Wysokoprzepustowe fenotypowanie oparte na obrazie w celu określenia morfologicznych i fizjologicznych odpowiedzi na pojedyncze i połączone stresy u ziemniaka

Summary

Zaprojektowaliśmy protokół fenotypowania oparty na obrazach, aby określić morfologiczne i fizjologiczne reakcje na pojedyncze i skojarzone zabiegi upałów, suszy i podlewania. Podejście to umożliwiło identyfikację wczesnych, późnych i regeneracyjnych reakcji na poziomie całego zakładu, w szczególności części nadziemnych, a także podkreśliło konieczność stosowania wielu czujników obrazowania.

Abstract

Wysokoprzepustowe fenotypowanie oparte na obrazach jest potężnym narzędziem do nieinwazyjnego określania rozwoju i wydajności roślin w określonych warunkach w czasie. Korzystając z wielu czujników obrazowania, można ocenić wiele interesujących cech, w tym biomasę roślin, wydajność fotosyntezy, temperaturę baldachimu i wskaźniki odbicia liści. Rośliny są często narażone na wiele stresów w warunkach polowych, w których silne fale upałów, powodzie i susze poważnie zagrażają produktywności upraw. Kiedy stresy zbiegają się w czasie, wynikający z tego wpływ na rośliny może być wyraźny ze względu na synergiczne lub antagonistyczne interakcje. Aby wyjaśnić, w jaki sposób rośliny ziemniaka reagują na pojedyncze i połączone stresy, które przypominają naturalnie występujące scenariusze stresu, na wybraną odmianę ziemniaka (Solanum tuberosum L., odmiana Lady Rosetta) nałożono pięć różnych zabiegów na początku tuberyzacji, tj. kontrola, susza, upały, nasiąkanie wodą oraz kombinacje stresów związanych z upałem, suszą i podlewaniem. Nasza analiza pokazuje, że stres związany z podlewaniem miał najbardziej szkodliwy wpływ na wydajność roślin, prowadząc do szybkich i drastycznych reakcji fizjologicznych związanych z zamknięciem aparatów szparkowych, w tym zmniejszenia wydajności kwantowej i wydajności fotosystemu II oraz wzrostu temperatury korony drzew i indeksu wodnego. Pod wpływem ciepła i skojarzonego leczenia stresem względne tempo wzrostu uległo zmniejszeniu we wczesnej fazie stresu. Pod wpływem suszy i połączonych stresów objętość roślin i wydajność fotosyntezy spadły wraz ze wzrostem temperatury i zamknięciem aparatów szparkowych w późnej fazie stresu. Połączenie zoptymalizowanego leczenia stresu w określonych warunkach środowiskowych wraz z wybranymi protokołami fenotypowania pozwoliło na ujawnienie dynamiki morfologicznych i fizjologicznych reakcji na pojedyncze i złożone stresy. W tym artykule przedstawiono przydatne narzędzie dla badaczy roślin, którzy chcą zidentyfikować cechy roślin wskazujące na odporność na kilka stresów związanych ze zmianą klimatu.

Introduction

Potencjalne skutki zmian klimatycznych, w tym wzrost intensywności i częstotliwości fal upałów, powodzi i susz, mają negatywny wpływ na uprawę roślin¹. Ważne jest, aby zrozumieć wpływ zmian klimatycznych na zmienność upraw i wynikające z tego wahania rocznej produkcji roślinnej². Wraz z rosnącym zaludnieniem i zapotrzebowaniem na żywność, utrzymanie plonów roślin uprawnych jest wyzwaniem, dlatego pilnie potrzebne jest znalezienie odpornych na zmiany klimatu upraw do hodowli^3,4. Ziemniak (Solanum tuberosum L.) jest jedną z podstawowych roślin uprawnych, która przyczynia się do globalnego bezpieczeństwa żywnościowego ze względu na wysoką wartość odżywczą i zwiększoną efektywność wykorzystania wody. Jednak głównym problemem jest zmniejszenie wzrostu i plonowania w niesprzyjających warunkach, szczególnie w przypadku odmian podatnych^5,6. W wielu badaniach podkreślono znaczenie zbadania alternatywnych podejść do utrzymania produktywności upraw ziemniaków, w tym praktyk rolniczych, znalezienia tolerancyjnych genotypów i zrozumienia wpływu stresu na rozwój i plony7^,8,9, który jest również bardzo pożądany przez europejskich plantatorów ziemniaków (lub rolników)¹⁰.

Zautomatyzowane platformy fenotypowania, w tym fenotypowanie oparte na obrazach, umożliwiają ilościowe analizy struktury i funkcji roślin, które są niezbędne do wyboru odpowiednich cech zainteresowania^11,12. Fenotypowanie o wysokiej przepustowości jest zaawansowaną, nieinwazyjną techniką określania różnych cech morfologicznych i fizjologicznych w powtarzalny i szybki sposób ¹³. Chociaż fenotyp odzwierciedla różnice genotypowe w związku z efektami środowiskowymi, porównanie roślin w kontrolowanych warunkach ze stresem umożliwia powiązanie obszernych informacji o fenotypowaniu z określonym stanem (stresowym) ¹⁴. Fenotypowanie oparte na obrazie jest niezbędne do opisania zmienności fenotypowej, a także jest w stanie przebadać zestaw cech w całym rozwoju roślin, niezależnie od wielkości populacji¹⁵. Na przykład pomiar cech morfologicznych, w tym kształtu, wielkości i indeksu koloru liści za pomocą czujników obrazowania czerwono-zielono-niebieskiego (RGB), służy do określania wzrostu i rozwoju roślin. Ponadto pomiary cech fizjologicznych, w tym wydajności fotosyntezy, temperatury korony drzew i współczynnika odbicia liści, są określane ilościowo za pomocą wielu typów czujników, takich jak fluorescencja chlorofilu, termiczna podczerwień (IR) i obrazowanie hiperspektralne¹⁶. Ostatnie badania w kontrolowanych środowiskach wykazały potencjał wykorzystania fenotypowania opartego na obrazie do oceny różnych mechanizmów i reakcji fizjologicznych roślin w warunkach stresów abiotycznych, takich jak upały w ziemniakach¹⁷, susza w jęczmieniu¹⁸, rice¹⁹, oraz połączone susze i obróbki cieplnej w pszenicy²⁰. Mimo że badanie reakcji roślin na wielokrotne interakcje stresowe jest złożone, odkrycia ujawniają nowe informacje na temat mechanizmów działania roślin w radzeniu sobie z gwałtownymi zmianami warunków klimatycznych²¹.

