Method Article

Generowanie i dalsza analiza transkryptomów pojedynczych komórek i jąder w organoidach mózgowych

DOI:

10.3791/66225

⸱

March 29th, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC), 2Institut für Biologie, Humboldt-Universität zu Berlin, 3Organoid platform, Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj wprowadzamy kompleksowy protokół do generowania i dalszej analizy organoidów ludzkiego mózgu za pomocą sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki i pojedynczego jądra.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatniej dekady, transkryptomika pojedynczej komórki znacznie się rozwinęła i stała się standardową metodą laboratoryjną do jednoczesnej analizy profili ekspresji genów poszczególnych komórek, umożliwiając uchwycenie różnorodności komórkowej. W celu przezwyciężenia ograniczeń wynikających z trudnych do wyizolowania typów komórek, do sekwencjonowania można zastosować alternatywne podejście mające na celu odzyskanie pojedynczych jąder zamiast nienaruszonych komórek, dzięki czemu profilowanie transkryptomu poszczególnych komórek ma uniwersalne zastosowanie. Techniki te stały się kamieniem węgielnym w badaniach nad organoidami mózgowymi, ustanawiając je jako modele rozwijającego się ludzkiego mózgu. Wykorzystując potencjał transkryptomiki pojedynczych komórek i pojedynczych jąder w badaniach nad organoidami mózgu, protokół ten przedstawia przewodnik krok po kroku obejmujący kluczowe procedury, takie jak dysocjacja organoidów, izolacja pojedynczych komórek lub jąder, przygotowanie biblioteki i sekwencjonowanie. Wdrażając te alternatywne podejścia, naukowcy mogą uzyskać wysokiej jakości zestawy danych, umożliwiające identyfikację typów komórek neuronalnych i nieneuronalnych, profili ekspresji genów i trajektorii linii komórkowych. Ułatwia to kompleksowe badania nad procesami komórkowymi i mechanizmami molekularnymi kształtującymi rozwój mózgu.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich lat, technologie organoidowe stały się obiecującym narzędziem do hodowli tkanek podobnych do narządów1,2,3. Szczególnie w przypadku narządów, do których nie ma łatwego dostępu, takich jak ludzki mózg, organoidy dają możliwość uzyskania wglądu w rozwój i manifestację choroby4. W związku z tym organoidy mózgowe są szeroko stosowane jako model eksperymentalny do badania różnych zaburzeń ludzkiego mózgu, w tym chorób rozwojowych, psychiatrycznych, a nawet neurodegeneracyjnych4,5,6.

Wraz z pojawieniem się technologii profilowania transkryptomu pojedynczej komórki, pierwotne tkanki ludzkie i złożone modele in vitro mogły być badane z niespotykanym dotąd poziomem szczegółowości, dostarczając mechanistycznego wglądu w zmiany ekspresji genów na poziomie subpopulacji komórek w zdrowiu i chorobie oraz informując o nowych przypuszczalnych celach terapeutycznych7,8,9. Dziedzina organoidów rozwinęła się dzięki wykorzystaniu profilowania transkryptomu pojedynczej komórki do oceny składu komórkowego, odtwarzalności i wierności technologii organoidów mózgowych10,11,12. Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) umożliwiło klasyfikację komórek i identyfikację dysregulacji genetycznej w chorych organoidach13,14. Co ważne, to właśnie złożoność tkanek organoidowych wymusza wdrożenie technik umożliwiających profilowanie pojedynczych komórek. Charakterystyka organoidów przy użyciu metod takich jak masowe profilowanie transkryptomu (masowe sekwencjonowanie RNA) prowadzi do zamaskowanej heterogeniczności komórkowej i profili ekspresji genów, które są uśredniane dla wszystkich typów komórek w złożonej tkance, ostatecznie ograniczając nasze zrozumienie procesów zachodzących podczas rozwoju organoidów w zdrowiu i chorobie15,16,17. Wraz z rozwojem metod sekwencjonowania scRNA, tworzona jest coraz większa liczba atlasów, czego przykładem są zasoby takie jak Allen Brain Atlas lub Single cell atlas of human brain organoids autorstwa Uzquiano et al.18.

Osiągnięcie udanego seq scRNA z organoidów mózgowych polega na skutecznej izolacji i wychwytywaniu nienaruszonych komórek. Ponieważ dysocjacja organoidów mózgowych w celu uzyskania pojedynczych komórek opiera się na trawieniu enzymatycznym, może wpływać na wzorce ekspresji genów poprzez wywoływanie stresu i uszkodzenia komórek19,20. Dlatego dysocjacja tkanki na poszczególne komórki jest najważniejszym krokiem. Alternatywnym podejściem jest sekwencjonowanie RNA pojedynczego jądra (snRNA-seq), które ułatwia bezenzymatyczną ekstrakcję jąder zarówno ze świeżych, jak i mrożonych, tissue21,22. Jednak izolacja jąder od tkanki stwarza inne wyzwania, takie jak wzbogacenie typów komórek będących przedmiotem zainteresowania i niska zawartość RNA w jądrach w porównaniu z komórkami.

