Kolonizacja ryzobakterii wspomagających wzrost roślin (PGPR) w ryzosferze jest niezbędna dla jej efektu stymulującego wzrost. Konieczne jest ujednolicenie metody wykrywania kolonizacji ryzosfery bakteryjnej. W tym miejscu opisujemy powtarzalną metodę ilościowego określania kolonizacji bakteryjnej na powierzchni korzenia.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiar kolonizacji bakteryjnej korzeni Arabidopsis thaliana w warunkach hydroponicznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pomiar kolonizacji bakteryjnej na korzeniu Arabidopsis thaliana jest jednym z najczęstszych eksperymentów w badaniach interakcji roślina-mikroorganizm. Ustandaryzowana metoda pomiaru kolonizacji bakteryjnej w ryzosferze jest niezbędna do poprawy odtwarzalności. Najpierw wyhodowaliśmy sterylną A. thaliana w warunkach hydroponicznych, a następnie zaszczepiliśmy komórki bakteryjne w ryzosferze przy końcowym stężeniu OD600 wynoszącym 0,01. Po 2 dniach od inokulacji tkanka korzenia została pobrana i trzykrotnie przemyta w sterylnej wodzie w celu usunięcia nieskolonizowanych komórek bakteryjnych. Korzenie zostały następnie zważone, a komórki bakteryjne skolonizowane na korzeniu zostały zebrane przez wir. Zawiesinę komórkową rozcieńczano w gradiacji buforem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS), a następnie posiewano na pożywce agarowej Luria-Bertani (LB). Płytki inkubowano w temperaturze 37 °C przez 10 godzin, a następnie pojedyncze kolonie na płytkach LB policzono i znormalizowano, aby wskazać komórki bakteryjne skolonizowane na korzeniach. Metoda ta służy do wykrywania kolonizacji bakteryjnej w ryzosferze w warunkach monooddziaływania, z dobrą odtwarzalnością.
Wprowadzenie
Istnieją ilościowe i jakościowe metody wykrywania kolonizacji ryzosfery przez pojedynczy szczep bakterii. W przypadku metody jakościowej należy użyć szczepu, który konstytutywnie wyraża fluorescencję, a rozkład i intensywność fluorescencji należy zbadać za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub laserowych instrumentów konfokalnych1,2. Strategie te mogą dobrze odzwierciedlać kolonizację bakteryjną in situ3, ale nie są tak dokładne, jak tradycyjne metody liczenia płytek w kwantyfikacji. Poza tym, ze względu na ograniczenie polegające na wyświetlaniu tylko częściowych stref korzeniowych pod mikroskopem, czasami może to mieć wpływ na subiektywne uprzedzenia.
Tutaj opisujemy metodę ilościową, która obejmuje zbieranie skolonizowanych komórek bakteryjnych i liczenie bakteryjnych CFU na talerzu. Metoda ta opiera się na rozcieńczaniu i posiewie, za pomocą którego można policzyć skolonizowane szczepy, które zostały usunięte z korzeni roślin, i obliczyć całkowitą liczbę skolonizowanych bakterii na korzeniu4,5.
Najpierw, A. thaliana została wyhodowana w warunkach hydroponicznych, a następnie komórki bakteryjne zostały zaszczepione w ryzosferze w końcowym stężeniu 0,01 OD600. Zainfekowane tkanki korzeni pobrano 2 dni po inokulacji i umyto w sterylnej wodzie w celu usunięcia nieskolonizowanych komórek bakteryjnych. Ponadto komórki bakteryjne skolonizowane na korzeniu zebrano, rozcieńczono w buforowanym fosforanem buforze soli fizjologicznej (PBS) i posiano na pożywce agarowej Luria-Bertani (LB). Po inkubacji w temperaturze 37 °C przez 10 godzin, pojedyncze kolonie na płytkach LB policzono i znormalizowano w celu określenia komórek bakteryjnych skolonizowanych na korzeniach.
Ta metoda jest wysoce przydatna, ma dobrą powtarzalność i jest bardziej odpowiednia do dokładnego określenia kolonizacji bakteryjnej ryzosfery.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Sterylna uprawa hydroponiczna A. thaliana
- Przygotuj sadzonki A. thaliana.
- Przygotować pożywkę z siewek A. thaliana, która składa się z 1/2 MS pożywki (Murashige i Skoog) z 2% (wag./obj.) sacharozy i 0,9% (wag./obj.) agaru.
- Wlej przygotowaną pożywkę sterylizacyjną do sterylnych kwadratowych szalek Petriego (13 cm x 13 cm) przed zestaleniem. Unikaj suszenia powietrzem, aby utrzymać wilgotność.