Na fizjologiczne i morfologiczne reakcje roślin bezpośrednio wpływają warunki stresu abiotycznego (wysoka temperatura, deficyt wody i powodzie), co skutkuje spadkiem plonów²². Mimo że ziemniaki charakteryzują się wysoką efektywnością zużycia wody w porównaniu z innymi uprawami, deficyt wody negatywnie wpływa na ilość i jakość plonów ze względu na płytką architekturę korzeni⁵. W zależności od intensywności i czasu trwania suszy, wskaźnik powierzchni liści ulega zmniejszeniu, a opóźnienie wzrostu baldachimu z zahamowaniem tworzenia nowych liści jest wyraźne w późniejszych stadiach stresu, co prowadzi do zmniejszenia szybkości fotosyntezy²³. Progowy poziom wody jest krytyczny w przypadku nadmiaru wody lub przedłużających się okresów suszy, co ma negatywny wpływ na wzrost roślin i rozwój bulw z powodu ograniczenia tlenu, zmniejszonej przewodności hydraulicznej korzeni i ograniczenia wymiany gazowej^24,25. Co więcej, ziemniaki są wrażliwe na wysokie temperatury, w których temperatury powyżej optymalnych poziomów powodują opóźnioną inicjację, wzrost i tempo przyswajania bulw²⁶. Kiedy stresy pojawiają się w połączeniu, regulacje biochemiczne i reakcje fizjologiczne różnią się od indywidualnych reakcji na stres, co podkreśla konieczność zbadania reakcji roślin na kombinacje stresu²⁷. Połączone stresy mogą skutkować (jeszcze) poważnym ograniczeniem wzrostu roślin i determinującym wpływem na cechy związane z reprodukcją²⁸. Wpływ kombinacji stresu zależy od dominacji każdego stresu nad innymi, co prowadzi do wzmocnienia lub stłumienia reakcji roślin (np. susza zwykle prowadzi do zamknięcia aparatów szparkowych, podczas gdy aparaty szparkowe są otwarte, aby umożliwić chłodzenie powierzchni liści pod wpływem stresu cieplnego). Jednak wciąż pojawiają się połączone badania nad stresem i potrzebne są dalsze badania, aby lepiej zrozumieć złożoną regulację pośredniczącą w reakcjach roślin w tych warunkach²⁹. W związku z tym badanie to ma na celu podkreślenie i zalecenie protokołu fenotypowania przy użyciu wielu czujników obrazowania, które mogą być odpowiednie do oceny reakcji morfofizjologicznych i zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw ogólnej wydajności ziemniaków w przypadku pojedynczego i skojarzonego leczenia stresu. Zgodnie z hipotezą, połączenie wielu czujników obrazowania okazało się cennym narzędziem do scharakteryzowania wczesnych i późniejszych strategii podczas reakcji roślin na stres. Optymalizacja protokołu fenotypowania opartego na obrazie będzie interaktywnym narzędziem dla badaczy i hodowców roślin w celu znalezienia cech interesujących dla tolerancji na stres abiotyczny.

Protocol

1. Przygotowanie materiału roślinnego i warunki wzrostu

1. Przeszczep in vitro sadzonek ziemniaka (Solanum tuberosum L., cv. Lady Rosetta) z hodowli tkankowej do doniczek o pojemności 250 ml.
2. Napełnij doniczki w pełni nasyconym substratem Klasmman Substrate 2 i trzymaj je w komorze wzrostowej w warunkach słabego oświetlenia przez 1 tydzień.
3. Dostosuj warunki oświetleniowe na poziomie czaszy do 160 μmol·^m-2·^s-1 za pomocą kombinacji 25% światła białego i 35% podczerwieni za pomocą światłomierza.
4. Rośliny przesadzamy po 10 dniach uprawy sadzonek in vitro w glebie do doniczek o pojemności 3 litrów (średnica 15,5 cm, wysokość 20,5 cm).
5. Napełnij 3-litrowy garnek 1850 g 3:1 Klasmann Substrate 2: Sand.
6. Umieść rośliny w komorze wzrostowej w warunkach świetlnych 320 μmol·^m-2·^s-1 z kombinacją 55% światła białego i 81% podczerwieni i ustaw reżim długiego dnia (16 godzin fotoperiodu).
7. Ustaw temperaturę w komorze wzrostowej na 22 °C/19 °C dla dnia/nocy i wilgotność względną (RH) na 55% dla całego eksperymentu.
8. Utrzymuj masę doniczki na poziomie 60% względnej zawartości wody w glebie (SRWC) jako odpowiedniego poziomu kontrolnego, aby utrzymać wzrost i plony^30,31.
   UWAGA: Na podstawie poprzednich badań, utrzymanie objętościowej zawartości wody powyżej 60% sprzyjało wzrostowi mchu na powierzchni gleby i zwiększało ryzyko chorób roślin. Ponadto obecność mchu może generować mylące pozytywne sygnały z obrazowania fluorescencyjnego chlorofilu, które jest trudne do odfiltrowania. Użyj następującego równania: SRWC% = (FW-DW)/(TW-DW) × 100, gdzie FW to świeża masa gleby, TW to masa turgoru, a DW to sucha masa³².
   1. Pobrać próbki gleby (100 g) z trzech różnych worków z mieszanką Klasmman Substrate 2 jako powtórzenia i zważyć świeżą masę gleby.
   2. Nasyc glebę wodą, aż doniczki zatrzymają wodę bez kapania i zważą ciężar turgoru gleby.
   3. Umieścić próbkę w piecu w temperaturze 80 °C na 3 dni, aż próbki gleby całkowicie wyschną, a następnie zważyć glebę w stanie suchym³³.
9. Umieść niebieskie maty na powierzchni doniczki, aby zmniejszyć parowanie.
   UWAGA: Kolor niebieski jest niezbędny, aby odjąć tło gleby od pikseli roślin w segmentacji obrazu.
10. Wybierz dziesięć kontrprób biologicznych na zabieg.
11. Losowo dobieraj doniczki podczas nawadniania (w sumie 50 doniczek).
12. Dodaj niebieskie uchwyty, aby podeprzeć rośliny i uniknąć uszkodzeń mechanicznych podczas umieszczania ich w systemie fenotypowania.

2. Zastosowanie stresu

1. Na wczesnym etapie tuberyzacji (28 dni po przesadzeniu sadzonek in vitro) podziel rośliny na pięć grup poddanych działaniu substancji i fenotypuj dziesięć roślin na zabieg (Rysunek 1).
2. Wywołaj pojedynczy i połączony stres do poziomu, który nie jest szkodliwy, w następujący sposób:
   1. W komorze wzrostowej utrzymuj rośliny pod kontrolą, zabiegi suszy i podlewania w temperaturze 22 °C/19 °C dzień/noc (krok 1.7), z różnymi procentami SRWC:
      Kontrola (C) z 60% SRWC dla całego eksperymentu.
      Susza (D) z 20% SRWC stopniowo przez 7 dni, po czym następuje 1 dzień rekonwalescencji.
      Nasiąkanie wodą (W) ze 160% SRWC przez 5 dni, a następnie 10 dni regeneracji.
   2. Aby utrzymać poziom wody nad powierzchnią gleby podczas zabiegu nasiąkania wodą, włóż plastikową torbę do pustej doniczki, a następnie umieść główną doniczkę z ziemią w przygotowanej drugiej doniczce.
   3. Umieść rośliny w kapsule wzrostowej w temperaturze 30/28 °C dzień/noc i 55% wilgotności względnej do obróbki cieplnej. Nałożyć pojedyncze i połączone naprężenia cieplne w następujący sposób:
      1. W przypadku ciepła (H) utrzymuj temperaturę 30-28 °C z 60% SRWC przez 15 dni.
      2. W przypadku potrójnego stresu Upał + Susza + Podmokłość (HDW) należy wystawić rośliny na obróbkę cieplną w temperaturze dzień/noc 30 °C/28 °C przez pierwsze 7 dni (przy zachowaniu 60% SRWC), a następnie suszę + połączone leczenie cieplne przez pozostałe 7 dni (20% SRWC i 30 °C/28 °C) i na koniec wystawić rośliny na stres związany z podlewaniem przez 1 dzień. W tym drugim przypadku umieść rośliny z powrotem w komorze wzrostowej (patrz krok 1.7, aby zapoznać się z warunkami) i wywołaj nasiąkanie wodą do 160% SRWC przez 1 dzień.
         UWAGA: Wybrane czasy trwania indukowanych stresów oparto na eksperymencie pilotażowym, który wykazał efekty stresu bez szkodliwego wpływu przy 100% przeżywalności traktowanych roślin. W środowisku komory wzrostowej zmienność warunków środowiskowych mieściła się w zakresie ± 0,2 °C dla temperatury i ± 3% dla wilgotności.

