Artykuł metodologiczny

Obrazowanie in vivo sferoid wątroby wszczepionych do przedniej komory oka myszy

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66234

⸱

29 marca 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Rolf Luft Research Center for Diabetes and Endocrinology, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, 2Tecnológico de Monterrey, 3Diabetes Research Institute, Miller School of Medicine, University of Miami

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy platformę, która umożliwia nieinwazyjne obrazowanie in vivo sferoidów wątroby wszczepionych do przedniej komory oka myszy. Przebieg pracy obejmuje zarówno generowanie sferoid z pierwotnych komórek wątroby, jak i przeszczep do oka myszy oraz obrazowanie in vivo w rozdzielczości komórkowej za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Streszczenie

Badania biomedyczne wątroby u ssaków są utrudnione przez brak metod do nieinwazyjnego obrazowania podłużnego in vivo w rozdzielczości komórkowej. Do tej pory obrazowanie optyczne wątroby in situ było możliwe dzięki obrazowaniu przyżyciowemu, które oferuje obrazowanie w wysokiej rozdzielczości na poziomie komórkowym, ale nie może być wykonane wiele razy, a zatem wzdłużnie u tego samego zwierzęcia. Nieinwazyjne metody obrazowania, takie jak bioluminescencja, pozwalają na wielokrotne sesje obrazowania na tym samym zwierzęciu, ale nie pozwalają osiągnąć rozdzielczości komórek. Aby wypełnić tę lukę metodologiczną, opracowaliśmy platformę do nieinwazyjnego obrazowania in vivo sferoid wątroby wszczepionych w przednią komorę oka myszy. W przebiegu pracy opisanym w tym badaniu pierwotne sferoidy wątroby myszy są generowane in vitro i przeszczepiane do przedniej komory oka myszy biorców, gdzie wszczepiają się na tęczówkę. Rogówka działa jak naturalne okno ciała, przez które możemy obrazować wszczepione sferoidy za pomocą konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej. Sferoidy przeżywają w oku miesiące i podczas których komórki mogą być badane w kontekście zdrowia i choroby, a także monitorowane w odpowiedzi na różne bodźce podczas powtarzanych sesji obrazowania przy użyciu odpowiednich sond fluorescencyjnych. W niniejszym protokole przedstawiamy zestawienie kroków niezbędnych do wdrożenia tego systemu obrazowania i wyjaśniamy, jak najlepiej wykorzystać jego potencjał.

Wprowadzenie

Monitorowanie funkcji wątroby u ssaków podczas zdrowia i choroby jest ograniczone przez brak wysokorozdzielczych, nieinwazyjnych technik obrazowania in vivo. Wizualizacja tego narządu jest utrudniona ze względu na jego niedostępną lokalizację, a w celu poskładania procesów komórkowych badania in vivo opierają się na składaniu ofiar ze zwierząt w różnych punktach czasowych. Aby obejść to ograniczenie obrazowania, wiele prac opiera się na modelach in vitro, w których mikrotkanki podobne do wątroby są wizualizowane i badane w kontrolowanym środowisku.

W ostatnich latach rozwój trójwymiarowych systemów hodowli, takich jak sferoidy wątroby, pomógł i przyspieszył badania nad wątrobą. Sferoidy wątroby to wielokomórkowe agregaty, które do pewnego stopnia naśladują mikrośrodowisko i złożone interakcje komórka-komórka w tkance wątroby1 i oferują wyraźną przewagę nad tradycyjnymi kulturami jednowarstwowymi2,3. Sferoidy wątroby są również używane jako modele dla różnych chorób wątroby4,5,6 i odegrały zasadniczą rolę w zrozumieniu mechanizmów choroby. Jednak kluczowymi ograniczeniami obecnych modeli wątroby in vitro są brak fizjologicznego środowiska in vivo i ograniczony czas wykorzystania w hodowli (około 20 dni)3. Sferoidy wątroby były wcześniej przeszczepiane do różnych miejsc in vivo, takich jak pod torebką nerkową7 lub dootrzewnowo8, które nie są dostępne do obrazowania optycznego. Obrazowanie wątroby w trybie przyżyciowym jest najnowocześniejszą techniką oferującą obrazowanie w czasie rzeczywistym z rozdzielczością komórkową. Obecnie to obrazowanie wątroby in situ jest możliwe tylko na zewnętrznym narządzie, który jest wysoce inwazyjny i często terminalny9. Chociaż dopasowanie okienka brzusznego pozwoliłoby na wielokrotne sesje obrazowania wątroby, wiąże się to ze skomplikowaną operacją i opieką pooperacyjną.

Aby przeprowadzić monitorowanie podłużne w rozdzielczości komórkowej, zbadaliśmy transplantację sferoid wątroby do przedniej komory oka (ACE) myszy, gdzie tkanka podobna do wątroby jest wszczepiana w środowisko fizjologiczne, podłączona do bodźców ciała i dostępna do obrazowania optycznego. Rogówka jest przezroczystą tkanką i działa jak okno, przez które mikrotkanki wszczepione do tęczówki mogą być obrazowane nieinwazyjnie i podłużnie za pomocą mikroskopii konfokalnej. W tym miejscu przedstawiamy przebieg pracy tej nowo opracowanej platformy do obrazowania in vivo sferoidów wątroby10. Protokół ten jest przewodnikiem krok po kroku dotyczącym jego wdrożenia, podzielonego na (1) ekstrakcję pierwotnych komórek wątroby myszy i tworzenie sferoid wątroby in vitro, (2) przeszczepienie sferoid wątroby do ACE myszy biorców oraz (3) obrazowanie in vivo wszczepionych sferoid wątroby u znieczulonych myszy. Ponadto zaprezentujemy niektóre z możliwości i zastosowań tej platformy obrazowania.

Protokół

Wszystkie procedury wykonywane na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Eksperymentów na Zwierzętach w Karolinska Institutet.

