Artykuł metodologiczny

Interferencja RNA w parazytoidzie jaja, Trichogramma dendrolimi Matsumura

DOI:

10.3791/66250

⸱

21 listopada 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, 2State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Manipulacja interferencją RNA (RNAi) stanowi ogromne wyzwanie dla wielu gatunków parazytoidów o niewielkich rozmiarach, takich jak osy Trichogramma. W badaniu tym opracowano skuteczną metodę RNAi u Trichogramma denrolimi. Obecna metodologia zapewnia solidny model do badania regulacji genów u os Trichogramma.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Parazytoidy jaj, Trichogramma spp., są uznawane za skuteczne środki kontroli biologicznej przeciwko różnym szkodnikom Lepidoptera w rolnictwie i lasach. Niedojrzałe stadia potomstwa Trichogramma rozwijają się w jaju żywiciela, wykazując niezwykłą drobnienie (około 0,5 mm długości dorosłego osobnika). Metodologia interferencji RNA (RNAi) stała się kluczowym narzędziem do wyjaśniania funkcji genów w wielu organizmach. Jednak manipulowanie RNAi u niektórych małych gatunków parazytoidów, takich jak Trichogramma, na ogół stanowiło poważne wyzwanie. W niniejszej pracy przedstawiono skuteczną metodę RNAi w Trichogramma denrolimi. Przedstawiona procedura obejmuje pozyskanie i izolację pojedynczych próbek T. dendrolimi z jaj gospodarza, zaprojektowanie i syntezę dwuniciowego RNA (dsRNA), przeszczepienie i hodowlę poczwarek T. dendrolimi in vitro, mikroiniekcję dsRNA, a następnie ocenę knockdownu genu docelowego za pomocą analizy RT-qPCR. Badanie to dostarcza kompleksowej, wizualnie szczegółowej procedury przeprowadzania eksperymentów RNAi u T. dendrolimi, umożliwiając w ten sposób naukowcom zbadanie regulacji genów u tego gatunku. Co więcej, metodologia ta może być dostosowana do badań RNAi lub mikroiniekcji u innych gatunków Trichogramma z niewielkimi korektami, co czyni ją cennym punktem odniesienia do przeprowadzania eksperymentów RNAi u innych gatunków endopasożytniczych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trichogramma spp. to grupa parazytoidów jaj, które są szeroko wykorzystywane jako wysoce skuteczne środki kontroli biologicznej przeciwko szerokiemu spektrum szkodników Lepidopteran w ekosystemach rolniczych i leśnych na całym świecie1,2,3,4. Zastosowanie masowo hodowanego Trichogramma zapewnia przyjazne dla środowiska podejście do zrównoważonego zarządzania szkodnikami5,6,7. Zrozumienie biologii molekularnej os Trichogramma dostarcza cennych informacji na temat zwiększania wydajności masowej hodowli i wydajności polowej tych środków kontroli biologicznej8,9poprzez badanie metodologii regulacji genów i edycji genomu10.

Od czasu odkrycia w 1998 roku specyficznej interferencji genetycznej za pośrednictwem dwuniciowego RNA (dsRNA) u Caenorhabditis elegans, metoda interferencji RNA (RNAi) przekształciła się w niezbędny zestaw narzędzi genetycznych do badania mechanizmów regulacyjnych organizmów poprzez tłumienie ekspresji docelowych genów11. Eksperymenty RNAi stały się standardową metodologią szeroko stosowaną do badania funkcji genów u wielu gatunków owadów12,13. Niemniej jednak manipulacja RNAi stanowi ogromne wyzwanie u wielu gatunków parazytoidów, szczególnie wśród tych należących do endopasożytniczej rodziny Chalcidoidea14,15,16. Metoda RNAi została udokumentowana na co najmniej 13 gatunkach parazytoidów14,15,16,17,18,19. Wśród nich podejście RNAi zostało kompleksowo przeprowadzone na osach Nasonia i ma zastosowanie na wszystkich etapach rozwoju, w tym na zarodkach, larwach, poczwarkach i osobnikach dorosłych14,15,16. Warto zauważyć, że osy Nasonia są ektoparazytoidami, a ich potomstwo rozwija się w przestrzeni śródmiąższowej między poczwarką gospodarza a poczwarką, co umożliwia ich hodowlę in vitro i sprawia, że tolerują niektóre zabiegi, takie jak mikroiniekcja. W przeciwieństwie do os Nasonia, osobniki Trichogramma przechodzą cały swój rozwój embrionalny, larwalny i poczwarkowy wewnątrz jaja gospodarza. Warstwa w stadiach zarodka i larwy (która może utrudniać przepuszczalność dsRNA), podatność na uszkodzenia i trudności w przetrwaniu in vitro stanowią poważne przeszkody20,21,22. Dodatkowo, niewielki rozmiar osobników Trichogramma, około ~0,5 mm długości dorosłego osobnika lub poczwarki, sprawia, że manipulacja nimi jest niezwykle skomplikowana20,21,22.