3. Przygotowanie roślin do fenotypowania

1. Po włączeniu świateł o godzinie 6:00 rano w komorach wzrostowych, należy pozwolić roślinom na aklimatyzację w stałych warunkach oświetleniowych wzrostu (320 μmol·^m-2·^s-1) przez co najmniej 2-3 godziny przed rozpoczęciem protokołu fenotypowania. Gwarantuje to, że fotosynteza i regulacja aparatów szparkowych są w stanie ustalonym³⁴.
2. Przed pomiarem należy przenieść rośliny z miejsca uprawy do obszaru bufora wzrostu systemu fenotypowania używanego do ręcznego ładowania roślin do systemu, podczas gdy automatyczne ocenianie jest w trybie czuwania i jest umieszczone w szklarni (rysunek uzupełniający 1, rysunek uzupełniający 2 i rysunek uzupełniający 3).
   UWAGA: Rośliny utrzymywano w obszarze buforowym wzrostu w okresie fenotypowania trwającym 3,5 godziny. W szklarni zmienność warunków środowiskowych mieściła się w zakresie ± 2 °C dla temperatury, ± 5% dla wilgotności i 20% wahań natężenia światła. Dlatego należy wziąć pod uwagę, że pomiary powinny rozpocząć się natychmiast i być krótkie, unikając wpływu warunków szklarniowych na rośliny.
3. Na platformie fenotypowania umieść doniczki w dyskach, które automatycznie przesuwają się po przenośniku taśmowym w określonych odstępach czasu do czujnika obrazowania zgodnie z protokołami pomiarowymi określonymi w sekcji 4.
4. Oznacz każdą roślinę/tacę unikalnym identyfikatorem, aby upewnić się, że zmierzone dane są przypisane do właściwej rośliny przez cały czas trwania eksperymentu.

4. Protokół fenotypowania

1. Zoptymalizuj protokół fenotypowania za pomocą wielu czujników obrazowania (fluorescencja chlorofilu, termiczne IR, RGB i obrazowanie hiperspektralne), umożliwiając w ten sposób jednoczesny pomiar zarówno parametrów fizjologicznych, jak i morfologicznych roślin (Rysunek 2).
   UWAGA: Ponieważ reakcje roślin odzwierciedlają warunki środowiskowe i efekty dobowe, ważne jest, aby rozważyć randomizację doniczek i przeprowadzenie fenotypowania w tym samym okresie dnia.
2. Na platformie fenotypowania upewnij się, że rośliny wchodzą do systemu przez tunel adaptacyjny (Rysunek 2A), w którym najpierw rejestrowana jest wysokość rośliny, a następnie wysokość każdego czujnika jest dostosowywana w oparciu o ustaloną odległość roboczą.
3. Przeprowadź pomiary w dwóch rundach, zgodnie z uzasadnieniem w protokole pomiarowym za pomocą oprogramowania.
   1. W pierwszej rundzie obejmują pomiary reakcji fizjologicznych określanych ilościowo jako "szybkie reakcje" przy użyciu fluorescencji chlorofilu i obrazowania termicznego.
   2. Zacznij od pomiaru parametrów fizjologicznych podczas zabiegów stresu cieplnego, a następnie pozostałych zabiegów.
   3. W drugiej rundzie przejdź do innych pomiarów w celu oceny wolniejszych reakcji, w tym strukturalnego RGB i obrazowania hiperspektralnego, a następnie oceny wagi i podlewania.
4. Na etapie ważenia i podlewania należy zdefiniować masę odniesienia dla każdej rośliny, aby umożliwić automatyczne podlewanie i ważenie do danego zabiegu.
   1. Upewnij się, że całkowita masa referencyjna obejmuje ciężar dysku, wkładki umieszczonej na przenośniku taśmowym, niebieskiego uchwytu nośnego, niebieskiej maty, doniczki, gleby i biomasy roślinnej w zdefiniowanym protokole.
   2. Aby uzyskać dokładny pomiar ewapotranspiracji na etapie ważenia i podlewania, przygotuj puste doniczki jako odniesienie. Ponadto przygotuj dodatkowe doniczki, aby skorygować masę biomasy roślin.
5. Aby zmierzyć 50 roślin, cały czas trwania protokołu fenotypowania trwa 215 minut (85 minut w 1 rundzie i 130 minut w 2 rundzie).
6. Fenotyp codziennie wszystkie rośliny w warunkach kontrolnych (1 dzień przed zabiegiem), a następnie indukować zabiegi stresowe w celu monitorowania dynamicznych reakcji i oceny wczesnych i późnych faz wywołanego stresu.

5. Dostosowywanie ustawień dla każdego sensora obrazowania

1. Kinetyczne obrazowanie fluorescencyjne chlorofilu
   UWAGA: Kinetyczna fluorescencja chlorofilu służy do badania zdolności fotosyntetycznych roślin w odpowiedzi na różne warunki środowiskowe, w tym stresy abiotyczne, oraz do dostarczania cennych informacji na temat wydajności kwantowej fotochemii i rozpraszania ciepła (proces niefotochemiczny).
   1. Przeprowadź pomiar fluorescencji chlorofilu na roślinach przystosowanych do światła, stosując protokół krótkiego światła, aby rozróżnić reakcje roślin na różne zabiegi.
   2. Acmission³⁵ rośliny przez 5 minut pod światłem w tunelu adaptacyjnym wyposażonym w chłodne białe diody LED (6500 K) o temperaturze 500 μmol·^m-2·^s-1,
      UWAGA: Obrazowanie fluorescencji chlorofilu jest pierwszym pomiarem po adaptacji światła, stosowanym do monitorowania zmian zdolności fotosyntetycznych roślin.
   3. Wybierz i zoptymalizuj wstępnie zdefiniowany protokół w zależności od wielkości zakładu i wymaganego natężenia światła.
   4. Zoptymalizuj ustawienia pomiaru, w tym ustawienia kamery i natężenia światła, aby zapewnić uzyskanie silnego sygnału o optymalnym stosunku sygnału do szumu.
      1. Dostosuj ustawienia aparatu, takie jak migawka (czas naświetlania, czas pomiaru błysków) i czułość (wzmocnienie elektryczne aparatu). Używaj migawki przy 2 ms i czułości 12%.
         UWAGA: Wartości te są dostosowywane w zależności od rozmiaru i kształtu skrzydła oraz zdefiniowanej odległości między górną częścią baldachimu a czujnikiem obrazu.
      2. Dostosuj natężenie światła aktynicznego na 500 μmol·^m-2·^s-1 i ustaw impuls nasycenia na 3200 μmol·^m-2·^s-1, czyli co najmniej 6-7 razy więcej niż światło aktynowe.
   5. Do pomiaru parametrów w lekkim stanie ustalonym (Lss) (opisanym poniżej) instalacje przystosowujące się do światła przez 5 minut przed pomiarami w tunelu do adaptacji światła.
   6. Aby oszacować wydajność kwantową fotosystemu w stanie ustalonym II (PSII) roślin przystosowanych do światła, wybierz protokół krótkiego światła (Rysunek 3) i ustaw protokół w następujący sposób.
      UWAGA: Czas trwania protokołu wynosił 10 s na roślinę.
      1. Rozpocznij pomiar od włączenia chłodnego białego światła aktynicznego o temperaturze 500 μmol·^m-2·^s-1 na 3 sekundy, aby zmierzyć fluorescencję światła w stanie ustalonym (F_t_Lss aka. F_t')
      2. Zastosuj impuls nasycenia przy 3200 μmol·^m-2·^s-1 przez 800 ms, aby zmierzyć maksymalną fluorescencję w stanie ustalonym w świetle (F_m_Lss aka. F_m')
      3. Wyłącz światło aktyniczne, a następnie włącz światło dalekiej czerwieni (735 nm), aby umożliwić PSII relaks w ciemności przez 800 ms i zmierz minimalną fluorescencję w stanie ustalonym w świetle (F_o_Lss aka. F_o').
   7. Aby obliczyć parametry względne, użyj oprogramowania do analizy danych, które odejmuje tło i wyodrębnia odpowiednie parametry.
      UWAGA: Parametry wyodrębnione z zastosowanego protokołu to: maksymalna wydajność fotochemii PSII próbki przystosowanej do światła w stanie ustalonym pod wpływem światła, określona jako F_v/F_m_Lss aka. F_v'/F_m', wydajność kwantowa fotosystemu II lub sprawność operacyjna fotosystemu II w stanie ustalonym pod względem światła zdefiniowanym jako QY_Lss aka. φ_PSII = F_q'/F_m', a frakcję otwartych centrów reakcji w PSII (utlenione QA) określa się jako qL_Lss = (F_q'/F_v') x (F₀'/F_t').
2. Obrazowanie termiczne w podczerwieni (IR)
   UWAGA: Obrazowanie termiczne w podczerwieni służy do nieinwazyjnego pomiaru rzeczywistej temperatury czaszy, określając w ten sposób różne regulacje szparkowe. W jednostce termowizyjnej w podczerwieni kamera termowizyjna jest zamontowana z boku na ramieniu robota w celu pomiaru temperatury czaszy z boku.
   1. Aby zwiększyć kontrast temperatury tła w stosunku do temperatury obrazowanego obiektu podczas przetwarzania obrazu, należy użyć automatycznie sterowanej podgrzewanej ściany po przeciwnej stronie kamery termowizyjnej w celu zwiększenia kontrastu. Wyreguluj temperaturę ścian na poziomie 8 °C wyższym niż temperatura powietrza w zespole obrazowania.
      UWAGA: Obrazy termowizyjne zostały uzyskane w ciemności przy użyciu trybu skanowania linii³⁵.
   2. Po pozyskaniu obrazu wygeneruj maskę roślinną na podstawie danych z widoku bocznego RGB i wykorzystaj ją do jednoczesnej rejestracji z danymi termicznymi w analizie obrazu. Zapewnia to precyzyjną identyfikację skanowanego obiektu przy jednoczesnym wyeliminowaniu zakłóceń tła, takich jak uchwyt rośliny.
   3. Aby zapobiec wpływowi zmiennych warunków środowiskowych w całym eksperymencie, należy obliczyć parametr różnica temperatur (delta T lub ΔT).
      UWAGA: Delta T (ΔT) definiuje się jako różnicę między zmierzoną temperaturą powierzchni liścia (średnią wszystkich pikseli z całej wykrytej powierzchni rośliny) a temperaturą powietrza otoczenia wewnątrz pola obrazowania.
3. Obrazowanie RGB
   UWAGA: Obrazowanie RGB opiera się na kamerach wizualnego systemu inercyjnego (VIS), które wykrywają światło w zakresie widzialnym od 400-700 nm, gdzie służy do dogłębnej analizy morfologii roślin, architektury i ekstrakcji cech indeksu kolorów.
   1. Zespół obrazowania zawiera obrotowy stół do precyzyjnego pozycjonowania tacy i jednocześnie umożliwia obrazowanie pod wieloma kątami dla widoków bocznych.
   2. Ustaw obrazowanie RGB w oparciu o obrazowanie z boku, aby uchwycić roślinę pod trzema kątami (0°, 120° i 240°), która jest wykonywana w trybie skanowania liniowego (RGB1) i obrazowaniu z góry w trybie migawki (RGB2).
   3. Obie kamery posiadają źródło światła oparte na diodach LED, zapewniające równomierne oświetlenie obrazowanej rośliny, a co za tym idzie dokładne określenie cech morfologicznych i kolorystycznych.
   4. Wyodrębnij obliczone parametry za pomocą oprogramowania do analizy danych.
   5. Aby uzyskać dodatkowe parametry na podstawie widoków z boku i z góry, oblicz objętość instalacji (biomasa cyfrowa)³⁶:
      
