Wykorzystanie systemu perfuzji tkanek in vitro do wykrywania czynności funkcjonalnych izolowanych rurek jelitowych w czasie rzeczywistym

Summary

Prezentujemy metodę izolowania rurki jelitowej szczurów i oceny wpływu leków na ich napięcie, częstotliwość i amplitudę in vitro. Metoda ta stanowi cenne podejście dla naukowców badających rurki jelitowe.

Abstract

Choroby przewodu pokarmowego, które występują często, stanowią poważne wyzwanie dla ludzi. Jelito cienkie jest integralną częścią trawienia i wchłaniania pokarmów i leków oraz odgrywa kluczową rolę w leczeniu tych chorób. Eksperyment z ruchem rurki jelitowej, powszechna i niezbędna metoda in vitro, jest wykorzystywany do badania dynamiki przewodu pokarmowego. Obejmuje to przygotowanie izolowanej rurki jelitowej, a także zawieszenie przygotowanej rurki jelitowej w kąpieli i podłączenie jej do detektora sygnału. Następnie rejestruje się i analizuje szereg parametrów, takich jak napięcie, które można wykorzystać do oceny funkcji motorycznej jelit, a także rozważania dotyczące utrzymania aktywności cewy jelitowej in vitro. Ustandaryzowany program od pobrania próbki do zebrania danych znacznie poprawia powtarzalność danych eksperymentalnych i zapewnia autentyczność zapisu napięcia jelitowego po interwencji fizjologicznej, patologicznej i farmakologicznej. W tym miejscu przedstawiamy kluczowe problemy w eksploatacji eksperymentalnej oraz cenny referencyjny protokół eksperymentalny do badania leków regulujących motorykę przewodu pokarmowego.

Introduction

Choroby przewodu pokarmowego, powszechne schorzenie, mają poważny wpływ na życie i zdrowie ludzi¹. Zaburzenia motoryki przewodu pokarmowego są ważną częścią funkcjonalnych chorób przewodu pokarmowego, objawiającą się przede wszystkim wyniszczającymi objawami, opóźnionym opróżnianiem żołądka i poważnymi problemami gastrycznymi². Może zaburzać koordynację żołądkowo-jelitową, utrudniać opróżnianie żołądka, wpływać na jelitową nietolerancję pokarmową, a nawet powodować funkcjonalną niedrożność w jelicie cienkim lub grubym³. U pacjentów poddawanych zabiegom chirurgicznym przewodu pokarmowego zaburzenie to może bezpośrednio prowadzić do niewydolności jelit. Co więcej, zaburzenia jelitowe są związane nie tylko z chorobami przewodu pokarmowego, ale także z czynnikami patogennymi różnych innych chorób, takich jak zapalenie wątroby i choroby ośrodkowego układu nerwowego. Zbiorowiska drobnoustrojów jelitowych odgrywają kluczową rolę regulacyjną w fizjologii jelit, w tym w ruchliwości, co z kolei wpływa na kolonizację w ekosystemie drobnoustrojów⁴. W miarę jak zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu B postępuje do przewlekłego wirusowego zapalenia wątroby typu B, występują różne stopnie zmian we florze jelitowej. Modulowanie flory jelitowej wykazało korzyści w leczeniu wirusa zapalenia wątroby typu B⁵. Dodatkowo ośrodkowy układ nerwowy może wpływać na pracę jelita i zmieniać jego skład mikrobiologiczny. Ostatnie postępy w technologii sekwencjonowania mikroflory ujawniły dwukierunkowe interakcje między mikroflorą jelitową a funkcją ośrodkowego układu nerwowego, ściśle związane z występowaniem i postępem chorób ośrodkowego układu nerwowego^6,7.

