Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hodowla Axenic Delia antiqua z częściowo fermentowaną, sterylną dietą

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66259

⸱

22 grudnia 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology, Ecology Institute, Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences), 2Agriculture and Rural Bureau of Changqing District

W tym artykule

Podsumowanie

Opisana jest prosta procedura hodowli aksenicznej Delia antiqua z na wpół fermentowaną, sterylną dietą. Tylko jeden szczep Wolbachia został wykryty w każdym stadium rozwojowym aksenu D. antiqua za pomocą PCR.

Streszczenie

Owady akseniczne są pozyskiwane z sterylnych systemów sztucznej hodowli przy użyciu sterylnych pożywek. Owady te, charakteryzujące się niewielkimi rozmiarami, krótkim cyklem wzrostu i niskim zapotrzebowaniem na paszę, są idealne do badania relacji między mikroorganizmami a gospodarzami. Mikrobiota jelitowa znacząco wpływa na cechy fizjologiczne gospodarzy owadów, a wprowadzenie określonych szczepów do owadów aksenicznych stanowi metodę weryfikacji funkcji mikrobiologicznych jelit. Delia antiqua, groźny szkodnik z rzędu Diptera, rodziny Anthomyiidae i rodzaju Delia, żywi się głównie cebulą, czosnkiem, porem i innymi warzywami z rodziny Liliaceae. Jego larwy żywią się cebulkami, powodując gnicie, więdnięcie, a nawet śmierć całych roślin. Hodując larwy akseniczne, można przeprowadzić badania kontrolne w celu zaobserwowania wpływu mikroflory jelitowej na wzrost i rozwój D. antiqua. W przeciwieństwie do metody polegającej na eliminacji powiązanych drobnoustrojów za pomocą antybiotyków, w niniejszym artykule przedstawiono niskokosztowe i wysoce efektywne podejście do hodowli aksenu D. antiqua. Po sterylizacji powierzchniowej jaj D. antiqua, do hodowli larw zastosowano na wpół sfermentowaną sterylną dietę, a stan aksoniczny D. antiqua zweryfikowano za pomocą testów zależnych od kultury i niezależnych od kultury. Podsumowując, połączenie sterylizacji jaj owadów i przygotowania sterylnych diet do hodowli larw umożliwiło opracowanie wydajnej i prostej metody otrzymywania aksenu D. antiqua. Metoda ta stanowi skuteczne podejście do badania interakcji między owadami a mikroflorą.

Wprowadzenie

Zwierzęta akseniczne, zdefiniowane jako zwierzęta, u których nie można wykryć żadnych żywotnych mikroorganizmów lub pasożytów, są cennymi modelami eksperymentalnymi do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm1,2. Owady, największa grupa bezkręgowców, mogą tworzyć symbiotyczne relacje z mikroorganizmami3. Owady akseniczne mogą być wykorzystywane do badania interakcji gospodarz-symbiont w systemach symbiotycznych4. Na przykład Nishide i wsp.5 opracowali praktyczną procedurę sterylnego chowu robaka o nieprzyjemnym zapachu Plautia stali, umożliwiając wiarygodną i rygorystyczną analizę interakcji gospodarz-symbiont w modelowych systemach symbiotycznych. Owady akseniczne mogą być wytwarzane poprzez sterylizację stadium jajowego i dostarczanie sterylnego pokarmu larwom i dorosłym osobnikom6,7. Owady akseniczne mają ogromne znaczenie i są szeroko stosowane w badaniach biologicznych. Na przykład badanie przeprowadzone przez Somerville et al.8 wykazało, że diamentowe zaszczepione Enterobacter cloacae poprawiły zdolności adaptacyjne transgenicznych samców.

Delia antiqua Meigen jest ważnym ekonomicznie szkodnikiem cebuli i innych upraw Liliaceae na całym świecie, którego larwy uszkadzają cebulki cebul i innych upraw Liliaceae9. D. antiqua występuje głównie w klimacie umiarkowanym i jest szeroko rozpowszechniony na obszarach uprawy cebuli w obu Amerykach, Europie i Azji. Jeśli nie jest odpowiednio kontrolowany, może powodować straty w plonach cebuli (Allium L.), czosnku (Allium sativum L.), szalotki (Allium fistulosum L.) i pora (Alliumchoenoprasum L.) w zakresie od 50% do 100%10,11. Larwy żywią się podziemnymi częściami roślin, a to karmienie powoduje więdnięcie sadzonek i ostatecznie śmierć. Ponadto uszkodzone rośliny mogą przepuszczać patogeny, co prowadzi do gnicia cebul12. Nawet jeśli rośliny nie zostaną całkowicie skonsumowane przez larwy, szkody, które powodują, sprawiają, że rośliny cebuli nie nadają się do sprzedaży i powodują straty ekonomiczne.

Owady są ściśle związane z mikrobiotą jelitową, a większość jelit owadów zawiera różnorodne bakterie symbiotyczne, które rozwijają się dzięki składnikom odżywczym dostarczanym przez gospodarza13,14. Jing et al.15 wykazali, że podstawową funkcją symbiotycznej społeczności jelitowej jest dostarczanie niezbędnych składników odżywczych, a następnie funkcji związanych z trawieniem i detoksykacją. W niektórych przypadkach bakterie jelitowe mogą służyć jako zasób mikrobiologiczny do celów zwalczania szkodników. W związku z tym pożądane jest badanie wydajności poszczególnych bakterii jelitowych i specyficznych funkcji w organizmie D. antiqua. Dlatego przygotowanie larw aksenicznych jest szczególnie ważne dla badania interakcji między określonymi szczepami bakterii a owadami16. Obecnie powszechnie stosowaną metodą eliminacji bakterii jelitowych owadów jest zastosowanie kombinacji antybiotyków w celu wyeliminowania powiązanych drobnoustrojów17,18,19. W przeciwieństwie do stosowania samych antybiotyków, które mogą jedynie zmniejszyć liczbę drobnoustrojów, akseniczny chów owadów pozwala na kontrolę składu i ilości mikroorganizmów, umożliwiając dokładniejszą walidację funkcjonalności mikrobioty jelitowej.

Tak więc, ten artykuł wprowadza protokół przygotowania i hodowli aksonicznego D. antiqua. Pokarm dla larw aksenu uzyskuje się poprzez sterylizację w wysokiej temperaturze naturalnej diety w połączeniu z pokarmami na wpół sfermentowanymi. Jaja są sterylizowane zgodnie z protokołem eksperymentalnym w celu uzyskania jaj aksenowych, a na koniec larwy akseniczne są hodowane z jaj aksenicznych. Na potrzeby eksperymentu przeprowadzono akseniczny system chowu tylko dla jednego pokolenia. Zapewni to wygodę w badaniu interakcji między owadami a mikrobiotą jelitową.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

D. antiqua są pozyskiwane z pola Fanzhen, Taian.

1. Przygotowanie bezpłodnych diet

  1. