Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowe fenotypowanie oparte na obrazie w celu określenia morfologicznych i fizjologicznych odpowiedzi na pojedyncze i połączone stresy u ziemniaka

3.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66255

⸱

7 czerwca 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1PSI (Photon Systems Instruments), spol. s r.o. Drasov, 2Plant Stress Resilience, Institute of Environmental Biology, Utrecht University, 3Plant Breeding, Wageningen University and Research, 4Department of Biology, Biochemistry, Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg, 5Department of Biotechnology and Systems Biology, National Institute of Biology, 6Plant Cell Biology, Institute of Cellular and Molecular Botany, University of Bonn, 7Department of Functional & Evolutionary Ecology, University of Vienna

W tym artykule

Podsumowanie

Zaprojektowaliśmy protokół fenotypowania oparty na obrazach, aby określić morfologiczne i fizjologiczne reakcje na pojedyncze i skojarzone zabiegi upałów, suszy i podlewania. Podejście to umożliwiło identyfikację wczesnych, późnych i regeneracyjnych reakcji na poziomie całego zakładu, w szczególności części nadziemnych, a także podkreśliło konieczność stosowania wielu czujników obrazowania.

Streszczenie

Wysokoprzepustowe fenotypowanie oparte na obrazach jest potężnym narzędziem do nieinwazyjnego określania rozwoju i wydajności roślin w określonych warunkach w czasie. Korzystając z wielu czujników obrazowania, można ocenić wiele interesujących cech, w tym biomasę roślin, wydajność fotosyntezy, temperaturę baldachimu i wskaźniki odbicia liści. Rośliny są często narażone na wiele stresów w warunkach polowych, w których silne fale upałów, powodzie i susze poważnie zagrażają produktywności upraw. Kiedy stresy zbiegają się w czasie, wynikający z tego wpływ na rośliny może być wyraźny ze względu na synergiczne lub antagonistyczne interakcje. Aby wyjaśnić, w jaki sposób rośliny ziemniaka reagują na pojedyncze i połączone stresy, które przypominają naturalnie występujące scenariusze stresu, na wybraną odmianę ziemniaka (Solanum tuberosum L., odmiana Lady Rosetta) nałożono pięć różnych zabiegów na początku tuberyzacji, tj. kontrola, susza, upały, nasiąkanie wodą oraz kombinacje stresów związanych z upałem, suszą i podlewaniem. Nasza analiza pokazuje, że stres związany z podlewaniem miał najbardziej szkodliwy wpływ na wydajność roślin, prowadząc do szybkich i drastycznych reakcji fizjologicznych związanych z zamknięciem aparatów szparkowych, w tym zmniejszenia wydajności kwantowej i wydajności fotosystemu II oraz wzrostu temperatury korony drzew i indeksu wodnego. Pod wpływem ciepła i skojarzonego leczenia stresem względne tempo wzrostu uległo zmniejszeniu we wczesnej fazie stresu. Pod wpływem suszy i połączonych stresów objętość roślin i wydajność fotosyntezy spadły wraz ze wzrostem temperatury i zamknięciem aparatów szparkowych w późnej fazie stresu. Połączenie zoptymalizowanego leczenia stresu w określonych warunkach środowiskowych wraz z wybranymi protokołami fenotypowania pozwoliło na ujawnienie dynamiki morfologicznych i fizjologicznych reakcji na pojedyncze i złożone stresy. W tym artykule przedstawiono przydatne narzędzie dla badaczy roślin, którzy chcą zidentyfikować cechy roślin wskazujące na odporność na kilka stresów związanych ze zmianą klimatu.

Wprowadzenie

Potencjalne skutki zmian klimatycznych, w tym wzrost intensywności i częstotliwości fal upałów, powodzi i susz, mają negatywny wpływ na uprawę roślin1. Ważne jest, aby zrozumieć wpływ zmian klimatycznych na zmienność upraw i wynikające z tego wahania rocznej produkcji roślinnej2. Wraz z rosnącym zaludnieniem i zapotrzebowaniem na żywność, utrzymanie plonów roślin uprawnych jest wyzwaniem, dlatego pilnie potrzebne jest znalezienie odpornych na zmiany klimatu upraw do hodowli3,4. Ziemniak (Solanum tuberosum L.) jest jedną z podstawowych roślin uprawnych, która przyczynia się do globalnego bezpieczeństwa żywnościowego ze względu na wysoką wartość odżywczą i zwiększoną efektywność wykorzystania wody. Jednak głównym problemem jest zmniejszenie wzrostu i plonowania w niesprzyjających warunkach, szczególnie w przypadku odmian podatnych5,6. W wielu badaniach podkreślono znaczenie zbadania alternatywnych podejść do utrzymania produktywności upraw ziemniaków, w tym praktyk rolniczych, znalezienia tolerancyjnych genotypów i zrozumienia wpływu stresu na rozwój i plony7,8,9, który jest również bardzo pożądany przez europejskich plantatorów ziemniaków (lub rolników)10.

Zautomatyzowane platformy fenotypowania, w tym fenotypowanie oparte na obrazach, umożliwiają ilościowe analizy struktury i funkcji roślin, które są niezbędne do wyboru odpowiednich cech zainteresowania11,12. Fenotypowanie o wysokiej przepustowości jest zaawansowaną, nieinwazyjną techniką określania różnych cech morfologicznych i fizjologicznych w powtarzalny i szybki sposób 13. Chociaż fenotyp odzwierciedla różnice genotypowe w związku z efektami środowiskowymi, porównanie roślin w kontrolowanych warunkach ze stresem umożliwia powiązanie obszernych informacji o fenotypowaniu z określonym stanem (stresowym) 14. Fenotypowanie oparte na obrazie jest niezbędne do opisania zmienności fenotypowej, a także jest w stanie przebadać zestaw cech w całym rozwoju roślin, niezależnie od wielkości populacji15. Na przykład pomiar cech morfologicznych, w tym kształtu, wielkości i indeksu koloru liści za pomocą czujników obrazowania czerwono-zielono-niebieskiego (RGB), służy do określania wzrostu i rozwoju roślin. Ponadto pomiary cech fizjologicznych, w tym wydajności fotosyntezy, temperatury korony drzew i współczynnika odbicia liści, są określane ilościowo za pomocą wielu typów czujników, takich jak fluorescencja chlorofilu, termiczna podczerwień (IR) i obrazowanie hiperspektralne16. Ostatnie badania w kontrolowanych środowiskach wykazały potencjał wykorzystania fenotypowania opartego na obrazie do oceny różnych mechanizmów i reakcji fizjologicznych roślin w warunkach stresów abiotycznych, takich jak upały w ziemniakach17, susza w jęczmieniu18, rice19, oraz połączone susze i obróbki cieplnej w pszenicy20. Mimo że badanie reakcji roślin na wielokrotne interakcje stresowe jest złożone, odkrycia ujawniają nowe informacje na temat mechanizmów działania roślin w radzeniu sobie z gwałtownymi zmianami warunków klimatycznych21.

Na fizjologiczne i morfologiczne reakcje roślin bezpośrednio wpływają warunki stresu abiotycznego (wysoka temperatura, deficyt wody i powodzie), co skutkuje spadkiem plonów22. Mimo że ziemniaki charakteryzują się wysoką efektywnością zużycia wody w porównaniu z innymi uprawami, deficyt wody negatywnie wpływa na ilość i jakość plonów ze względu na płytką architekturę korzeni5. W zależności od intensywności i czasu trwania suszy, wskaźnik powierzchni liści ulega zmniejszeniu, a opóźnienie wzrostu baldachimu z zahamowaniem tworzenia nowych liści jest wyraźne w późniejszych stadiach stresu, co prowadzi do zmniejszenia szybkości fotosyntezy23. Progowy poziom wody jest krytyczny w przypadku nadmiaru wody lub przedłużających się okresów suszy, co ma negatywny wpływ na wzrost roślin i rozwój bulw z powodu ograniczenia tlenu, zmniejszonej przewodności hydraulicznej korzeni i ograniczenia wymiany gazowej24,25. Co więcej, ziemniaki są wrażliwe na wysokie temperatury, w których temperatury powyżej optymalnych poziomów powodują opóźnioną inicjację, wzrost i tempo przyswajania bulw26. Kiedy stresy pojawiają się w połączeniu, regulacje biochemiczne i reakcje fizjologiczne różnią się od indywidualnych reakcji na stres, co podkreśla konieczność zbadania reakcji roślin na kombinacje stresu27. Połączone stresy mogą skutkować (jeszcze) poważnym ograniczeniem wzrostu roślin i determinującym wpływem na cechy związane z reprodukcją28. Wpływ kombinacji stresu zależy od dominacji każdego stresu nad innymi, co prowadzi do wzmocnienia lub stłumienia reakcji roślin (np. susza zwykle prowadzi do zamknięcia aparatów szparkowych, podczas gdy aparaty szparkowe są otwarte, aby umożliwić chłodzenie powierzchni liści pod wpływem stresu cieplnego). Jednak wciąż pojawiają się połączone badania nad stresem i potrzebne są dalsze badania, aby lepiej zrozumieć złożoną regulację pośredniczącą w reakcjach roślin w tych warunkach29. W związku z tym badanie to ma na celu podkreślenie i zalecenie protokołu fenotypowania przy użyciu wielu czujników obrazowania, które mogą być odpowiednie do oceny reakcji morfofizjologicznych i zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw ogólnej wydajności ziemniaków w przypadku pojedynczego i skojarzonego leczenia stresu. Zgodnie z hipotezą, połączenie wielu czujników obrazowania okazało się cennym narzędziem do scharakteryzowania wczesnych i późniejszych strategii podczas reakcji roślin na stres. Optymalizacja protokołu fenotypowania opartego na obrazie będzie interaktywnym narzędziem dla badaczy i hodowców roślin w celu znalezienia cech interesujących dla tolerancji na stres abiotyczny.

Protokół

1. Przygotowanie materiału roślinnego i warunki wzrostu

  1. Przesadź sadzonki ziemniaka (Solanum tuberosum L., cv. Lady Rosetta) z hodowli in vitro do doniczek o pojemności 250 mL.
  2. Wypełnij doniczki w pełni nasyconym podłożem Klasmman Substrate 2 i przechowuj je w komorze wzrostowej w warunkach niskiego oświetlenia przez 1 tydzień.
  3. Ustaw natężenie światła na poziomie korony roślin na 160 µmol·m-2·s-1, stosując kombinację 25% światła białego i 35% podczerwieni, mierząc wartości luksometrem.
  4. Po 10 dniach uprawy sadzonek in vitro w glebie przesadź rośliny do doniczek o pojemności 3 L (średnica 15,5 cm, wysokość 20,5 cm).
  5. Wypełnij doniczkę 3 L ilością 1850 g mieszaniny Klasmann Substrate 2 i piasku w proporcji 3:1.
  6. Umieść rośliny w komorze wzrostowej w warunkach oświetlenia 320 µmol·m-2·s-1 z kombinacją 55% światła białego i 81% podczerwieni, ustawiając reżim długiego dnia (fotoperiod 16 h).
  7. Ustaw temperaturę w komorze wzrostowej na 22 °C/19 °C dla dnia/nocy oraz względną wilgotność powietrza (RH) na 55% przez cały czas trwania eksperymentu.
  8. Utrzymuj masę doniczki na poziomie 60% względnej zawartości wody w glebie (SRWC) jako odpowiedni poziom kontrolny dla zachowania wzrostu i plonu30,31.
    UWAGA: Na podstawie wcześniejszych prób utrzymywanie objętościowej zawartości wody powyżej 60% sprzyjało wzrostowi mchu na powierzchni gleby i zwiększało ryzyko chorób roślin. Ponadto obecność mchu mogła generować mylące sygnały dodatnie w obrazowaniu fluorescencji chlorofilu, które są trudne do odfiltrowania. Użyj następnego równania: SRWC% = (FW-DW)/(TW-DW) × 100, gdzie FW to masa świeża gleby, TW to masa turgorowa, a DW to masa sucha32.
    1. Wybierz próbki gleby (100 g) z trzech różnych worków z mieszanką Klasmman Substrate 2 jako powtórzenia i zważ masę świeżą gleby.
    2. Nasyć glebę wodą, aż doniczki zatrzymają wodę bez wyciekania, a następnie zważ masę turgorową gleby.
    3. Umieść próbkę w suszarce w temperaturze 80 °C przez 3 dni, aż próbki gleby całkowicie wyschną, a następnie zważ masę suchą gleby33.
  9. Połóż niebieskie maty na powierzchni doniczek, aby ograniczyć parowanie.
    UWAGA: Kolor niebieski jest niezbędny do odjęcia tła gleby od pikseli roślin podczas segmentacji obrazu.
  10. Wybierz dziesięć powtórzeń biologicznych na każdą próbę.
  11. Zrandomizuj rozmieszczenie doniczek podczas podlewania (łącznie 50 doniczek).
  12. Dodaj niebieskie uchwyty, aby podeprzeć rośliny i uniknąć uszkodzeń mechanicznych podczas umieszczania ich w systemie fenotypowania.

2. Przyłożenie stresu

  1. W wczesnej fazie bulwowania (28 dni po przesadzeniu sadzonek in vitro), podziel rośliny na pięć grup traktowanych i przeprowadź fenotypowanie dziesięciu roślin na każdą grupę (Rycina 1).
  2. Indukuj stresy pojedyncze i złożone na poziomie, który nie jest szkodliwy, w następujący sposób:
    1. W komorze wzrostu utrzymuj rośliny w warunkach kontrolnych, stresu suszy oraz zalewania w temperaturze 22 °C/19 °C dzień/noc (krok 1.7), przy różnych wartościach SRWC:
      Kontrola (C) z 60% SRWC przez cały okres eksperymentu.
      Susza (D) z stopniowym obniżaniem SRWC do 20% przez 7 dni, a następnie 1 dniem regeneracji.
      Zalewanie (W) z 160% SRWC przez 5 dni, a następnie 10 dniami regeneracji.
    2. Aby utrzymać poziom wody powyżej powierzchni gleby w zabiegu zalewania, włóż plastikowy worek do pustej doniczki, a następnie umieść główną doniczkę z glebą w tak przygotowanej drugiej doniczce.
    3. W celu przeprowadzenia zabiegów cieplnych umieść rośliny w kapsule wzrostowej w temperaturze 30/28 °C dzień/noc i przy 55% RH. Zastosuj pojedynczy i złożony stres cieplny w następujący sposób:
      1. Dla ciepła (H) utrzymuj temperaturę 30-28 °C przy 60% SRWC przez 15 dni.
      2. Dla potrójnego stresu Ciepło + Susza + Zalewanie (HDW) poddaj rośliny działaniu temperatury 30 °C/28 °C dzień/noc przez pierwsze 7 dni (utrzymując 60% SRWC), następnie zastosuj złożony zabieg suszy i ciepła przez kolejne 7 dni (20% SRWC i 30 °C/28 °C), a na koniec poddaj rośliny stresowi zalewania przez 1 dzień. W tym ostatnim kroku przenieś rośliny z powrotem do komory wzrostu (warunki opisane w kroku 1.7) i indukuj zalewanie do poziomu 160% SRWC przez 1 dzień.
        UWAGA: Wybrane czasy trwania indukowanych stresów oparto na eksperymencie pilotażowym, który wykazał efekty stresu bez szkodliwych następstw i przy 100% przeżywalności traktowanych roślin. W środowisku komory wzrostu zmienność warunków środowiskowych mieściła się w zakresie ± 0,2 °C dla temperatury i ± 3% dla wilgotności.

3. Przygotowanie roślin do fenotypowania

  1. Po włączeniu świateł o godzinie 6:00 rano w komorach wzrostowych, należy pozwolić roślinom na aklimatyzację w stałych warunkach oświetlenia wzrostowego (320 µmol·m-2·s-1) przez co najmniej 2-3 h przed rozpoczęciem protokołu fenotypowania. Zapewnia to osiągnięcie stanu stacjonarnego procesów fotosyntezy i regulacji szparkowej34.
  2. Przed pomiarem przenieść rośliny z miejsca uprawy do obszaru bufora wzrostowego systemu fenotypowania służącego do ręcznego ładowania roślin do systemu, podczas gdy automatyczna ocena znajduje się w trybie czuwania i jest zlokalizowana w szklarni (Supplementary Figure 1, Supplementary Figure 2 oraz Supplementary Figure 3).
    UWAGA: Rośliny były przechowywane w obszarze bufora wzrostowego podczas okresu fenotypowania trwającego 3,5 h. W szklarni zmienność warunków środowiskowych wynosiła ± 2 °C dla temperatury, ± 5% dla wilgotności oraz 20% wahań natężenia światła. Należy zatem przyjąć, że pomiary powinny rozpocząć się niezwłocznie i być krótkie, aby uniknąć wpływu warunków panujących w szklarni na rośliny.
  3. Na platformie fenotypowania umieścić doniczki w dyskach, które automatycznie przemieszczają się na taśmociągu w określonych odstępach czasu do czujnika obrazującego, zgodnie z protokołami pomiarowymi określonymi w sekcji 4.
  4. Oznaczyć każdą roślinę/tace unikalnym identyfikatorem, aby zapewnić przypisanie zmierzonych danych do właściwej rośliny przez cały czas trwania eksperymentu.

4. Protokół fenotypowania

  1. Zoptymalizować protokół fenotypowania przy użyciu wielu czujników obrazujących (fluorescencja chlorofilu, podczerwień termiczna, RGB oraz obrazowanie hiperspektralne), co pozwala na jednoczesny pomiar parametrów fizjologicznych i morfologicznych roślin (Rycina 2).
    UWAGA: Ponieważ reakcje roślin odzwierciedlają warunki środowiskowe i efekty dobowe, ważne jest zastosowanie randomizacji doniczek oraz przeprowadzanie fenotypowania w tym samym przedziale czasowym dnia.
  2. W platformie fenotypowania zapewnić, aby rośliny wprowadzano do systemu poprzez tunel adaptacyjny (Rycina 2A), w którym najpierw rejestrowana jest wysokość rośliny, a następnie dostosowywana jest wysokość każdego czujnika na podstawie stałej odległości roboczej.
  3. Przeprowadzić pomiary w dwóch turach, zgodnie z protokołem pomiarowym zdefiniowanym w oprogramowaniu.
    1. Pierwsza tura powinna obejmować pomiary reakcji fizjologicznych ilościowo określanych jako „szybkie reakcje”, z wykorzystaniem fluorescencji chlorofilu i obrazowania termicznego.
    2. Rozpocząć od pomiaru parametrów fizjologicznych w wariantach stresu termicznego, a następnie w pozostałych wariantach.
    3. W drugiej turze przejść do pozostałych pomiarów służących ocenie wolniejszych reakcji, w tym obrazowania strukturalnego RGB i hiperspektralnego, a następnie do oceny masy i podlewania.
  4. Podczas etapu ważenia i podlewania zdefiniować masę referencyjną dla każdej rośliny, aby umożliwić zautomatyzowane podlewanie i ważenie zgodnie z danym wariantem.
    1. Upewnić się, że całkowita masa referencyjna obejmuje masę tarczy, wkładki znajdującej się na taśmociągu, niebieskiego uchwytu wsporczego, niebieskiej maty, doniczki, gleby oraz biomasy rośliny zgodnie z zdefiniowanym protokołem.
    2. W celu dokładnego pomiaru ewapotranspiracji podczas etapu ważenia i podlewania przygotować puste doniczki jako referencję. Dodatkowo przygotować doniczki pomocnicze w celu korekty o masę biomasy roślinnej.
  5. W przypadku pomiaru 50 roślin czas trwania całego protokołu fenotypowania wynosi 215 min (85 min w 1. turze i 130 min w 2. turze).
  6. Codziennie przeprowadzać fenotypowanie wszystkich roślin w warunkach kontrolnych (1 dzień przed traktowaniem), a następnie wywołać stres w celu monitorowania reakcji dynamicznych oraz oceny wczesnej i późnej fazy indukowanego stresu.