Wraz ze starzeniem się społeczeństwa, częstość występowania zaburzeń motoryki przewodu pokarmowego nasila się, co wiąże się ze spadkiem lub utratą funkcji neuronalnych w jelitowym układzie nerwowym i wewnętrznym unerwieniem jelit⁸. Wraz z poszerzaniem się wiedzy na temat chorób przewodu pokarmowego pojawia się wiele nowatorskich pomysłów i podejść, które mogą prowadzić do opracowania nowych leków. Jednak wiele z tych pomysłów jest nadal hipotetycznych lub czeka na pozytywne wyniki badań klinicznych, aby się zmaterializować^9,10. Skuteczne metody badawcze są kluczowe w pokonywaniu chorób przewodu pokarmowego. W ostatnich latach szeroko zakrojone badania koncentrowały się na lekach żołądkowo-jelitowych i regulacji motoryki. Leki żołądkowo-jelitowe i dynamika przewodu pokarmowego są nierozłączne, a wiele innych leków ogólnoustrojowych ma różny wpływ na dynamikę przewodu pokarmowego. Na przykład niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ) są stosowane w leczeniu bólu i stanu zapalnego oraz powolnych ruchów przewodu pokarmowego, zwiększając ryzyko choroby wrzodowej ¹¹. Z drugiej strony, niektóre leki przeciwdepresyjne mogą wpływać na motorykę przewodu pokarmowego¹². Obecnie głównym eksperymentem farmakologicznym in vitro badającym wpływ leków żołądkowo-jelitowych i innych leków ogólnoustrojowych na motorykę przewodu pokarmowego jest test in vitro ruchu jelitowego¹³. Symulując warunki fizjologiczne, obserwują bezpośredni wpływ leków na skurcz i rozluźnienie mięśni gładkich jelit, oceniając ich wpływ na przewód pokarmowy. Jednak dokładna przyczyna zaburzeń motoryki przewodu pokarmowego pozostaje niejasna, prawdopodobnie jest to złożona interakcja czynników genetycznych, środowiskowych, dietetycznych i neuroendokrynnych. W związku z tym leczenie zaburzeń motoryki przewodu pokarmowego nadal stanowi poważne wyzwanie.

Jelito cienkie, będące kluczowym miejscem dla trawienia, wchłaniania i metabolizmu leków, ma znaczenie dla funkcji przewodu pokarmowego. W rezultacie test ruchu izolowanej rurki jelitowej jest niezbędnym narzędziem do badania chorób przewodu pokarmowego. Polega to na przygotowaniu i umieszczeniu izolowanej rurki jelitowej zwierzęcia w kąpieli, podłączeniu jej do wymiennika energii, wykorzystaniu przetwornika do przekształcania ruchów mechanicznych w sygnały elektryczne w celu wzmocnienia oraz rejestrowaniu przez rejestrator fizjologiczny. Aby ocenić funkcję motoryczną rurki jelitowej, można zmierzyć różne parametry, takie jak częstotliwość, średnia amplituda drgań, napięcie i obszar pod krzywą. Metoda ta oferuje takie korzyści, jak prostota, ekonomiczna wykonalność, łatwa kontrola warunków eksperymentalnych, minimalne czynniki wpływające, wysoka odtwarzalność oraz dokładne i wiarygodne wyniki. Co więcej, jest szczególnie przydatny do badania mechanizmu działania leków. Istnieją jednak znaczące wyzwania związane z działaniem eksperymentu z izolowaną rurką jelitową, na przykład aktywność jelitowa jest trudna do utrzymania przez długi czas. Aby odpowiedzieć na te problemy i skorzystać z doświadczeń z eksperymentów in vitro, niniejszy artykuł będzie zawierał szczegółowe wprowadzenie do kluczowych problemów w eksploatacji eksperymentalnej i przedstawi cenny referencyjny protokół eksperymentalny do badania leków regulujących motorykę przewodu pokarmowego.

Protocol

Ten protokół wywodzi się z wcześniej opublikowanej literatury^14,15,16,17. W niniejszym badaniu wykorzystano samce szczurów Sprague Dawley (SD) (260-300 g, 8-10 tygodniowe). Protokół na zwierzętach został poddany przeglądowi i zatwierdzony przez Komitet Zarządzający Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Chengdu (Rekord nr 2023017). Przed eksperymentem szczury zostały poinstruowane, aby pościć przez 24 godziny. Podczas eksperymentu szczury były trzymane w komorze dla zwierząt i miały swobodny dostęp do jedzenia i wody.