Badania transkryptomu organoidów mózgowych są powszechnie przeprowadzane przy użyciu scRNA-seq10,18,23. Jednak izolacja pojedynczych jąder może zapewnić ortogonalną i uzupełniającą metodę badania profilu transkryptomicznego organoidów. W tym miejscu przedstawiamy zestaw narzędzi do sekwencjonowania scRNA i snRNA dla organoidów mózgowych i omawiamy punkty krytyczne dla uzyskania najlepszej jakości danych sekwencjonowania.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany protokół jest wykonywany w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 1 Centrum Medycyny Molekularnej im. Maxa Delbrücka (numer zatwierdzenia: 138/08), zgodnie z wymaganiami i zgodnie z unijnymi i krajowymi zasadami etyki w badaniach.

1. Pozyskiwanie organoidów przodomózgowia z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)

UWAGA: Ten protokół został przetestowany dla kilku różnych linii iPSC hodowanych na różnych podłożach komórek macierzystych różnych firm (Tabela 1). Wytwarzanie organoidów przodomózgowia jest w dużym stopniu zależne od wysokiej jakości iPSC i konfluencji 60%-70% przed rozpoczęciem protokołu. W tym przypadku użyliśmy dostępnej na rynku linii komórkowej (patrz Tabela materiałów).

  1. Dzień 0: Formowanie się ciała zarodka
    1. W przypadku traktowania 96-dołkowej płytki roztworem pluronicznym dodać 80 μl sterylnego, przefiltrowanego 2% roztworu pluronicznego na studzienkę 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U. Inkubować przez co najmniej 15 minut w temperaturze pokojowej (RT) lub 37 °C.
      UWAGA: Płytki poddane działaniu pluronu mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni i mogą być używane bezpośrednio, bez żadnych etapów mycia w celu utworzenia ciała zarodka.
    2. Usuń roztwór pluroniczny z każdej studzienki za pomocą aspiratora lub pipety wielokanałowej przed wysiewem komórek.
    3. Przed rozpoczęciem należy przygotować następujące odczynniki na jedną płytkę 96-dołkową: 15 ml probówki wirówkowej z 5 ml wstępnie podgrzanego DMEM: pożywka F12; 11 ml pożywki z komórek macierzystych uzupełniona 50 μM Y-27632, płytka poddana działaniu pluronu (jak opisano powyżej).
    4. Odessać pożywkę z jednego dołka 6-dołkowej płytki zawierającej 60-70% zlewających się iPSC. Umyj komórki raz za pomocą PBS. Dodać 500 μl odczynnika na bazie trypsyny i inkubować przez 2-6 minut w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Czas inkubacji dla prawidłowego oderwania komórek za pomocą odczynnika na bazie trypsyny zależy od gęstości komórek i właściwości adhezyjnych macierzy komórkowej każdej linii iPSC. Aby uniknąć nadmiernego trawienia, zaleca się zbadanie morfologii komórek po 2 minutach inkubacji z odczynnikiem na bazie trypsyny przy użyciu mikroskopu jasnego pola.
    5. Odłączyć komórki za pomocą pipety o pojemności 1000 μl i przenieść do wcześniej przygotowanej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml z pożywką DMEM:F12, aby zatrzymać dysocjację.
    6. Zawiesinę komórek wirować przez 3 minuty przy 300 x g. Odessać supernatant i zachować osad komórkowy. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki z komórkami macierzystymi uzupełnionej 50 μM Y-27632.
    7. Policz komórki za pomocą licznika komórek i dodaj żądaną liczbę komórek do pożywki z komórkami macierzystymi uzupełnionej 50 μM Y-27632. Do wytworzenia pojedynczego ciała zarodkowego potrzeba 3 000-12 000 komórek w zależności od linii komórkowej.
    8. Przenieś zawiesinę komórek do wielokanałowego zbiornika odczynnika za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Za pomocą pipety wielokanałowej umieść 100 μl/basenik zawiesiny komórek na uprzednio poddanej działaniu pluronu 96-dołkowej płytce.
    9. Umieścić 96-dołkową płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5%O2 i 5% CO2 . Aby uniknąć jakichkolwiek zakłóceń podczas tworzenia ciała zarodka, należy powstrzymać się od przesuwania płytki.
  2. Dzień 2: Badanie formowania się ciała zarodka
    1. Zbadaj formowanie się ciała zarodka za pomocą 10-krotnego obiektywu mikroskopu jasnego pola. Ciała zarodków powinny mieć wyraźne krawędzie i minimalną śmierć komórek.
    2. Odessać jak najwięcej pożywki i zastąpić 100 μl/studzienkę pożywki z komórkami macierzystymi. (Krytyczny) Ciała zarodkowe można łatwo usunąć ze studni podczas wymiany pożywki. Zwróć uwagę, aby ich nie usuwać, dlatego monitoruj podłoże po aspiracji.
  3. Dzień 3: Indukcja neuroektodermy
    1. Odessać jak najwięcej pożywki i zastąpić 120 μl/studzienkę pożywką indukcyjną i umieścić płytkę w temperaturze 37 °C, 20%O2 i 5% CO2 .
  4. Dzień 6: Osadzanie
    1. W zależności od linii iPSC, do wywołania pojawienia się neuroektodermy potrzebne są 3 lub 4 dni. Regularnie monitoruj ciała zarodków. Gdy krawędzie staną się jasne, ciała zarodkowe są gotowe do osadzenia. Użyj jednej z dwóch różnych metod, które mogą być użyte do osadzania ciała zarodka, jak opisano poniżej24.
    2. Metoda osadzania 1: Osadzanie plików cookie
      1. Rozmrażać porcję nierozcieńczonego żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej na lodzie przez 1-2 godziny. (Krytyczne) Zawsze trzymaj żel do macierzy zewnątrzkomórkowej na lodzie, aby zapobiec jego zestaleniu. Porcje należy przygotować z wyprzedzeniem, aby zminimalizować czas rozmrażania i powtarzające się cykle rozmrażania.
      2. Odetnij końcówkę pipety o pojemności 200 μl za pomocą szczypiec kłowych i zbierz 16-32 ciała zarodkowe do jednej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
      3. Przenieść ciała zarodków w 67 μl pożywki do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Dodaj 100 μl żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej za pomocą wyciętej końcówki pipety o pojemności 200 μl i delikatnie wymieszaj.
      4. Równomiernie rozprowadź ciała zarodkowe w naczyniu o średnicy 6 cm i umieść płytkę na 5-10 minut, aby żel macierzy zewnątrzkomórkowej zastygł.
      5. Dodać około 4 ml pożywki różnicującej i inkubować w temperaturze 37 °C, 20%O2 i 5% CO2 . Następnego dnia umieść naczynie na wytrząsarce orbitalnej (84 obr./min). Upewnij się, że wszystkie ciała zarodków odczepiają się od dna. Jeśli nie, użyj przeciętej końcówki pipety i nośnika, aby delikatnie je odłączyć.
    3. Metoda osadzania 2: Osadzanie w płynie
      1. Rozmrozić podwielokrotność nierozcieńczonego żelu z matrycą zewnątrzkomórkową na lodzie przez 1-2 godziny i umieścić na lodzie pożywkę różnicującą. (Krytyczny) Pożywka musi być lodowata podczas dodawania żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej.
      2. Gdy podłoże ostygnie, dodaj żel do macierzy zewnątrzkomórkowej do końcowego stężenia 2%. Odetnij końcówkę pipety o pojemności 200 μl za pomocą szczypiec pazurowych i przenieś do 24 ciał zarodkowych do jednego dołka na 6-dołkowej płytce.
      3. Usuń cały nadmiar pożywki i dodaj około 4 ml 2% żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej/pożywki różnicującej do jednego dołka 6-dołkowej płytki. Natychmiast umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej (84 obr./min).
  5. Dzień 9-20: Wykonuj pełną wymianę mediów przy użyciu pożywek różnicujących co 3-4 dni.
  6. Dzień 21-30: Przenieś organoidy do pożywki dojrzewającej i wykonuj pełną wymianę pożywki co 3-4 dni.
  7. Dysocjacja organoidów: Do dysocjacji pojedynczych jąder i komórek należy używać organoidów wysokiej jakości. Aby uniknąć nadmiernej śmierci komórki, regularnie tnij organoidy, aby zapobiec gromadzeniu się martwiczego rdzenia i pozwól im się zregenerować przez 2 tygodnie przed dysocjacją w celu dalszej analizy.

