Pomiar kolonizacji bakteryjnej korzeni Arabidopsis thaliana w warunkach hydroponicznych

Podsumowanie

Kolonizacja ryzobakterii wspomagających wzrost roślin (PGPR) w ryzosferze jest niezbędna dla jej efektu stymulującego wzrost. Konieczne jest ujednolicenie metody wykrywania kolonizacji ryzosfery bakteryjnej. W tym miejscu opisujemy powtarzalną metodę ilościowego określania kolonizacji bakteryjnej na powierzchni korzenia.

Streszczenie

Pomiar kolonizacji bakteryjnej na korzeniu Arabidopsis thaliana jest jednym z najczęstszych eksperymentów w badaniach interakcji roślina-mikroorganizm. Ustandaryzowana metoda pomiaru kolonizacji bakteryjnej w ryzosferze jest niezbędna do poprawy odtwarzalności. Najpierw wyhodowaliśmy sterylną A. thaliana w warunkach hydroponicznych, a następnie zaszczepiliśmy komórki bakteryjne w ryzosferze przy końcowym stężeniu OD₆₀₀ wynoszącym 0,01. Po 2 dniach od inokulacji tkanka korzenia została pobrana i trzykrotnie przemyta w sterylnej wodzie w celu usunięcia nieskolonizowanych komórek bakteryjnych. Korzenie zostały następnie zważone, a komórki bakteryjne skolonizowane na korzeniu zostały zebrane przez wir. Zawiesinę komórkową rozcieńczano w gradiacji buforem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS), a następnie posiewano na pożywce agarowej Luria-Bertani (LB). Płytki inkubowano w temperaturze 37 °C przez 10 godzin, a następnie pojedyncze kolonie na płytkach LB policzono i znormalizowano, aby wskazać komórki bakteryjne skolonizowane na korzeniach. Metoda ta służy do wykrywania kolonizacji bakteryjnej w ryzosferze w warunkach monooddziaływania, z dobrą odtwarzalnością.

Wprowadzenie

Istnieją ilościowe i jakościowe metody wykrywania kolonizacji ryzosfery przez pojedynczy szczep bakterii. W przypadku metody jakościowej należy użyć szczepu, który konstytutywnie wyraża fluorescencję, a rozkład i intensywność fluorescencji należy zbadać za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub laserowych instrumentów konfokalnych^1,2. Strategie te mogą dobrze odzwierciedlać kolonizację bakteryjną in situ³, ale nie są tak dokładne, jak tradycyjne metody liczenia płytek w kwantyfikacji. Poza tym, ze względu na ograniczenie polegające na wyświetlaniu tylko częściowych stref korzeniowych pod mikroskopem, czasami może to mieć wpływ na subiektywne uprzedzenia.

Tutaj opisujemy metodę ilościową, która obejmuje zbieranie skolonizowanych komórek bakteryjnych i liczenie bakteryjnych CFU na talerzu. Metoda ta opiera się na rozcieńczaniu i posiewie, za pomocą którego można policzyć skolonizowane szczepy, które zostały usunięte z korzeni roślin, i obliczyć całkowitą liczbę skolonizowanych bakterii na korzeniu^4,5.

Najpierw, A. thaliana została wyhodowana w warunkach hydroponicznych, a następnie komórki bakteryjne zostały zaszczepione w ryzosferze w końcowym stężeniu 0,01 OD₆₀₀. Zainfekowane tkanki korzeni pobrano 2 dni po inokulacji i umyto w sterylnej wodzie w celu usunięcia nieskolonizowanych komórek bakteryjnych. Ponadto komórki bakteryjne skolonizowane na korzeniu zebrano, rozcieńczono w buforowanym fosforanem buforze soli fizjologicznej (PBS) i posiano na pożywce agarowej Luria-Bertani (LB). Po inkubacji w temperaturze 37 °C przez 10 godzin, pojedyncze kolonie na płytkach LB policzono i znormalizowano w celu określenia komórek bakteryjnych skolonizowanych na korzeniach.

Ta metoda jest wysoce przydatna, ma dobrą powtarzalność i jest bardziej odpowiednia do dokładnego określenia kolonizacji bakteryjnej ryzosfery.