1. Przygotowanie roztworu

1. Przygotować fizjologiczny roztwór soli (PSS) zawierający 118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2,5 mM CaCl₂, 1,2 mM KH₂PO₄, 1,2 mM MgCl₂∙6H₂O, 25 mM NaHCO₃, 11 mM D-glukozy i 5 mM HEPES (patrz Tabela materiałów).
2. Nasycić roztwory i pęcherzyki zmieszanym gazem o stężeniach 95%_O2 i 5%_CO2. W międzyczasie utrzymuj wartości pH roztworu między 7,38 a 7,42 za pomocą 2 mM NaOH.
3. Wstępnie schłodzić 1/3 PSS do 4 °C, a resztę podgrzać do 37 °C do kolejnych eksperymentów.
   UWAGA: PSS został pierwotnie przygotowany w temperaturze pokojowej w krokach 1.1-1.2

2. Rozwarstwienie kanału jelitowego u szczura

1. Zbierz szalki Petriego wypełnione PSS o temperaturze 4°C, pęsetę chirurgiczną i nożyczki. Podawać 2% izofluranu w celu znieczulenia szczura poprzez inhalację przez około 5 minut. Sprawdź, czy szczur jest głęboko znieczulony, przeprowadzając test szczypania palca u nogi. W razie potrzeby podać dodatkowe środki znieczulające. Następnie należy odsłonić kanał jelitowy, otwierając jamę brzuszną na stole operacyjnym.
2. Szybko umieść rurki żołądkowe i jelitowe na szalce Petriego wypełnionej 4 °C PSS (pH 7,40) z 95% Nasyceniem_O2 i 5% CO₂ . Zlokalizuj dwunastnicę, która jest początkiem jelita cienkiego, w odźwierniku żołądka. Za pomocą pęsety delikatnie unieś sąsiednią tkankę i ostrożnie odetnij ją nożyczkami od brzegu jelita. Następnie podziel jelito na segmenty o długości 1-2 cm; cały ten proces jest zilustrowany w Rysunek 1.

3. Zawieszenie i unieruchomienie kanału jelitowego (Rysunek 2)

1. Włączyć system perfuzji tkanek in vitro i ustawić temperaturę kąpieli w instrumencie na 37 °C. Umieścić PSS (37 °C) w wannie.
2. Przygotować szew chirurgiczny o długości 15 cm (patrz Tabela Materiałów) i namoczyć go w 4 °C PSS nasyconym 95%_O2 + 5% CO_{2 .} Za pomocą szwu zabezpiecz jeden koniec kanału jelitowego i użyj stalowego haczyka na igłę, aby zabezpieczyć drugi koniec.
3. Zainstaluj rurkę jelitową. Zamontuj segment za pomocą stalowego haka igłowego na dnie wanny i przymocuj drugi koniec linii chirurgicznej do przetwornika. Włącz przełącznik gazu, aby w wannie pojawiły się bąbelki.
4. Otwórz oprogramowanie do akwizycji danych (patrz tabela materiałów) i kliknij Start, aby upewnić się, że rejestrowany jest odpowiedni sygnał ścieżki.

4. Normalizacja

1. Obróć spiralną oś wanny w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby rozluźnić rurki jelitowe do ich naturalnego stanu. Kliknij Setup-Zero All Inputs, aby upewnić się, że początkowe napięcie rurki jelitowej jest ustawione na 0 g w oprogramowaniu.
2. Obrócić oś spiralną wanny w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby podnieść wartość naprężenia do 1 g i ustabilizować ją w pH = 7,40, 95% O₂ + 5% CO₂ nasyconym 37 °C PSS przez 30 min.
   UWAGA: Normalizacja rurki jelitowej polega na dostosowaniu jej napięcia wstępnego do stanu optymalnego. W przypadku próbek z jam atomowych konieczne było optymalne obciążenie wstępne, aby utrzymać wyjątkową aktywność in vitro. Optymalne napięcie wstępne rurki jelitowej szczura wynosiło 1 g¹⁸.