5. Dostosowywanie ustawień dla każdego czujnika obrazowania

  1. Kinetyczne obrazowanie fluorescencji chlorofilu
    UWAGA: Kinetyczna fluorescencja chlorofilu jest wykorzystywana do badania wydajności fotosyntetycznej roślin w odpowiedzi na różne warunki środowiskowe, w tym stresy abiotyczne, oraz do dostarczania cennych informacji o wydajności kwantowej fotochemii i rozpraszaniu ciepła (procesy niefotochemiczne).
    1. Przeprowadzić pomiar fluorescencji chlorofilu u roślin zaadaptowanych do światła, stosując krótki protokół świetlny w celu rozróżnienia reakcji roślin poddanych różnym zabiegom.
    2. Aklimatyzować35 rośliny przez 5 min pod światłem w tunelu adaptacyjnym wyposażonym w białe zimne diody LED (6500 K) o natężeniu 500 µmol·m-2·s-1.
      UWAGA: Obrazowanie fluorescencji chlorofilu jest pierwszym pomiarem po adaptacji do światła, służącym do monitorowania zmian w wydajności fotosyntetycznej roślin.
    3. Wybrać i zoptymalizować zdefiniowany protokół zgodnie z wielkością rośliny i wymaganym natężeniem światła.
    4. Zoptymalizować ustawienia pomiarowe, w tym ustawienia kamery i natężenia światła, aby zapewnić pozyskanie silnego sygnału z optymalnym stosunkiem sygnału do szumu.
      1. Dostosować ustawienia kamery, takie jak migawka (czas ekspozycji, czas trwania błysków pomiarowych) i czułość (wzmocnienie elektryczne kamery). Użyć migawki 2 ms i czułości 12%.
        UWAGA: Wartości te są dostosowywane w zależności od wielkości i kształtu liścia oraz określonej odległości między szczytem korony a sensorem obrazującym.
      2. Ustawić natężenie światła aktynicznego na 500 µmol·m-2·s-1 i ustawić impuls nasycający na 3200 µmol·m-2·s-1, co jest wartością co najmniej 6-7 razy wyższą niż światło aktyniczne.
    5. Aby zmierzyć parametry w stanie stacjonarnym pod wpływem światła (Lss) (opisane poniżej), zaadaptować rośliny do światła przez 5 min przed pomiarami w tunelu adaptacyjnym.
    6. Aby oszacować wydajność kwantową fotosystemu II (PSII) w stanie stacjonarnym u roślin zaadaptowanych do światła, wybrać krótki protokół świetlny (Rysunek 3) i skonfigurować go w następujący sposób.
      UWAGA: Czas trwania protokołu wynosił 10 s na roślinę.
      1. Rozpocząć pomiar, włączając białe zimne światło aktyniczne o natężeniu 500 µmol·m-2·s-1 przez 3 s, aby zmierzyć fluorescencję stacjonarną w świetle (Ft_Lss, tzw. Ft')
      2. Zastosować impuls nasycający o natężeniu 3200 µmol·m-2·s-1 przez 800 ms, aby zmierzyć maksymalną fluorescencję stacjonarną w świetle (Fm_Lss, tzw. Fm')
      3. Wyłączyć światło aktyniczne, a następnie włączyć światło dalekiej czerwieni (735 nm), aby umożliwić relaksację PSII w ciemności przez 800 ms i zmierzyć minimalną fluorescencję stacjonarną w świetle (Fo_Lss, tzw. Fo').
    7. Do obliczenia parametrów względnych użyć oprogramowania do analizy danych, które odejmuje tło i wyodrębnia istotne parametry.
      UWAGA: Parametry wyodrębnione z zastosowanego protokołu to: maksymalna wydajność fotochemii PSII próbki zaadaptowanej do światła w stanie stacjonarnym określona jako Fv/Fm_Lss, tzw. Fv'/Fm', wydajność kwantowa fotosystemu II lub sprawność operacyjna fotosystemu II w stanie stacjonarnym zdefiniowana jako QY_Lss, tzw. φPSII = Fq'/Fm', oraz frakcja otwartych centrów reakcyjnych w PSII (utleniony QA) określona jako qL_Lss = (Fq'/Fv') x (F0'/Ft').
  2. Obrazowanie termiczne w podczerwieni (IR)
    UWAGA: Termiczne obrazowanie IR jest wykorzystywane do nieinwazyjnego pomiaru rzeczywistej temperatury korony, co pozwala na określenie różnych regulacji szparkowych. W jednostce obrazowania termicznego IR kamera termiczna jest zamontowana bocznie na ramieniu robotycznym, aby mierzyć temperaturę korony z widoku bocznego.
    1. Aby zwiększyć kontrast temperatury tła względem temperatury obrazowanego obiektu podczas przetwarzania obrazu, zastosować automatycznie sterowaną podgrzewaną ścianę po przeciwnej stronie kamery termicznej. Regulować temperaturę ściany tak, aby była o 8 °C wyższa od temperatury powietrza w jednostce obrazującej.
      UWAGA: Obrazy termiczne pozyskano w ciemności, korzystając z trybu skanowania liniowego35.
    2. Po pozyskaniu obrazu wygenerować maskę rośliny na podstawie danych RGB z widoku bocznego i wykorzystać ją do korejestracji z danymi termicznymi podczas analizy obrazu. Zapewnia to precyzyjną identyfikację skanowanego obiektu przy jednoczesnej eliminacji zakłóceń tła, takich jak uchwyt rośliny.
    3. Aby zapobiec wpływowi wahań warunków środowiskowych w trakcie całego eksperymentu, obliczyć parametr różnicy temperatur (delta T lub ΔT).
      UWAGA: Delta T (ΔT) jest definiowana jako różnica między zmierzoną temperaturą powierzchni liścia (średnia ze wszystkich pikseli z całej wykrytej powierzchni rośliny) a temperaturą powietrza wewnątrz komory obrazującej.
  3. Obrazowanie RGB
    UWAGA: Obrazowanie RGB opiera się na kamerach wizualno-bezwładnościowych (VIS), które wykrywają światło w zakresie widzialnym od 400-700 nm; jest ono wykorzystywane do szczegółowej analizy morfologii, architektury rośliny oraz ekstrakcji cech indeksu koloru.
    1. Jednostka obrazująca zawiera obrotowy stół do precyzyjnego pozycjonowania tacy, który jednocześnie umożliwia wielokątowe obrazowanie widoków bocznych.
    2. Skonfigurować obrazowanie RGB w oparciu o widok boczny, aby uchwycić roślinę z trzech kątów (0°, 120° i 240°) w trybie skanowania liniowego (RGB1) oraz obrazowanie z widoku górnego w trybie migawkowym (RGB2).
    3. Obie kamery posiadają źródło światła oparte na diodach LED, co zapewnia jednorodne oświetlenie obrazowanej rośliny, a tym samym dokładne określenie cech morfologicznych i kolorystycznych.
    4. Wyodrębnić obliczone parametry, korzystając z oprogramowania do analizy danych.
    5. Aby uzyskać dodatkowe parametry na podstawie widoków bocznych i górnych, obliczyć objętość rośliny (cyfrową biomasę)36:
      Wzór na obliczenie objętości, równanie Volume_plant=sqrt(Area_side view^2×Area_top view), metoda.
    6. Obliczyć względne tempo wzrostu (RGR)37:
      Schemat równania względnego tempa wzrostu; obliczanie RGR przy użyciu różnic logarytmów objętości.
      Gdzie Tn i Tn+1 oznaczają przedział czasu (dni).
  4. Obrazowanie hiperspektralne
    UWAGA: Obrazowanie hiperspektralne jest wykorzystywane do wizualizacji odbicia spektralnego roślin. Zmiany w odbiciu liści są wskaźnikami różnego stanu fizjologicznego danej rośliny.
    1. Użyć sensora obrazowania hiperspektralnego do ilościowego określenia odbicia korony w widzialnej części widma światła, stosując hiperspektralną kamerę widzialną i bliskiej podczerwieni (VNIR) w zakresie 380-900 nm oraz kamerę podczerwieni krótkofalowej (SWIR) w zakresie 900-1700 nm.
    2. Kamery są zamontowane na ramieniu robotycznym z zintegrowanym halogenowym źródłem światła (600 W) w celu zapewnienia jednorodnego i spektralnie odpowiedniego oświetlenia próbek podczas pozyskiwania obrazu w obszarze XZ.
    3. Obie kamery pracują w trybie skanowania liniowego i są umieszczone w izolowanej od światła komorze obrazującej.
    4. Przed każdą serią pomiarów przeprowadzić dwa pomiary kalibracyjne (automatycznie): kalibrację prądu ciemnego oraz kalibrację radiometryczną przy użyciu standardu teflonowego odbicia spektralnego.
    5. Obraz kalibracji ciemnej jest odejmowany od obrazu surowego i białego obrazu kalibracyjnego w celu usunięcia szumu prądu ciemnego. Następnie wygenerować końcowy obraz hiperspektralny poprzez podzielenie obrazu surowego po odjęciu przez biały obraz kalibracyjny.