Protokół

1. Sterylna uprawa hydroponiczna A. thaliana

1. Przygotuj sadzonki A. thaliana.
   1. Przygotować pożywkę z siewek A. thaliana, która składa się z 1/2 MS pożywki (Murashige i Skoog) z 2% (wag./obj.) sacharozy i 0,9% (wag./obj.) agaru.
   2. Wlej przygotowaną pożywkę sterylizacyjną do sterylnych kwadratowych szalek Petriego (13 cm x 13 cm) przed zestaleniem. Unikaj suszenia powietrzem, aby utrzymać wilgotność.
   3. Zanurzyć nasiona A. thaliana w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml wypełnionej 1 ml sterylnej wody o temperaturze 4 °C na ponad 12 godzin, a następnie sterylizować nasiona 1 ml 2% (obj./obj.) NaClO przez 2 min.
   4. Dokładnie umyj nasiona sterylną wodą sześć razy, aby usunąć roztwór NaClO. Zasiej nasiona na szalkach Petriego za pomocą pożywki agarowej MS ze sterylną końcówką o pojemności 1 ml.
   5. Uszczelnij szalki Petriego oddychającą taśmą medyczną i umieść je pionowo w lekkim inkubatorze, aby rosły przez 1 tydzień. Ustaw stosunek dzień/noc inkubatora światła na 16 h/8 h, utrzymuj temperaturę na poziomie 23 °C i wilgotność na poziomie 40%-60%.
2. Przeszczep A. thaliana.
   1. Wytnij 5 mm otwory w barwniku komórkowym o wielkości porów 40 μm i wysterylizuj je.
   2. Przesadź trzy 7-dniowe rośliny A. thaliana przez otwory sitka komórkowego i umieść je na 6-dołkowej płytce zawierającej 3 ml sterylnego płynu 1/2 MS pożywki z 0,5% sacharozy.
   3. Umieść 6-dołkowe płytki w lekkim inkubatorze (Rysunek 1A) i inkubuj przez 10 dni.

2. Hodowla i inokulacja bakterii

1. Przygotować zawiesinę bakteryjną do inokulacji.
   1. W przypadku Bacillus velezensis zaszczepić komórki bakteryjne w sterylnym podłożu LB i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 170 obr./min, aż osiągnie OD₆₀₀ 0,8-1,2.
   2. Zebrać komórki bakteryjne przez odwirowanie przy 6000 x g przez 2 minuty i ponownie zawiesić komórki w buforze PBS (2 mM KH₂PO₄, 8 mM Na₂HPO₄, 136 mM NaCl, 2,6 mM KCl). Powtórz etapy wirowania i ponownego zawieszania 3 razy, aby usunąć pożywkę LB i metabolity bakteryjne.
   3. Zawiesić komórki bakteryjne w świeżej pożywce 1/2 MS o końcowym stężeniu OD₆₀₀ 0,01. Zaszczepić zawiesiny bakterii na 6-dołkowych płytkach, na których rosną siewki A. thaliana, umieścić 6-dołkowe płytki w inkubatorze światła i hodować je przez 2 dni.

3. Pomiar bakterii skolonizowanych na korzeniach

1. Zbierz tkankę korzenia i pokryj płytki skolonizowanymi komórkami.
   UWAGA: Wszystkie kroki powinny być wykonywane w warunkach gnotobiotycznych
   1. Zważyć probówki o pojemności 2 ml i zapisać masę jako W₀.
   2. Zbierz współhodowane tkanki korzenia A. thaliana i umyj je 3 razy w sterylnej wodzie. Umieść korzeń na bibule filtracyjnej, aby usunąć nadmiar wody.
   3. Umieść korzeń w zważonej probówce do mikrowirówki, zważ korzenie razem z probówką i zapisz go jako W₁.
   4. Dodaj 1 ml PBS do każdej probówki i wiruj probówki przez 8 minut z maksymalną prędkością.
   5. Rozcieńczyć zawiesiny zebranymi komórkami bakteryjnymi skolonizowanymi przez korzeń do 1 x ^10-1-1 x ^10-4 (zgodnie ze zdolnością kolonizacji bakterii). Rozcieńczone zawiesiny bakteryjne rozprowadzić na płytkach zawierających podłoże agarowe LB i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 godzin.
2. Policz kolonie i znormalizuj dane.
   1. Policz kolonie bakterii na płytkach LB.
   2. Obliczyć jtk jtk zgodnie z odpowiednim rozcieńczeniem i znormalizować dane za pomocą świeżej masy korzenia (W_{1-W 0}). Końcowe wyniki wskazują na liczbę komórek bakteryjnych skolonizowanych na gram korzenia w 2 dni po inokulacji (Rysunek 1B).

Wyniki

Aby przetestować dokładność wykrywania zdolności kolonizacji bakterii w ryzosferze A. thaliana za pomocą tej metody, zaszczepiliśmy osobno w ryzosferze A. thaliana szczep dziki Bacillus velezensis SQR9 oraz pochodną mutantę Δ8mcp. Mutanta Δ8mcp jest mutantą pozbawioną wszystkich genów kodujących chemoreceptory, co skutkuje znacznym zmniejszeniem kolonizacji⁶. Po 2 dniach od inokulacji zmierzyliśmy stopień ich kolonizacji, stosując opisany tutaj test kolonizacji korzeni. Wyniki wykazały istotną redukcję kolonizacji korzeni przez mutantę Δ8mcp, co wskazuje, że zastosowane warunki i metoda skutecznie mierzą kolonizację bakterii (Rycina 1C).

