Prezentujemy metodę izolowania rurki jelitowej szczurów i oceny wpływu leków na ich napięcie, częstotliwość i amplitudę in vitro. Metoda ta stanowi cenne podejście dla naukowców badających rurki jelitowe.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykorzystanie systemu perfuzji tkanek in vitro do wykrywania czynności funkcjonalnych izolowanych rurek jelitowych w czasie rzeczywistym
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Choroby przewodu pokarmowego, które występują często, stanowią poważne wyzwanie dla ludzi. Jelito cienkie jest integralną częścią trawienia i wchłaniania pokarmów i leków oraz odgrywa kluczową rolę w leczeniu tych chorób. Eksperyment z ruchem rurki jelitowej, powszechna i niezbędna metoda in vitro, jest wykorzystywany do badania dynamiki przewodu pokarmowego. Obejmuje to przygotowanie izolowanej rurki jelitowej, a także zawieszenie przygotowanej rurki jelitowej w kąpieli i podłączenie jej do detektora sygnału. Następnie rejestruje się i analizuje szereg parametrów, takich jak napięcie, które można wykorzystać do oceny funkcji motorycznej jelit, a także rozważania dotyczące utrzymania aktywności cewy jelitowej in vitro. Ustandaryzowany program od pobrania próbki do zebrania danych znacznie poprawia powtarzalność danych eksperymentalnych i zapewnia autentyczność zapisu napięcia jelitowego po interwencji fizjologicznej, patologicznej i farmakologicznej. W tym miejscu przedstawiamy kluczowe problemy w eksploatacji eksperymentalnej oraz cenny referencyjny protokół eksperymentalny do badania leków regulujących motorykę przewodu pokarmowego.
Wprowadzenie
Choroby przewodu pokarmowego, powszechne schorzenie, mają poważny wpływ na życie i zdrowie ludzi1. Zaburzenia motoryki przewodu pokarmowego są ważną częścią funkcjonalnych chorób przewodu pokarmowego, objawiającą się przede wszystkim wyniszczającymi objawami, opóźnionym opróżnianiem żołądka i poważnymi problemami gastrycznymi2. Może zaburzać koordynację żołądkowo-jelitową, utrudniać opróżnianie żołądka, wpływać na jelitową nietolerancję pokarmową, a nawet powodować funkcjonalną niedrożność w jelicie cienkim lub grubym3. U pacjentów poddawanych zabiegom chirurgicznym przewodu pokarmowego zaburzenie to może bezpośrednio prowadzić do niewydolności jelit. Co więcej, zaburzenia jelitowe są związane nie tylko z chorobami przewodu pokarmowego, ale także z czynnikami patogennymi różnych innych chorób, takich jak zapalenie wątroby i choroby ośrodkowego układu nerwowego. Zbiorowiska drobnoustrojów jelitowych odgrywają kluczową rolę regulacyjną w fizjologii jelit, w tym w ruchliwości, co z kolei wpływa na kolonizację w ekosystemie drobnoustrojów4. W miarę jak zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu B postępuje do przewlekłego wirusowego zapalenia wątroby typu B, występują różne stopnie zmian we florze jelitowej. Modulowanie flory jelitowej wykazało korzyści w leczeniu wirusa zapalenia wątroby typu B5. Dodatkowo ośrodkowy układ nerwowy może wpływać na pracę jelita i zmieniać jego skład mikrobiologiczny. Ostatnie postępy w technologii sekwencjonowania mikroflory ujawniły dwukierunkowe interakcje między mikroflorą jelitową a funkcją ośrodkowego układu nerwowego, ściśle związane z występowaniem i postępem chorób ośrodkowego układu nerwowego6,7.
