Pomiar kolonizacji bakteryjnej korzeni Arabidopsis thaliana w warunkach hydroponicznych

Istnieją ilościowe i jakościowe metody wykrywania kolonizacji ryzosfery przez pojedynczy szczep bakterii. W przypadku metody jakościowej należy użyć szczepu, który konstytutywnie wyraża fluorescencję, a rozkład i intensywność fluorescencji należy zbadać za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub laserowych instrumentów konfokalnych^1,2. Strategie te mogą dobrze odzwierciedlać kolonizację bakteryjną in situ³, ale nie są tak dokładne, jak tradycyjne metody liczenia płytek w kwantyfikacji. Poza tym, ze względu na ograniczenie polegające na wyświetlaniu tylko częściowych stref korzeniowych pod mikroskopem, czasami może to mieć wpływ na subiektywne uprzedzenia.

Tutaj opisujemy metodę ilościową, która obejmuje zbieranie skolonizowanych komórek bakteryjnych i liczenie bakteryjnych CFU na talerzu. Metoda ta opiera się na rozcieńczaniu i posiewie, za pomocą którego można policzyć skolonizowane szczepy, które zostały usunięte z korzeni roślin, i obliczyć całkowitą liczbę skolonizowanych bakterii na korzeniu^4,5.

Najpierw, A. thaliana została wyhodowana w warunkach hydroponicznych, a następnie komórki bakteryjne zostały zaszczepione w ryzosferze w końcowym stężeniu 0,01 OD₆₀₀. Zainfekowane tkanki korzeni pobrano 2 dni po inokulacji i umyto w sterylnej wodzie w celu usunięcia nieskolonizowanych komórek bakteryjnych. Ponadto komórki bakteryjne skolonizowane na korzeniu zebrano, rozcieńczono w buforowanym fosforanem buforze soli fizjologicznej (PBS) i posiano na pożywce agarowej Luria-Bertani (LB). Po inkubacji w temperaturze 37 °C przez 10 godzin, pojedyncze kolonie na płytkach LB policzono i znormalizowano w celu określenia komórek bakteryjnych skolonizowanych na korzeniach.

Ta metoda jest wysoce przydatna, ma dobrą powtarzalność i jest bardziej odpowiednia do dokładnego określenia kolonizacji bakteryjnej ryzosfery.

1. Sterylna uprawa hydroponiczna A. thaliana

1. Przygotuj sadzonki A. thaliana.
   1. Przygotować pożywkę z siewek A. thaliana, która składa się z 1/2 MS pożywki (Murashige i Skoog) z 2% (wag./obj.) sacharozy i 0,9% (wag./obj.) agaru.
   2. Wlej przygotowaną pożywkę sterylizacyjną do sterylnych kwadratowych szalek Petriego (13 cm x 13 cm) przed zestaleniem. Unikaj suszenia powietrzem, aby utrzymać wilgotność.
   3. Zanurzyć nasiona A. thaliana w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml wypełnionej 1 ml sterylnej wody o temperaturze 4 °C na ponad 12 godzin, a następnie sterylizować nasiona 1 ml 2% (obj./obj.) NaClO przez 2 min.
   4. Dokładnie umyj nasiona sterylną wodą sześć razy, aby usunąć roztwór NaClO. Zasiej nasiona na szalkach Petriego za pomocą pożywki agarowej MS ze sterylną końcówką o pojemności 1 ml.
   5. Uszczelnij szalki Petriego oddychającą taśmą medyczną i umieść je pionowo w lekkim inkubatorze, aby rosły przez 1 tydzień. Ustaw stosunek dzień/noc inkubatora światła na 16 h/8 h, utrzymuj temperaturę na poziomie 23 °C i wilgotność na poziomie 40%-60%.
2. Przeszczep A. thaliana.
   1. Wytnij 5 mm otwory w barwniku komórkowym o wielkości porów 40 μm i wysterylizuj je.
   2. Przesadź trzy 7-dniowe rośliny A. thaliana przez otwory sitka komórkowego i umieść je na 6-dołkowej płytce zawierającej 3 ml sterylnego płynu 1/2 MS pożywki z 0,5% sacharozy.
   3. Umieść 6-dołkowe płytki w lekkim inkubatorze (Rysunek 1A) i inkubuj przez 10 dni.