   6. Obliczać względną szybkość wzrostu (RGR)³⁷:
      
      Gdzie T_n i T_n+1 wskazują przedział czasu (dni).
4. Obrazowanie hiperspektralne
   UWAGA: Obrazowanie hiperspektralne służy do wizualizacji odbicia spektralnego roślin. Zmiany w współczynniku odbicia liści są wskaźnikami różnego stanu fizjologicznego danej rośliny.
   1. Użyj czujnika obrazowania hiperspektralnego, aby określić ilościowo współczynnik odbicia czaszy w widzialnej części widma światła, za pomocą kamery hiperspektralnej w zakresie widzialnym w bliskiej podczerwieni (VNIR) w zakresie 380-900 nm i kamery na podczerwień o krótkiej długości fali (SWIR) w zakresie 900-1700 nm.
   2. Kamery są zamontowane na ramieniu robota z zaimplementowanym źródłem światła w postaci lampy halogenowej (600 W) w celu uzyskania jednorodnego i odpowiedniego spektralnie oświetlenia próbki podczas akwizycji obrazu poruszającego się w obszarze XZ.
   3. Obie kamery działają w trybie skanowania liniowego i są umieszczone w izolowanym światłem pudełku do obrazowania.
   4. Przed każdą rundą pomiarową należy wykonać dwa pomiary kalibracyjne (automatycznie): kalibrację prądu ciemnego i kalibrację radiometryczną przy użyciu wzorca odbicia spektralnego teflonu.
   5. Ciemny obraz kalibracyjny jest odejmowany od surowego i białego obrazu kalibracyjnego w celu usunięcia szumu ciemnego prądu. Następnie wygeneruj końcowy obraz hiperspektralny, dzieląc surowy obraz po odjęciu przez biały obraz kalibracyjny.