1. Ekstrakcja pierwotnych komórek wątroby myszy i wytwarzanie sferoid wątroby in vitro

  1. preparat
    1. Do kaniulacji, resekcji wątroby i izolacji pierwotnych komórek wątroby, oprócz pipet serologicznych i probówek wirówkowych, przygotuj następujące sterylne lub jednorazowe materiały, oprócz pipet serologicznych i probówek wirówkowych (Rysunek 1A): pompa perystaltyczna, wirówka z wiadrem wahadłowym, podkładka chłonna, mata preparacyjna, dwa kleszcze z zakrzywioną końcówką, nożyczki chirurgiczne, jedna igła motylkowa 27 G, jedno sitko do komórek 70 μm, jeden podnośnik komórek, jedna szalka Petriego 100 mm, komora do liczenia komórek i 96-dołkowe mikropłytki z dnem w kształcie litery U.
    2. Przygotować roztwory stosowane w perfuzji wątroby, izolacji pierwotnych komórek wątroby i wytwarzaniu sferoid wątroby, jak podano w tabeli 1.
      UWAGA: Bufor mineralizacyjny i roztwór gradientowy należy przygotować na świeżo.
    3. Ustaw system perfuzyjny składający się z pompy perystaltycznej, która przewodzi roztwory z łaźni wodnej o temperaturze 42 °C do wątroby (Rysunek 1A). Wyższa temperatura łaźni wodnej zapewnia, że docierają do wątroby w optymalnej temperaturze 37 °C. Dostosuj ją w zależności od długości rurki i temperatury pokojowej (RT).
    4. Do kaniulacji należy przymocować igłę motylkową o pojemności 27 G do końca tuby. Nośnik galwaniczny użyty w końcowych etapach izolacji należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. procedura
    1. W łaźni wodnej o temperaturze 42 °C w probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml podgrzej następujące roztwory: 40 ml PBS, 20 ml buforu perfuzyjnego i 12 ml buforu do wytrawiania.
    2. Aby oczyścić i ogrzać rurki pompy, należy wprowadzić w cyrkulację około 20 ml wstępnie podgrzanego PBS.
    3. Zmień rurkę na bufor perfuzyjny, zalej rurkę i igłę motylkową, a następnie ustaw natężenie przepływu na 4 ml/min. Upewnij się, że w rurce nie ma pęcherzyków podczas zmian buforu w całym protokole.
    4. Poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy i użyj igieł, aby przymocować kończyny do deski sekcyjnej.
    5. Zwilż sierść brzucha 70% etanolem i rozetnij ją, aby uzyskać dostęp do narządów trawiennych.
    6. Przesuń jelita w prawo, aby odsłonić żyłę wrotną i żyłę główną dolną (Ryc. 1B).
    7. Wprowadzić kanulokację żyły głównej mniej więcej w połowie jej długości z igłą w pozycji poziomej, upewnić się, że jest stabilna i uruchomić pompę.
    8. Kiedy wątroba zaczyna się nadmuchiwać lub pojawiają się białe kropki w bliższych płatach, przetnij żyłę wrotną, aby umożliwić odpływ krwi i buforu perfuzyjnego.
    9. Wątroba powinna natychmiast zacząć blanszować. Zachęcaj do oczyszczania za pomocą zakrzywionych kleszczy, aby zacisnąć żyłę wrotną w odstępach 5 sekund.
    10. Powtarzaj krok 1.2.9, aż wątroba stanie się żółta i oczyszczona z krwi (ok. 15-20 ml buforu perfuzyjnego).
    11. Zatrzymaj pompę perystaltyczną, aby zmienić rurkę na bufor wytrawiający i ponownie uruchomić pompę. Gdy bufor trawienny dotrze do wątroby, zmniejsz natężenie przepływu do 2,5 ml/min.
      UWAGA: Czerwień fenolowa znajdująca się w buforze trawiennym pozwala na odróżnienie jego dopływu do wątroby i umożliwia regulację parametrów pompy w trakcie zabiegu.
    12. Aby pobudzić bufor do dotarcia do wszystkich płatów wątrobowych i zapewnić prawidłowe trawienie, powtórz krok 1.2.9 kilka razy.
    13. Zatrzymaj przepływ pompy perystaltycznej, gdy bufor trawienny jest wyczerpany lub wątroba wygląda na wystarczająco strawioną.
      UWAGA: Stopień trawienia można monitorować wizualnie, delikatnie ściskając płaty wątroby kleszczami i sprawdzając, czy na tkance pojawiają się małe ślady. Wątroba również stanie się słaba.
    14. Aby pobrać wątrobę, należy przeciąć więzadła i połączenia wątrobowe w jamie brzusznej, dążąc do jej całkowitego usunięcia, i umieścić ją na szalce Petriego zawierającej 10 ml zimnego podłoża galwanicznego (Tabela 1).
    15. Po usunięciu pęcherzyka żółciowego wykonaj małe szczypce na płatach za pomocą kleszczy, lekko rozrywając torebkę wątrobową. Potrząsając wątrobą w naczyniu, obserwuj komórki wylewające się do pożywki.
    16. Trzymając wątrobę stabilnie kleszczami, delikatnie przeciągnij podnośnik komórek wzdłuż płatów, aby uwolnić komórki.
      UWAGA: Prawidłowe trawienie międzyzrazikowe doprowadzi do zawieszenia komórek w pożywce, a nie fragmentów tkanek.
    17. Za pomocą pipety serologicznej zebrać zawiesinę komórek z płytki Petriego i przefiltrować przez sitko o wielkości 70 μm umieszczone na probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Użyj świeżego podłoża galwanicznego, aby umyć naczynie z strawionych komórek wątroby i przenieść je do filtra.
    18. Wirować przy 50 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek.
    19. Usunąć supernatant, pozostawiając około 1 ml na pokrycie osadu komórkowego, zakręcić probówką w celu ponownego zawieszenia komórek, a następnie stopniowo dodawać 10 ml zimnego podłoża galwanicznego.
    20. Dodaj 10 ml roztworu gradientowego do zawiesiny komórek i delikatnie odwróć probówkę 10 razy.
    21. Wirować przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    22. Osad zawiera żywotne komórki wątroby wzbogacone o hepatocyty, podczas gdy supernatant zawiera martwe komórki i szczątki. Odrzucić supernatant za pomocą pipety serologicznej, pozostawiając około 1 ml i ponownie zawiesić osad przez delikatne mieszanie.
    23. Dodać 20 ml pożywki do powlekania na zimno do zawiesiny komórek i odwirować przy 50 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu zmycia roztworu gradientowego.
    24. Usunąć supernatant, pozostawiając około 1 ml nad osadem, i ponownie zawiesić komórki w 20 ml zimnego podłoża galwanicznego.
      UWAGA: W tym przypadku osad komórkowy można zagęścić, więc w razie potrzeby użyj pipety serologicznej o pojemności 10 ml, aby delikatnie dysocjować komórki.
    25. Ręcznie określ liczbę komórek i żywotność za pomocą komory zliczania komórek i błękitu trypanowego.
      UWAGA: Komórki hepatocytów szybko wytrącą się w probówce; Aby je ponownie zawiesić, delikatnie odwróć rurkę kilka razy.
    26. Wysiewaj komórki wątroby w 200 μl / studzienkę pożywki galwanowej w 1200 komórkach / dobrze na 96-dołkowych płytkach o bardzo niskiej przyczepności.
      UWAGA: Optymalna objętość pożywki na studzienkę to 200 μL; Możliwe jest jednak wysiewanie komórek w 100 μl/studzienkę.
    27. Obracaj płytki o masie 200 x g przez 3 minuty, aby zebrać komórki w środku studzienek.
    28. Inkubuj (37 °C, 5% CO2) komórki i pozostaw je do utworzenia sferoid przez 5 dni (Rysunek 1C) naturalnie.
    29. W 5 dniu ostrożnie usuń połowę pożywki ze studzienki i zastąp ją pożywką do konserwacji niezawierającą surowicy (Tabela 1). Powtarzaj ten krok co 48 godzin do 10 dnia, kiedy sferoidy wątroby są gotowe do przeszczepienia.
      UWAGA: Tworzenie struktury przypominającej kapsułkę w hodowanych sferoidach wątroby wykazuje dobrą agregację i żywotność.