2. Wyprowadzenie pojedynczej komórki z organoidów

UWAGA: Dysocjacja pojedynczej komórki odbywa się za pomocą Zestawu do dysocjacji tkanek nerwowych (Tabela 2), który wykorzystuje dysocjację mechaniczną i enzymatyczną. Tutaj opisujemy ręczną dysocjację mechaniczną. Alternatywnie można użyć maszyny dysocjującej.

  1. Przygotować roztwór STOP i 0,04% BSA na lodzie. Przygotować mieszankę enzymów 1 i 2 oraz 0,04% BSA w PBS i umieścić na lodzie.
  2. Zebrać do 5 organoidów w jednym dołku na 6-dołkowej płytce i odessać nadmiar pożywki i przemyć raz PBS w celu usunięcia pożywki hodowlanej. Umieść organoidy na środku studni i za pomocą skalpela dokładnie zmiel organoidy.
  3. Dodać mieszaninę enzymów 1 i umieścić w temperaturze 37 °C, 20%O2 i 5% CO2, wstrząsając z prędkością 90 obr./min przez 10-15 min.
  4. Używając końcówki do pipet o pojemności 1000 μl, ponownie zawiesić organoidy, pipetując do 10 μl. Dodaj mieszankę enzymów 2 i dobrze wymieszaj, pipetując za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1000 μl. Umieścić w temperaturze 37 °C, 20%O2 i 5% CO2 , wstrząsając z prędkością 90 obr./min przez 10-15 min.
  5. Zatrzymaj proces dysocjacji, ponownie zawieszając roztwór komórkowy w 10 ml zimnego roztworu STOP. Roztwór komórek filtracyjnych za pomocą sitka komórkowego 70 μM. Odwirować przefiltrowany roztwór komórkowy przez 10 minut przy 300 x g w temperaturze 4 °C do uzyskania osadu.
  6. Odessać pożywkę, pozostawiając osad komórkowy i ponownie zawiesić komórki w 4 ml zimnego 0,04% BSA. Przefiltruj roztwór komórek za pomocą sitka komórkowego 40 μM i policz komórki za pomocą licznika komórek.
  7. Odwirować roztwór komórek przez 10 minut przy 300 x g w temperaturze 4 °C. Odessać roztwór BSA, pozostawiając osad komórek. Ponownie zawiesić komórki zgodnie z instrukcją zestawu do sekwencjonowania snRNA na bazie mikrofluidyki w pożywce NSB+.