6. Eksport danych i analiza obrazu

  1. Użyj oprogramowania do analizy danych w celu automatycznej ekstrakcji, odejmowania tła oraz segmentacji Maski Rośliny (Plant Mask) w potoku przetwarzania obrazów (Ryc. 2B).
  2. Oprogramowanie wykonuje w pełni zautomatyzowaną analizę, w której aplikacja maski, odejmowanie tła (izolacja roślin z tła) oraz obliczanie parametrów są procesowane zgodnie z opisem dla obrazowania RGB38 i obrazowania termicznego20.
  3. Wyekstrahuj zmierzone i obliczone parametry z pikseli właściwych dla roślin, zdefiniowanych przez wygenerowaną z obrazu RGB Maskę Rośliny (Plant Mask) oraz Maskę Tacy (Tray Mask).
  4. Jeśli obrazy nie zostały w pełni wyselekcjonowane, co może wystąpić z powodu zmian w zieloności roślinności w późniejszych stadiach rozwojowych lub efektu działania stresu, otwórz sekcję lokalnej analizy danych w oprogramowaniu i ponownie dostosuj ustawienia Maski Rośliny w oprogramowaniu do analizy danych, zależnie od każdego czujnika.
  5. W przetwarzaniu obrazów fluorescencji chlorofilu dostosuj parametry analizy ustawień Maski Rośliny dla fluorescencji chlorofilu (Ryc. uzupełniająca 4).
    1. Ustaw wartość progu (threshold) na True, co oznacza, że segmentacja roślin jest wykonywana automatycznie.
    2. Ustaw Indeks Ramki Maski (Mask Frame Index) na False, co oznacza, że do detekcji Maski Rośliny używana jest ramka Time-Visual, zgodnie z definicją w protokole fluorescencji chlorofilu.
  6. W przetwarzaniu obrazów termicznych ustaw parametry analizy Maski Rośliny (Ryc. uzupełniająca 5).
    1. Ustaw automatyczny próg dla Generowania Maski Obiektu (Object Mask Generation) na False.
    2. Ustaw maskę z bocznego obrazu RGB (RGB side image) na True, aby była wykorzystywana w analizie.
  7. W przetwarzaniu obrazów RGB dostosuj parametry analizy ustawień Maski Rośliny (Ryc. uzupełniająca 6 oraz Ryc. uzupełniająca 7) w zależności od gatunku i stadium rozwojowego.
    1. Wybierz formułę 4*G-3*B-R, która służy do generowania maski obiektu i definiuje użyty komponent koloru (komponenty czerwony, zielony i niebieski).
      UWAGA: Ta standardowa formuła oraz inne ustawienia mogą ulegać zmianom w zależności od użytej kamery (widok z góry lub widok boczny), zastosowanejy procedury oraz różnych odmian.
    2. Dostosuj Próg (Threshold) używany do konwersji obrazu w skali szarości z wzmocnionym kanałem zielonym na obraz binarny, co pozwala określić powierzchnię zajętą przez roślinę.
    3. Dostosuj Rozmiar Filtra Medianowego (Median Filter Size) używany do redukcji szumu i błędnych pikseli oraz uzupełniania brakujących.
    4. Dostosuj Minimalny rozmiar obiektu w pikselach, który ma zostać uwzględniony w analizie.
    5. Dostosuj Minimalny rozmiar dziur w obiektach maski w pikselach, zazwyczaj rzędu kilkudziesięciu pikseli. Dziury mniejsze od tej wartości są zamykane i traktowane jako piksele obiektu.
    6. Ustaw Użyj Redukcji Odbić (Use Reflection Reduction) na True w celu normalizacji wartości RGB dla każdego piksela.
    7. Ustaw Pomiń Punkty z Błędną Ekspozycją (Skip Bad Exposed Points) na True, aby wyciąć prześwietlone lub niedoświetlone piksele z maski rośliny (np. pominięcie odbić powierzchniowych lub ciemnych pikseli, w których szum jest większy niż sygnał).
  8. Pokoloruj ustawienia segmentacji analizowane z obrazów RGB przy użyciu oprogramowania do analizy danych, aby dostarczyć informacji o zmianach barw związanych z odpowiedziami stresowymi i starzeniem się roślin.
    UWAGA: Zieloność szacowana jest przy użyciu zdefiniowanego zakresu kolorów reprezentujących wszystkie stadia rozwoju rośliny. Intensywność kanałów kolorystycznych ze wszystkich pikseli odpowiadających powierzchni rośliny została pogrupowana i zaklastrowana, aby służyć jako źródłowa mapa kolorów dla segmentacji barwnej.
    1. Wprowadź do oprogramowania przetworzony obraz RGB (z usuniętym tłem) oraz mapę kolorów – listę odcieni dla konkretnej analizy.
    2. Aby uzyskać obiektywne wyniki, wykonaj wybór odcieni przy użyciu zestawu danych „treningowych”, wybierając różne stadia rozwojowe i zabiegi.
      UWAGA: Analiza zapisuje wartości R, G i B każdego piksela każdego obrazu z tego zestawu treningowego.
    3. Zdefiniuj liczbę odcieni (wybierz 6 odcieni) za pomocą oprogramowania dla wyjściowej definicji kolorów, w zakresie 0-255 dla każdego kanału.
    4. Podaj listę odcieni wygenerowaną w oprogramowaniu do analizy danych (Colors).
  9. W przetwarzaniu obrazów hiperspektralnych opracuj pozyskane dane hiperspektralne przy użyciu analizy piksel po pikselu zaimplementowanej w oprogramowaniu do analizy hiperspektralnej, obejmującej kalibrację radiometryczną i szumu ciemnego, odejmowanie tła oraz segmentację maski rośliny. Do dalszych analiz wykorzystaj widma średnie i indeksy wegetacyjne.
  10. Utwórz maskę do ekstrakcji danych z obrazu hiperspektralnego na podstawie obrazu VNIR wykonanego kamerą hiperspektralną VNIR. Dla skanu hiperspektralnego SWIR wygeneruj maskę rośliny na podstawie analizy SWIR.
    1. W przypadku Maski Rośliny VNIR użyj formuły 1.2*(2.5*(R740-R672)-1.3*(R740-R556)) do wizualizacji obrazów, gdzie R reprezentuje wartość odbicia dla konkretnej długości fali (Ryc. uzupełniająca 8).
    2. W przypadku Maski Rośliny SWIR użyj w przetwarzaniu obrazów formuły (R960-R1450)-(R960-R1200) do wizualizacji obrazów (Ryc. uzupełniająca 9).

7. Ważenie i podlewanie

  1. Zapisz wagę (przed) podlewaniem podczas procedury ważenia i podlewania. Następnie wykonaj podlewanie i zapisz również wagę po podlewaniu.
  2. Podlewaj tacki w trybie referencyjnym – dla każdej tacki w bazie danych zapisana była wartość referencyjna, do której zawsze była ona podlewana. Wyznacz wartość referencyjną na podstawie zastosowanej próby.

8. Analiza danych

  1. Przeanalizuj dane, stosując analizę ANOVA oraz test Shapiro.
  2. Przeprowadź porównania parowe między różnymi wariantami zabiegowymi za pomocą testu Wilcoxona dla par w programie R studio (wersja 4.2.3), wykorzystując pakiety (dplyr), (tidyverse), (rstatix) oraz (ggpubr).
    UWAGA: Analiza obrazów została wykonana automatycznie przy użyciu oprogramowania do analizy danych. W celu dalszej analizy pozyskanych obrazów należy użyć oprogramowania do analizy danych dedykowanego dla konkretnego czujnika.

Wyniki

W niniejszym badaniu wykorzystano zautomatyzowane fenotypowanie obrazowe w celu zbadania odpowiedzi morfologicznych i fizjologicznych ziemniaka (cv. Lady Rosetta) pod wpływem pojedynczego i połączonego stresu. Zastosowane podejście wykazało dynamiczne odpowiedzi roślin z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną w momencie wywołania stresu na etapie inicjacji bulw. Aby ocenić wczesne i późne fazy stresu, wyniki przedstawiono w trzech okresach czasowych ([0-5 dni fenotypowania (DOP)], [6-10 DOP] oraz [11-15 DOP]) (Rysunek 1). Do 0 DOP wszystkie rośliny były hodowane w warunkach kontrolnych (C), a następnie w dniach 1-5 DOP zastosowano stres zalewowy (W) oraz stres termiczny (H). W związku z tym odpowiedzi obserwowano w następujący sposób: (i) w dniach 0-5 DOP określono początkowy stres termiczny i zalewowy; (ii) w dniach 6-10 DOP obserwowano wczesną suszę (D) oraz połączony stres termiczny i suszę (HD) oraz (iii) w dniach 11-15 DOP wykazano późny stres termiczny, suszę oraz połączony stres termiczny + susza + zalew (HDW). Regenerację po zalaniu obserwowano w okresach 6-10 DOP oraz 11-15 DOP.

Cechy morfologiczne
Obrazowanie RGB zastosowano w celu określenia wpływu różnych stresów i ich kombinacji na wzrost nadziemnych części roślin. Wyniki przedstawione na Rysunku 4 pokazują, że obróbka termiczna oraz stres spowodowany podtopieniem (0-5 DOP) już powodują zmniejszenie objętości roślin i RGR w porównaniu z grupą kontrolną. W okresie 6-10 DOP objętość roślin i RGR roślin kontrolnych stale rosły, natomiast w warunkach wysokiej temperatury oraz połączonego stresu cieplnego, suszy i podtopienia, wzrost objętości roślin był wyraźnie ograniczony (Rysunek 4A). Ze względu na wysoką podatność roślin na stres spowodowany podtopieniem, odnotowano znaczny spadek RGR (Rysunek 4B). Podczas późnego stresu suszowego (11-15 DOP), przy utrzymaniu SRWC na poziomie 20%, zaobserwowano wyraźny spadek RGR w porównaniu z grupą kontrolną. Jednak w późnej fazie połączonego stresu HDW zastosowanie zabiegu podtopienia spowodowało wzrost RGR w ostatnim dniu stresu.