2. Przeszczepienie sferoid wątroby do przedniej komory oka (ACE)

  1. preparat
    1. W celu przeszczepienia sferoid wątroby do ACE należy upewnić się, że masz zapewnione następujące zasoby (Rysunek 2A): mikroskop stereoskopowy, jednostka anestezjologiczna izofluranu, komora indukcyjna, izofluran, poduszka grzewcza, wykonana na zamówienie metalowa płyta podstawy, uchwyt na głowę myszy i maska przeciwgazowa, kleszcze przymocowane do solidnego przegubu uniwersalnego, strzykawka z gwintowanym tłokiem Hamilton 500 μL, silikon, polietylen i rurka do pompy, wykonana na zamówienie szklana kaniula lub cewnik 24 G, etanol 70%, sterylna sól fizjologiczna, sterylne igły 23 G, maść do oczu (płynna parafina i wazelina w proporcji 1:1), jednorazowa strzykawka 1 ml i naczynie do zawieszania komórek 35 mm.
    2. Wyczyść strzykawkę Hamiltona, rurkę i kaniulę, przepuszczając 70% etanolu i soli fizjologicznej.
    3. Napełnij strzykawkę Hamiltona, rurkę i szklaną kaniulę solą fizjologiczną i przymocuj strzykawkę Hamilton do stołu w pozycji poziomej za pomocą taśmy (Rysunek 2A).
    4. Użyj wykonanej na zamówienie szklanej kaniuli.
      1. Wydłużyć kapilarnę ze szkła borokrzemianowego za pomocą dwustopniowego ściągacza do mikropipet do średnicy wewnętrznej >300 μm, aby umożliwić aspirację sferoid.
      2. Ukosuj i stęp końcówkę za pomocą ukosownika mikroelektrod i wystaw końcówkę kaniuli na działanie płomienia na kilka sekund, aby zmiękczyć krawędzie.
        UWAGA: Ukosowarka mikroelektrod składa się z obracającego się kamienia szlifierskiego, który jest obsługiwany ręcznie; W związku z tym określone ustawienia nie mają zastosowania.
    5. Alternatywnie, zbuduj kaniulę za pomocą plastikowej części cewnika 24 G (Rysunek 2B).
    6. Przygotować jednostkę do znieczulenia izofluranem i ogrzać poduszkę grzewczą do temperatury 37 °C.
    7. Przykryj końcówki kleszczy przymocowanych do solidnego uniwersalnego złącza kawałkiem rurki polietylenowej, aby utworzyć pętlę, która pomaga ustabilizować oko.
    8. Przenieść sferoidy wątroby z płytki 96-dołkowej do naczynia do zawiesiny komórek o średnicy 35 mm z pożywką konserwacyjną za pomocą pipety i końcówki o pojemności 200 μl.
  2. procedura
    1. Znieczulić mysz w komorze indukcyjnej za pomocą dawki 2,5% izofluranu i 280 ml/min powietrza.
    2. Gdy mysz jest nieprzytomna, zmniejsz znieczulenie do 1,8% izofluranu i 280 ml/min powietrza, podłącz rurkę anestezjologiczną do uchwytu na głowę i szybko przenieś zwierzę na poduszkę grzewczą, umieszczając nos wewnątrz uchwytu na głowę.
    3. Unieruchom głowę za pomocą, delikatnie wyjmij oko z oczodołu i zabezpiecz je kleszczami, a następnie umieść kroplę soli fizjologicznej na obu oczach, aby zapobiec wysuszeniu.
    4. Pod stereoskopem użyj strzykawki Hamiltona, aby zassać i zebrać sferoidy wątroby do końcówki kaniuli i pozostawić je poziomo na czystej powierzchni.
      UWAGA: Zasysanie pożywki wraz ze sferoidami wątroby pomaga zapobiegać ich przywieraniu do ścianek kaniuli.
    5. Ostrożnie nakłuć rogówkę za pomocą igły 23 G i osuszyć wyciekającą ciecz wodnistą chusteczką. W razie potrzeby, aby poszerzyć nacięcie, ostrożnie przesuń igłę na boki, aby przeciąć rogówkę.
      UWAGA: Do wykonania nakłucia rogówki używa się sterylnej igły jednorazowego użytku, więc rogówka nie jest dezynfekowana przed nacięciem.
    6. Dodaj krople soli fizjologicznej do oka, aby uniknąć wysuszenia.
    7. Weź kaniulę zawierającą sferoidy wątroby i trzymaj ją pionowo, aby sferoidy mogły grawitować w kierunku końcówki kaniuli.
    8. Delikatnie włóż kaniulę do otworu i ze skosem skierowanym w stronę źrenicy, użyj strzykawki Hamiltona, aby powoli wypchnąć sferoidy wątroby do ACE (Rysunek 2C).
      UWAGA: Przed wyjęciem kaniuli zaleca się odczekanie kilku sekund, aż ciśnienie płynu wewnątrz i na zewnątrz oka ponownie się dostosuje i uniknięcie wydostania się sferoid z powrotem na zewnątrz oka.
    9. Na zewnątrz rogówki umieść sferoidy wątroby wokół źrenicy i z dala od nacięcia, delikatnie szturchając rogówkę końcówką kaniuli (Ryc. 2C).
    10. Poczekaj ~ 5-10 minut, aż sferoidy wątroby osiądą na tęczówce, zanim uwolnisz oko z kleszczy.
    11. Nałóż wazelinową maść na oko na operowane oko, która pomaga nawilżyć i wyleczyć rogówkę.
    12. W razie potrzeby przystąp do operacji drugiego oka zgodnie z tą samą metodą.
    13. Przed obudzeniem myszy należy podać środek przeciwbólowy, aby uniknąć dyskomfortu pooperacyjnego, na przykład 0,1 mg/kg buprenorfiny w sterylnym roztworze soli fizjologicznej, podawany podskórnie.
      UWAGA: Myszom podano tylko jedną dawkę leków przeciwbólowych, ponieważ szybko dochodziły do siebie po tym małym zabiegu i nie wykazywały żadnych oznak bólu ani zmienionego zachowania. Ponieważ zabieg ten jest bardzo szybki (trwa poniżej 10 minut) i powoduje jedynie niewielki dyskomfort, myszy nie wymagają żadnej opieki pooperacyjnej, poza znieczuleniem pooperacyjnym podawanym przed obudzeniem zwierzęcia.