3. Izolacja pojedynczych jąder z organoidów

  1. Przenieś organoidy do schłodzonego PBS i pokrój każdy organoid na 4 części. Umyj organoidy 2x schłodzonym PBS.
  2. Przeciąć nożyczkami końcówkę pipety o pojemności 1000 μl i przenieść kawałki organoidów do leżaczka o pojemności 2 ml. Całkowicie odessać PBS i dodać 1 ml buforu do lizy NP40.
  3. Odrzuć 3x tłuczkiem A i 3x tłuczkiem B. Przenieś zawiesinę do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Przemyć kaczownik dodatkowym 1 ml buforu do lizy NP40 i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odwirowywać zawiesinę przez 5 minut przy 500 x g.
  4. Odessać supernatant pozostawiając 50 μl supernatantu. Dodać 1 ml NSB+ bez naruszania osadu. Zawiesić ponownie po 5 minutach inkubacji.
  5. Zawiesina warstwowa na wierzchu gradientu Percoll (dolna warstwa: 1 ml NSB + i 250 μl Percollu, środkowa warstwa: 1 ml NSB+ i 188 μl Percollu, górna warstwa: 1 ml NSB+ i 125 μl Percollu). (Krytyczny) Wykonuj nakładanie warstw bardzo ostrożnie, aby uniknąć mieszania warstw.
  6. Wirować przez 5 minut przy 500 x g w temperaturze 4 °C, odsysać supernatant i ponownie zawiesić w NSB+. Przefiltrować roztwór jąder za pomocą sitka komórkowego 40 μM.
  7. Wybarwić i policzyć jądra za pomocą DAPI i komory Neubauera. Zawiesić jądra zgodnie z instrukcją zestawu scRNA-seq opartego na mikrofluidyce.

4. Przygotowanie i sekwencjonowanie bibliotek

  1. Załaduj 10 000 komórek i jąder do systemu mikrofluidycznego i wygeneruj bibliotekę zgodnie z podręcznikiem zestawu scRNA-seq opartego na mikrofluidyce (Tabela materiałów).
  2. Sekwencjonuj biblioteki z szacunkową liczbą 6 x 108 odczytów na bibliotekę sekwencyjną snRNA i 1,6 x 108 odczytów na bibliotekę sekwencyjną scRNA, co daje nasycenie sekwencjonowaniem 87% dla zestawu danych snRNA-seq i 36% nasycenie sekwencjonowaniem dla zestawu danych scRNA-seq.

5. Analiza

  1. Przeprowadź analizę sekwencjonowania przy użyciu potoku analizy danych dla scRNA-seq i snRNA-seq i dopasuj do ludzkiego genomu GRCh38. Poddaj macierz zliczania wygenerowaną przez ten potok dalszej analizie przy użyciu pakietu R Seurat (wersja 4.1.1)25.
  2. Utwórz obiekt Seurat, biorąc pod uwagę geny, które były reprezentowane w co najmniej 5 komórkach i włączając komórki, które zawierały co najmniej 300 genów. Wykonaj dodatkowe filtrowanie kontroli jakości, zachowując komórki, które zawierały więcej niż 1000 genów, ale mniej niż 4000 genów dla zestawu danych scRNA-seq i więcej niż 800, ale mniej niż 4000 genów na jądro dla zestawu danych snRNA-seq. Wyklucz zestawy danych, komórki i jądra przekraczające 5% odczytów mitochondrialnych.
  3. Aby złagodzić efekty wsadowe między obiema metodami, zintegruj oba filtrowane zestawy danych, znormalizuj i zwizualizuj za pomocą ujednoliconego przybliżenia i projekcji rozmaitości (UMAP). Pomiń klaster 1, który charakteryzuje się niskim unikalnym identyfikatorem molekularnym (UMI) i liczbą genów. Następnie, dla klastrów, przypisz tożsamości komórek na podstawie znanych genów markerowych i 30-dniowego zestawu danych organoidów od Any Uzquiano et. al. (Uzupełniający plik kodowania 1)18.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zbadać skład komórek organoidów mózgowych za pomocą scRNA-seq i snRNA-seq, organoidy mózgowe zostały zebrane po 30 dniach hodowli, ponieważ organoidy na tym etapie wykazują już pętle neuroepiteliczne składające się z progenitorów otoczonych przez pośrednie progenitory i neurony we wczesnym stadium4,18. Monitorowanie jakości organoidów przez cały okres wzrostu i hodowli ma zasadnicze znaczenie dla uzyskania wiarygodnych danych dotyczących pojedynczych komórek i pojedynczych jąder.

Organoidy powstają poprzez agregację iPSC w ciała embrionalne (Rysunek 1B,C). Oczekuje się, że po złożeniu te embrionalne ciała będą miały wyraźne krawędzie z minimalnymi resztkami komórkowymi (Rysunek 1C). Po indukcji neuroektodermy, ciała embrionalne wykazują zauważalne pojaśnienie wokół powierzchni ze stosunkowo ciemniejszym obszarem wewnętrznym, co wskazuje na udaną indukcję neuronalną (Rysunek 1D). W kolejnych tygodniach organoidy rozwijają tak zwane pętle, neuronalne struktury przypominające rozetę, składające się głównie z komórek neuroepitelialnych (Ryc. 1E,F). Chociaż organoidy te mogą być utrzymywane w hodowli przez kilka miesięcy, należy zauważyć, że wraz ze wzrostem ich rozmiaru następuje odpowiedni wzrost śmierci komórek w wewnętrznej części organoidów z powodu braku składników odżywczych i dostępności tlenu, co ostatecznie prowadzi do rozwoju martwiczego rdzenia.