6. Eksport danych i analiza obrazu

1. Użyj oprogramowania do analizy danych do automatycznej ekstrakcji, odejmowania tła i segmentacji maski roślinnej potoku przetwarzania obrazu (Rysunek 2B).
2. Oprogramowanie przeprowadza w pełni zautomatyzowaną analizę, w której nakładanie maski, odejmowanie tła, w którym rośliny są izolowane od tła, oraz obliczanie parametrów są przetwarzane zgodnie z opisem dla obrazowania RGB³⁸ i obrazowania termicznego²⁰.
3. Wyodrębnij zmierzone i obliczone parametry z pikseli specyficznych dla rośliny, zgodnie z definicją generowanej przez obraz RGB Maska roślinna i Maska tacy.
4. Jeśli obrazy nie zostały w pełni wybrane, co może wystąpić z powodu zmian w zazielenieniu roślinności w późniejszych stadiach rozwojowych lub efektu leczenia stresem, otwórz część analizy danych lokalnych w oprogramowaniu i ponownie dostosuj ustawienia maski roślin w oprogramowaniu analizatora danych w zależności od każdego czujnika.
5. W przetwarzaniu obrazu fluorescencji chlorofilu dostosuj parametry analizy ustawień maski roślinnej fluorescencji chlorofilu (rysunek uzupełniający 4).
   1. Ustaw próg jako True, co oznacza, że segmentacja roślin jest wykonywana automatycznie.
   2. Ustaw indeks ramki maski na wartość Fałsz, co oznacza, że do wykrywania maski roślinnej używana jest ramka czasowo-wizualna zdefiniowana w protokole fluorescencji chlorofilu.
6. W przypadku przetwarzania obrazu termicznego ustaw parametry analizy maski roślinnej (rysunek uzupełniający 5).
   1. Ustaw automatyczny próg generowania maski obiektu na wartość Fałsz.
   2. Ustaw maskę z obrazu bocznego RGB jako True, która ma być używana do analizy.
7. W przetwarzaniu obrazu RGB dostosuj parametry analizy ustawień maski roślinnej (rysunek uzupełniający 6 i rysunek uzupełniający 7) w zależności od gatunku i etapu rozwoju.
   1. Wybierz formułę 4*G-3*B-R, która jest definicją generowania maski obiektu i definiuje używany składnik koloru (składnik Czerwony, Zielony, Niebieski).
      UWAGA: Ta standardowa formuła i inne ustawienia mogą się zmieniać w zależności od typu używanej kamery (widok z góry lub rozmiaru), zastosowanego leczenia i różnych odmian.
   2. Dostosuj próg używany do konwersji obrazu w skali szarości z ulepszonym kanałem zielonym na obraz binarny określający powierzchnię pokrytą przez roślinę.
   3. Dostosuj rozmiar filtra mediany używanego do redukcji szumów i nieprawidłowych pikseli oraz uzupełnienia brakujących pikseli.
   4. Dostosuj minimalny rozmiar obiektu w pikselach, który ma zostać uwzględniony w analizie.
   5. Dostosuj minimalny rozmiar otworów w obiektach maski w pikselach, zwykle dziesiątki pikseli. Otwory mniejsze od tej wartości są zamykane i wprowadzane do pikseli obiektu.
   6. Ustaw opcję Użyj redukcji odbić na wartość True dla normalizacji wartości RGB w każdym pikselu.
   7. Ustaw opcję Pomiń źle naświetlone punkty jako True dla kadrowania nad/niedostatecznie naświetlonych pikseli z maski rośliny (np. pominięcie odbić powierzchni lub ciemnych pikseli, w których szum jest większy niż sygnał).
8. Pokoloruj ustawienia segmentacji analizowane na podstawie RGB za pomocą oprogramowania do analizy danych, aby dostarczyć informacji o zmianach koloru związanych z reakcjami na stres i starzeniem się roślin.
   UWAGA: Zieleń jest szacowana za pomocą predefiniowanego zakresu kolorów reprezentujących wszystkie etapy rozwoju rośliny. Intensywność kanałów kolorów ze wszystkich pikseli odpowiadających powierzchni rośliny została pogrupowana i zgrupowana w celu wykorzystania jako źródłowa mapa kolorów do segmentacji kolorów.
   1. Dostarcz przetworzony obraz RGB (usunięte tło), mapę kolorów - listę odcieni do konkretnej analizy, jako dane wejściowe w oprogramowaniu.
   2. Aby uzyskać bezstronne wyniki, dokonaj selekcji odcieni za pomocą zestawu danych "treningowych" i wybierz różne etapy rozwoju i zabiegi.
      UWAGA: Analiza zapisuje wartości R, G i B każdego piksela każdego obrazu z tego zestawu danych treningowych.
   3. Zdefiniuj liczbę odcieni (wybierz 6 odcieni) za pomocą oprogramowania do wyjścia definicji kolorów, w zakresie od 0 do 255 dla każdego kanału.
   4. Podaj listę odcieni wygenerowanych w oprogramowaniu analizatora danych (Kolory).
9. W przetwarzaniu obrazu hiperspektralnego przetwarzaj uzyskane dane hiperspektralne za pomocą analizy piksel po pikselu zaimplementowanej w oprogramowaniu analizatora hiperspektralnego, obejmującej kalibrację radiometryczną i ciemnego szumu, odejmowanie tła i segmentację masek roślinnych. Do dalszej analizy należy wykorzystać średnie widma i wskaźniki wegetacji.
10. Utwórz maskę do ekstrakcji danych z obrazu hiperspektralnego z obrazu VNIR wykonanego przez kamerę hiperspektralną VNIR. W przypadku skanowania hiperspektralnego SWIR wygeneruj maskę roślinną na podstawie analizy SHIR.
    1. W VNIR Plant Mask użyj wzoru 1.2*(2.5*(R740-R672)-1.3*(R740-R556)) do wizualizacji obrazów, w których R reprezentuje wartość odbicia w określonej długości fali (rysunek uzupełniający 8).
    2. W SWIR Plant Mask użyj wzoru (R960-R1450)-(R960-R1200) w przetwarzaniu obrazu w celu wizualizacji obrazów (rysunek uzupełniający 9).

7. Ważenie i podlewanie

1. Przechowuj wagę (przed) podlewaniem podczas procedury ważenia i podlewania. Następnie zastosuj podlewanie i utrzymuj wagę również po podlaniu.
2. Podlewaj tace w trybie referencyjnym - każda taca miała zapisaną w bazie danych wartość referencyjną, do której zawsze była podlewana. Określ odniesienie na podstawie leczenia.

8. Analiza danych

1. Przeanalizuj dane za pomocą testu ANOVA i Shapiro.
2. Przeprowadź porównania parami między różnymi zabiegami za pomocą testu Pairwise Wilcox w R studio (wersja 4.2.3) przy użyciu pakietów (dplyr), (tidyverse), (rstatix) i (ggpubr).
   UWAGA: Analiza obrazu została przeprowadzona automatycznie przy użyciu oprogramowania do analizy danych. Do dalszej analizy akwizycji obrazu należy użyć oprogramowania do analizy danych specyficznego dla czujnika.

Results

W tym badaniu, zautomatyzowane fenotypowanie oparte na obrazie zostało użyte do zbadania morfologicznych i fizjologicznych reakcji ziemniaka (odmiany Lady Rosetta) pod wpływem stresu pojedynczego i połączonego. Zastosowane podejście wykazało dynamiczne reakcje roślin w wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej po wywołaniu stresu na etapie inicjacji bulw. Aby ocenić wczesną i późną fazę stresu, wyniki przedstawiono jako 3 okresy czasowe ([0-5 dni fenotypowania (DOP)], [6-10 DOP] i [11-15 DOP]) (Rysunek 1). Do 0 DOP wszystkie rośliny uprawiano w warunkach kontrolnych (C), a następnie od 1-5 DOP, gdzie stosowano stres wodny (W) i stres cieplny (H). W związku z tym odpowiedzi zaobserwowano w następujący sposób: (i) w 0-5 DOP, wskazywały na początkowe ciepło i nasiąkanie wodą; (ii) w 6-10 DOP, odzwierciedlał wczesną suszę (D) i obserwowano połączone upały i suszę (HD), a (iii) w 11-15 DOP, wykazywał późne upały, suszę i połączone upały + suszę + nasiąkanie wodą (HDW). Powrót do zdrowia po nasiąkaniu wodą zaobserwowano w 6-10 DOP i 11-15 DOP.

Cechy morfologiczne
Obrazowanie RGB zastosowano w celu określenia wpływu różnych naprężeń i kombinacji na wzrost roślin nadziemnych. Wyniki w Rysunek 4 pokazują, że obróbka cieplna i stres nasiąkający wodą (0-5 DOP) już powodują zmniejszenie objętości rośliny i RGR w porównaniu z kontrolą. Podczas 6-10 DOP objętość roślin i RGR roślin kontrolnych stale wzrastały, podczas gdy pod wpływem upałów, upałów, suszy i podlewania, ten wzrost objętości roślin był wyraźnie zmniejszony (Rysunek 4A). Ponieważ rośliny są bardzo podatne na stres związany z podlewaniem, zauważalny był spadek RGR (Rysunek 4B). W okresie stresu suszy późnej (11-15 DOP), gdzie SRWC utrzymywało się na poziomie 20%, zaobserwowano wyraźne zmniejszenie RGR w porównaniu z kontrolą. Jednak w późnej fazie skojarzonego HDW zastosowanie leczenia nasiąkającego wodą spowodowało wzrost RGR w ostatnim dniu stresu.

Cechy fizjologiczne
Zastosowano połączenie fenotypowania strukturalnego i fizjologicznego, aby ujawnić dalsze reakcje na stres. Zastosowanie wielu czujników obrazowania umożliwia określenie reakcji fizjologicznych we wczesnej fazie stresu. Dalsza analiza danych dotyczących fluorescencji chlorofilu wykazała, że nasiąkanie wodą negatywnie wpływało na wydajność fotosyntezy, gdzie F_v'/F_m' (F_v / F_m_Lss) drastycznie spadło w 0-5 DOP i 6-10 DOP, ale odpowiedź regeneracyjną zaobserwowano w 11-15 DOP, gdzie F_v'/F_m' nieznacznie wzrosło (Rysunek 5A). W późnej fazie stresu (11-15 DOP) zaobserwowano zmniejszenie F_v'/F_m' w suszy oraz skojarzonych upałach i suszy. W podmokłych roślinach wydajność operacyjna roślin (QY_Lss aka. φ_PSII) była znacznie niższa w porównaniu z innymi zabiegami w 0-5 DOP i 6-10 DOP, ale nieznacznie wzrosła przy 11-15 DOP, co wskazuje na regenerację roślin (Rysunek 5B). Co więcej, różne mechanizmy regulacji wydajności przyczyniające się do ochrony PSII zostały określone poprzez obliczenie frakcji otwartych centrów reakcji w PSII w lekkim stanie ustalonym (qL_Lss) (Rysunek 5C). Jedynie w czasie suszy zaobserwowano wzrost qL, prawdopodobnie z powodu fotoinhibicji.