W niniejszym badaniu przedstawiamy kompleksową procedurę przeprowadzania eksperymentów z interferencją RNA (RNAi) u Trichogramma denrolimi Matsumura. Procedura ta obejmuje następujące procedury: (1) projektowanie i syntezę dwuniciowego RNA (dsRNA), (2) mikroiniekcję poczwarek T. denrolimi, (3) przeszczepienie i inkubację in vitro tych poczwarek oraz (4) wykrywanie knockdownu genu docelowego za pomocą analizy RT-qPCR. Docelowym genem wybranym do eksperymentu RNAi jest homologia łańcucha ciężkiego ferrytyny (Ferhch). FerHCH, białko wiążące żelazo, zawiera centrum ferroksydazy obdarzone zdolnościami przeciwutleniającymi, ułatwiającymi utlenianie Fe2+ do Fe3+. Odgrywa niezastąpioną rolę we wzroście i rozwoju różnych organizmów poprzez utrzymanie równowagi redoks i homeostazy żelaza. Wyczerpanie FerHCH może powodować nadmierną akumulację żelaza, co prowadzi do nieodwracalnego uszkodzenia tkanek i często prowadzi do znaczących zmian fenotypowych, w tym wad wzrostu, deformacji i śmiertelności23,24. Badanie to oferuje przewodnik krok po kroku dotyczący przeprowadzania RNAi u T. denrolimi, który będzie nieoceniony w badaniu funkcji genów w szerszym kontekście os Trichogramma.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów, instrumentów, oprogramowania i odczynników używanych w tym protokole.

1. Zbieranie i utrzymywanie hodowli owadów

  1. Przyklej grupę ~ 5 000 jaj Corcyra cephalonica (Stainton) na karcie o wymiarach 9 cm na 16 cm, używając roztworu 1:5 (v/v) gumy arabskiej w proszku i wody25,26.
    UWAGA: Unikaj dołączania zbyt wielu jaj żywiciela do karty, ponieważ przepełnienie sprawia, że jest to niepraktyczne dla późniejszych procedur przenoszenia i sekcji.
  2. Aby zapobiec wykluwaniu się jaj gospodarza, poddaj karty jaj gospodarza 30-minutowemu naświetlaniu promieniowaniem ultrafioletowym (UV) (Rysunek 1-i). Następnie pokrój papier z inaktywowanymi jajkami na karty jaj o grubości 1 cm i średnicy 8 cm, z których każda zawiera około 300-500 jaj (Rysunek 1-ii)25,26,27.
  3. Wprowadź kohortę 80-120 os T. denrolimi do szklanej rurki o średnicy 2 cm i długości 8 cm. Uszczelnij tubę bawełną.
    UWAGA: Utrzymuj osy w temperaturze 25 ± 1 °C, z cyklem światło/ciemność 16 godzin światła i 8 godzin ciemności oraz utrzymuj wilgotność względną około 75%.
  4. Przedstaw karcie jaja żywiciela osom w celu pasożytowania (Rysunek 1-ii). Pozwól osom złożyć jaja w jajach żywiciela na 6 godzin, po czym natychmiast usuń osy.
    UWAGA: Unikaj nadmiernego przedłużania okresu pasożytowania, ponieważ może to prowadzić do przeludnienia potomstwa T. denrolimi w jaju żywiciela, co skutkuje zwiększoną śmiertelnością potomstwa os28,29.