Aby zbadać różnorodność komórkową w organoidach korowych poprzez analizę sekwencjonowania, wyizolowaliśmy zarówno pojedyncze komórki, jak i jądra z organoidów. Aby zrównoważyć nieodłączną heterogeniczność w pojedynczej partii organoidów mózgowych, przeprowadziliśmy sekwencjonowanie czterech połączonych organoidów z jednej partii. Dodatkowo, w celach porównawczych między procesami izolacji i w celu usunięcia efektów wsadowych między sekwencją snRNA a biblioteką scRNA-seq, organoidy te podzielono na połówki (w sumie osiem połówek; Rysunek 2). Po enzymatycznej izolacji poszczególnych komórek ważne jest, aby zapewnić, że żywotność komórek utrzymuje się powyżej 80%, przy jednoczesnej obserwacji, że komórki zachowują okrągłą morfologię (Rysunek 3A,B). Podobnie, mechaniczna izolacja pojedynczych jąder powinna dać nienaruszone jądra o różnych rozmiarach z minimalną lub żadną wykrywalną ilością wykrywalnych zanieczyszczeń (Rysunek 3C,D).

Analiza sekwencjonowania wykazała, że więcej komórek niż jąder zostało przechwyconych i zsekwencjonowanych. Oba zestawy danych wykazały dobrą jakość ocenianą na podstawie wysokiej liczby genów i UMI na komórkę i jądro oraz niskiego odsetka odczytów mitochondrialnych (Figura 4A-C). Zgodnie z oczekiwaniami, odczyty mitochondrialne i rybosomalne stanowią większą część całkowitych odczytów odzyskanych w zestawie danych scRNA-seq w porównaniu ze zbiorem danych snRNA-seq. W zbiorze danych scRNA-seq większość komórek zawierała mniej niż 30% odczytów rybosomalnych, podczas gdy w zbiorze danych snRNA-seq większość jąder zawierała mniej niż 5% odczytów rybosomalnych. Ponadto większość komórek przechwyconych w zbiorze danych scRNA-seq zawiera mniej niż 5% odczytów mitochondrialnych. Po odfiltrowaniu odczytów mitochondrialnych około 10 000 komórek i 3 000 jąder przekroczyło próg jakości.

Analiza integracyjna obu zestawów danych wykazała, że wszystkie klastry są reprezentowane w obu zestawach danych, co wskazuje, że obie metody odzyskują te same typy komórek (Rysunek 5A,C). Adnotacja zestawu danych pokazuje, że główne populacje komórek obejmują glej promieniowy, pośrednie komórki progenitorowe, podkorowe komórki progenitorowe i neurony, a także nowonarodzone neurony projekcji głębokiej warstwy i mniej reprezentowane typy komórek, takie jak Cajal-Retzius, komórki korowe i splot naczyniówkowy (Figura 5B). Ogólnie rzecz biorąc, scRNA-seq i snRNA-seq mogą odzyskać wszystkie typy komórek, które powinny być obecne w 30-dniowym organoidzie mózgowym20.