Wraz ze starzeniem się społeczeństwa, częstość występowania zaburzeń motoryki przewodu pokarmowego nasila się, co wiąże się ze spadkiem lub utratą funkcji neuronalnych w jelitowym układzie nerwowym i wewnętrznym unerwieniem jelit8. Wraz z poszerzaniem się wiedzy na temat chorób przewodu pokarmowego pojawia się wiele nowatorskich pomysłów i podejść, które mogą prowadzić do opracowania nowych leków. Jednak wiele z tych pomysłów jest nadal hipotetycznych lub czeka na pozytywne wyniki badań klinicznych, aby się zmaterializować9,10. Skuteczne metody badawcze są kluczowe w pokonywaniu chorób przewodu pokarmowego. W ostatnich latach szeroko zakrojone badania koncentrowały się na lekach żołądkowo-jelitowych i regulacji motoryki. Leki żołądkowo-jelitowe i dynamika przewodu pokarmowego są nierozłączne, a wiele innych leków ogólnoustrojowych ma różny wpływ na dynamikę przewodu pokarmowego. Na przykład niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ) są stosowane w leczeniu bólu i stanu zapalnego oraz powolnych ruchów przewodu pokarmowego, zwiększając ryzyko choroby wrzodowej 11. Z drugiej strony, niektóre leki przeciwdepresyjne mogą wpływać na motorykę przewodu pokarmowego12. Obecnie głównym eksperymentem farmakologicznym in vitro badającym wpływ leków żołądkowo-jelitowych i innych leków ogólnoustrojowych na motorykę przewodu pokarmowego jest test in vitro ruchu jelitowego13. Symulując warunki fizjologiczne, obserwują bezpośredni wpływ leków na skurcz i rozluźnienie mięśni gładkich jelit, oceniając ich wpływ na przewód pokarmowy. Jednak dokładna przyczyna zaburzeń motoryki przewodu pokarmowego pozostaje niejasna, prawdopodobnie jest to złożona interakcja czynników genetycznych, środowiskowych, dietetycznych i neuroendokrynnych. W związku z tym leczenie zaburzeń motoryki przewodu pokarmowego nadal stanowi poważne wyzwanie.
Jelito cienkie, będące kluczowym miejscem dla trawienia, wchłaniania i metabolizmu leków, ma znaczenie dla funkcji przewodu pokarmowego. W rezultacie test ruchu izolowanej rurki jelitowej jest niezbędnym narzędziem do badania chorób przewodu pokarmowego. Polega to na przygotowaniu i umieszczeniu izolowanej rurki jelitowej zwierzęcia w kąpieli, podłączeniu jej do wymiennika energii, wykorzystaniu przetwornika do przekształcania ruchów mechanicznych w sygnały elektryczne w celu wzmocnienia oraz rejestrowaniu przez rejestrator fizjologiczny. Aby ocenić funkcję motoryczną rurki jelitowej, można zmierzyć różne parametry, takie jak częstotliwość, średnia amplituda drgań, napięcie i obszar pod krzywą. Metoda ta oferuje takie korzyści, jak prostota, ekonomiczna wykonalność, łatwa kontrola warunków eksperymentalnych, minimalne czynniki wpływające, wysoka odtwarzalność oraz dokładne i wiarygodne wyniki. Co więcej, jest szczególnie przydatny do badania mechanizmu działania leków. Istnieją jednak znaczące wyzwania związane z działaniem eksperymentu z izolowaną rurką jelitową, na przykład aktywność jelitowa jest trudna do utrzymania przez długi czas. Aby odpowiedzieć na te problemy i skorzystać z doświadczeń z eksperymentów in vitro, niniejszy artykuł będzie zawierał szczegółowe wprowadzenie do kluczowych problemów w eksploatacji eksperymentalnej i przedstawi cenny referencyjny protokół eksperymentalny do badania leków regulujących motorykę przewodu pokarmowego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ten protokół wywodzi się z wcześniej opublikowanej literatury14,15,16,17. W niniejszym badaniu wykorzystano samce szczurów Sprague Dawley (SD) (260-300 g, 8-10 tygodniowe). Protokół na zwierzętach został poddany przeglądowi i zatwierdzony przez Komitet Zarządzający Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Chengdu (Rekord nr 2023017). Przed eksperymentem szczury zostały poinstruowane, aby pościć przez 24 godziny. Podczas eksperymentu szczury były trzymane w komorze dla zwierząt i miały swobodny dostęp do jedzenia i wody.
1. Przygotowanie roztworu
- Przygotować fizjologiczny roztwór soli (PSS) zawierający 118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM MgCl2∙6H2O, 25 mM NaHCO3, 11 mM D-glukozy i 5 mM HEPES (patrz Tabela materiałów).