2. Synteza dsRNA

  1. Zaprojektuj zestawy starterów zawierające promotor T7 do syntezy dwuniciowego RNA (dsRNA). Wybierz segment 300-400 pz z docelowego genu (Ferhch) do syntezy dsRNA.
  2. Pozyskanie komercyjnie zsyntetyzowanych zestawów starterów do produkcji dsRNA dla docelowego genu i dsGFP do wykorzystania jako kontrola ujemna.
  3. Wyodrębnij zawartość RNA ze 100 os T. denrolimi za pomocą wspomnianego zestawu zgodnie z protokołem producenta9. Sprawdź jakość zawartości RNA; kontynuuj, jeśli wartość OD260/OD280 mieści się w zakresie od 1,8 do 2,09.
  4. Oczyść zawartość RNA za pomocą 2 μL 5x buforu (1 U/50 μL), 1 μL DNAzy (1 U/50 μL) i 6,5 μL RNA (~100 ng/μL), 0,5 μLH2Ow 42 °C przez 2 min.
  5. Wykonaj reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR), aby wygenerować matrycę cDNA z 10 μL oczyszczonego RNA (~100 ng/μL), 4 μL 5x buforu (1 U/50 μL), 1 μL Enzyme Mix I (1 U/50 μL) i 4 μL H2O. Wykonaj RT-PCR przy użyciu następujących ustawień: 37 °C przez 15 min, 85 °C przez 5 s. Przechowywać produkt cDNA w temperaturze -4 °C do czasu użycia.
  6. Przeprowadzić reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) w celu amplifikacji sekwencji dsRNA zgodnie z odniesioną mieszanką główną (10 μL Taq II [1 U/50 μL], 0,8 μL startera przedniego [0,4 μM], 0,8 μL startera odwrotnego [0,4 μM], 0,8 μL matrycy DNA [40 ng/μL], i 7,6 μlH2O). Wykonaj PCR przy użyciu następujących ustawień: 94 °C przez 2 min; 35 cykli w temperaturze 94 °C przez 30 s, 60 °C przez 30 s, 72 °C przez 30 s; 72 °C przez 2 min.
  7. Oceń jakość produktów PCR za pomocą elektroforezy na 2,0% żelu agarozowym5,9 i potwierdź sekwencję docelową za pomocą sekwencjonowania Sangera.
  8. Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z wytycznymi producenta9,23.
  9. Wykorzystaj system RNAi do syntezy dsRNA dla docelowego genu z 10 μL 2x buforu (0,02 U/μL), 8 μL matrycy DNA (75 ng / μL) i 2 μL mieszanki enzymów (1 U/50 μL) z następującymi ustawieniami: 37 °C przez 30 min, 70 °C przez 10 min, i 25 °C przez 20 min. Eluować zsyntetyzowane dsRNA za pomocą 30 μl wody wolnej od nukleaz
    10. .
  10. Oceń jakość produktu dsRNA, wizualizując go na 1,0% żelu agarozowym5,9. Rozcieńczyć dsRNA do 7 000 ng/μl. Sprawdź jakość produktu dsRNA; kontynuuj, jeśli wartość OD260/OD280 mieści się w zakresie od 1,8 do 2,09. Produkt dsRNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.

3. Przeszczepienie poczwarek T. denrolimi

  1. Hoduj jaja pasożytniczego żywiciela przez około 8 dni w temperaturze 25 ± 1°C, utrzymując cykl 16 godzin światła/8 godzin ciemności i wilgotność względną ~75%. Jaja pasożytniczego żywiciela czernieją po 5 dniach30 (Rysunek 1-iv,v).
  2. Przenieś kartę jaja gospodarza do mikroskopu preparacyjnego. Użyj pary igieł wolframowych (Rysunek 1-vi), aby skrupulatnie usunąć kosmówkę z jaj gospodarza (Rysunek 1-vii) i odzyskaj poczwarkę od wewnątrz (Rysunek 1-viii)5,17,18.
    UWAGA: Końcówka igły preparacyjnej powinna być mniejsza niż 0,05 mm.
  3. Przygotuj czystą płytę na podłoże. Wylej 10-15 ml roztworu agaru o stężeniu 15 g/l, pozwalając mu naturalnie ostygnąć (Rysunek 2-i).
    UWAGA: Wymieszaj roztwór agaru z 0,5 g streptomycyny, aby zahamować wzrost zanieczyszczeń in vitro.
  4. Za pomocą zdezynfekowanego grawera wytraw kilka rowków o głębokości 0,2-0,3 mm i szerokości 0,4-0,8 mm (Rysunek 2-ii).
  5. Użyj małego pędzelka (Rysunek 2-iii), aby przesadzić poczwarkę z wypreparowanego jaja gospodarza do jednego z rowków na podłożu agarowym (Rysunek 2-iv).
  6. Powtórz kroki 3.4 i 3.5, przesadzając 100-300 poczwarek pojedynczo do rowków jeden po drugim (Rysunek 2-v).