3. Obrazowanie in vivo wszczepionych sferoidów wątroby w ACE

  1. preparat
    1. Przygotuj następujące materiały i instrumenty do nieinwazyjnego obrazowania in vivo sferoidów wątroby wszczepionych w ACE (Ryc. 3A): pionowy mikroskop konfokalny, soczewka do zanurzania w wodzie na dużą odległość roboczą, jednostka anestezjologiczna izofluranowa, komora indukcyjna, izofluran, poduszka grzewcza, wykonana na zamówienie metalowa płyta podstawy, uchwyt na głowę myszy i maska przeciwgazowa, kleszcze przymocowane do solidnego stawu uniwersalnego, żel do sztucznego łzawienia, maść do oczu (płynna parafina i wazelina w 1: 1 stosunek).
    2. Opcjonalne materiały obejmują wstrzykiwane sondy fluorescencyjne, jednorazowe strzykawki i igły 27 G do wstrzykiwań dożylnych do ogona.
  2. procedura
    1. Znieczulić mysz w komorze indukcyjnej za pomocą dawki 2,5% izofluranu i 280 ml/min powietrza.
    2. Gdy mysz jest nieprzytomna, zmniejsz znieczulenie do 1,8% izofluranu i 280 ml/min powietrza, podłącz rurkę anestezjologiczną do uchwytu na głowę i szybko przenieś zwierzę na poduszkę grzewczą, umieszczając nos wewnątrz uchwytu na głowę.
    3. Unieruchomić głowę w uchwycie głowicy za pomocą.
    4. Umieść kroplę sztucznego żelu łzowego na obu oczach, aby zapobiec wysuszeniu.
    5. W tym momencie wstrzyknąć dożylnie sondy fluorescencyjne przez żyłę ogonową i natychmiast po tym wykonać obraz.
    6. Przechyl głowę, delikatnie wyjmij oko z oczodołu i zabezpiecz je kleszczami i umieść pod obiektywem.
    7. Nałóż dużą ilość sztucznego żelu przeciwłzowego, aby wypełnić przestrzeń między rogówką a obiektywem i skup się na sferoidach wątroby przez okular.
      UWAGA: Jeśli to możliwe, zdejmij okular z jednej z lornetek, aby uzyskać widzenie bez powiększenia i łatwiej zlokalizować sferoidy na tęczówce.
    8. Aby uzyskać obrazowanie w wysokiej rozdzielczości pomimo ruchów oddechowych zwierzęcia, należy używać obiektywów 25x i następujących ustawień obrazowania: format 512 x 512 pikseli, prędkość skanowania 600 Hz i grubość stosu Z 3 μm. Szczegółowe ustawienia obrazowania znajdują się w tabeli 2.
      UWAGA: Podczas obrazowania stężenie znieczulenia jest regulowane w zakresie 1,6-2,2 ml / h izofluranu, aby uzyskać płytki, kontrolowany rytm oddychania, a tym samym zminimalizować ruchy zwierzęcia.
    9. Pod koniec sesji obrazowania należy potraktować obrazowane oczy wazelinową maścią do oczu przed usunięciem izofluranu i obudzeniem zwierzęcia.

Wyniki

Pierwotne komórki wątroby, wzbogacone o hepatocyty, wyizolowano z wątroby mysiej za pomocą dwuetapowej perfuzji kolagenazą, wykorzystując pompę perystaltyczną do krążenia ciepłych buforów przez wątrobę, co pozwoliło na dostarczenie enzymów dysocjujących do wszystkich komórek dzięki wykorzystaniu unaczynienia organu (Rycina 1A). W tym celu kanulowano żyłę główną dolną, a żyłę wrotną przecięto, aby umożliwić przepływ buforów (Rycina 1B). Najpierw przez wątrobę przepłukano bufor na bazie HBSS, aby usunąć krew. Jeśli kanulacja przebiegła pomyślnie i nie występują skrzepy krwi, wątroba blaknie i staje się żółta w ciągu kilku sekund. Następnie przez wątrobę przepuszczono bufor trawienny zawierający mieszankę enzymów Liberase, aby zdysocjować tkankę do postaci zawiesiny pojedynczych komórek. Komórki przeliczono ręcznie i wysiano do 96-dołkowych płytek o ultra niskiej adhezji (ULA), które umożliwiają samoorganizację w sferoidy w ciągu kilku dni. W 5. dniu sferoidy są już uformowane, a cienka kapsuła otaczająca sferoidy wskazuje na pomyślną agregację (Rycina 1C). Przeszczepu dokonuje się w 10. dniu, kiedy sferoidy są zwarte i wykształciły silne połączenia międzykomórkowe. Liczba wysianych komórek na dołek determinowała rozmiar sferoidu wątrobowego, przy czym 1000, 1200 i 1500 komórek/dołek dawały sferoidy o średnicach odpowiednio 238 µm ± 10 µm, 248 µm ± 17 µm i 298 µm ± 19 µm (średnia ± SD) (Rycina 1C,D). Do transplantacji wybieramy sferoidy o średnicy około 250 µm z następujących powodów: (1) rozmiar sferoidów nie powinien być zbyt duży, aby uniknąć hipoksji i powstania rdzenia nekrotycznego, ale powinien zawierać wystarczającą liczbę komórek, aby wspierać komunikację międzykomórkową i umożliwić przebudowę przeszczepu w oku, (2) masa sferoidów tej wielkości pozwala im grawitacyjnie przesuwać się w stronę tęczówki i poprawia ich przyживienie, (3) rozmiar ten jest odpowiedni w odniesieniu do transplantacji 5-10 sferoidów do oka jednej myszy.