- Nasycić roztwory i pęcherzyki zmieszanym gazem o stężeniach 95%O2 i 5%CO2. W międzyczasie utrzymuj wartości pH roztworu między 7,38 a 7,42 za pomocą 2 mM NaOH.
- Wstępnie schłodzić 1/3 PSS do 4 °C, a resztę podgrzać do 37 °C do kolejnych eksperymentów.
UWAGA: PSS został pierwotnie przygotowany w temperaturze pokojowej w krokach 1.1-1.2
2. Rozwarstwienie kanału jelitowego u szczura
- Zbierz szalki Petriego wypełnione PSS o temperaturze 4°C, pęsetę chirurgiczną i nożyczki. Podawać 2% izofluranu w celu znieczulenia szczura poprzez inhalację przez około 5 minut. Sprawdź, czy szczur jest głęboko znieczulony, przeprowadzając test szczypania palca u nogi. W razie potrzeby podać dodatkowe środki znieczulające. Następnie należy odsłonić kanał jelitowy, otwierając jamę brzuszną na stole operacyjnym.
- Szybko umieść rurki żołądkowe i jelitowe na szalce Petriego wypełnionej 4 °C PSS (pH 7,40) z 95% NasyceniemO2 i 5% CO2 . Zlokalizuj dwunastnicę, która jest początkiem jelita cienkiego, w odźwierniku żołądka. Za pomocą pęsety delikatnie unieś sąsiednią tkankę i ostrożnie odetnij ją nożyczkami od brzegu jelita. Następnie podziel jelito na segmenty o długości 1-2 cm; cały ten proces jest zilustrowany w Rysunek 1.
3. Zawieszenie i unieruchomienie kanału jelitowego (Rysunek 2)
- Włączyć system perfuzji tkanek in vitro i ustawić temperaturę kąpieli w instrumencie na 37 °C. Umieścić PSS (37 °C) w wannie.
- Przygotować szew chirurgiczny o długości 15 cm (patrz Tabela Materiałów) i namoczyć go w 4 °C PSS nasyconym 95%O2 + 5% CO2 . Za pomocą szwu zabezpiecz jeden koniec kanału jelitowego i użyj stalowego haczyka na igłę, aby zabezpieczyć drugi koniec.
- Zainstaluj rurkę jelitową. Zamontuj segment za pomocą stalowego haka igłowego na dnie wanny i przymocuj drugi koniec linii chirurgicznej do przetwornika. Włącz przełącznik gazu, aby w wannie pojawiły się bąbelki.
- Otwórz oprogramowanie do akwizycji danych (patrz tabela materiałów) i kliknij Start, aby upewnić się, że rejestrowany jest odpowiedni sygnał ścieżki.
4. Normalizacja
- Obróć spiralną oś wanny w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby rozluźnić rurki jelitowe do ich naturalnego stanu. Kliknij Setup-Zero All Inputs, aby upewnić się, że początkowe napięcie rurki jelitowej jest ustawione na 0 g w oprogramowaniu.
- Obrócić oś spiralną wanny w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby podnieść wartość naprężenia do 1 g i ustabilizować ją w pH = 7,40, 95% O2 + 5% CO2 nasyconym 37 °C PSS przez 30 min.
UWAGA: Normalizacja rurki jelitowej polega na dostosowaniu jej napięcia wstępnego do stanu optymalnego. W przypadku próbek z jam atomowych konieczne było optymalne obciążenie wstępne, aby utrzymać wyjątkową aktywność in vitro. Optymalne napięcie wstępne rurki jelitowej szczura wynosiło 1 g18.
5. Wykrywanie reaktywności
- Obserwuj rytmiczne spontaniczne fale skurczu w oprogramowaniu i przejdź do następnego eksperymentu, ponieważ wskazuje to na wystarczającą odpowiedź.
6. Obserwacja eksperymentalna
- Dodaj badany lek (taki jak acetylocholina itp.) do kąpieli, aby zbadać wpływ leku na czynność zgłębnika jelitowego.
UWAGA: Działanie leku oceniano, porównując zmiany w krzywej zwężenia jelit przed i po podaniu. Po dodaniu leku należy zwiększyć pęcherzyk, aby wymieszać lek, a następnie dostosować pęcherzyk do normy po wymieszaniu.