Rysunek 1: Wzrost A. thaliana oraz kolonizacja korzeni przez Bacillus velezensis SQR9 i Δ8mcp. (A) Widok z góry na 7-dniowe rośliny A. thaliana rosnące w płytkach 6-dołkowych z barwnikiem komórkowym w warunkach hydroponicznych. (B) Widok z boku na 7-dniowe rośliny A. thaliana rosnące w płytkach 6-dołkowych, gdzie każdy dołek zawiera 3 siewki. (C) Kolonizacja przez szczep dziki B. velezensis SQR9 oraz Δ8mcp zmierzona przy użyciu przedstawionego testu. Wykonano sześć powtórzeń, a dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Aby osiągnąć dobrą odtwarzalność, istnieją cztery krytyczne etapy procesu wykrywania kolonizacji tego protokołu. Po pierwsze, należy upewnić się, że liczba zaszczepionych komórek bakteryjnych jest dokładnie taka sama w każdym eksperymencie. Po drugie, konieczne jest również kontrolowanie intensywności czyszczenia nieskolonizowanych bakterii sterylną wodą. Po trzecie, każdy proces rozcieńczania próbki musi być wirowany przed wykonaniem, aby próbka mogła być w stanie całkowitego wymieszania, aby uniknąć błędów wchłaniania spowodowanych charakterystyką bakterii, które łatwo zatopić w probówce mikrowirówkowej. Dlatego zalecamy użycie przyrządu wirowego do mieszania zawiesiny bakteryjnej przed każdym wchłonięciem. Po czwarte, podczas wszystkich operacji wykonywanych tą metodą należy ściśle zapewnić aseptykę, aby uniknąć jakiejkolwiek możliwości zanieczyszczenia.

Ta metoda służy do określenia bakterii skolonizowanych na powierzchni korzenia. Oprócz bakterii powierzchniowych korzeni, bakterie endofityczne i grzyby również kolonizują ryzosferę^{rośliny 7}. Zdolność kolonizacyjną bakterii endofitycznych można nadal wykryć za pomocą protokołu opisanego w tym artykule, ale tkanka korzeniowa powinna zostać zmielona w celu uwolnienia bakterii endofitycznych. Jednak grzyby endofityczne różnią się od bakterii. Większość metod głównego nurtu wykorzystuje transmisyjną mikroskopię elektronową (TEM) do obserwacji wzrostu strzępek, która jest jakościową metodą wykrywania podobną do znakowania fluorescencyjnego bakterii do wizualizacji⁸.

Porównując kolonizację różnych szczepów, nie należy ich zaszczepiać na jednej płytce 6-dołkowej, aby uniknąć wpływu bakteryjnych związków lotnych⁹ i roślinnych związków lotnych^10,11. Wybraliśmy 2-dniowy okres po inokulacji do wykrycia korzenia, ponieważ kolonizacja SQR9 osiągnęła maksimum między 2 a 4 dniami; Czas wykrywania kolonizacji bakteryjnej można dostosować w zależności od szczepów.

W porównaniu z innymi opisanymi metodami, ta metoda jest dokładna i łatwa w obsłudze. Na przykład metoda opisana przez Noama i wsp. polega na tym, że rzodkiewnik z hodowli w postaci stałej jest zaszczepiany bakteriami natychmiast po przesadzeniu do warunków hydroponicznych^12,13. W tym przypadku proponujemy, aby bakterie zostały zaszczepione do ryzosfery po kilku dniach od przesadzenia, aby uniknąć wpływu adaptacji roślin do zmienionego środowiska wzrostu. Metoda opisana w tym badaniu jest również dobra dla roślin do uwalniania wysięku korzeniowego, który wpływa na kolonizację.

Aby pędy roślin rosły oddzielnie w powietrzu i całkowicie z dala od zanurzenia w cieczy, dokonaliśmy kilku drobnych modyfikacji i obróbki na barwierce komórek, aby udostępnić je dla tej metody hydroponicznej. Co więcej, metoda ta jest bardziej odpowiednia do dokładnego oznaczania kolonizacji bakteryjnej w małych ilościach, ale nie do dużych ilości wysięków korzeniowych zebranych w hydrokulturze¹⁴. Należy zauważyć, że metoda ta jest modyfikowana na podstawie wcześniej opublikowanych badań 12,14,15.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytka 6-dołkowa	Corning	3516
Barwnik do komórek filtracyjnych	Solarbio	F8200-40µ m
Czytnik mikropłytek	Tecan	Infinite M200 PRO
Murashige i Skoog medium	Hopebio	HB8469-5
NaClO	Alfa	L14709
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
Kwadratowa szalka Petriego	Ruiai Zhengte	PYM-130
Vortex Genie2	Scientific Industries	G560E