Te wyniki były zgodne z danymi IR, które odzwierciedlały różne mechanizmy leżące u podstaw naprężeń (Rysunek 6). W nasiąkaniu wodą zaobserwowano wzrost deltaT (ΔT), co zmniejszyło szybkość wymiany gazu. W przypadku późnej suszy oraz połączonych stresów związanych z upałami i suszą, wzrost ΔT był spowodowany zamknięciem aparatów szparkowych, uważanych za jedną z głównych reakcji na uniknięcie nadmiernej utraty wody. Z drugiej strony zaobserwowano zmniejszenie ΔT pod wpływem obróbki cieplnej, ponieważ aparaty szparkowe otwierają się w celu zwiększenia wydajności transpiracji i schłodzenia powierzchni liści.

Badając dane hiperspektralne, wybrano dwa parametry z hiperspektralnych danych VNIR do oceny wskaźników odbicia liści, w tym NDVI jako wskaźnik zawartości chlorofilu i PRI jako wskaźnik efektywności fotosyntezy. Wyniki wykazały spadek NDVI i PRI tylko w przypadku nasiąkania wodą w związku z redukcją obserwowaną w cechach morfologicznych (Figura 7A,B). Ponadto, na podstawie danych hiperspektralnych SWIR wykorzystywanych do oceny zawartości wody w roślinach, zaobserwowano wzrost indeksu wodnego w nasiąkaniu wodą podczas 0-5 DOP (Rysunek 7C). Jednak w przypadku obróbki cieplnej zaobserwowano odwrotną reakcję, w której indeks wodny był niższy niż w kontroli. Wyniki te były zgodne z badaniem roślinności na podstawie segmentacji kolorów widoku z góry RGB. Zmiany proporcji odcieni wskazują na reakcje na stres w czasie (Rysunek 8). Indeks zazielenienia wykazał zmniejszenie zawartości pigmentu w warunkach suszy i połączonego HDW w późnej fazie stresu i stopniowej regeneracji po zabiegach podmokłych. W związku z tym zastosowanie wielu czujników obrazowania odzwierciedliło korelację cech morfofizjologicznych i umożliwiło ocenę ogólnej wydajności roślin w warunkach stresu abiotycznego.

Rysunek 1: Harmonogram stosowania różnych zabiegów, w tym wiek roślin w dniach po przesadzeniu sadzonek in vitro. Dzień 0 fenotypowania (DOP) mierzono w warunkach kontrolnych (C), a następnie indukowano różne stresy o różnym czasie trwania. Od 1-5 DOP zastosowano naprężenia nasiąkające wodą (W) i początkową reakcję obróbki cieplnej (H). W kolejnych dniach 6-10 DOP, gdzie przedstawiono początkową fazę stresu suszy (D) oraz skojarzonego stresu cieplnego i suszy (HD). W okresie 11-15 DOP odzwierciedlono reakcję roślin na późną fazę suszy i zabiegów termicznych oraz zastosowanie nasiąkania wodą do HD (HDW) przez 1 dzień. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Schemat podsumowujący protokół fenotypowania i analizy danych. (A) Przegląd protokołu fenotypowania. Rośliny są transportowane do systemu fenotypowania z kontrolowanych warunków w komorze wzrostowej FS-WI (PSI). Rośliny były aklimatyzowane w komorze adaptacji światła przez 5 minut w temperaturze 500 μmol.m-2.s-1 przed pomiarami. Do określenia cech morfologicznych i fizjologicznych wykorzystano wiele czujników obrazowania, a następnie stację ważenia i pojenia. W zależności od zabiegu, rośliny umieszczano z powrotem w kontrolowanych warunkach, w temperaturze 22 °C/19 °C lub 30 °C/28 °C. (B) Automatyczna ekstrakcja i segmentacja potoku przetwarzania obrazu z każdego czujnika obrazu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Przegląd protokołu krótkiego światła dla obrazowania fluorescencji chlorofilu. Protokół pomiarowy rozpoczął się od włączenia chłodnego białego światła aktynicznego w celu zmierzenia fluorescencji w stanie ustalonym w świetle (F_t_Lss), a następnie zastosowania impulsu nasycenia w celu zmierzenia maksymalnej fluorescencji światła w stanie ustalonym (F_m_Lss). Światło aktyniczne zostało wyłączone, a światło dalekiej czerwieni zostało włączone w celu określenia minimalnej fluorescencji światła w stanie ustalonym (F_o_Lss). Czas trwania protokołu wynosił 10 s na roślinę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Obrazowanie RGB używane do oceny morfologicznej. (A) Objętość rośliny obliczona na podstawie obszaru RGB z góry i z boku. (B) Względna szybkość wzrostu (RGR) w fazie inicjacji bulw. Dane przedstawiają wartości średnie ± odchyleniu standardowym (n = 10). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Obrazowanie fluorescencji chlorofilu na roślinach przystosowanych do światła. (A) Maksymalna wydajność fotochemii PSII próbki przystosowanej do światła w stanie ustalonym (F_v/F_m_Lss). (B) Wydajność kwantowa fotosystemu II lub sprawność operacyjna fotosystemu II w stanie ustalonym światła (QY_Lss). (C) Frakcja otwartych centrów reakcji w PSII w lekkim stanie ustalonym (utleniona QA) (qL_Lss). Dane przedstawiają wartości średnie ± odchyleniu standardowym (n = 10). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Obrazowanie termiczne w podczerwieni zostało użyte do obliczenia różnicy między średnią temperaturą korony drzew uzyskaną z obrazów termowizyjnych IR a temperaturą powietrza (ΔT). Dane reprezentują średnie wartości ± odchylenie standardowe (n = 10). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Obrazowanie hiperspektralne do wyznaczania wskaźników wegetacji i zawartości wody. (a) Znormalizowany różnicowy wskaźnik wegetacji (NDVI). (B) Wskaźnik odbicia fotochemicznego (PRI) obliczony na podstawie obrazowania VNIR. (C) Wskaźnik wodny obliczony na podstawie obrazowania SWIR. Dane przedstawiają wartości średnie ± odchyleniu standardowym (n = 10). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Wskaźnik zazielenienia dla roślin poddanych różnym zabiegom. Przetwarzanie obrazu opiera się na przekształceniu oryginalnego obrazu RGB w mapę kolorów składającą się z 6 zdefiniowanych odcieni. Dane przedstawiają wartości średnie ± odchyleniu standardowym (n = 10). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Natężenie światła mierzone w dniach fenotypowania (DOP). Czas trwania pomiarów od 9:00 do 12:35. LI_Buff odnosi się do mediany danych z 5 czujników światła rozmieszczonych w szklarni. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Wilgotność względna (RH) mierzona w dniach fenotypowania (DOP). Czas trwania pomiarów od 9:00 do 12:35. RH_Buff odnosi się do mediany danych z 5 czujników wilgotności rozmieszczonych w szklarni. RH2 odnosi się do wilgotności względnej w komorze adaptacyjnej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Temperatura mierzona podczas dni fenotypowania (DOP). Czas trwania pomiarów od 9:00 do 12:35. T_Buff odnosi się do mediany danych z 5 czujników temperatury rozmieszczonych w szklarni. T2 odnosi się do temperatury w komorze adaptacyjnej. T3 odnosi się do temperatury ściany grzewczej. T4 odnosi się do temperatury w jednostce termowizyjnej IR. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 4: Zrzut ekranu z oprogramowania do analizy danych pokazujący parametry dostosowane do analizy masek roślinnych w czujnikach obrazowania fluorescencji chlorofilu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 5: Zrzut ekranu z oprogramowania do analizy danych pokazujący parametry dostosowane do analizy masek roślinnych w czujnikach termowizyjnych w podczerwieni. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 6: Zrzut ekranu z oprogramowania do analizy danych pokazujący parametry dostosowane do analizy masek roślinnych w czujnikach obrazowania RGB z 1 strony. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 7: Zrzut ekranu z oprogramowania do analizy danych pokazujący parametry dostosowane do analizy masek roślinnych w czujnikach obrazowania RGB2 z widokiem z góry. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 8: Zrzut ekranu z oprogramowania do analizy danych pokazujący parametry dostosowane do analizy masek roślinnych w czujnikach obrazowania VNIR. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 9: Zrzut ekranu z oprogramowania do analizy danych pokazujący parametry dostosowane do analizy masek roślinnych w czujnikach obrazowania SWIR. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Ulepszone zaawansowane narzędzia do obrazowania o wysokiej rozdzielczości i techniki widzenia komputerowego umożliwiły szybki rozwój fenotypowania roślin w celu uzyskania danych ilościowych z ogromnych obrazów roślin w powtarzalny sposób³⁹. Badanie to miało na celu dostosowanie i optymalizację wysokoprzepustowej metodologii opartej na obrazach przy użyciu szeregu obecnie dostępnych czujników obrazowania do monitorowania dynamicznych reakcji roślin na pojedyncze i połączone stresy abiotyczne. Kilka krytycznych etapów zastosowanego podejścia wymaga dostosowania, w tym zastosowania naprężeń i wyboru odpowiedniego protokołu obrazowania dla pomiarów. Wykorzystanie wielu czujników do akwizycji obrazu pozwala na ilościowe określenie kluczowych cech fenotypowych (takich jak wzrost roślin, wydajność fotosyntezy, regulacje aparatów szparkowych, współczynnik odbicia liści itp.). Ponadto pomaga zrozumieć, w jaki sposób rośliny ziemniaka reagują na różne stresy abiotyczne. Jest to kluczowy warunek wstępny przyspieszenia projektów hodowli roślin w celu opracowania genotypów odpornych na zmiany klimatu⁴⁰. Reakcje morfologiczne na wywołany stres zależą od etapu rozwoju. Na przykład wywołanie stresu na etapie rozłogów lub bulw hamuje rozwój liści i roślin oraz ogranicza liczbę rozłogów, zmniejszając w ten sposób ostateczny plon⁴¹. Jednak w niesprzyjających warunkach rośliny wykorzystują reakcje na stres jako reakcję adaptacyjną w celu zapobiegania i naprawy uszkodzeń komórek wywołanych stresem⁴². Rośliny mają mechanizmy adaptacyjne do unikania i tolerowania warunków stresowych w zależności od poziomu nasilenia⁴³.