7. Analiza danych
UWAGA: System perfuzji tkanek in vitro ma cztery kanały, które mogą jednocześnie przeprowadzać testy wpływu czterech identycznych lub różnych leków na cztery rurki jelitowe. Ponieważ parametry eksperymentalne i metody analizy są takie same dla wszystkich kanałów, jako przykład do analizy danych wybierany jest jeden kanał.
- Zatrzymaj oprogramowanie do akwizycji danych i przeprowadź analizę danych w tym oprogramowaniu do akwizycji danych. Edytuj tablicę danych i wybierz parametry analizy w następujący sposób: Kliknij na Window-Data Pad i wybierz średnie naprężenie dla kanału.
- Zaznacz krzywą skurczu przed podaniem i kliknij Dodaj do konsoli danych; wybierz krzywą skurczu po podaniu i kliknij Dodaj do konsoli danych. Średnia wartość napięcia przed i po podaniu pojawi się kolejno na tabletce danych.
- Kliknij Window-Data Pad, aby skopiować dane do innego oprogramowania do analizy statystycznej (patrz Spis materiałów) w celu analizy statystycznej.
- Przeanalizuj inne parametry, takie jak średnia amplituda, średnia częstotliwość i całka (obszar pod krzywą), po prostu zastąp średnie napięcie odpowiednim parametrem, a operacja jest taka sama jak w krokach 6.1-6.3.
- Zapisz krzywą skurczu: Wybierz krzywą skurczu, kliknij Edytuj-Kopiuj dane wykresu laboratoryjnego, aby skopiować dane do oprogramowania do rysowania (patrz Tabela materiałów), aby narysować krzywą skurczu.
8. Leczenie pooperacyjne
- Po operacji należy poddać zwierzęta eutanazji zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami.
UWAGA: W niniejszym badaniu zwierzęta zostały poddane eutanazji poprzez wdychanie nadmiaru izofluranu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Pierwsza część badania koncentruje się na procesie oddzielania izolowanych fragmentów jelita z organizmu i przekształcania ich w odcinki o długości 2 cm in vitro. Proces ten został szczegółowo przedstawiony na Rysunku 1. Druga część obejmuje zawieszenie i standaryzację pierścienia izolowanego fragmentu jelita. Powodzenie tego procesu zademonstrowano na Rysunku 2, który ukazuje automatyczne rytmiczne skurcze prawidłowego odcinka jelita. Na koniec w badan...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Motoryka przewodu pokarmowego jest osiągana przez serię precyzyjnie skoordynowanych skurczów i rozluźnień mięśni gładkich. Proces ten obejmuje rytmiczny skurcz jednej grupy mięśni, skoordynowany skurcz wielu grup oraz specjalny skurcz napędowy20,21. Występowanie zaburzeń motoryki przewodu pokarmowego może wiązać się z dysfunkcjami na różnych poziomach, takich jak ośrodkowy układ nerwowy, autonomiczny układ nerwowy, jelitowy układ nerwowy i mięśnie gładkie przewod...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Specjalny Program Talentów Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Chengdu dla "Xinglin Scholars and Discipline Talents Research Promotion Plan" (33002324).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Acetylocholina | Sigma, Stany Zjednoczone | A6625 | |
| atropina | Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chiny | IA06501 | |
| Chlorek baru | Macklin Biochemical Co., Ltd., Szanghaj, Chiny | B861682 | |
| CaCl2 | Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chiny | A501330 | |
| D-glukoza | Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chiny | A610219 | |
| oprogramowanie do rysowania | GraphPad Software, San Diego, Kalifornia, USA& | mdash; | |
| Epinephrine | Sigma, USA | E4642 | |
| HEPES | Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, Chiny | S3872 | |
| System perfuzji tkanek in vitro | PowerLab, ADInstruments, Australia | ML0146 | |
| KCl | Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chiny | A100395 | |
| KH2PO4 | Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chiny | A100781 | |
| LabChart Professional wersja 8.3 | ADInstruments, Australia | — | |
| MgCl2· 6H2O | Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chiny | A100288 | |
| NaCl | Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chiny | A100241 | |
| NaHCO3 | Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chiny | A100865 | |
| nifedypina | Macklin Biochemical Co., Ltd., Szanghaj, Chiny | N5087 | |
| oprogramowanie | GraphPad Software, San Diego, Kalifornia, USA& | mdash; | |
| Szwy chirurgiczne | Johnson, USA& | mdash; |
Bibliografia
- Jiang, Z., et al. Therapeutic role of wuda granule in gastrointestinal motility disorder through promoting gastrointestinal motility and decreasing inflammatory level. Front Pharmacol. 14, 1-15 (2023).