2. Hodowla i inokulacja bakterii

1. Przygotować zawiesinę bakteryjną do inokulacji.
   1. W przypadku Bacillus velezensis zaszczepić komórki bakteryjne w sterylnym podłożu LB i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 170 obr./min, aż osiągnie OD₆₀₀ 0,8-1,2.
   2. Zebrać komórki bakteryjne przez odwirowanie przy 6000 x g przez 2 minuty i ponownie zawiesić komórki w buforze PBS (2 mM KH₂PO₄, 8 mM Na₂HPO₄, 136 mM NaCl, 2,6 mM KCl). Powtórz etapy wirowania i ponownego zawieszania 3 razy, aby usunąć pożywkę LB i metabolity bakteryjne.
   3. Zawiesić komórki bakteryjne w świeżej pożywce 1/2 MS o końcowym stężeniu OD₆₀₀ 0,01. Zaszczepić zawiesiny bakterii na 6-dołkowych płytkach, na których rosną siewki A. thaliana, umieścić 6-dołkowe płytki w inkubatorze światła i hodować je przez 2 dni.

3. Pomiar bakterii skolonizowanych na korzeniach

1. Zbierz tkankę korzenia i pokryj płytki skolonizowanymi komórkami.
   UWAGA: Wszystkie kroki powinny być wykonywane w warunkach gnotobiotycznych
   1. Zważyć probówki o pojemności 2 ml i zapisać masę jako W₀.
   2. Zbierz współhodowane tkanki korzenia A. thaliana i umyj je 3 razy w sterylnej wodzie. Umieść korzeń na bibule filtracyjnej, aby usunąć nadmiar wody.
   3. Umieść korzeń w zważonej probówce do mikrowirówki, zważ korzenie razem z probówką i zapisz go jako W₁.
   4. Dodaj 1 ml PBS do każdej probówki i wiruj probówki przez 8 minut z maksymalną prędkością.
   5. Rozcieńczyć zawiesiny zebranymi komórkami bakteryjnymi skolonizowanymi przez korzeń do 1 x ^10-1-1 x ^10-4 (zgodnie ze zdolnością kolonizacji bakterii). Rozcieńczone zawiesiny bakteryjne rozprowadzić na płytkach zawierających podłoże agarowe LB i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 godzin.
2. Policz kolonie i znormalizuj dane.
   1. Policz kolonie bakterii na płytkach LB.
   2. Obliczyć jtk jtk zgodnie z odpowiednim rozcieńczeniem i znormalizować dane za pomocą świeżej masy korzenia (W_{1-W 0}). Końcowe wyniki wskazują na liczbę komórek bakteryjnych skolonizowanych na gram korzenia w 2 dni po inokulacji (Rysunek 1B).

Aby przetestować dokładność zdolności kolonizacji bakterii wykrytej tą metodą w ryzosferze A. thaliana, zaszczepiliśmy Bacillus velezensis SQR9 WT i pochodną mutację Δ8mcp do ryzosfery A. thaliana oddzielnie. Δ8mcp jest mutantem, który nie ma wszystkich genów kodujących chemoreceptory i ma znacznie zmniejszoną kolonizację6. Zmierzyliśmy ich kolonizację 2 dni po inokulacji za pomocą obecnego testu kolonizacji korzeni. Wyniki wykazały znaczne zmniejszenie kolonizacji korzeni Δ8mcp, co wskazuje, że ten warunek i metoda skutecznie mierzą kolonizację bakterii (Rysunek 1C).

Rysunek 1: Uprawa A. thaliana i kolonizacja korzeni Bacillus velezensis SQR9 i Δ8mcp. (A) Widok z góry na 7-dniową A. thaliana rosnącą na 6-dołkowych płytkach z barwnikiem komórkowym w stanie hydroponicznym. (B) Widok z boku na 7-dniową A. thaliana rosnącą na płytkach 6-dołkowych, z których każda zawiera 3 siewki. (C) Kolonizacja B. velezensis typu dzikiego SQR9 i Δ8mcp mierzona przy użyciu przedstawionego testu. Uwzględniono sześć powtórzeń, a dane są prezentowane jako średnia ± SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów z treścią niniejszego artykułu.