Okres od formowania się ciała zarodka do dojrzewania; obrazy mikroskopowe; etapy różnicowania komórek.
Rysunek 1: Generowanie organoidów mózgowych z iPSC. Przebieg czasowy generowania organoidów mózgowych (A). Przykładowe obrazy udanego różnicowania kory mózgowej od iPSC (B), które tworzą ciała zarodkowe (72 godziny po wysiewie) (C) i wykazują udaną indukcję neuronalną po 7 dniach hodowli (D). Organoid przedstawia wyraźne pętle w dniu 15 (E) i dniu 30 (F). Podziałka: B-D 200 μm, E 400 μm, F 800 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Schemat sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki i jądra; dysocjacja enzymatyczna, metoda gradientu Percolla.
Rysunek 2: Proces pozyskiwania pojedynczych komórek i pojedynczych jąder z organoidów mózgowych. Dysocjację organoidów na pojedyncze komórki przeprowadza się poprzez mielenie organoidów skalpelem, a następnie trawienie enzymatyczne (u góry). Izolację jąder przeprowadza się przez dysocjację mechaniczną, po której następuje oczyszczanie za pomocą gradientu Percoll (na dole). Zawiesina pojedynczej komórki i jąder jest filtrowana i ładowana do systemu mikroprzepływowego w celu generowania biblioteki i sekwencjonowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Obrazy z mikroskopii komórkowej pokazujące różne gęstości komórek i wzory barwienia; Metoda obejmuje barwienie.
Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki izolowanych komórek i jąder z 30-dniowych organoidów. (A) Przykładowy obraz komórek zabarwionych na niebiesko trypanowo wykonany za pomocą licznika komórek i (B) odpowiednie zbliżenie. (C) Nałożenie jasnego pola i obrazu fluorescencyjnego jąder barwionych DAPI oraz (D) odpowiednie zbliżenie. Podziałka skali: 100 μM Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wykresy skrzypcowe przedstawiające zmienność danych w zależności od tożsamości; Wyniki analiz statystycznych.
Rysunek 4: Kontrola jakości sekwencji scRNA i snRNA. Wykresy skrzypcowe ilustrują bezwzględną liczbę UMI (A), liczbę genów (B), odczyty mitochondrialne (C) i rybosomalne (D) komórek (niebieskie) i jąder (różowo-fioletowe). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Diagram UMAP przedstawiający klastry scRNAseq i snRNAseq, analiza ekspresji genów w komórkach neuronalnych.
Rysunek 5: scRNA-seq i snRNA-seq pobierają podobne populacje komórek w 30-dniowych organoidach. Zintegrowany wbudowany UMAP 30-dniowych organoidów, pokazujący wyniki sekwencji scRNA (niebieski) i sekwencji snRNA (różowo-fioletowy) (A), zintegrowane i oznaczone adnotacjami oraz indywidualne profile sekwencji scRNA i sekwencji snRNA (B, C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Pożywki do hodowli komórkowych i składniki powłok Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: dysocjacyjne dla scRNA i snRNA-seq. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dodatkowy plik kodowania 1: Plik kodujący używany do analizy danych scRNA-seq i snRNA-seq. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza transkryptomiczna pojedynczych komórek i pojedynczych jąder stała się kluczowym narzędziem do zrozumienia mechanizmów regulacji genów w złożonych tkankach. Obie metody umożliwiają badania transkryptomu organoidów mózgowych. Aby zapewnić ogólny sukces eksperymentu, jakość materiału wyjściowego ma duże znaczenie. Dlatego konieczne jest regularne cięcie organoidów, aby zapobiec tworzeniu się nekrotycznego rdzenia26. Możliwe jest również wyeliminowanie tego problemu za pomocą kultury interfejsu powietrze-ciecz27. Aby zmniejszyć efekty partii spowodowane niejednorodnością organoidów, sugerujemy użycie co najmniej czterech organoidów na ekstrakcję. Alternatywnie możliwe jest przeprowadzenie wielu serii sekwencjonowania poszczególnych organoidów, co dodatkowo pozwala na zbadanie zmienności w obrębie tej samej partii17. W przypadku stosowania obu metod, scRNA-seq i snRNA-seq, równolegle, pocięcie organoidów na dwie części i podzielenie ich dla każdej metody może jeszcze bardziej zmniejszyć różnice spowodowane niejednorodnością organoidów.

Aby uzyskać dobrej jakości profil transkryptomiczny pojedynczej komórki lub jądra, kluczowe jest, aby błona komórkowa lub jądrowa pozostała nienaruszona podczas całej procedury. Dlatego tak ważne jest zoptymalizowanie zarówno stężenia enzymu, jak i czasu trawienia enzymatycznego, które należy dostosować do wieku i wielkości organoidu. Ponadto ważne jest, aby stosować odpowiednie temperatury i prędkość wirowania oraz unikać ostrego pipetowania. W przypadku niskiej żywotności można zastosować zestaw do usuwania martwych komórek po dysocjacji organoidów na pojedyncze komórki. Uzupełnienie, do izolacji jąder konieczne jest dokładne umycie organoidu PBS i dostosowanie liczby uderzeń wygarniaczem do wielkości organoidu. Ważne jest również, aby ostrożnie ułożyć gradient Percoll, aby uniknąć zakłóceń w warstwowaniu. Jeśli uszkodzone jądra pozostają po izolacji, zaleca się przeprowadzenie etapu sortowania za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją22. Ogólnie rzecz biorąc, stosowanie inhibitorów RNAzy ma zasadnicze znaczenie dla wszystkich etapów, od dysocjacji próbki do generowania biblioteki, w celu zachowania wysokiej jakości RNA każdej komórki lub jądra.

W tym badaniu sekwencjonowanie scRNA dało więcej komórek, co pozwala na szerszy przegląd populacji komórek. Ponadto komórki zawierają więcej RNA i są łatwiejsze do wzbogacenia dla określonych typów komórek poprzez markery powierzchniowe w porównaniu z jądrami. Jednak dysocjacja pojedynczych komórek opiera się na procesie enzymatycznym, który może indukować transkrypcję RNA związanych ze stresem 19,28. Szczególnie w chorobach, które są związane ze zwiększoną reakcją na stres, może to prowadzić do artefaktów wywołanych dysocjacją20. Ponadto wykazano, że izolacja pojedynczej komórki spowodowała utratę wrażliwych populacji komórek 3,29. Chociaż może to nie być oczywiste w tym badaniu, jest to możliwy wynik przy użyciu starszych organoidów mózgowych, które charakteryzują się większą różnorodnością komórkową.

Ponieważ oba zestawy danych pobierają te same populacje komórek, wybór metody izolacji w dużym stopniu zależy od pytań badawczych, pozyskiwania tkanek i zarządzania czasem. Podczas gdy po dysocjacji utrwalanie i przechowywanie pojedynczych komórek z organoidów mózgowych w metanolu jest dobrze znane30, izolacja pojedynczych jąder z zamrożonych organoidów mózgowych nadal wymaga optymalizacji.