- Talley, N. J. What causes functional gastrointestinal disorders? A proposed disease model. Am J Gastroenterol. 115 (1), 41-48 (2020).
- Frazer, C., Hussey, L., Bemker, M. Gastrointestinal motility problems in critically ill patients. Crit Care Nurs Clin North Am. 30 (1), 109-121 (2018).
- Waclawikova, B., Codutti, A., Alim, K., El, A. S. Gut microbiota-motility interregulation: insights from in vivo, ex vivo and in silico studies. Gut Microbes. 14 (1), 1997296(2022).
- Kwak, D. S., et al. Short-term probiotic therapy alleviates small intestinal bacterial overgrowth, but does not improve intestinal permeability in chronic liver disease. Eur J Gastroenterol Hepatol. 26 (12), 1353-1359 (2014).
- Tang, A. T., et al. Endothelial Tlr4 and the microbiome drive cerebral cavernous malformations. Nature. 545 (7654), 305-310 (2017).
- Mayer, E. A. Gut feelings: the emerging biology of gut-brain communication. Nature Rev Neurosci. 12 (8), 453-466 (2011).
- Singh, R., Zogg, H., Ghoshal, U. C., Ro, S. Current treatment options and therapeutic insights for gastrointestinal dysmotility and functional gastrointestinal disorders. Front Pharmacol. 13, 1-20 (2022).
- Sanger, G. J., Alpers, D. H. Development of drugs for gastrointestinal motor disorders: Translating science to clinical need. Neurogastroenterol Motil. 20 (3), 177-184 (2008).
- Valentin, N., Acosta, A., Camilleri, M. Early investigational therapeutics for gastrointestinal motility disorders: From animal studies to phase ii trials. Expert Opin Investig Drugs. 24 (6), 769-779 (2015).
- Shoor, S. Athletes, nonsteroidal anti-inflammatory drugs, coxibs, and the gastrointestinal tract. Curr Sports Med Rep. 1 (2), 107-115 (2002).
- Lacy, B. E., et al. Effects of antidepressants on gastric function in patients with functional dyspepsia. Am J Gastroenterol. 113 (2), 216-224 (2018).
- Lin, R. K., et al. The effects of ginsenosides on contractile activity of antibiotic-treated isolated small intestinal smooth muscle in mice. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research. 33 (04), 790-793 (2022).
- Jespersen, B., Tykocki, N. R., Watts, S. W., Cobbett, P. J. Measurement of smooth muscle function in the isolated tissue bath-applications to pharmacology research. J Vis Exp. (95), e52324(2015).
- Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. J Vis Exp. (69), e4198(2012).
- Semenov, I., Herlihy, J. T., Brenner, R. In vitro measurements of tracheal constriction using mice. J Vis Exp. (64), e3703(2012).
- Han, J., Chen, X. J. Study overview of invisible spectro intestine experiment. Guiding Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 14 (3), 94-96 (2008).
- Hao, F. F., Liu, W. Q., Wang, J. N., Nie, K. Experimental study on the effect of Forsythia suspensa water extract on the movement of isolated intestinal tract in rats. Shandong Journal of Traditional Chinese Medicine. 37 (1), 63-66 (2018).
- Ruoff, H. J., Fladung, B., Demol, P., Weihrauch, T. R. Gastrointestinal receptors and drugs in motility disorders. Digestion. 48 (1), 1-17 (1991).
- Foong, D., Zhou, J., Zarrouk, A., Ho, V., O'connor, M. D. Understanding the biology of human interstitial cells of cajal in gastrointestinal motility. Int J Mol Sci. 21 (12), 4540(2020).
- Mössner, J. Motilitätsstörungen des gastrointestinaltrakts. Der Internist. 56 (6), 613-614 (2015).
- Yin, J., Chen, J. D. Z. Gastrointestinal motility disorders and acupuncture. Autonomic Neuroscience. 157 (1-2), 31-37 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