Aby zrozumieć mechanizmy działania roślin, za jeden z kluczowych etapów uważa się wywołanie odpowiedniego czasu trwania i intensywności stresu oraz określenie reakcji roślin na stres za pomocą czujników obrazowania. Gdy kilka naprężeń zbiega się w czasie, intensywność jednego naprężenia może unieważnić wpływ pozostałych w zależności od kombinacji, intensywności i czasu trwania naprężeń. W ten sposób efekty stresu mogą się sumować lub przeciwstawne reakcje mogą się (częściowo) znosić, co ostatecznie skutkuje pozytywnym lub negatywnym wpływem na rośliny. Protokół wybrany w tym badaniu został oparty na wcześniejszych doświadczeniach, aby zapewnić zastosowanie wystarczającego poziomu stresu. Na przykład, zastosowanie stresu suszy zostało dostosowane do umiarkowanego poziomu, tak jak w poprzednim eksperymencie, odpowiedź nie różniła się od leczenia kontrolnego we wczesnym stadium stresu opartego na obrazowaniu fluorescencyjnym chlorofilu. Wynika to z występowania fotooddychania, które działa jako alternatywny pochłaniacz elektronów w błonie tylakoidowej i mechanizm ochronny dla fotosystemu II^44,45. W ramach połączonej reakcji na stres narażenie roślin na łagodny pierwotny czynnik stresogenny może zwiększyć tolerancję na następujący po nim stresor, co może mieć korzystny lub szkodliwy wpływ⁴⁶. W tym badaniu zaobserwowano silniejszą reakcję na połączony stres w porównaniu z indywidualnym stresem związanym z suszą. Badając inne reakcje fizjologiczne, wyniki wykazały wzrost ΔT (deltaT) podczas suszy, ponieważ aparaty szparkowe zbliżają się, aby uniknąć nadmiernej utraty wody. W przeciwieństwie do tego, odwrotną reakcję zaobserwowano w przypadku stresu cieplnego, w którym ΔT był niższy w porównaniu z kontrolą odzwierciedlającą otwieranie aparatów szparkowych w celu poprawy chłodzenia liści, zgodnie z ustaleniami dotyczącymi pszenicy w warunkach połączonego stresu cieplnego i suszy²⁰. Podczas nasiąkania wodą wzrost ΔT spowodowany zamknięciem aparatów szparkowych wynikał z niedoboru tlenu w glebie i zakłócenia homeostazy wody korzeniowej, obniżając w ten sposób strumień transpiracji ze wzrostem ABA, kluczowego hormonu w reakcjach na stres wodny⁴⁷.

W badaniach nad stresem roślin czas trwania stresu i następujących po nim zabiegów regeneracyjnych jest wprost proporcjonalny do intensywności stresu. Na przykład umiarkowany stres związany z suszą, taki jak utrzymanie wilgotności gleby na poziomie 20% pojemności pola (FC), wywołuje odwracalne zmiany fenotypowe, które zwykle wracają do normy po jednym dniu ponownego nawadniania. Natomiast silne warunki stresowe, takie jak nasiąkanie wodą, powodują rozległe uszkodzenia fenotypowe, co wymaga dłuższego okresu rekonwalescencji. Chociaż standaryzacja czasu trwania leczenia jest idealna, nieodłączna zmienność intensywności stresu musi być uwzględniona w projekcie eksperymentalnym.

Drugim krytycznym krokiem jest wybór odpowiedniego protokołu i optymalizacja ustawień dla każdego czujnika. Fluorescencja chlorofilu jest potężnym narzędziem w określaniu wydajności aparatu fotosyntetycznego pod wpływem stresu⁴⁸. Różne protokoły pomiaru fluorescencji chlorofilu można wybrać dla roślin przystosowanych do światła lub ciemności, w zależności od pytania badawczego i projektu eksperymentalnego⁴⁹. W tym badaniu wybrany protokół (krótka odpowiedź na światło) umożliwia określenie różnych cech, w tym F_v'/F_m',_{φ PSII} i qL, które wskazują na wydajność fotosyntezy w różnych warunkach⁵⁰. Wcześniejsze badania wykazały, że zastosowany protokół w fenotypowaniu o wysokiej przepustowości jest skuteczny w badaniu wydajności fotosyntezy roślin w różnych zastosowaniach leczenia stresu i rozróżnianiu roślin zdrowych i zestresowanych^14,20. Opierając się na projekcie eksperymentalnym, bardzo ważne jest, aby wziąć pod uwagę czas trwania wybranego protokołu podczas pomiaru w systemie o wysokiej przepustowości z dużą populacją roślin. W związku z tym wybrano pomiar fluorescencji chlorofilu na roślinach przystosowanych do światła przy użyciu protokołu krótkotrwałego, aby rozróżnić reakcje na różne zabiegi. Interakcje genotyp-środowisko mogą wpływać na wiele cech fenotypowych, co ma kluczowe znaczenie podczas pomiaru¹². Należy wziąć pod uwagę, że czas trwania pomiaru powinien być zakończony w krótkim czasie, aby zminimalizować dobowy wpływ na ograniczenia fotosyntezy⁵¹.