4. Mikroiniekcja dsRNA do poczwarki T. denrolimi

  1. Użyj ściągacza do szklanych igieł, aby pociągnąć szklaną kapilę (Rysunek 3-i,ii). Ustaw ciepło na 280, prędkość na 170, opóźnienie na 250, a pociągnięcie na 30 na ściągaczu igłowym (Rysunek 3-iii). Przygotuj wiele igieł ze szkła kapilarnego do mikroiniekcji (Rysunek 3-iv,v).
  2. Skosuj końcówkę szklanej igły za pomocą płytki ściernej (Rysunek 3-vi).
    UWAGA: Upewnij się, że końcówka igły do wstrzykiwań pozostaje ostra; w przeciwnym razie może to spowodować śmiertelność poczwarki lub utrudnić przepływ odczynnika przez igłę (Rysunek 3-vii).
  3. Załadować około 2 μl roztworu do wstrzykiwań dsRNA o stężeniu 7 000 ng/μl do przygotowanej igły iniekcyjnej za pomocą pompy do mikroiniekcji (Rysunek 3-vii).
  4. Przenieś substrat agarowy zawierający setki poczwarek na platformę mikroskopu złożonego (Rysunek 3-viii).
  5. Ostrożnie wprowadzić igłę do wstrzykiwań do brzucha poczwarki T. denrolimi pod kątem ~30° do brzucha pod soczewką (Rysunek 3-ix).
  6. Stopniowo wstrzykiwać ~5 nL roztworu do wstrzykiwań (krok 4.3) do poczwarki T. denrolimi tak delikatnie, jak to możliwe.
    UWAGA: Poczwarka T. denrolimi może nieznacznie pęcznieć po wstrzyknięciu roztworu dsRNA. Wstrzyknięcie nadmiernej ilości roztworu do poczwarki lub użycie igieł ze zbyt dużymi otworami może spowodować przedwczesną śmierć poczwarki. Zmień igły, gdy zostaną zatkane po wstrzyknięciu od kilku do kilkudziesięciu poczwarek.
  7. Powtórz kroki 4.5 i 4.6, wstrzykując dsRNA do 600 poczwarek jeden po drugim.
    UWAGA: Aby uzyskać wiarygodną analizę RT-qPCR, zawartość RNA należy wyizolować z co najmniej 100 poczwarek. Wstrzyknąć co najmniej 600 poczwarek dla trzech powtórzeń w leczeniu dsRNA i trzech powtórzeń w kontroli negatywnej dsGFP 9.

5. Inkubacja poczwarek T. denrolimi

  1. Przenieść substrat zawierający wstrzyknięte poczwarki do inkubatora w temperaturze 25 ± 1 °C w cyklu 16 godzin/8 godzin światło/ciemność i wilgotności względnej ~75%.
  2. Inkubować około 700 poczwarek T. denrolimi na zabieg przez 24 godziny lub 48 godzin. Wyodrębnij zawartość RNA z grupy 100 poczwarek na replikę9.
    UWAGA: Usunąć skurczone poczwarki (martwe poczwarki) z próbek; W przeciwnym razie może to spowodować błędy w wykrywaniu ekspresji genów.
  3. Inkubuj ~ 50 poczwarek T. denrolimi na zabieg, aż pojawią się osy (Rysunek 3-x). Rejestruj szybkość pojawiania się i szybkość deformacji.