Ogólnie rzecz biorąc, nasze protokoły stanowią wszechstronną i adaptowalną platformę do badania profilu transkryptomicznego poszczególnych komórek i jąder w organoidach mózgowych, torując drogę do dogłębnych badań kwestii związanych z rozwojem i chorobą w modelach ludzkiego mózgu in vitro.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Valerii Fernandez-Vallone za oryginalne instrukcje dotyczące zestawu do dysocjacji neuronalnej Miltenyi. Dziękujemy również Platformie Technologicznej Genomiki Centrum Maxa Delbruecka za udostępnienie receptury buforu do lizy NP40 oraz cenne porady dotyczące tworzenia tego protokołu. Dziękujemy również Margarecie Herzog i Alexandrze Tschernycheff za wsparcie organizacyjne laboratorium.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M W H2O (DTT)Sigma  43816-10ML
1,5 ml probówki o niskim poziomie wiązania DNA Probówka do mikrowirówekVWR525-0130
10x rurociąg Cellranger analiza pipline
15 ml FalconProbówka wirówkowa
2-merkaptoetanolowa (BME)Life Technologies21985023
50 mlProbówka wirówkowa
A83-01Bio Technologies379762
Roztwór antybiotykowy/przeciwgrzybiczy (100X)Life Technologies15240062
B-27 Plus SuplementLife Technologies17504044
B-27 Suplement bez witaminy ALife Technologies12587010
Albumina surowicy bydlęcej, wolna od kwasów tłuszczowych (BSA)Sigma AldrichA8806-5G 
cAMPBiogems6099240
cAMPBiogems6099240
C-CHIP NEUBAUER ULEPSZONYVWRDHC-N01
Sitko komórkowe 40 i mikro; mNeolab352340
Sitko do komórek 70 & mikro; m (biały) NylonowySigmaCLS431751-50EA
Chromium i Następny Zestaw akcesoriów GEM10X Genomics1000204
Chromium Next GEM Chip G Zestaw pojedynczych komórek, 16 rxns10X Genomics1000127
Chromium Następny zestaw pojedynczych komórek GEM 3' v3.110X Genomics1000268
kompletny,  Wolny od EDTA inhibitor proteazy CocktaillRoche11873580001
DAPIMERCK Chemicals0000001722
DMEM/F12Life Technologies11320074
Zestaw młynków do tkanek Dounce 2 ml kompletnySigmaAldrich 10536355
Essential E8 Flex TechnologieżywotnościA2858501
Liczenie komórek EVE SlajdyVWREVS-050 ( 734-2676)
Surowica bydlęca dla płodu wolna od tetracyklin (FBS)PAN BiotechP30-3602
Geltrex LDEV-Free (powłoka)Life TechnologiesA1413302 
gentleMACSMiltenyi Biotecmaschine dysocjacyjny
GlutaMAX suplementyLife Technologies35050038
Testowana hodowla komórek sodowych heparynySigmaH3149-10KU
ludzka rekombinowana BDNFStemCell Technologies78005.3
ludzka rekombinowana GDNFStemCell Technologies78058.3
Roztwór insuliny LudzkiSigma AldrichI2643-25MG
Wymiana surowicy nokautującejLife Technologies10828028
LDN193189 Chlorowodorek 98%Sigma Aldrich130-106-540
MEM aminokwas endogenny (100x)Sigma AldrichM7145-100ml
MgCl2 Chlorek magnezu (1M) Termo bez RNAZ ScientificAM9530G
mTeSR PlusStemCell Technologies100-0276pożywka dla komórek macierzystych
mTeSR1StemCell Technologies85850pożywka dla komórek macierzystych
N2 Suplement StemCell Technologies17502048
Zestaw do dysocjacji tkanek nerwowychMiltenyi Biotec BV & Co. KG130-092-628
Neurobasal PlusLife TechnologiesA3582901
NastępnySystem Seq500IlluminaSequencer
NP-40 Surfact-Amps Roztwór detergentuLife Technologies28324
PBS Dulbecco' sInvitrogen14190169
PenStrep (Penicylina - Streptomycyna)Life Technologies15140122
PercollTh. Geyer10668276
Pluronic (R) F-127Sigma AldrichP2443-1KG
RiboLock RNase InhibitorLife Technologies EO0382
Inhibitor skał (dichlorowodorek Y-27632) SBBiomolCay10005583-10
SB 431542 Biogems3014193
Chlorek sodu NaCl (5M), bez RNaz - 100 mlInvitrogenAM9760G
StemFlex MediumThermo ScientificA3349401pożywka dla komórek macierzystych
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotec130-104-368pożywka dla komórek macierzystych
TC-Platte 96 Well, okrągłe dnoSarstedt83.3925.500
TISSUi006-ATissUse GmbHhttps://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
Trypan BlueT8154-20mlSigma
TrypLE Express Enzyme, bez czerwieni fenolowejLife Technologies12604013Odczynnik na bazie trypsyny
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7,5Life Technologies15567027
XAV939Enzo Nauki przyrodniczeBML-WN100-0005
Falcon Falcon kontroler średniej