Cechy fizjologiczne
W celu ujawnienia dalszych reakcji na stres zastosowano kombinację fenotypowania strukturalnego i fizjologicznego. Wykorzystanie wielu czujników obrazujących umożliwia określenie odpowiedzi fizjologicznych w wczesnej fazie stresu. Dalsza analiza danych fluorescencji chlorofilu wykazała, że zalewanie negatywnie wpływało na wydajność fotosyntetyczną, gdzie Fv'/Fm' (Fv/Fm_Lss) gwałtownie spadło w dniach 0-5 DOP i 6-10 DOP, natomiast w dniach 11-15 DOP zaobserwowano reakcję regeneracyjną, w której Fv'/Fm' nieznacznie wzrosło (Rysunek 5A). Podczas późnej fazy stresu (11-15 DOP) zaobserwowano spadek Fv'/Fm' w warunkach suszy oraz połączonego stresu cieplnego i suszy. W roślinach zalewanych wydajność operacyjna roślin (QY_Lss, tzw. φPSII) była znacznie niższa w porównaniu z innymi wariantami w dniach 0-5 DOP i 6-10 DOP, ale odnotowano niewielki wzrost w dniach 11-15 DOP, co wskazuje na regenerację roślin (Rysunek 5B). Ponadto, różne mechanizmy regulujące wydajność przyczyniające się do ochrony PSII określono poprzez obliczenie frakcji otwartych centrów reakcyjnych w PSII w stanie stacjonarnym oświetlenia (qL_Lss) (Rysunek 5C). Tylko w warunkach suszy zaobserwowano wzrost qL, co prawdopodobnie wynikało z fotoinhibicji.

Wyniki te były zgodne z danymi IR, które odzwierciedlały różne mechanizmy leżące u podstaw reakcji na stresy (Rycina 6). W warunkach zalewy zaobserwowano wzrost deltaT (ΔT), co spowodowało zmniejszenie szybkości wymiany gazowej. W przypadku późnej suszy oraz połączonego stresu wysoką temperaturą i suszą wzrost ΔT wynikał z zamknięcia aparatów szparkowych, co uznaje się za jedną z głównych odpowiedzi w celu uniknięcia nadmiernej utraty wody. Z drugiej strony, w przypadku zabiegów wysoką temperaturą zaobserwowano spadek ΔT, ponieważ aparaty szparkowe otwierają się, aby zwiększyć efektywność transpiracji i ochłodzić powierzchnię liścia.

Na podstawie analizy danych hiperspektralnych z zakresu VNIR wybrano dwa parametry do oceny indeksów odbicia liści: NDVI jako wskaźnika zawartości chlorofilu oraz PRI jako wskaźnika wydajności fotosyntezy. Wyniki wykazały spadek NDVI i PRI wyłącznie w warunkach zalewania, co korelowało z obserwowaną redukcją cech morfologicznych (Rysunek 7A,B). Ponadto w hiperspektralnych danych z zakresu SWIR, wykorzystanych do oceny zawartości wody w roślinach, zaobserwowano wzrost indeksu wody podczas zalewania w okresie 0-5 DOP (Rysunek 7C). Natomiast w przypadku traktowania temperaturą zaobserwowano odwrotną reakcję, w której indeks wody był niższy niż w grupie kontrolnej. Wyniki te były zgodne z analizą roślinności przeprowadzoną na podstawie segmentacji kolorystycznej obrazów RGB z widoku z góry. Zmiany w proporcjach odcieni wskazują na odpowiedzi stresowe w czasie (Rysunek 8). Indeks zazielenienia wykazał redukcję zawartości pigmentów w warunkach suszy oraz połączonego stresu HDW w późnej fazie stresu, a także stopniową regenerację po traktowaniu zalewaniem. Zatem zastosowanie wielu czujników obrazujących odzwierciedliło korelację cech morfofizjologicznych i umożliwiło ocenę ogólnej kondycji roślin pod wpływem stresów abiotycznych.

Schemat osi czasu zabiegów stresowych roślin; kontrola, upał, susza, podtopienie; dni fenotypowania.
Rysunek 1: Oś czasu stosowania różnych zabiegów, obejmująca wiek roślin w dniach po przesadzeniu sadzonek in vitro. Dzień 0 fenotypowania (DOP) został zmierzony w warunkach kontrolnych (C), a następnie indukowano różne stresy o różnym czasie trwania. Od 1. do 5. DOP stosowano stres podtopieniowy (W) oraz początkową reakcję na zabieg wysoką temperaturą (H). W kolejnych dniach 6-10 DOP przedstawiono początkową fazę stresu suszy (D) oraz połączony stres wysoką temperaturą i suszą (HD). W dniach 11-15 DOP odzwierciedlono reakcję roślin na późną fazę zabiegów suszy i wysokiej temperatury oraz zastosowanie podtopienia w grupie HD (HDW) przez 1 dzień. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Schemat procesu fenotypowania roślin, fluorescencji chlorofilu, podczerwieni termicznej (IR), RGB i obrazowania hiperspektralnego.
Rysunek 2: Schemat podsumowujący protokół fenotypowania i analizę danych. (A) Przegląd protokołu fenotypowania. Rośliny są transportowane do systemu fenotypowania z kontrolowanych warunków w komorze wzrostu FS-WI (PSI). Przed pomiarami rośliny były aklimatyzowane do światła w komorze adaptacyjnej przez 5 min przy natężeniu 500 µmol.m-2.s-1. Do określenia cech morfologicznych i fizjologicznych wykorzystano wiele czujników obrazujących, po czym następowała stacja ważenia i podlewania. W zależności od traktowania rośliny były przenoszone z powrotem do kontrolowanych warunków, albo w temperaturze 22 °C/19 °C, albo 30 °C/28 °C. (B) Automatyczna ekstrakcja i segmentacja w ramach potoku przetwarzania obrazów z każdego czujnika obrazującego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat protokołu fluorescencji chlorofilu; pokazujący wpływ światła aktynicznego i dalekiej czerwieni na Ft_Lss, Fm_Lss.
Rysunek 3: Przegląd krótkiego protokołu oświetleniowego dla obrazowania fluorescencji chlorofilu. Protokół pomiarowy rozpoczynał się od włączenia chłodnego białego światła aktynicznego w celu pomiaru fluorescencji stanu stacjonarnego w świetle (Ft_Lss), a następnie zastosowania impulsu nasycającego do pomiaru maksymalnej fluorescencji stanu stacjonarnego w świetle (Fm_Lss). Światło aktyniczne zostało wyłączone, a włączono światło dalekiej czerwieni w celu oznaczenia minimalnej fluorescencji stanu stacjonarnego w świetle (Fo_Lss). Czas trwania protokołu wynosił 10 s na roślinę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza wykresu pudełkowego objętości RGB i RGR przy różnych traktowaniach; wyniki eksperymentu i analizy ANOVA.
Rysunek 4: Obrazowanie RGB wykorzystane do oceny morfologicznej. (A) Objętość rośliny obliczona na podstawie pola powierzchni widoków RGB z góry i z boku. (B) Względna szybkość wzrostu (RGR) w fazie inicjacji bulw. Dane przedstawiają wartości średnie ± odchylenie standardowe (n = 10). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Odpowiedź roślin na stres; wykresy pudełkowe Anova; kontrola vs. zabiegi wysoką temperaturą, suszą i zalewaniem.
Rycina 5: Obrazowanie fluorescencji chlorofilu u roślin zaadaptowanych do światła. (A) Maksymalna wydajność fotochemii PSII próbki zaadaptowanej do światła w stanie stacjonarnym oświetlenia (Fv/Fm_Lss). (B) Wydajność kwantowa fotosystemu II lub wydajność operacyjna fotosystemu II w stanie stacjonarnym oświetlenia (QY_Lss). (C) Odsetek otwartych centrów reakcyjnych w PSII w stanie stacjonarnym oświetlenia (utleniony QA) (qL_Lss). Dane przedstawiają wartości średnie ± odchylenie standardowe (n = 10). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres pudełkowy IrPlant_Avg_deltaT w różnych wariantach traktowania, przedstawiający wyniki analizy ANOVA.
Rysunek 6: Wykorzystano obrazowanie termowizyjne IR do obliczenia różnicy między średnią temperaturą korony rośliny wyznaczoną z obrazów termowizyjnych a temperaturą powietrza (ΔT). Dane przedstawiają wartości średnie ± odchylenie standardowe (n = 10). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza wykresów pudełkowych danych VNIR i SWIR; wyniki ANOVA dla roślin poddanych stresowi suszy i wysokiej temperaturze.
Rysunek 7: Obrazowanie hiperspektralne w celu wyznaczenia wskaźników roślinności i zawartości wody. (A) Znormalizowany Różnicowy Wskaźnik Wegetacji (NDVI). (B) Fotochemiczny Wskaźnik Refleksji (PRI) obliczony na podstawie obrazowania VNIR. (C) Wskaźnik wody obliczony na podstawie obrazowania SWIR. Dane przedstawiają wartości średnie ± odchylenie standardowe (n = 10). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Porównanie stresu genotypu LadyRosetta; wykres przedstawiający procentowe zmiany w warunkach kontrolnych i stresowych.
Rysunek 8: Indeks zieleni dla roślin poddanych różnym zabiegom. Przetwarzanie obrazu opiera się na transformacji oryginalnego obrazu RGB w mapę kolorów składającą się z 6 zdefiniowanych odcieni. Dane reprezentują wartości średnie ± odchylenie standardowe (n = 10). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina uzupełniająca 1: Natężenie światła mierzone w dniach fenotypowania (DOP). Czas trwania pomiarów od 9:00 do 12:35. LI_Buff odnosi się do danych mediany z 5 czujników światła rozmieszczonych w szklarni. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 2: Wilgotność względna (RH) mierzona w dniach fenotypowania (DOP).Czas trwania pomiarów od godziny 9:00 do 12:35. RH_Buff odnosi się do średnich danych z 5 czujników wilgotności rozmieszczonych w szklarni. RH2 odnosi się do wilgotności względnej w komorze adaptacyjnej. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 3: Temperatura mierzona w dniach fenotypowania (DOP).Czas trwania pomiarów od godziny 9:00 do 12:35. T_Buff odnosi się do mediany danych z 5 czujników temperatury rozmieszczonych w szklarni. T2 odnosi się do temperatury w komorze adaptacyjnej. T3 odnosi się do temperatury ściany grzejnej. T4 odnosi się do temperatury w jednostce obrazowania termowizyjnego IR. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 4: Zrzut ekranu z oprogramowania do analizy danych przedstawiający parametry dostosowane do analizy maski roślin w czujnikach obrazowania fluorescencji chlorofilu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 5: Zrzut ekranu z oprogramowania do analizy danych przedstawiający parametry dostosowane do analizy maski roślin w czujnikach obrazowania w podczerwieni termicznej. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 6: Zrzut ekranu z oprogramowania analizatora danych przedstawiający parametry dostosowane do analizy maski rośliny w czujnikach obrazujących widok jednostronny RGB. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 7: Zrzut ekranu z oprogramowania do analizy danych przedstawiający parametry dostosowane do analizy maski roślin w czujnikach obrazujących widok z góry RGB2. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 8: Zrzut ekranu z oprogramowania analizatora danych pokazujący parametry dostosowane do analizy maski roślin w czujnikach obrazowania VNIR. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 9: Zrzut ekranu z oprogramowania do analizy danych przedstawiający parametry dostrojone do analizy maski roślin w czujnikach obrazowania SWIR. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Ulepszone zaawansowane narzędzia do obrazowania o wysokiej rozdzielczości i techniki widzenia komputerowego umożliwiły szybki rozwój fenotypowania roślin w celu uzyskania danych ilościowych z ogromnych obrazów roślin w powtarzalny sposób39. Badanie to miało na celu dostosowanie i optymalizację wysokoprzepustowej metodologii opartej na obrazach przy użyciu szeregu obecnie dostępnych czujników obrazowania do monitorowania dynamicznych reakcji roślin na pojedyncze i połączone stresy abiotyczne. Kilka krytycznych etapów zastosowanego podejścia wymaga dostosowania, w tym zastosowania naprężeń i wyboru odpowiedniego protokołu obrazowania dla pomiarów. Wykorzystanie wielu czujników do akwizycji obrazu pozwala na ilościowe określenie kluczowych cech fenotypowych (takich jak wzrost roślin, wydajność fotosyntezy, regulacje aparatów szparkowych, współczynnik odbicia liści itp.). Ponadto pomaga zrozumieć, w jaki sposób rośliny ziemniaka reagują na różne stresy abiotyczne. Jest to kluczowy warunek wstępny przyspieszenia projektów hodowli roślin w celu opracowania genotypów odpornych na zmiany klimatu40. Reakcje morfologiczne na wywołany stres zależą od etapu rozwoju. Na przykład wywołanie stresu na etapie rozłogów lub bulw hamuje rozwój liści i roślin oraz ogranicza liczbę rozłogów, zmniejszając w ten sposób ostateczny plon41. Jednak w niesprzyjających warunkach rośliny wykorzystują reakcje na stres jako reakcję adaptacyjną w celu zapobiegania i naprawy uszkodzeń komórek wywołanych stresem42. Rośliny mają mechanizmy adaptacyjne do unikania i tolerowania warunków stresowych w zależności od poziomu nasilenia43.