6. Wykrywanie docelowej ekspresji genów

  1. Zaprojektuj zestaw starterów dla genu docelowego i genów referencyjnych dla RT-qPCR za pomocą narzędzia do projektowania.
    UWAGA: Upewnij się, że sekwencje starterów RT-qPCR nie nakładają się na docelowy region dsRNA.
  2. Zastosuj gen forkhead box O (FoxO) jako gen referencyjny w analizie RT-qPCR; startery FoxO zostały zgłoszone wcześniej9.
  3. Uzyskaj komercyjnie zsyntetyzowane zestawy starterów. Wykonać RT-qPCR z 10 μL Taq II (1 U/50 μL), 0,8 μL startera doprowadzającego (0,4 μM), 0,8 μL startera odwrotnego (0,4 μM), 0,8 μL matrycy (10 ng/μL) i 7,6 μLH2O. Wykonaj RT-qPCR przy następujących ustawieniach: 95 °C przez 30 s; 35 cykli w temperaturze 95 °C przez 5 s, 57 °C przez 30 s, 72 °C przez 30 sekund; 95 °C przez 10 s; 60 °C przez 5 s i 95 °C przez 5 s.
  4. Oblicz wartość ekspresji docelowego genu za pomocą metody 2-ΔΔCt9,25.
  5. Zastosuj test Kruskala-Wallisa do analizy ekspresji docelowego genu pod wpływem różnych metod leczenia (dsFerhch, dsGFP, bez iniekcji).
    UWAGA: Unikaj używania testów parametrycznych (np. testu t) do porównań post-hoc, ponieważ heteroskedastyczność i nienormalność danych mogą prowadzić do błędnych wniosków25.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szybkość pojawiania się poczwarek T. denrolimi, którym wstrzyknięto dsFerhch, była znacznie niższa niż u tych, którym wstrzyknięto dsGFP lub tych bez wstrzyknięć (Tabela 1). Wśród wynurzonych os 51,85% os T. denrolimi poddanych dsFerhch rozwinęło zdeformowane małe skrzydła. Zdeformowanych os nie zaobserwowano u os, którym wstrzyknięto dsGFP lub bez żadnej iniekcji (Tabela 1). Co więcej, odwłoki poczwarek T. denrolimi, którym ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Osy Trichogramma są uznawane za skuteczne środki kontroli biologicznej, w szczególności zwalczające szereg szkodników z rzędu Lepidoptera w rolnictwie i leśnictwie1. Te maleńkie osy przechodzą swoje niedojrzałe stadia w jaju gospodarza, co stanowi wyzwanie w przeprowadzaniu eksperymentów RNAi 5,18. Badanie to stanowi kompleksowy przewodnik wizualny do przeprowadzania eksperymentów RNAi na T. denrolimi. Biorąc pod uwagę ws...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te badania zostały sfinansowane przez Projekty Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (32172476, 32102275), Program Innowacji Naukowych i Technologicznych w Rolnictwie (CAAS-ZDRW202203, CAAS-ZDRW202108) oraz Centralne Fundusze Kierujące Lokalnym Rozwojem Nauki i Technologii (XZ202301YD0042C).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2x ES Taq MasterMix (Dye)Cowin Biotech, ChinyCW0690HDo amplifikacji sekwencji dsRNA
20x bufor PBS, traktowany DEPC (7.2-7.6)Sangon Biotech, ChinyB540627-0500Do rozcieńczania paska
agarowegoShishi Globe Agar Industries Co., Ltd, Chinynie dotyczyDo produkcji pożywki hodowlanej
Ampicylina sodowaSangon Biotech, ChinyA610028Do zrobienia
pożywka hodowlana Bioer Kąpiel metalowa o stałej temperaturze BIOER, ChinyMB-102Do syntezy kapilary ze
szkła borokrzemianowego dsRNA WPI, USA1B100-4Do wyciągania szklanej igły kapilarnej
Czysta ławka Airtech, ChinySW-CJ-1FDDo ekstrakcji RNA
Podwójnie destylowana wodaSangon Biotech, ChinyA500197-0500Do rozcieńczania
cDNA Komora do badań środowiskowych Panasonic, JaponiaMLR-352H-PCDo hodowli T. denrolimi
Eppendorf Wirówka Eppendrof, Niemcy5418RDo przechowywania zawartości RNA
Eppendorf FemtoJet 4iEppendrof, NiemcyFemtoJet 4iDo wstrzykiwania T. denrolimi
Eppendorf Wirówka z chłodzeniem Eppendrof, Niemcy5810RWirówka
Roztwór etanolu (75%, bez RNaz)Aladdin, ChinyM052131-500mlDo ekstrakcji żelu RNA
ekstrakcjiOmega, USAD25000-02Do ekstrakcji cDNA
GUM ArabicSolarbio, ChinyCG5991-500gAby zrobić kartę jajeczną
Izopropyl alchoholAladdin, Chiny80109218Aby wyekstrahować RNA