Operacja transplantacji wymaga użycia strzykawki z manualnym tłokiem połączonej ze szklaną kaniulą (Rysunek 2A). Szklana kaniula składa się z kapilary z borokrzemianowego szkła, zmodyfikowanej wewnętrznie w celu uzyskania cienkiej, tępej końcówki za pomocą wyciągacza i ściinarki do mikropipet. Prostszą alternatywną kaniulę można stworzyć, używając dostępnego komercyjnie plastikowego cewnika połączonego z przewodami strzykawki i ustabilizowanego w końcówce pipety (Rysunek 2B). Operacja polega na inokulacji sferoidów wątroby do przedniej komory oka (ACE) poprzez nacięcie w rogówce (Rysunek 2C). Sferoidy umieszczano na brzegach źrenicy, aby były lepiej dostępne do obrazowania i aby zapobiec ich przemieszczeniu się do kąta oka. Do transplantacji wykorzystano myszy albinosy, ponieważ ich niepigmentowana tęczówka umożliwia obrazowanie in vivo przeszczepionych sferoidów wątroby. Myszy biorcy poddano transplantacji w obu oczach, wprowadzając od 7-10 sferoidów/oko; zdjęcia stereoskopowe wykonano 3 dni po transplantacji (post-Tx) a także po 1 tygodniu i 1 miesiącu post-Tx, aby udokumentować gojenie się rogówki i sukces przyjęcia sferoidów (Rysunek 2D). Należy zauważyć, że zmiana wyglądu sferoidów wątroby w ACE między momentem świeżego przeszczepienia a pełnym przyjęciem wynika z osadzenia się przeszczepu na tęczówce, a także z narostu jednowarstwy komórek tęczówki nad sferoidem. Wskaźnik sukcesu przyjęcia sferoidów wątroby w ACE wynosi 70% (n = 9 oczu u myszy samców i samic) (Rysunek 2E). Pierwsze dni post-Tx są najbardziej krytyczne dla przeżycia i przyjęcia przeszczepu, co prawdopodobnie wynika z pocierania oczu przez zwierzę biorcę i usuwania sferoidów przed zagojeniem się rogówki. Wielkość sferoidów wątroby nie różni się znacząco po post-Tx, a zmiany kształtu przypisuje się przebudowie i przyjęciu przeszczepu (Rysunek 2F). W 1 miesiącu post-Tx wszystkie przyjęte sferoidy obecne na tęczówce były unaczynione i unerwione, co wykazano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego (Rysunek 2G).

Nieinwazyjne obrazowanie in vivo przeprowadza się na znieczulonych myszach biorcach przy użyciu pionowego mikroskopu konfokalnego i zanurzeniowego obiektywu o dużej odległości roboczej (Rysunek 3A, Tabela 2). Obrazowanie fluorescencyjne w ACE można zrealizować za pomocą różnych podejść, co przedstawiono na Rysunku 3B. Wstrzyknięcie sond fluorescencyjnych do krwiobiegu myszy biorcy umożliwia wizualizację różnych typów komórek i struktur w obrębie sferoidów. Wykorzystano lektynę do znakowania naczyń krwionośnych (Rysunek 3C), CMFDA do obserwacji sieci kanalików żółciowych (Rysunek 3D) oraz pHrodo-LDL, który potwierdził aktywny pobór LDL przez komórki sferoidów (Rysunek 3E). Można również zastosować sferoidy wątrobowe generowane z reporterowych modeli mysich. Sferoidy Albumin-Cre:tdTomato pozwoliły na znakowanie i śledzenie hepatocytów (Rysunek 3F), a sferoidy wykazujące ekspresję biosensora Fluorescent Ubiquitin Cell Cycle Indicator (FUCCI) posłużyły do wizualizacji dynamiki cyklu komórkowego z rozdzielczością do pojedynczej komórki (Rysunek 3G). Wreszcie, sferoidy wątrobowe mogą zostać zmodyfikowane genetycznie in vitro przed transplantacją, a w przypadku transdukcji wirusem AAV-GFP ekspresja była obserwowana in vivo przez ponad 6 miesięcy (Rysunek 3H).