5. Wykrywanie reaktywności

1. Obserwuj rytmiczne spontaniczne fale skurczu w oprogramowaniu i przejdź do następnego eksperymentu, ponieważ wskazuje to na wystarczającą odpowiedź.

6. Obserwacja eksperymentalna

1. Dodaj badany lek (taki jak acetylocholina itp.) do kąpieli, aby zbadać wpływ leku na czynność zgłębnika jelitowego.
   UWAGA: Działanie leku oceniano, porównując zmiany w krzywej zwężenia jelit przed i po podaniu. Po dodaniu leku należy zwiększyć pęcherzyk, aby wymieszać lek, a następnie dostosować pęcherzyk do normy po wymieszaniu.

7. Analiza danych

UWAGA: System perfuzji tkanek in vitro ma cztery kanały, które mogą jednocześnie przeprowadzać testy wpływu czterech identycznych lub różnych leków na cztery rurki jelitowe. Ponieważ parametry eksperymentalne i metody analizy są takie same dla wszystkich kanałów, jako przykład do analizy danych wybierany jest jeden kanał.

1. Zatrzymaj oprogramowanie do akwizycji danych i przeprowadź analizę danych w tym oprogramowaniu do akwizycji danych. Edytuj tablicę danych i wybierz parametry analizy w następujący sposób: Kliknij na Window-Data Pad i wybierz średnie naprężenie dla kanału.
2. Zaznacz krzywą skurczu przed podaniem i kliknij Dodaj do konsoli danych; wybierz krzywą skurczu po podaniu i kliknij Dodaj do konsoli danych. Średnia wartość napięcia przed i po podaniu pojawi się kolejno na tabletce danych.
3. Kliknij Window-Data Pad, aby skopiować dane do innego oprogramowania do analizy statystycznej (patrz Spis materiałów) w celu analizy statystycznej.
4. Przeanalizuj inne parametry, takie jak średnia amplituda, średnia częstotliwość i całka (obszar pod krzywą), po prostu zastąp średnie napięcie odpowiednim parametrem, a operacja jest taka sama jak w krokach 6.1-6.3.
5. Zapisz krzywą skurczu: Wybierz krzywą skurczu, kliknij Edytuj-Kopiuj dane wykresu laboratoryjnego, aby skopiować dane do oprogramowania do rysowania (patrz Tabela materiałów), aby narysować krzywą skurczu.

8. Leczenie pooperacyjne

1. Po operacji należy poddać zwierzęta eutanazji zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami.
   UWAGA: W niniejszym badaniu zwierzęta zostały poddane eutanazji poprzez wdychanie nadmiaru izofluranu.

Results

Pierwsza część badania skupia się na procesie oddzielania izolowanych rurek jelitowych od ciała i przekształcania ich w rurki o średnicy 2 cm in vitro. Proces ten jest szczegółowo zilustrowany w Rysunek 1. Druga część polega na zawieszeniu i standaryzacji izolowanego pierścienia rurki jelitowej. Sukces tego procesu jest pokazany w Rysunek 2, który pokazuje automatyczne rytmiczne kurczenie się normalnej rurki. Wreszcie, w badaniu przeanalizowano wpływ reprezentatywnych środków kurczliwych i zwiotczających na izolowany pierścień rurki jelitowej. Stwierdzono, że acetylocholina (0,3 μmol/L) i chlorek baru (1,2 mmol/L) zwiększają napięcie w tych rurkach, podczas gdy atropina (300 μmol/L), epinefryna (1 μmol/L) i nifedypina (10 μmol/L) hamują ich napięcie, jak pokazano na Rysunek 3.