Obrazowanie termiczne w podczerwieni wykorzystano do określenia temperatury baldachimu i zrozumienia regulacji aparatów szparkowych przy różnych zabiegach⁵². Warto wspomnieć, że zastosowano optymalizację technologiczną tam, gdzie ściana grzewcza znajdowała się po przeciwnej stronie kamery, a temperatura ściany była dynamicznie sterowana i programowalna. W związku z tym regulacja ogrzewanej ściany tła za pomocą zintegrowanych czujników środowiskowych jest niezbędna do prawidłowego doboru roślin z tła poprzez zwiększenie kontrastu temperatury tła nad temperaturą obrazowanego obiektu.

Mimo że analiza obrazu jest zautomatyzowana, dostosowanie wskaźników progowania RGB jest nadal wymagane w celu uzyskania odpowiedniej maski binarnej w obrazowaniu RGB w celu precyzyjnego wyboru roślin⁵³. Ponadto wybór wielu kątów jest ważny dla odpowiedniego oszacowania parametrów ilościowych, w tym biomasy cyfrowej i tempa wzrostu. W tym badaniu wybrano i uśredniono trzy kąty (0°, 120° i 240°) w widoku bocznym RGB, aby dokładnie obliczyć objętość rośliny i względne tempo wzrostu.

W zależności od zakresu spektralnego, wiele cech fizjologicznych można badać za pomocą obrazowania hiperspektralnego⁵⁴. Konieczne jest określenie, który ze wskaźników współczynnika odbicia dostarcza niezbędnych informacji i pokazuje reakcję roślin w różnych warunkach¹⁴. Jest bardzo pożądany w badaniach przesiewowych odmian tolerancyjnych i fenotypowaniu roślin w celu określenia korelacji między wskaźnikami hiperspektralnymi a innymi cechami fizjologicznymi⁵⁵. W tym badaniu rośliny poddane działaniu podlewania wykazały wyraźną reakcję na zawartość chlorofilu i wydajność fotosyntezy na podstawie obrazowania VNIR. Ponadto zaobserwowano różne reakcje w indeksie wodnym obliczonym na podstawie obrazowania SWIR pod wpływem obróbki cieplnej i nasiąkania wodą ze względu na różne regulacje aparatów szparkowych i zawartość wody w liściach.

W związku z tym wyniki te podkreślają użyteczność takiego podejścia po optymalizacji ustawień i potencjał wykorzystania wielu czujników do znalezienia cech stresu istotnych dla tolerancji klimatu. Ocena dynamiki reakcji za pomocą wielu czujników obrazowania może być wykorzystana jako jedno z potężnych narzędzi w ulepszaniu programów hodowlanych.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,1 cala Czujnik CMOS z kamerą RGB	PSI, Drá sov, Czechy	https://psi.cz/	Czujnik zapewnia rozdzielczość 4112 & razy ; 4168 pikseli dla widoku z boku i 2560 & razy - 1920 pikseli dla widoku z góry. Matryca jest niezwykle czuła i jest prawdziwym zamiennikiem megapikselowej matrycy CCD i zapewnia ostre, niskoszumowe obrazy
FluorCam	PSI, Dr&aaostry; sov, Republika Czeska	FC1300/8080-15	Fluorometr chlorofilowy z modulacją amplitudy impulsów (PAM)
Oprogramowanie Fluorcam 10	PSI, Dr&aaostry; sov, Republika Czeska	Wersja 1.0.0.18106	Do wizualizacji i analizy obrazów fluorescencji chlorofilu
GigE PSI RGB – 12,36 megapiksela Kamera	PSI, Drá sov, Czechy	https://psi.cz/	Do projekcji bocznych użyto trybu skanowania linii o rozdzielczości 4112 px/linię, 200 linii na sekundę. Obszar sfotografowany z boku wynosił 1205 i razy; 1005 mm (wysokość i szerokość), podczas gdy obszar obrazowany z pozycji widoku z góry wynosił 800 &; 800 mm.
Oprogramowanie do analizatora hiperspektralnego	PSI, Dr&aaostry; sov, Czechy	Wersja 1.0.0.14	Do wizualizacji i analizy obrazów hiperspektralnych
Kamera hiperspektralna HC-900 Series	PSI, Drá sov, Republika Czeska	https://hyperspec.org/products/	Kamera w zakresie widzialnym bliskiej podczerwieni (VNIR) 380-900 nm o rozdzielczości spektralnej 0,8 nm FWHM
Kamera hiperspektralna SWIR1700	PSI, Drá sov, Republika Czeska	https://hyperspec.org/products/	Kamera termowizyjna o krótkich falach (SWIR) 900 - 1700 nm o rozdzielczości spektralnej 2 nm Kamera termowizyjna FWHM
InfraTec (VarioCam HEAD 820(800))	Flir,  Stany Zjednoczone	https://www.infratec.eu/thermography/infrared-camera/variocam-hd-head-800/	Rozdzielczość 1024 i razy; 768 pikseli, czułość termiczna < 20 mK i wartość emisyjności termicznej ustawiona domyślnie na 0,95.  z prędkością skanowania 30 Hz i każdą linią składającą się z 768 pikseli. Sfotografowany obszar wynosił 1205 i razy; 1005 mm (wysokość i razy; szerokość).
Panel LED	PSI, Dr&aaostry; sov, Republika Czeska	https://led-growing-lights.com/products/	Wyposażony w 4 i 240 czerwono-pomarańczowych (618 nm), 120 zimnych białych diod LED (6500 K) i 240 diod LED dalekiej czerwieni (735 nm) rozmieszczonych równomiernie na obszarze obrazowania 80 i razy 80 cm
Czujniki światła, temperatury i wilgotności względnej	PSI, Drá sov, Republika Czeska	https://psi.cz/	Czujniki używane do monitorowania kontrolowanych warunków w szklarni
MEGASTOP Niebieskie maty	Friedola	75831	Do pokrycia powierzchni gleby
Oprogramowanie do morfoanalizu	PSI, Dr&aaostry; sov, Czechy	Wersja 1.0.9.8	Do wizualizacji i analizy obrazów RGB oraz analizy segmentacji kolorów
Oprogramowanie PlantScreen Data Analyzer (wersja 3.3.17.0)	PSI, Drá sov, Republika Czeska	https://plantphenotyping.com/products/plantscreen-modular-system/	Do wizualizacji i analizy danych ze wszystkich czujników obrazowania,  jednostka pojenia-ważenia i warunki środowiskowe w szklarni
System modułowy PlantScreen	PSI, Dr&aaostry; sov, Republika Czeska	https://plantphenotyping.com/products/plantscreen-modular-system/	Rodzaj platformy fenotypowej
Oprogramowanie Plantscreen Scheduler	PSI, Dr&aaostry; sov, Republika Czeska	Wersja 2.6.8368.25987	Aby zaplanować eksperyment i ustawić protokół pomiarowy
SpectraPen MINI	PSI, Drá sov, Republika Czeska	https://handheld.psi.cz/products/spectrapen-mini/#details	Światłomierz do regulacji poziomu światła na poziomie baldachimu
Kamera wysokiej rozdzielczości TOMI-2	PSI, Dr&aaostry; sov, Czechy	https://fluorcams.psi.cz/products/handy-fluorcam/	Rozdzielczość 1360 & razy; 1024 piksele, liczba klatek na sekundę 20 kl./s i 16-bitowa głębia) z 7-pozycyjnym kołem filtrów jest zamontowany na ramieniu robota umieszczonym w środku wielokolorowego panelu świetlnego LED o wymiarach 1326 x 1586 mm.
Komora wzrostowa Walk-in FytoScope	PSI, Dr&aaostry; sov, Republika Czeska	https://growth-chambers.com/products/walk-in-fytoscope-fs-wi/	Rodzaj komór używanych do uprawy rośliny