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stem cell-derived human intestinal organoids as an infection model for Rotaviruses. mBio. 3 (4), e00159-e00212 (2012).">Finkbeiner, S. R., et al. Stem cell-derived human intestinal organoids as an infection model for Rotaviruses. mBio. 3 (4), e00159-e00212 (2012).
  2. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nat Commun. 6, 8715(2015).">Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nat Commun. 6, 8715(2015).
  3. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2 (17), e94954(2017).">Guan, Y., et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2 (17), e94954(2017).
  4. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).">Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).">Dang, J., et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).
  6. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nat Commun. 12 (1), 1929(2021).">Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nat Commun. 12 (1), 1929(2021).
  7. A single-cell type transcriptomics map of human tissues. Sci Adv. 7 (31), eabh2169(2021).">Karlsson, M., et al. A single-cell type transcriptomics map of human tissues. Sci Adv. 7 (31), eabh2169(2021).
  8. Single-cell and spatial transcriptomics: deciphering brain complexity in health and disease. Nat Rev Neurol. 19 (6), 346-362 (2023).">Piwecka, M., Rajewsky, N., Rybak-Wolf, A. Single-cell and spatial transcriptomics: deciphering brain complexity in health and disease. Nat Rev Neurol. 19 (6), 346-362 (2023).
  9. Advancing cancer research and medicine with single-cell genomics. Cancer Cell. 37 (4), 456-470 (2020).">Lim, B., Lin, Y., Navin, N. Advancing cancer research and medicine with single-cell genomics. Cancer Cell. 37 (4), 456-470 (2020).
  10. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).">Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
  11. Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids. Nat Commun. 13 (1), 3312(2022).">Fiorenzano, A., et al. Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids. Nat Commun. 13 (1), 3312(2022).
  12. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).">Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  13. Schizophrenia is defined by cell-specific neuropathology and multiple neurodevelopmental mechanisms in patient-derived cerebral organoids. Mol Psychiatry. 27 (3), 1416-1434 (2022).">Notaras, M., et al. Schizophrenia is defined by cell-specific neuropathology and multiple neurodevelopmental mechanisms in patient-derived cerebral organoids. Mol Psychiatry. 27 (3), 1416-1434 (2022).
  14. Modelling viral encephalitis caused by herpes simplex virus 1 infection in cerebral organoids. Nat Microbiol. 8 (7), 1252-1266 (2023).">Rybak-Wolf, A., et al. Modelling viral encephalitis caused by herpes simplex virus 1 infection in cerebral organoids. Nat Microbiol. 8 (7), 1252-1266 (2023).
  15. The organoid cell atlas. Nat Biotechnol. 39 (1), 13-17 (2021).">Bock, C., et al. The organoid cell atlas. Nat Biotechnol. 39 (1), 13-17 (2021).
  16. High-throughput single-cell transcriptomics on organoids. Cur Opinion Biotechnol. 55, 167-171 (2019).">Brazovskaja, A., Treutlein, B., Camp, J. G. High-throughput single-cell transcriptomics on organoids. Cur Opinion Biotechnol. 55, 167-171 (2019).
  17. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).">Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
  18. Proper acquisition of cell class identity in organoids allows definition of fate specification programs of the human cerebral cortex. Cell. 185 (20), 3770-3788.e27 (2022).">Uzquiano, A., et al. Proper acquisition of cell class identity in organoids allows definition of fate specification programs of the human cerebral cortex. Cell. 185 (20), 3770-3788.e27 (2022).
  19. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. Int J Mol Sci. 21 (21), 7944(2020).">Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. Int J Mol Sci. 21 (21), 7944(2020).
  20. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 14 (10), 935-936 (2017).">Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  21. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat Med. 26 (5), 792-802 (2020).">Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat Med. 26 (5), 792-802 (2020).
  22. Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles. STAR Protoc. 2 (3), 100694(2021).">Santos, M. D., et al. Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles. STAR Protoc. 2 (3), 100694(2021).
  23. Inferring and perturbing cell fate regulomes in human cerebral organoids. Nature. 621 (7978), 365-372 (2021).">Fleck, J. S., et al. Inferring and perturbing cell fate regulomes in human cerebral organoids. Nature. 621 (7978), 365-372 (2021).
  24. Morphogenesis and development of human telencephalic organoids in the absence and presence of exogenous extracellular matrix. EMBO J. 42 (22), e113213(2023).">Martins-Costa, C., et al. Morphogenesis and development of human telencephalic organoids in the absence and presence of exogenous extracellular matrix. EMBO J. 42 (22), e113213(2023).
  25. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587.e29 (2021).">Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587.e29 (2021).
  26. A simple method to improve the quality and yield of human pluripotent stem cell-derived cerebral organoids. Heliyon. 7 (6), e07350(2021).">Choe, M. S., et al. A simple method to improve the quality and yield of human pluripotent stem cell-derived cerebral organoids. Heliyon. 7 (6), e07350(2021).
  27. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat Neurosci. 22 (4), 669-679 (2019).">Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat Neurosci. 22 (4), 669-679 (2019).
  28. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).">Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
  29. Comparison of single-nucleus and single-cell transcriptomes in hepatocellular carcinoma tissue. Mol Med Rep. 26 (5), 339(2022).">Wen, F., Tang, X., Xu, L., Qu, H. Comparison of single-nucleus and single-cell transcriptomes in hepatocellular carcinoma tissue. Mol Med Rep. 26 (5), 339(2022).
  30. Cell fixation and preservation for droplet-based single-cell transcriptomics. BMC Biol. 15 (1), 44(2017).">Alles, J., et al. Cell fixation and preservation for droplet-based single-cell transcriptomics. BMC Biol. 15 (1), 44(2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell TranscriptomicsSingle Nuclei TranscriptomicsBrain OrganoidsOrganoid DissociationNuclei IsolationLibrary PreparationRNA SequencingSpatial TranscriptomicsCell Type RecoveryGene Expression Profiles

Related Articles