Ta metoda głównie wprowadza określenie funkcji motorycznej izolowanej rurki jelitowej. Na ruchy jelit wpływa wiele czynników, a większość efektów jest wywierana przez receptory w jelicie. W przewodzie pokarmowym znajdują się różne receptory, w tym cholinergiczne receptory M, receptory adrenergiczne α i β, receptory 5-HT, receptory histaminowe i receptory hormonów żołądkowo-jelitowych¹⁹. Skurcz w izolowanym jelicie może być spowodowany działaniem acetylocholiny na receptory M. Efekt ten może być blokowany przez atropinę, która działa jako środek blokujący receptory M (Rysunek 3A). Jednak skurcz mięśni gładkich odcinka jelitowego, który jest spowodowany wejściem jonów baru do chlorku baru i ich wiązaniem z kalmoduliną, nie może być zablokowany przez atropinę (Rysunek 3B). Epinefryna działa jako agonista zarówno dla receptorów α, jak i β (Rysunek 3C). Pobudza receptor α i receptor β₂ jelita cienkiego, co powoduje rozluźnienie mięśni gładkich i osłabienie skurczu jelita cienkiego. W rezultacie perystaltyka jelit zostaje spowolniona, a szybkość wchłaniania zmniejszona. W przeciwieństwie do tego, nifedypina zapobiega wewnętrznemu przepływowi Ca²⁺ i wspomaga relaks jelit (Rysunek 3D). Pomaga to w łagodzeniu skurczów jelit, obniżaniu ciśnienia jelitowego i ułatwianiu wchłaniania wody w jelicie.

Rysunek 1: Izolacja rurki jelitowej. (A) rurki jelitowe u szczurów; (B) Rurki jelitowe wyjęto z organizmu i umieszczono na szalce Petriego zawierającej 4 °C roztworu soli fizjologicznej; (C) rurka jelitowa po usunięciu otaczającej tkanki; (D) Rurka jelitowa o długości 2 cm użyta w doświadczeniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Proces zawieszania i standaryzacji izolowanych pierścieni rurki jelitowej. (A) System perfuzji tkanek in vitro (patrz Tabela Materiałów); (B) zamocowanie obu końców rurki jelitowej za pomocą żelaznego haka i linki chirurgicznej na szalce Petriego zawierającej 4 °C roztwór soli fizjologicznej; C) umieszczenie rurki jelitowej w jednej z kąpieli zawierających roztwór soli fizjologicznej o temperaturze 37 °C; (D) podawanie napięcia wstępnego i rejestrowanie normalnego przebiegu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Wpływ leków na izolowane rurki jelitowe. Wpływ (A) acetylocholiny (0,3 μmol/l) i atropiny (300 μmol/l), (B) chlorku baru (1,2 mmol/l), (C) epinefryny (1 μmol/l) i (D) nifedypiny (10 μmol/l) na izolowane rurki jelitowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Motoryka przewodu pokarmowego jest osiągana przez serię precyzyjnie skoordynowanych skurczów i rozluźnień mięśni gładkich. Proces ten obejmuje rytmiczny skurcz jednej grupy mięśni, skoordynowany skurcz wielu grup oraz specjalny skurcz napędowy^20,21. Występowanie zaburzeń motoryki przewodu pokarmowego może wiązać się z dysfunkcjami na różnych poziomach, takich jak ośrodkowy układ nerwowy, autonomiczny układ nerwowy, jelitowy układ nerwowy i mięśnie gładkie przewodu pokarmowego. Te struktury tkankowe funkcjonują razem poprzez uwalnianie różnych neuroprzekaźników i czynników humoralnych, które wiążą się z odpowiednimi receptorami w celu wykonywania różnych funkcji fizjologicznych²². Dlatego badanie lokalnego mechanizmu działania leków jest niezbędne, a przeprowadzanie eksperymentów in vitro na jelicie cienkim może dostarczyć dokładniejszych informacji, wykluczając zakłócenia spowodowane obcymi substancjami i regulację ośrodkowego układu nerwowego.