- Zanurzyć nasiona A. thaliana w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml wypełnionej 1 ml sterylnej wody o temperaturze 4 °C na ponad 12 godzin, a następnie sterylizować nasiona 1 ml 2% (obj./obj.) NaClO przez 2 min.
- Dokładnie umyj nasiona sterylną wodą sześć razy, aby usunąć roztwór NaClO. Zasiej nasiona na szalkach Petriego za pomocą pożywki agarowej MS ze sterylną końcówką o pojemności 1 ml.
- Uszczelnij szalki Petriego oddychającą taśmą medyczną i umieść je pionowo w lekkim inkubatorze, aby rosły przez 1 tydzień. Ustaw stosunek dzień/noc inkubatora światła na 16 h/8 h, utrzymuj temperaturę na poziomie 23 °C i wilgotność na poziomie 40%-60%.
- Przeszczep A. thaliana.
- Wytnij 5 mm otwory w barwniku komórkowym o wielkości porów 40 μm i wysterylizuj je.
- Przesadź trzy 7-dniowe rośliny A. thaliana przez otwory sitka komórkowego i umieść je na 6-dołkowej płytce zawierającej 3 ml sterylnego płynu 1/2 MS pożywki z 0,5% sacharozy.
- Umieść 6-dołkowe płytki w lekkim inkubatorze (Rysunek 1A) i inkubuj przez 10 dni.
2. Hodowla i inokulacja bakterii
- Przygotować zawiesinę bakteryjną do inokulacji.
- W przypadku Bacillus velezensis zaszczepić komórki bakteryjne w sterylnym podłożu LB i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 170 obr./min, aż osiągnie OD600 0,8-1,2.
- Zebrać komórki bakteryjne przez odwirowanie przy 6000 x g przez 2 minuty i ponownie zawiesić komórki w buforze PBS (2 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4, 136 mM NaCl, 2,6 mM KCl). Powtórz etapy wirowania i ponownego zawieszania 3 razy, aby usunąć pożywkę LB i metabolity bakteryjne.
- Zawiesić komórki bakteryjne w świeżej pożywce 1/2 MS o końcowym stężeniu OD600 0,01. Zaszczepić zawiesiny bakterii na 6-dołkowych płytkach, na których rosną siewki A. thaliana, umieścić 6-dołkowe płytki w inkubatorze światła i hodować je przez 2 dni.
3. Pomiar bakterii skolonizowanych na korzeniach
- Zbierz tkankę korzenia i pokryj płytki skolonizowanymi komórkami.
UWAGA: Wszystkie kroki powinny być wykonywane w warunkach gnotobiotycznych- Zważyć probówki o pojemności 2 ml i zapisać masę jako W0.
- Zbierz współhodowane tkanki korzenia A. thaliana i umyj je 3 razy w sterylnej wodzie. Umieść korzeń na bibule filtracyjnej, aby usunąć nadmiar wody.
- Umieść korzeń w zważonej probówce do mikrowirówki, zważ korzenie razem z probówką i zapisz go jako W1.
- Dodaj 1 ml PBS do każdej probówki i wiruj probówki przez 8 minut z maksymalną prędkością.
- Rozcieńczyć zawiesiny zebranymi komórkami bakteryjnymi skolonizowanymi przez korzeń do 1 x 10-1-1 x 10-4 (zgodnie ze zdolnością kolonizacji bakterii). Rozcieńczone zawiesiny bakteryjne rozprowadzić na płytkach zawierających podłoże agarowe LB i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 godzin.
- Policz kolonie i znormalizuj dane.
- Policz kolonie bakterii na płytkach LB.