Eksperyment ze sferoidami wątrobowymi przedstawiający układ inkubacji, procedurę chirurgiczną, obrazy wzrostu komórek i dane dotyczące rozmiaru.
Rysunek 1: Izolacja pierwotnych hepatocytów mysich i generowanie sferoidów wątrobowych. (A) Materiały i sprzęt użyte do izolacji pierwotnych hepatocytów mysich: 1. Bufor do izolacji; 2. Kąpiel wodna; 3. Pompa perystaltyczna; 4. Płytka Petriego; 5. Sitko komórkowe; 6. Podkład chłonny; 7. Mata do sekcji; 8. Przenosik komórkowy (Cell Lifter); 9. Igła motylkowa 27 G; 10. Narzędzia do sekcji. (B) Jama brzuszna podczas operacji: żyła główna została zakanulowana i poddana perfuzji, a żyła wrotna przecięta, aby umożliwić przepływ buforów. (C) Obrazy w jasnym polu przedstawiające tworzenie sferoidów wątrobowych in vitro w 0 (d0), 5 (d5) i 10 (d10) dni po wysianiu, paski skali = 200 µm. (D) Rozmiar sferoidów wątrobowych przy różnych stężeniach wysiewu komórek, n = 21 sferoidów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Układ równowagi statycznej; transplantacja sferoidów wątrobowych; platforma optyczna; kroki chirurgiczne; dane wykresowe.
Rycina 2: Transplantacja i przyswajanie sferoidów wątrobowych do ACE myszy. (A) Materiały i sprzęt użyte do transplantacji (Tx) sferoidów wątrobowych do ACE: 1. Sferoidy wątrobowe w naczyniu hodowlanym; 2. Sterylna sól fizjologiczna; 3. Maść do oczu; 4. Igły 23 G; 5. Kanula; 6. Strzykawka Hamiltona; 7. Rurka do gazu znieczulającego; 8. Ustabilizator głowy i maska gazowa; 9. Mata grzewcza; 10. Specjalnie wykonana metalowa płyta podstawowa; 11. Pinceta i stały przegub uniwersalny. (B) Układ kanuli i strzykawki Hamiltona: 1. Szklana kanula połączona ze strzykawką Hamiltona za pomocą drenu Portex i igły 27G; 2. Szklana kanula połączona z drenem Portex za pomocą dodatkowych odcinków drenu silikonowego i drenu PharMed; 3. Alternatywnie złożona kanula plastikowa; 4. Części tworzące kanulę plastikową: plastikowy cewnik 24G BD Insyte połączony drenem PharMed i osłonięty odciętym końcówką pipety 10 µl dla stabilności i łatwości chwytu. (C) Ilustracja etapów operacji Tx: 1. Sferoidy są zbierane do kanuli; 2. Rogówka zostaje nakłuta igłą; 3. Kanula zostaje wprowadzona do nacięcia, a sferoidy zostają uwolnione do ACE; 4. Z zewnątrz oka sferoidy są pozycjonowane blisko źrenicy i z dala od nacięcia. (D) Obrazy stereoskopowe sferoidów wątrobowych (sph) w oku myszy w dniu operacji oraz 3, 7 i 30 dni po Tx. Strzałki wskazują żywe sferoidy. (E) Stopień przyswajania sferoidów wątrobowych (wielkość 1200 komórek/studzienkę) po Tx, n= 9 oczu u 6 myszy biorców. (F) Wielkość sferoidów wątrobowych w hodowli przed transplantacją (in vitro, n= 20 sferoidów z jednej preparacji) oraz 1 miesiąc po Tx w ACE (in vivo, n= 16 sferoidów u 3 myszy biorców), obliczona poprzez uśrednienie średnic pionowych i poziomych. (G) Barwienie immunofluorescencyjne przyswojonych sferoidów wątrobowych 2 miesiące po Tx, wykazujące unaczynienie (CD31, różowy, linia przerywana wyznacza masę sferoidu) i unerwienie współczulne (tyrozynowa hydroksylaza (TH), pomarańczowy), pasek skali = 100 µm. Dane dla panelu F zostały zaadaptowane za zgodą Lazzeri-Barcelo i wsp.10. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Izolacja komórek wątroby, generowanie sferoidów, transplantacja, obrazowanie in vivo; mikroskopia fluorescencyjna.
Rysunek 3: Nieinwazyjne wewnątrzgałkowe obrazowanie in vivo przeszczepionych sferoidów wątrobowych. (A) Materiały i sprzęt użyte do obrazowania ACE in vivo: 1. Pionowy konfokalny mikroskop skaningowy; 2. Ciemnia; 3. Zmotoryzowany stół XYZ; 4. Obiektyw zanurzeniowy; 5. Uchwyt do głowy i maska gazowa; 6. Pinceta i sztywny przegub uniwersalny; 7. Mata grzewcza; 8. Specjalnie wykonana metalowa płyta podstawowa. (B) Schemat przedstawiający różne podejścia stosowane do obrazowania in vivo odczytów fluorescencyjnych w sferoidach wątrobowych przeszczepionych do oka. (C-H) Reprezentatywne obrazy sferoidów ACE-liver podczas obrazowania in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej. Sygnał rozproszonego światła jest wykorzystywany do obserwacji objętości i struktury sferoidu; (C) Naczynia krwionośne znakowane poprzez dożylną iniekcję fluorescencyjnej lektyny, pasek skali = 100 µm; (D) Sieć kanalików żółciowych znakowana poprzez iniekcję fluorescencyjnego CMFDA, pasek skali = 50 µm; (E) Pobieranie LDL poprzez iniekcję fluorescencyjnej sondy pHrodo-LDL, pasek skali = 100 µm; (F) Hepatocyty wykazujące ekspresję Td-Tomato, groty strzałek wskazują jądra, a gwiazdki wskazują unaczynienie wewnątrz sferoidu, pasek skali = 50 µm; (G) Monitorowanie dynamiki cyklu komórkowego w sferoidach wątrobowych wykazujących ekspresję FUCCI, paski skali = 50 µm (obraz główny) i 20 µm (powiększenie). (H) sferoidy wątrobowe transdukowane in vitro wirusem AAV8-GFP przed Tx i obrazowane w oku 6 miesięcy po Tx, pasek skali = 50 µm. Obraz w panelu G został dostosowany za zgodą Lazzeri-Barcelo i wsp.10. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 1: Roztwory stosowane do izolacji pierwotnych hepatocytów myszych. Skład roztworów i buforów niezbędnych do izolacji hepatocytów myszych. Składniki buforu do trawienia oraz roztworu gradientowego należy przygotować bezpośrednio w dniu izolacji. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2. Ustawienia mikroskopu konfokalnego Leica SP5 użyte do obrazowania in vivo wewnątrzgałkowego sferoidów wątroby. Tabela została opracowana za zgodą Lazzeri i wsp.10. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Protokół ten opisuje nowatorską platformę do wewnątrzgałkowego obrazowania in vivo sferoidów wątroby wszczepionych do ACE. ACE był wcześniej używany jako miejsce przeszczepu innych mikrotkanek pochodzących z narządów, takich jak wyspy trzustkowe11,12, ze względu na unikalne mikrośrodowisko wszczepienia, bogate w naczynia, nerwy i tlen oraz dostęp do obrazowania przez rogówkę. Podczas gdy obrazowanie wątroby w pozycji przyżyciowej umożliwia wizualizację komórek i procesów in situ, monitorowanie podłużne nie jest możliwe. Obrazowanie wątroby przez okno brzuszne wiąże się ze skomplikowaną operacją, a ruch narządu w ciele utrudnia śledzenie pojedynczych komórek w czasie. W związku z tym ta nowatorska metoda obrazowania umożliwia nieinwazyjne, podłużne monitorowanie komórek wątroby w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Protokół ten podzielony jest na trzy części. Pierwszym z nich jest izolacja pierwotnych hepatocytów za pomocą dwuetapowej perfuzji kolagenazy, zaadaptowanej z Charni-Natan i wsp.13, z tą różnicą, że perfuzję wątroby wykonujemy na martwej myszy zamiast na znieczulonych żywych zwierzętach. Ta odmiana niesie ze sobą pewne korzyści, takie jak mniej względów etycznych i unikanie pozostałości znieczulenia w organizmie. W tej pracy generujemy sferoidy wątroby z frakcji izolacji wzbogaconej w hepatocyty, ale nie wyklucza to możliwości izolowania innych populacji komórek niemiąższowych przy użyciu innych specjalistycznych protokołów w celu wytworzenia sferoid kokultury o zróżnicowanym składzie14,15.

Druga część tego protokołu polega na przeszczepieniu sferoid wątroby do ACE myszy biorców. Jest to szybka (poniżej 10 min) i prosta operacja wykonywana na znieczulonych myszach i nie wymaga żadnego leczenia pooperacyjnego. Nakłucie rogówki samoczynnie się uszczelnia i goi w ciągu 3-5 dni. Czasami podczas procesu gojenia obserwuje się pewne zmętnienie wokół nacięcia, ale ustępuje ono w ciągu kilku dni. Nie spotkaliśmy się z przypadkami synechii przedniej w oczach operowanych zwierząt. Zabiegi transplantacyjne wykonujemy w czystym, ale plenerowym laboratorium i bez problemów z infekcjami operowanych oczu. Zaszczepienie i wszczepienie sferoid do oka nie pogarsza widzenia ani nie zmienia zachowania zwierzęcia biorcy. W tym protokole stosujemy znieczulenie izofluranem zarówno do operacji transplantacji, jak i obrazowania in vivo , które jest dobrze tolerowane przez myszy. Ze względu na działanie zależne od dawki, można go łatwo dostosować w trakcie zabiegów i ma tę zaletę, że skraca czas snu i budzenia się. Można jednak zastosować alternatywne środki znieczulające do wstrzykiwań. Po przeszczepie zazwyczaj pozostawiamy 1 miesiąc na pełne wszczepienie sferoidów, unaczynienie i unerwienie, przed wykonaniem interwencji leczniczych i obrazowania in vivo . Wykazaliśmy również, że przeszczep i wszczepienie jest możliwe przy użyciu sferoid ludzkiej wątroby i myszy biorców z obniżoną odpornością10.