Aby zrozumieć mechanizmy działania roślin, za jeden z kluczowych etapów uważa się wywołanie odpowiedniego czasu trwania i intensywności stresu oraz określenie reakcji roślin na stres za pomocą czujników obrazowania. Gdy kilka naprężeń zbiega się w czasie, intensywność jednego naprężenia może unieważnić wpływ pozostałych w zależności od kombinacji, intensywności i czasu trwania naprężeń. W ten sposób efekty stresu mogą się sumować lub przeciwstawne reakcje mogą się (częściowo) znosić, co ostatecznie skutkuje pozytywnym lub negatywnym wpływem na rośliny. Protokół wybrany w tym badaniu został oparty na wcześniejszych doświadczeniach, aby zapewnić zastosowanie wystarczającego poziomu stresu. Na przykład, zastosowanie stresu suszy zostało dostosowane do umiarkowanego poziomu, tak jak w poprzednim eksperymencie, odpowiedź nie różniła się od leczenia kontrolnego we wczesnym stadium stresu opartego na obrazowaniu fluorescencyjnym chlorofilu. Wynika to z występowania fotooddychania, które działa jako alternatywny pochłaniacz elektronów w błonie tylakoidowej i mechanizm ochronny dla fotosystemu II44,45. W ramach połączonej reakcji na stres narażenie roślin na łagodny pierwotny czynnik stresogenny może zwiększyć tolerancję na następujący po nim stresor, co może mieć korzystny lub szkodliwy wpływ46. W tym badaniu zaobserwowano silniejszą reakcję na połączony stres w porównaniu z indywidualnym stresem związanym z suszą. Badając inne reakcje fizjologiczne, wyniki wykazały wzrost ΔT (deltaT) podczas suszy, ponieważ aparaty szparkowe zbliżają się, aby uniknąć nadmiernej utraty wody. W przeciwieństwie do tego, odwrotną reakcję zaobserwowano w przypadku stresu cieplnego, w którym ΔT był niższy w porównaniu z kontrolą odzwierciedlającą otwieranie aparatów szparkowych w celu poprawy chłodzenia liści, zgodnie z ustaleniami dotyczącymi pszenicy w warunkach połączonego stresu cieplnego i suszy20. Podczas nasiąkania wodą wzrost ΔT spowodowany zamknięciem aparatów szparkowych wynikał z niedoboru tlenu w glebie i zakłócenia homeostazy wody korzeniowej, obniżając w ten sposób strumień transpiracji ze wzrostem ABA, kluczowego hormonu w reakcjach na stres wodny47.

W badaniach nad stresem roślin czas trwania stresu i następujących po nim zabiegów regeneracyjnych jest wprost proporcjonalny do intensywności stresu. Na przykład umiarkowany stres związany z suszą, taki jak utrzymanie wilgotności gleby na poziomie 20% pojemności pola (FC), wywołuje odwracalne zmiany fenotypowe, które zwykle wracają do normy po jednym dniu ponownego nawadniania. Natomiast silne warunki stresowe, takie jak nasiąkanie wodą, powodują rozległe uszkodzenia fenotypowe, co wymaga dłuższego okresu rekonwalescencji. Chociaż standaryzacja czasu trwania leczenia jest idealna, nieodłączna zmienność intensywności stresu musi być uwzględniona w projekcie eksperymentalnym.

Drugim krytycznym krokiem jest wybór odpowiedniego protokołu i optymalizacja ustawień dla każdego czujnika. Fluorescencja chlorofilu jest potężnym narzędziem w określaniu wydajności aparatu fotosyntetycznego pod wpływem stresu48. Różne protokoły pomiaru fluorescencji chlorofilu można wybrać dla roślin przystosowanych do światła lub ciemności, w zależności od pytania badawczego i projektu eksperymentalnego49. W tym badaniu wybrany protokół (krótka odpowiedź na światło) umożliwia określenie różnych cech, w tym Fv'/Fm',φ PSII i qL, które wskazują na wydajność fotosyntezy w różnych warunkach50. Wcześniejsze badania wykazały, że zastosowany protokół w fenotypowaniu o wysokiej przepustowości jest skuteczny w badaniu wydajności fotosyntezy roślin w różnych zastosowaniach leczenia stresu i rozróżnianiu roślin zdrowych i zestresowanych14,20. Opierając się na projekcie eksperymentalnym, bardzo ważne jest, aby wziąć pod uwagę czas trwania wybranego protokołu podczas pomiaru w systemie o wysokiej przepustowości z dużą populacją roślin. W związku z tym wybrano pomiar fluorescencji chlorofilu na roślinach przystosowanych do światła przy użyciu protokołu krótkotrwałego, aby rozróżnić reakcje na różne zabiegi. Interakcje genotyp-środowisko mogą wpływać na wiele cech fenotypowych, co ma kluczowe znaczenie podczas pomiaru12. Należy wziąć pod uwagę, że czas trwania pomiaru powinien być zakończony w krótkim czasie, aby zminimalizować dobowy wpływ na ograniczenia fotosyntezy51.

Obrazowanie termiczne w podczerwieni wykorzystano do określenia temperatury baldachimu i zrozumienia regulacji aparatów szparkowych przy różnych zabiegach52. Warto wspomnieć, że zastosowano optymalizację technologiczną tam, gdzie ściana grzewcza znajdowała się po przeciwnej stronie kamery, a temperatura ściany była dynamicznie sterowana i programowalna. W związku z tym regulacja ogrzewanej ściany tła za pomocą zintegrowanych czujników środowiskowych jest niezbędna do prawidłowego doboru roślin z tła poprzez zwiększenie kontrastu temperatury tła nad temperaturą obrazowanego obiektu.