Laserowy ściągacz do mikropipet SUTTER, USAP-2000Do ciągnięcia szklanej igły kapilarnej
Mikroładowarka Eppendrof, Niemcy20 & mikro; LAby załadować młynek do tkanek wielopróbkowych dsRNA
 POROSTY, ChinyLC-TG-24Do mielenia T. denrolimi
Szlifierka igłowa SUTTER, USABV-10-EDo mielenia szklanej igły kapilarnej
Woda wolna od nukleazSangon Biotech, ChinyDo rozcieńczania RNA
MikroskopOLYMPUS OLYMPUS, JaponiaXZX16Aby obserwować
maszynę do PCRBio-rad, USAS-1000Do amplifikacji DNA
PowerPac BasicBio-rad, USAPowerPacTM Basic Dowykrywania jakości dsRNA 
Podkład dsGFP (Naprzód)[TAATACGACTCACTATAGGG]
ACAAACCAAGGCAAGTAATA
Starter dsGFP (Reverse)[TAATACGACTCACTATAGGG]
CAGAGGCATCTTCAACG
Starter Ferhch dla qPCR (Naprzód)TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCTGCT
Starter Ferhch dla qPCR ( Odwrócony)CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT
Starter Ferhch dla RNAi (Reverse)[TAATACGACTCACTATAGGG]AG
TAGCCATCATCTTTCC
Starter Ferhch dla RNAi(Forward)[TAATACGACTCACTATAGGG]
ACACTGTCAATCGTCCTG
Starter of FoxO dla qPCR (do przodu)CTACGCCGATCTCATAACGC
Starter FoxO do qPCR (odwrócony)TGCTGTCCCCTTGTCCT
Zestaw odczynników PrimeScript RT z gumką gDNA (idealny czas rzeczywisty)TaKaRa, JaponiaRR047A Ilościowy
PCR w czasie rzeczywistym Bio-rad, USACFX 96 TouchDo przeprowadzania reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR) 
do projektowania starterów i sond do PCR w czasie rzeczywistym (TaqMan)https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/
T7 RiBoMAX Express RNAi SystemPromega, USAP1700Do syntezy dsRNA   in vitro 
TB Green Premix Ex TaqTM figure-materials-1 (Til RnaseH Plus)TaKaRa, JaponiaRR820ADo wykonywania RT-qPCR
TrichlorometanKESHI, ChinyGB / T682-2002Do ekstrakcji odczynnika RNA
TRIzolAmbion, USA15596018Do ekstrakcji całkowitej zawartości RNA z próbek
Zamrażarka ultraniskotemperaturowa Thermo, Stany ZjednoczoneForma 911
dsRNA Zestaw do T. denrolimi Narzędzie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status and perspectives. Annu Rev Entomol. 66, 463-484 (2020).
  2. Zhou, J. C., et al. Optimal clutch size for quality control of bisexual and Wolbachia-infected thelytokous lines of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) mass reared on eggs of a substitutive host, Antheraea pernyi Guérin-Méneville (Lepidoptera: Saturniidae). Pest Manag Sci. 76 (8), 2635-2644 (2020).
  3. Li, T. H., et al. Current status of the biological control of the fall armyworm Spodoptera frugiperda by egg parasitoids. J Pest Sci. 96, 1345-1363 (2023).
  4. Zhou, J. C., et al. Effects of temperature and superparasitism on quality and characteristics of thelytokous Wolbachia-infected Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) during mass rearing. Sci Rep. 9 (1), 18114(2019).
  5. Zhou, J. C., et al. Penetrance during Wolbachia-mediated parthenogenesis of Trichogramma wasps is reduced by continuous oviposition, associated with exhaustion of Wolbachia titers in ovary and offspring eggs. Pest Manag Sci. 78 (7), 3080-3089 (2022).
  6. Huang, N. X., et al. Long-term and large-scale releases of Trichogramma promote pesticide decrease in maize in northeastern China. Entomol Gen. 40 (4), 331-335 (2020).
  7. Wang, P., et al. Performance of Trichogramma japonicum as a vector of Beauveria bassiana for parasitizing eggs of rice striped stem borer, Chilo suppressalis. Entomol Gen. 41 (2), 147-155 (2021).
  8. Ning, S. F., et al. The identification and expression pattern of the sex determination genes and their sex-specific variants in the egg parasitoid Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae). Front Physiol. 14, 1243753(2023).
  9. Huo, L. X., et al. Selection and evaluation of RT-qPCR reference genes for expression analysis in the tiny egg parasitoid wasp, Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae). J Asia Pac Entomol. 25 (2), 101883(2022).