Trzecią częścią tej metody jest obrazowanie in vivo wszczepionych sferoid wątroby w ACE. Protokół ten opisuje konfigurację obrazowania in vivo , która wykorzystuje sprzęt mikroskopowy powszechnie spotykany w ośrodkach badawczych zajmujących się obrazowaniem. Co więcej, specjalistyczne materiały, takie jak uchwyt na głowę myszy i plastikowa kaniula, są teraz dostępne na rynku. Dzięki takiemu zestawowi obrazowania jesteśmy w stanie uchwycić przekroje z i uzyskać trójwymiarową rekonstrukcję architektury sferoidy, w zależności od głębokości penetracji lasera i detekcji fluorescencyjnej. Monitorowanie funkcji komórkowych w wszczepionych sferoidach wątroby opiera się na wizualizacji białek fluorescencyjnych, które informują o typach komórek, funkcjach komórkowych i dynamice. W związku z tym ta platforma obrazowania może być wykorzystywana przy użyciu różnych modalności, samodzielnie lub w połączeniu: (1) Sondy fluorescencyjne mogą być podawane dożylnie, np. przeciwciała do znakowania i śledzenia komórek, a także barwniki funkcjonalne; (2) Sferoidy wątroby mogą być generowane z komórek wyizolowanych z modeli myszy reporterowych, które wyrażają białka fluorescencyjne specyficzne dla wątroby, np. sferoidy wątroby FUCCI, które informują o dynamice cyklu komórkowego; (3) Tworzenie sferoid wątroby in vitro można połączyć z transfekcją lub transdukcją, aby wyposażyć sferoidy w białka fluorescencyjne i bioczujniki. np. wirusy związane z adenowirusami. W naszych warunkach eksperymentalnych i przy użyciu pojedynczego fotonu do wzbudzenia, możliwa do osiągnięcia głębokość obrazowania wynosi około 60-100 μm. Jest to jednak zależne od mocy lasera i dostępności obrazowania wielofotonowego, charakterystyki emisji sondy fluorescencyjnej i czułości detektorów, a także kąta oka, w którym wszczepiona jest sferoida. Po akwizycji obrazowej można przeprowadzić dalszą analizę obrazu za pomocą popularnych programów, takich jak Image J i Imaris. Na przykład w przypadku reportera FUCCI komórki aktywne cyklu komórkowego oznaczone kolorem zielonym mogą być policzone i porównane z całkowitą liczbą krwinek czerwonych, aby ocenić aktywność cyklu komórkowego w obrębie przeszczepionej sferoidy. Dodatkowo, platforma obrazowania ACE umożliwia nakładanie substancji do oka (w postaci kropli do oczu) lub wstrzykiwanie bezpośrednio do ACE w celu leczenia przeszczepu i monitorowania jego reakcji. Pośmiertnie przeszczepione sferoidy można łatwo odzyskać za pomocą ręcznej mikrodysekcji i mogą dostarczyć cennych informacji za pomocą technik ex vivo , takich jak barwienie immunofluorescencyjne, analiza transkryptomiczna itp.10.

Ta technika ma pewne ograniczenia. Po pierwsze, z naszego doświadczenia wynika, że myszy biorcy muszą być albinosami, czyli mieć niepigmentowaną tęczówkę. Po wszczepieniu sferoidy wątroby pokrywają się monowarstwą komórek tęczówki, co nie wpływa na żywotność ani funkcję sferoid, ale pigment w komórkach tęczówki uniemożliwia obrazowanie. Drugą kwestią jest stabilność podczas obrazowania wewnątrzgałkowego u znieczulonych myszy. Podczas sesji obrazowania in vivo stężenie znieczulenia i oddech zwierzęcia muszą być ściśle monitorowane, aby zminimalizować ruch. Niemniej jednak, korzystając ze wskazanych tutaj ustawień obrazowania, jesteśmy w stanie uzyskać obrazowanie w wysokiej rozdzielczości na poziomie pojedynczej komórki.

Podsumowując, protokół ten opisuje wdrożenie nieinwazyjnej platformy obrazowania in vivo tkanki podobnej do wątroby wszczepionej w oczy myszy. Używamy łatwych procedur, powszechnego sprzętu i niedrogich materiałów, dzięki czemu jest to osiągalne podejście dla wielu badaczy. Model ten łączy zalety sferoid wątroby 3D in vitro ze środowiskiem in vivo i dostępnością optyczną zapewnianą przez ACE, aby stworzyć cenną platformę do badania fizjologii i patologii wątroby w badaniach podstawowych i warunkach przedklinicznych.