Izolowane próbki rurki jelitowej jelita krętego świnki morskiej, jelita czczego królika i dwunastnicy są powszechnie stosowane u zwierząt doświadczalnych. Ponadto jelito kręte, dwunastnica i jelito czcze szczurów i kotów mogą być również wykorzystywane do eksperymentów in vitro . Ta metoda jest odpowiednia dla izolowanych tkanek. Mięśnie gładkie jelit mają cechy automatycznego rytmicznego skurczu i wpływają na niego splot nerwowy w ścianie jelita. Izolowane rurki jelitowe wielu zwierząt mogą utrzymać swoje spontaniczne funkcje motoryczne w odpowiednim środowisku przetrwania. Eksperyment z rurką jelitową in vitro ma zalety prostej obsługi, łatwej kontroli warunków eksperymentalnych, niewielu czynników wpływających, dobrej odtwarzalności, dokładnych i wiarygodnych wyników oraz bardziej sprzyja dyskusji na temat mechanizmu działania leku. Dodatkowo ta metoda jest uważana za ekonomiczną i wykonalną.

Eksperyment z rurką jelitową in vitro ma również swoje ograniczenia, takie jak stosowanie nieoczyszczonych surowych preparatów medycyny chińskiej, które zawierają zanieczyszczenia, jony nieorganiczne, saponiny i garbniki, co może wpłynąć na wiarygodność eksperymentu. Dlatego konieczna jest pełna ocena wpływu zanieczyszczeń i czynników fizykochemicznych na wyniki eksperymentalne, w tym pH cieczy oraz różnych cząstek elektrolitycznych i zanieczyszczeń. Ponadto konieczna jest poprawa stabilności instrumentu doświadczalnego in vitro i techniki konserwacji zwężnika jelitowego in vitro. Projektując doświadczenia in vitro, należy koniecznie rozważyć, czy stosowane leki lub preparaty spełniają wymagania tych eksperymentów (np. poziomy zanieczyszczeń).

W tej metodzie istnieje kilka środków ostrożności, których należy przestrzegać. Na początek rurkę jelitową należy usunąć z jamy brzusznej szczura i namoczyć w zimnym PSS przed eksperymentem. Ponadto ważne jest, aby pokroić całą rurkę na wiele części i przechowywać je w lodówce, minimalizując stymulację jelit. Podczas procesu dozowania ważne jest, aby upewnić się, że rurka dozująca nie styka się z przewodem, na którym zawieszona jest rurka jelitowa. Dodatkowo ilość leku dodawanego do kąpieli powinna być dokładna, a lek nie powinien być dodawany do ścianki wanny lub bezpośrednio do rurki jelitowej, aby uniknąć wpływu na wyniki. Podczas płukania rurki jelitowej należy stosować delikatne podejście i unikać płukania pod wysokim ciśnieniem, aby zapobiec przykurczowi tkanek. Zaleca się obchodzenie się z rurką jelitową pęsetą i unikanie wystawiania jej na działanie powietrza przez dłuższy czas, aby zapobiec utracie aktywności.

W niniejszej pracy przedstawiono demonstrację metodyki eksperymentalnej eksperymentów z izolowanymi rurkami jelitowymi, wykorzystując wpływ różnych tradycyjnych leków działających na receptory jelitowe w celu zilustrowania ich wpływu na ruch rurki jelitowej, co stanowi skuteczne podejście do badania mechanizmu działania leków regulujących perystaltykę przewodu pokarmowego w przewodzie pokarmowym.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetylocholina	Sigma, Stany Zjednoczone	A6625
atropina	Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	IA06501
Chlorek baru	Macklin Biochemical Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	B861682
CaCl2	Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	A501330
D-glukoza	Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	A610219
oprogramowanie do rysowania	GraphPad Software, San Diego, Kalifornia, USA&	mdash;
Epinephrine	Sigma, USA	E4642
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, Chiny	S3872
System perfuzji tkanek in vitro	PowerLab, ADInstruments, Australia	ML0146
KCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	A100395
KH2PO4	Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	A100781
LabChart Professional wersja 8.3	ADInstruments, Australia	—
MgCl2· 6H2O	Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	A100288
NaCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	A100241
NaHCO3	Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	A100865
nifedypina	Macklin Biochemical Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	N5087
oprogramowanie	GraphPad Software, San Diego, Kalifornia, USA&	mdash;
Szwy chirurgiczne	Johnson, USA&	mdash;