolidon Mr 40000)Sigma

Bibliografia

  1. Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiology. 146 (2), 325-332 (2008).
  2. Christey, M. C. Use of Ri-mediated transformation for production of transgenic plants. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant. 37 (6), 687-700 (2001).
  3. Gelvin, S. B. Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the “Gene-Jockeying” Tool. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (1), 16-37 (2003).
  4. Georgiev, M. I., Agostini, E., Ludwig-Müller, J., Xu, J. Genetically transformed roots: from plant disease to biotechnological resource. Trends in Biotechnology. 30 (10), 528-537 (2012).
  5. Gutierrez-Valdes, N., et al. Hairy root cultures—a versatile tool with multiple applications. Frontiers in Plant Science. 11, 33(2020).
  6. Niazian, M., Belzile, F., Torkamaneh, D. CRISPR/Cas9 in planta hairy root transformation: a powerful platform for functional analysis of root traits in Soybean. Plants. 11 (8), 1044(2022).
  7. Petit, A., et al. Further extension of the opine concept: plasmids in Agrobacterium rhizogenes cooperate for opine degradation. Molecular and General Genetics MGG. 190 (2), 204-214 (1983).
  8. Ozyigit, I. I., Dogan, I., Tarhan, E. A. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation and its biotechnological applications in crops. Crop improvement. , Springer. Boston, MA. (2013).
  9. Jedličková, V., et al. Hairy root transformation system as a tool for CRISPR/Cas9-directed genome editing in oilseed rape (Brassica napus). Frontiers in Plant Science. 13, 919290(2022).
  10. Steinbauerová, V., Neumann, P., Macas, J. Experimental evidence for splicing of intron-containing transcripts of plant LTR retrotransposon Ogre. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 427-436 (2008).
  11. Neumann, P., et al. Centromeres off the hook: massive changes in centromere size and structure following duplication of CenH3 gene in Fabeae species. Molecular Biology and Evolution. 32 (7), 1862-1879 (2015).
  12. Montazeri, M., et al. A Comparative analysis of the hairy root induction methods in Hypericum perforatum. Journal of Plant Molecular Breeding. 7 (1), 67-76 (2019).
  13. Zhang, X., et al. Peat-based hairy root transformation using Rhizobium rhizogenes as a rapid and efficient tool for easily exploring potential genes related to root-knot nematode parasitism and host response. Plant Methods. 19 (1), 22(2023).
  14. Christey, M. C., Sinclair, B. K. Regeneration of transgenic kale (Brassica oleracea var. acephala), rape (B. napus) and turnip (B. campestris var. rapifera) plants via Agrobacterium rhizogenes mediated transformation. Plant Science. 87 (2), 161-169 (1992).
  15. Christey, M. C., Sinclair, B. K., Braun, R. H., Wyke, L. Regeneration of transgenic vegetable brassicas (Brassica oleracea and B. campestris) via Ri-mediated transformation. Plant Cell Reports. 16 (9), 587-593 (1997).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Transformacja za pośrednictwem Agrobacteriumindukcja korzenipożywka regeneracyjnagenerowanie roślin transgenicznychtworzenie roślin kompozytowychelongacja pędówpożywka do indukcji korzeni
Transformacja i regeneracja korzeni owłosionych u Arabidopsis thaliana i Brassica napus
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.