Oświadczenia

P-OB jest współzałożycielem i dyrektorem generalnym Biocrine AB, IBL i BL są konsultantami Biocrine AB.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Szwedzkie Stowarzyszenie Diabetologiczne, Fundusze Karolinska Institutet, Szwedzką Radę ds. Badań, Fundację Novo Nordisk, Fundację Rodziny Erling-Persson, Strategiczny Program Badań nad Cukrzycą w Karolinska Institutet, Fundację Rodziny Knutów i Alice Wallenberg, Fundację Jonasa i Christiny af Jochnick, Szwedzkie Stowarzyszenie Diabetologiczne oraz ERC-2018-AdG 834860-EYELETS. Rysunki figur zostały stworzone przez FL-B przy użyciu BioRender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
27 G igła motylkowaVenofix4056388
AAV8-CAG-GFPCharles RiverCV17169-AV9inkubowana z izolowanymi hepatocytami w 1 &mikro; L/ml podczas tworzenia sferoidów wątroby
Absolutny i 70% etanolN/AN/A
Wkładka chłonnaUczestniczy203903
Albumin-Cre; RCL-tdPomidor (B6. Cg-Speer6-ps1Tg(Alb-cre)21Mgn/J ; Klasa B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)Jackson#003574 i #007914Myszy uzyskane z wewnętrznej hodowli
myszy albinosów B6 (B6(Cg)-Tyrc-2J/J)Jackson#000058Myszy uzyskane z hodowli wewnętrznej
B6; 129P2-GT(ROSA)26Sor[tm1(CAG-Venus/GMNN,-Cherry/CDT1)Jkn]/JknHINFRAFRONTIER/EMMAEM:08395Myszy uzyskane z własnej hodowli
Cewnik BD Insyte IV 24 G x 0,75 wstandardowych
Borosillikat World Precision Instruments1B150-4
Podnośnik komórekCorning3008
Sitko do komórek, 70 i mikro; mFalcon352350
Metalowa płyta na zamówienieSklep z narzędziamiNie dotyczy
Sigma-AldrichD4902
Dwustopniowy szklany ściągacz do mikropipetNarshigeModel PC-100
EDTASigma-AldrichE9884
Elektryczna poduszka grzewczaSklep z narzędziamiNie dotyczy
FBSGibcoN/A
g / mysz w PBS 10% FBS
Strzykawka HamiltonHamilton81242Model 1750 Strzykawka z gwintowanym tłokiem Luer Tip, 500 i mikro; L
HBSS; bez wapnia, bez magnezu i bez czerwieni fenolowejGibco14175095
HCX IRAPO L 25x/0.95 W obiektywLeicaN/A
HEPESGibco15630080
Komora indukcyjna 0.8 LUniventor8329001
Insulina-Transferyna-Selen (ITS-G)Gibco41400045
IsofluraneBaxterN/A
Lectin DyLight-649InvitrogenL32472podawany w dawce 1 mg/ml i 100 &mikro; L/mysz
Liberase TM Research GradeSigma-Aldrich5401127001
Ukosowarka mikroelektrodŚwiat Instrumenty precyzyjneModel BV-10
Uchwyt na głowę myszy i maska przeciwgazowaNarshigeModel SGM-4
Nunclon Sphera 96-dołkowa, mikropłytka w kształcie litery UThermo Fisher174929
Oculentum simplexAPLNie dotyczy
PBS 10xGibco14080055
PBS 1x; bez wapnia, bez magnezuGibco14190144
Penicylina-StreptomycynaGibco15140122
PercollSigma-AldrichP1644
Pompa perystaltycznaIsmatecModel ISM795
Przewody pompy PharMed BPTVWRVERN070540-07Średnica wewnętrzna 0,76 mm, średnica zewnętrzna 2,46 mm
pHrodo Red-LDLInvitrogenL34356Podaje się w dawce 1 mg/ml i 100 &mikro; L/mysz
Portex Rurki polietylenowe z drobnym otworemSmiths Medical800/100/140Średnica wewnętrzna 0,4 mm, średnica zewnętrzna 0,8 mm
Silikonowa mata preparcyjnaSklep z narzędziamiNie dotyczy
Chlorek sodu 0,9%BraunN/A
Solidny przegub uniwersalnyNarshigeModel UST-2
Mikroskop stereoskopowyLeicaModel M80
Naczynie do hodowli zawiesiny 35 mmSarstedt833900500
TemgesicIndivorN/Apodawane s.c. w stężeniach 0,05 mg/ml i 2 &mikro; Mysz L/g
Przezroczysta rurka silikonowaVWR228-1450Średnica wewnętrzna 1,5 mm, średnica zewnętrzna 3 mm
Trypan BlueSigma-AldrichT8154
Univentor 400 Jednostka anestezjologiczna Univentor8323001
Pionowy laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyLeicaModel TCS SP5 II
ViscotearsNovartisN/A
William's E Medium; bez glutaminy, czerwieni fenolowejGibco22551089
szklanych kaplarkach BD Medical 381212 Dexamethasone GlutaMAX Gibco 35050061 Green CMFDA Abcam ab145459 Rozpuszczony w DMSO, podawany w stężeniu 100 &mikro;

Bibliografia

  1. Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Sci Rep. 6, 25187(2016).
  2. Lauschke, V. M., et al. Massive rearrangements of cellular MicroRNA signatures are key drivers of hepatocyte dedifferentiation. Hepatology. 64 (5), 1743-1756 (2016).
  3. Oliva-Vilarnau, N., Vorrink, S. U., Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. A 3D cell culture model identifies Wnt/beta-catenin mediated inhibition of p53 as a critical step during human hepatocyte regeneration. Adv Sci (Weinh). 7 (15), 2000248(2020).
  4. Hurrell, T., et al. Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis. Cells. 9 (4), 964(2020).
  5. Kozyra, M., et al. Human hepatic 3D spheroids as a model for steatosis and insulin resistance. Sci Rep. 8 (1), 14297(2018).
  6. Lauschke, V. M., Shafagh, R. Z., Hendriks, D. F. G., Ingelman-Sundberg, M. 3D primary hepatocyte culture systems for analyses of liver diseases, drug metabolism, and toxicity: Emerging culture paradigms and applications. Biotechnol J. 14 (7), e1800347(2019).
  7. Shibuya, K., et al. The efficacy of the hepatocyte spheroids for hepatocyte transplantation. Cell Transplant. 30, 9636897211000014(2021).
  8. Hamazaki, K., Doi, Y., Koide, N. Microencapsulated multicellular spheroid of rat hepatocytes transplanted intraperitoneally after 90% hepatectomy. Hepatogastroenterology. 49 (48), 1514-1516 (2002).
  9. Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
  10. Lazzeri-Barcelo, F., et al. Intraocular liver spheroids for noninvasive high-resolution in vivo monitoring of liver cell function. Nat Commun. 15 (1), 767(2024).
  11. Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
  12. Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Intraocular in vivo imaging of pancreatic islet cell physiology/pathology. Mol Metab. 6 (9), 1002-1009 (2017).
  13. Charni-Natan, M., Goldstein, I. Protocol for Primary Mouse Hepatocyte Isolation. STAR protocols. 1 (2), 100086(2020).
  14. Baze, A., et al. Three-dimensional spheroid primary human hepatocytes in monoculture and coculture with nonparenchymal cells. Tissue Eng Part C Methods. 24 (9), 534-545 (2018).
  15. Mohar, I., Brempelis, K. J., Murray, S. A., Ebrahimkhani, M. R., Crispe, I. N. Isolation of nonparenchymal cells from the mouse liver. Methods Mol Biol. 1325, 3-17 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Obrazowanie nieinwazyjnemikroskopia konfokalnaobrazowanie podłużnesondy fluorescencyjneengraftment wątrobyrozdzielczość pojedynczej komórki
Obrazowanie in vivo sferoid wątroby wszczepionych do przedniej komory oka myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.