Mimo że analiza obrazu jest zautomatyzowana, dostosowanie wskaźników progowania RGB jest nadal wymagane w celu uzyskania odpowiedniej maski binarnej w obrazowaniu RGB w celu precyzyjnego wyboru roślin53. Ponadto wybór wielu kątów jest ważny dla odpowiedniego oszacowania parametrów ilościowych, w tym biomasy cyfrowej i tempa wzrostu. W tym badaniu wybrano i uśredniono trzy kąty (0°, 120° i 240°) w widoku bocznym RGB, aby dokładnie obliczyć objętość rośliny i względne tempo wzrostu.

W zależności od zakresu spektralnego, wiele cech fizjologicznych można badać za pomocą obrazowania hiperspektralnego54. Konieczne jest określenie, który ze wskaźników współczynnika odbicia dostarcza niezbędnych informacji i pokazuje reakcję roślin w różnych warunkach14. Jest bardzo pożądany w badaniach przesiewowych odmian tolerancyjnych i fenotypowaniu roślin w celu określenia korelacji między wskaźnikami hiperspektralnymi a innymi cechami fizjologicznymi55. W tym badaniu rośliny poddane działaniu podlewania wykazały wyraźną reakcję na zawartość chlorofilu i wydajność fotosyntezy na podstawie obrazowania VNIR. Ponadto zaobserwowano różne reakcje w indeksie wodnym obliczonym na podstawie obrazowania SWIR pod wpływem obróbki cieplnej i nasiąkania wodą ze względu na różne regulacje aparatów szparkowych i zawartość wody w liściach.

W związku z tym wyniki te podkreślają użyteczność takiego podejścia po optymalizacji ustawień i potencjał wykorzystania wielu czujników do znalezienia cech stresu istotnych dla tolerancji klimatu. Ocena dynamiki reakcji za pomocą wielu czujników obrazowania może być wykorzystana jako jedno z potężnych narzędzi w ulepszaniu programów hodowlanych.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie są im znane żadne konkurencyjne interesy finansowe ani powiązania osobiste, które mogłyby mieć wpływ na pracę opisaną w tym artykule.

Podziękowania

Ten projekt ADAPT (Accelerated Development of multiple-stress tolerant Potato) otrzymał dofinansowanie z programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji na podstawie umowy o grant nr GA 2020 862-858. Prace te były częściowo wspierane przez Ministerstwo Edukacji, Młodzieży i Sportu Republiki Czeskiej w ramach projektu Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego "ŚPIEWAJĄCA FABRYKA" (nr 1). CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446). Core Facility Plants Sciences firmy CEITEC MU jest znany ze wsparcia dla zakładów uprawowych. Dziękujemy firmie Meijer BV za dostarczenie sadzonek in vitro wykorzystanych w tym badaniu. Dziękujemy Lence Sochurkovej za pomoc w projektowaniu graficznym rysunku 2 oraz Pavli Homolovej za pomoc w przygotowaniu materiału roślinnego podczas eksperymentów w Centrum Badawczym Photon Systems Instruments (PSI) (Drásov, Czechy).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,1 cala Czujnik CMOS z kamerą RGBPSI, Drá sov, Czechyhttps://psi.cz/Czujnik zapewnia rozdzielczość 4112 & razy ; 4168 pikseli dla widoku z boku i 2560 & razy - 1920 pikseli dla widoku z góry. Matryca jest niezwykle czuła i jest prawdziwym zamiennikiem megapikselowej matrycy CCD i zapewnia ostre, niskoszumowe obrazy
FluorCam PSI, Dr&aaostry; sov, Republika CzeskaFC1300/8080-15 Fluorometr chlorofilowy z modulacją amplitudy impulsów (PAM) 
Oprogramowanie Fluorcam 10 PSI, Dr&aaostry; sov, Republika CzeskaWersja 1.0.0.18106Do wizualizacji i analizy obrazów fluorescencji chlorofilu
GigE PSI RGB – 12,36 megapiksela KameraPSI, Drá sov, Czechyhttps://psi.cz/Do projekcji bocznych użyto trybu skanowania linii o rozdzielczości 4112 px/linię, 200 linii na sekundę. Obszar sfotografowany z boku wynosił 1205 i razy; 1005 mm (wysokość i szerokość), podczas gdy obszar obrazowany z pozycji widoku z góry wynosił 800 &; 800 mm.
Oprogramowanie do analizatora hiperspektralnego PSI, Dr&aaostry; sov, CzechyWersja 1.0.0.14Do wizualizacji i analizy obrazów hiperspektralnych
Kamera hiperspektralna HC-900 SeriesPSI, Drá sov, Republika Czeskahttps://hyperspec.org/products/Kamera w zakresie widzialnym bliskiej podczerwieni (VNIR) 380-900 nm o rozdzielczości spektralnej 0,8 nm FWHM
Kamera hiperspektralna SWIR1700PSI, Drá sov, Republika Czeskahttps://hyperspec.org/products/Kamera termowizyjna o krótkich falach (SWIR) 900 - 1700 nm o rozdzielczości spektralnej 2 nm Kamera termowizyjna FWHM
InfraTec (VarioCam HEAD 820(800)) Flir,  Stany Zjednoczonehttps://www.infratec.eu/thermography/infrared-camera/variocam-hd-head-800/Rozdzielczość 1024 i razy; 768 pikseli, czułość termiczna < 20 mK i wartość emisyjności termicznej ustawiona domyślnie na 0,95.  z prędkością skanowania 30 Hz i każdą linią składającą się z 768 pikseli. Sfotografowany obszar wynosił 1205 i razy; 1005 mm (wysokość i razy; szerokość).
Panel LED PSI, Dr&aaostry; sov, Republika Czeskahttps://led-growing-lights.com/products/Wyposażony w 4 i 240 czerwono-pomarańczowych (618 nm), 120 zimnych białych diod LED (6500 K) i 240 diod LED dalekiej czerwieni (735 nm) rozmieszczonych równomiernie na obszarze obrazowania 80 i razy 80 cm
Czujniki światła, temperatury i wilgotności względnejPSI, Drá sov, Republika Czeskahttps://psi.cz/Czujniki używane do monitorowania kontrolowanych warunków w szklarni
MEGASTOP Niebieskie maty Friedola 75831Do pokrycia powierzchni gleby
Oprogramowanie do morfoanalizu PSI, Dr&aaostry; sov, CzechyWersja 1.0.9.8Do wizualizacji i analizy obrazów RGB oraz analizy segmentacji kolorów
Oprogramowanie PlantScreen Data Analyzer (wersja 3.3.17.0)PSI, Drá sov, Republika Czeskahttps://plantphenotyping.com/products/plantscreen-modular-system/Do wizualizacji i analizy danych ze wszystkich czujników obrazowania,  jednostka pojenia-ważenia i warunki środowiskowe w szklarni
System modułowy PlantScreen PSI, Dr&aaostry; sov, Republika Czeskahttps://plantphenotyping.com/products/plantscreen-modular-system/Rodzaj platformy fenotypowej
Oprogramowanie Plantscreen Scheduler PSI, Dr&aaostry; sov, Republika CzeskaWersja 2.6.8368.25987Aby zaplanować eksperyment i ustawić protokół pomiarowy
SpectraPen MINIPSI, Drá sov, Republika Czeskahttps://handheld.psi.cz/products/spectrapen-mini/#detailsŚwiatłomierz do regulacji poziomu światła na poziomie baldachimu
Kamera wysokiej rozdzielczości TOMI-2 PSI, Dr&aaostry; sov, Czechyhttps://fluorcams.psi.cz/products/handy-fluorcam/Rozdzielczość 1360 & razy; 1024 piksele, liczba klatek na sekundę 20 kl./s i 16-bitowa głębia) z 7-pozycyjnym kołem filtrów jest zamontowany na ramieniu robota umieszczonym w środku wielokolorowego panelu świetlnego LED o wymiarach 1326 x 1586 mm.
Komora wzrostowa Walk-in FytoScope PSI, Dr&aaostry; sov, Republika Czeskahttps://growth-chambers.com/products/walk-in-fytoscope-fs-wi/Rodzaj komór używanych do uprawy rośliny