  10. Leung, K., et al. Next-generation biological control: the need for integrating genetics and genomics. Biol Rev Camb Philos Soc. 95 (6), 1838-1854 (2020).
  11. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  12. Leonard, S. P., et al. Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens. Science. 367 (6477), 573-576 (2020).
  13. Sun, Y., et al. Silencing an essential gene involved in infestation and digestion in grain aphid through plant-mediated RNA interference generates aphid-resistant wheat plants. Plant Biotechnol J. 17 (5), 852-854 (2019).
  14. Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation. J Vis Exp. 130, e56990(2017).
  15. Dalla Benetta, E., Chaverra-Rodriguez, D., Rasgon, J. L., Akbari, O. S. Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis. J Vis Exp. 166, e61892(2020).
  16. Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nat Protoc. 1 (1), 486-494 (2006).
  17. Zhu, K. Y., Palli, S. R. Mechanisms, Applications, and Challenges of Insect RNA Interference. Annu Rev Entomol. 65, 293-311 (2020).
  18. Colinet, D., et al. Development of RNAi in a Drosophila endoparasitoid wasp and demonstration of its efficiency in impairing venom protein production. J Insect Physiol. 63, 56-61 (2014).
  19. Wang, B., et al. A digestive tract expressing α-amylase influences the adult lifespan of Pteromalus puparum revealed through RNAi and rescue analyses. Pest Manag Sci. 75 (12), 3346-3355 (2019).
  20. Zhou, J. C., et al. Wolbachia-infected Trichogramma dendrolimi is outcompeted by its uninfected counterpart in superparasitism but does not have developmental delay. Pest Manag Sci. 79 (3), 1005-1017 (2023).
  21. Zhou, J. C., et al. Posterior concentration of Wolbachia during the early embryogenesis of the host dynamically shapes the tissue tropism of Wolbachia in host Trichogramma wasps. Front Cell Infect Microbiol. 13, 1198428(2023).
  22. Lee, T. Y. The development of Trichogramma evanescens Westw. and its influence on the embryonic development of its host, Attacus cynthia ricini Boisd. Acta Entomol Sin Z. 11 (1), 89-119 (1961).
  23. Shen, Y., Chen, Y. Z., Zhang, C. X. RNAi-mediated silencing of genes in the brown planthopper Nilaparvata lugens affects survival, growth and female fecundity. Pest Manag Sci. 77 (1), 365-377 (2021).
  24. Wu, S., Yin, S., Zhou, B. Molecular physiology of iron trafficking in Drosophila melanogaster. Curr Res Insect Sci. 50, 100888(2022).
  25. Zhou, J. C., et al. Wolbachia-Driven Memory Loss in a Parasitic Wasp Increases Superparasitism to Enhance Horizontal Transmission. mBio. 13 (6), e0236222(2022).
  26. Ning, S. F., Zhou, J. C., Liu, Q. Q., Zhao, Q., Dong, H. Gradual, temperature-induced change of secondary sexual characteristics in Trichogramma pretiosum infected with parthenogenesis-inducing Wolbachia. PeerJ. 7, e7567(2019).
  27. Zhang, C., et al. Decreased Wolbachia titers cause gradual change in masculinization of intersex individuals of thelytokous Trichogramma dendrolimi. Entomol Gen. 42 (5), 751-759 (2022).
  28. Zhang, X., et al. Multi-parasitism: A promising approach to simultaneously produce Trichogramma chilonis and T. dendrolimi on eggs of Antheraea pernyi. Entomol Gen. 41 (6), 627-636 (2021).
  29. Zhou, J. C., et al. Effects of Thelytokous parthenogenesis-inducing Wolbachia on the fitness of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) in superparasitised and single-parasitised hosts. Front Ecol Evol. 9, 730664(2021).
  30. Flanders, S. E. Notes on the life history and anatomy of Trichogramma. Ann Entomol Soc Am. 30 (2), 304-308 (1937).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

RNA InterferenceTrichogramma DendrolimiEgg ParasitoidGene KnockdownDouble Stranded RNAMicro InjectionHost Egg ParasitizationRT qPCR AnalysisFerritin Heavy ChainBiological Control

Powiązane artykuły