- Obliczyć jtk jtk zgodnie z odpowiednim rozcieńczeniem i znormalizować dane za pomocą świeżej masy korzenia (W1-W 0). Końcowe wyniki wskazują na liczbę komórek bakteryjnych skolonizowanych na gram korzenia w 2 dni po inokulacji (Rysunek 1B).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby przetestować dokładność wykrywania zdolności kolonizacji bakterii w ryzosferze A. thaliana za pomocą tej metody, zaszczepiliśmy osobno w ryzosferze A. thaliana szczep dziki Bacillus velezensis SQR9 oraz pochodną mutantę Δ8mcp. Mutanta Δ8mcp jest mutantą pozbawioną wszystkich genów kodujących chemoreceptory, co skutkuje znacznym zmniejszeniem kolonizacji6. Po 2 dniach od inokulacji zmierzyliśmy stopień ich kolonizacji, stosując opisany tutaj test kol...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Aby osiągnąć dobrą odtwarzalność, istnieją cztery krytyczne etapy procesu wykrywania kolonizacji tego protokołu. Po pierwsze, należy upewnić się, że liczba zaszczepionych komórek bakteryjnych jest dokładnie taka sama w każdym eksperymencie. Po drugie, konieczne jest również kontrolowanie intensywności czyszczenia nieskolonizowanych bakterii sterylną wodą. Po trzecie, każdy proces rozcieńczania próbki musi być wirowany przed wykonaniem, aby próbka mogła być w stanie całkowitego wymieszania, aby uniknąć błędów wchłaniania ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów z treścią niniejszego artykułu.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32370135), Program Innowacji Chińskiej Akademii Nauk Rolniczych (CAAS-CSAL-202302), Projekt Naukowo-Technologiczny Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry (2021kj29).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Płytka 6-dołkowa | Corning | 3516 | |
| Barwnik do komórek filtracyjnych | Solarbio | F8200-40µ m | |
| Czytnik mikropłytek | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Murashige i Skoog medium | Hopebio | HB8469-5 | |
| NaClO | Alfa | L14709 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Kwadratowa szalka Petriego | Ruiai Zhengte | PYM-130 | |
| Vortex Genie2 | Scientific Industries | G560E |
Bibliografia
- Wang, B., Wan, C., Zeng, H. Colonization on cotton plants with a GFP labeled strain of Bacillus axarquiensis. Curr Microbiol. 77 (10), 3085-3094 (2020).
- Zhai, Z., et al. A genetic tool for production of GFP-expressing Rhodopseudomonaspalustris for visualization of bacterial colonization. AMB Express. 9 (1), 141(2019).
- Synek, L., Rawat, A., L'Haridon, F., Weisskopf, L., Saad, M. M., Hirt, H. Multiple strategies of plant colonization by beneficial endophytic Enterobacter sp. SA187. Environ Microbiol. 23 (10), 6223-6240 (2021).
- Zhang, H., et al. Bacillus velezensis tolerance to the induced oxidative stress in root colonization contributed by the two-component regulatory system sensor ResE. Plant Cell Environ. 44 (9), 3094-3102 (2021).
- Liu, Y., et al. Plant commensal type VII secretion system causes iron leakage from roots to promote colonization. Nat Microbiol. 8 (8), 1434-1449 (2023).
- Feng, H., et al. Identification of chemotaxis compounds in root exudates and their sensing chemoreceptors in plant-growth-promoting Rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQR9. Mol Plant Microbe Interact. 31, 995-1005 (2018).
- Woo, S. L., Hermosa, R., Lorito, M., Monte, E. Trichoderma: a multipurpose, plant-beneficial microorganism for eco-sustainable agriculture. Nat Rev Microbiol. 21 (5), 312-326 (2023).
- Nongkhlaw, F. M., Joshi, S. R. Microscopic study on colonization and antimicrobial property of endophytic bacteria associated with ethnomedicinal plants of Meghalaya. J Microsc Ultrastruct. 5 (3), 132-139 (2017).
- Ravelo-Ortega, G., Raya-González, J., López-Bucio, J. Compounds from rhizosphere microbes that promote plant growth. Curr Opin Plant Biol. 73, 1369-5266 (2023).
- Schulz-Bohm, K., Gerards, S., Hundscheid, M., Melenhorst, J., de Boer, W., Garbeva, P. Calling from distance: attraction of soil bacteria by plant root volatiles. ISME J. 12 (5), 1252-1262 (2018).
- Sharifi, R., Lee, S. M., Ryu, C. M. Microbe-induced plant volatiles. New Phytol. 220 (3), 684-691 (2018).
- Eckshtain-Levi, N., Harris, S. L., Roscios, R. Q., Shank, E. A. Bacterial community members increase Bacillus subtilis maintenance on the roots of Arabidopsis thaliana. Phytobiomes J. 4, 303-313 (2020).
- Liu, Y., et al. Root colonization by beneficial rhizobacteria. FEMS Microbiol Rev. 48, (2024).
- Yahya, M., et al. Differential root exudation and architecture for improved growth of wheat mediated by phosphate solubilizing bacteria. Front Microbiol. 12, 744094(2021).
- Husna, K. B. -E., Won, M. -H., Jeong, M. -I., Oh, K. -K., Park, D. S. Characterization and genomic insight of surfactin-producing Bacillus velezensis and its biocontrol potential against pathogenic contamination in lettuce hydroponics. Environ Sci Pollut Res Int. 30 (58), 121487-121500 (2023).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