Bibliografia

  1. Contribution of Working Group I to the Sixth Assessment Report of the intergovernmental Panel on Climate change. Climate Change 2021: The Physical Science Basis. IPCC. , Available from: https://www.ipcc.ch/report/ar6/wg1/ (2021).
  2. Ray, D. K., Gerber, J. S., Macdonald, G. K., West, P. C. Climate variation explains a third of global crop yield variability. Nat Commun. 6, 5989(2015).
  3. Acevedo, M., et al. A scoping review of adoption of climate-resilient crops by small-scale producers in low- and middle-income countries. Nat Plants. 6 (10), 1231-1241 (2020).
  4. van Dijk, M., Morley, T., Rau, M. L., Saghai, Y. A meta-analysis of projected global food demand and population at risk of hunger for the period 2010-2050. Nat Food. 2 (7), 494-501 (2021).
  5. Handayani, T., Gilani, S. A., Watanabe, K. N. Climatic changes and potatoes: How can we cope with the abiotic stresses. Breed Sci. 69 (4), 545-563 (2019).
  6. Devaux, A., Goffart, J. P., Kromann, P., Andrade-Piedra, J., Polar, V., Hareau, G. The potato of the future: Opportunities and challenges in sustainable agri-food systems. Potato Res. 64 (4), 681-720 (2021).
  7. Dahal, K., Li, X. Q., Tai, H., Creelman, A., Bizimungu, B. Improving potato stress tolerance and tuber yield under a climate change scenario - a current overview. Front Plant Sci. 10, 563(2019).
  8. Ahmad, U., Sharma, L. A review of best management practices for potato crop using precision agricultural technologies. Smart Agricultural Technology. 4, 100220(2023).
  9. Cabello, R., Monneveux, P., De Mendiburu, F., Bonierbale, M. Comparison of yield based drought tolerance indices in improved varieties, genetic stocks and landraces of potato (Solanum tuberosum L). Euphytica. 193 (2), 147-156 (2013).
  10. von Gehren, P., et al. Farmers feel the climate change: Variety choice as an adaptation strategy of European potato farmers. Climate. 11 (9), 189(2023).
  11. Fiorani, F., Schurr, U. Future scenarios for plant phenotyping. Annu Rev Plant Biol. 64, 267-291 (2013).
  12. Poorter, H., et al. Pitfalls and potential of high-throughput plant phenotyping platforms. Front Plant Sci. 14, 1233794(2023).
  13. Berger, B., de Regt, B., Tester, M. High-throughput phenotyping of plant shoots. Methods Mol Biol. 918, 9-20 (2012).
  14. Humplík, J. F., Lazár, D., Husičková, A., Spíchal, L. Automated phenotyping of plant shoots using imaging methods for analysis of plant stress responses - a review. Plant Methods. 11, 29(2015).
  15. Danilevicz, M. F., Bayer, P. E., Nestor, B. J., Bennamoun, M., Edwards, D. Resources for image-based high-throughput phenotyping in crops and data sharing challenges. Plant Physiol. 187 (2), 699-715 (2021).
  16. Abebe, A. M., Kim, Y., Kim, J., Kim, S. L., Baek, J. Image-based high-throughput phenotyping in horticultural crops. Plants. 12 (10), 2061(2023).
  17. Lazarević, B., Carović-Stanko, K., Safner, T., Poljak, M. Study of high-temperature-induced morphological and physiological changes in potato using nondestructive plant phenotyping. Plants. 11 (24), 3534(2022).
  18. Marchetti, C. F., et al. A novel image-based screening method to study water-deficit response and recovery of barley populations using canopy dynamics phenotyping and simple metabolite profiling. Front Plant Sci. 10, 1252(2019).
  19. Kim, S. L., et al. High-throughput phenotyping platform for analyzing drought tolerance in rice. Planta. 252 (3), 38(2020).
  20. Abdelhakim, L. O. A., Rosenqvist, E., Wollenweber, B., Spyroglou, I., Ottosen, C. O., Panzarová, K. Investigating combined drought- and heat stress effects in wheat under controlled conditions by dynamic image-based phenotyping. Agronomy. 11 (2), 364(2021).
  21. Zandalinas, S. I., Sengupta, S., Fritschi, F. B., Azad, R. K., Nechushtai, R., Mittler, R. The impact of multifactorial stress combination on plant growth and survival. New Phytologist. 230 (3), 1034-1048 (2021).
  22. Raza, A., et al. Impact of climate change on crops adaptation and strategies to tackle its outcome: A review. Plants. 8 (2), 34(2019).
  23. Nasir, M. W., Toth, Z. Effect of drought stress on potato production: A review. Agronomy. 12 (3), 635(2022).
  24. Wagg, C., Hann, S., Kupriyanovich, Y., Li, S. Timing of short period water stress determines potato plant growth, yield and tuber quality. Agric Water Manag. 247, 106731(2021).
  25. Yamauchi, T., Colmer, T. D., Pedersen, O., Nakazono, M. Regulation of root traits for internal aeration and tolerance to soil waterlogging-flooding stress. Plant Physiol. 176 (2), 1118-1130 (2018).
  26. Aien, A., Chaturvedi, A. K., Bahuguna, R. N., Pal, M. Phenological sensitivity to high temperature stress determines dry matter partitioning and yield in potato. Indian J Plant Physiol. 22 (1), 63-69 (2017).
  27. Zandalinas, S. I., Mittler, R., Balfagón, D., Arbona, V., Gómez-Cadenas, A. Plant adaptations to the combination of drought and high temperatures. Physiol Plant. 162 (1), 2-12 (2018).
  28. Suzuki, N., Rivero, R. M., Shulaev, V., Blumwald, E., Mittler, R. Abiotic and biotic stress combinations. New Phytologist. 203 (1), 32-43 (2014).
  29. Atkinson, N. J., Jain, R., Urwin, P. E. The Response of Plants to Simultaneous Biotic and Abiotic Stress. Combined Stresses in Plants. , Springer. Cham. (2015).
  30. Harris, P. M. The Potato Crop. 2nd ed. Harris, P. M. , Springer. Dordrecht. (1992).
  31. Weisz, R., Kaminski, J., Smilowitz, Z. Water deficit effects on potato leaf growth and transpiration: Utilizing fraction extractable soil water for comparison with other crops. Am Potato J. 71 (12), 829-840 (1994).
  32. Wang, X., Vignjevic, M., Jiang, D., Jacobsen, S., Wollenweber, B. Improved tolerance to drought stress after anthesis due to priming before anthesis in wheat (Triticum aestivum L.) var. Vinjett. J Exp Bot. 65 (22), 6441-6456 (2014).
  33. Junker, A., et al. Optimizing experimental procedures for quantitative evaluation of crop plant performance in high throughput phenotyping systems. Front Plant Sci. 5, 770(2015).
  34. Smith, S. M., et al. Diurnal changes in the transcriptome encoding enzymes of starch metabolism provide evidence for both transcriptional and posttranscriptional regulation of starch metabolism in arabidopsis leaves. Plant Physiol. 136 (1), 2687-2699 (2004).
  35. Findurová, H., Veselá, B., Panzarová, K., Pytela, J., Trtílek, M., Klem, K. Phenotyping drought tolerance and yield performance of barley using a combination of imaging methods. Environ Exp Bot. 209, 105314(2023).
  36. Klukas, C., Chen, D., Pape, J. M. Integrated analysis platform: an open-source information system for high-throughput plant phenotyping. Plant Physiol. 165 (2), 506-518 (2014).
  37. Paul, K., et al. Understanding the biostimulant action of vegetal-derived protein hydrolysates by high-throughput plant phenotyping and metabolomics: A case study on tomato. Front Plant Sci. 10, 47(2019).
  38. Awlia, M., et al. High-throughput non-destructive phenotyping of traits that contribute to salinity tolerance in Arabidopsis thaliana. Front Plant Sci. 7, 1414(2016).
  39. Li, Z., Guo, R., Li, M., Chen, Y., Li, G. A review of computer vision technologies for plant phenotyping. Comput Electron Agric. 176, 105672(2020).
  40. Li, L., Zhang, Q., Huang, D. A review of imaging techniques for plant phenotyping. Sensors (Switzerland). 14 (11), 20078-20111 (2014).
  41. Obidiegwu, J. E., Bryan, G. J., Jones, H. G., Prashar, A. Coping with drought: Stress and adaptive responses in potato and perspectives for improvement. Front Plant Sci. 6, 542(2015).
  42. Zhang, H., Zhao, Y., Zhu, J. K. Thriving under stress: How plants balance growth and the stress response. Dev Cell. 55 (5), 529-543 (2020).
  43. Bandurska, H. Drought stress responses: Coping strategy and resistance. Plants. 11 (7), 922(2022).
  44. Wingler, A., Lea, P. J., Quick, W. P., Leegood, R. C. Photorespiration: metabolic pathways and their role in stress protection. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 355 (1402), 1517-1529 (2000).
  45. Baker, N. R., Rosenqvist, E. Applications of chlorophyll fluorescence can improve crop production strategies: an examination of future possibilities. J Exp Bot. 55 (403), 1607-1621 (2004).
  46. Georgieva, M., Vassileva, V. Stress management in plants: Examining Provisional and Unique Dose-Dependent Responses. Int J Mol Sci. 24 (6), 5105(2023).
  47. Leeggangers, H. A. C. F., Rodriguez-Granados, N. Y., Macias-Honti, M. G., Sasidharan, R. A helping hand when drowning: The versatile role of ethylene in root flooding resilience. Environ Exp Bot. 213, 105422(2023).
  48. Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annu Rev Plant Biol. 59 (1), 89-113 (2008).
  49. Murchie, E. H., Lawson, T. Chlorophyll fluorescence analysis: a guide to good practice and understanding some new applications. J Exp Bot. 64 (13), 3983-3998 (2013).
  50. Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence-a practical guide. J Exp Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
  51. Yokoyama, G., Ono, S., Yasutake, D., Hidaka, K., Hirota, T. Diurnal changes in the stomatal, mesophyll, and biochemical limitations of photosynthesis in well-watered greenhouse-grown strawberries. Photosynthetica. 61 (1), 1-12 (2023).
  52. Jones, H. G. Application of thermal imaging and infrared sensing in plant physiology and ecophysiology. Advances in Botanical Research. 41, 107-163 (2004).
  53. Brainard, S. H., Bustamante, J. A., Dawson, J. C., Spalding, E. P., Goldman, I. L. A digital image-based phenotyping platform for analyzing root shape attributes in carrot. Front Plant Sci. 12, 690031(2021).
  54. Huber, S., Tagesson, T., Fensholt, R. An automated field spectrometer system for studying VIS, NIR and SWIR anisotropy for semi-arid savanna. Remote Sens Environ. 152, 547-556 (2014).
  55. Mertens, S., et al. Proximal hyperspectral imaging detects diurnal and drought-induced changes in maize physiology. Front Plant Sci. 12, 640914(2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wysokoprzepustowe fenotypowanieodpowiedź ziemniaka na strescechy morfologicznecechy fizjologicznefluorescencja chlorofiluobrazowanie termiczneobrazowanie hiperspektralnedynamika wzrostu roślinkombinowane zabiegi stresowe
Wysokoprzepustowe fenotypowanie oparte na obrazie w celu określenia morfologicznych i fizjologicznych odpowiedzi na pojedyncze i połączone stresy u ziemniaka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.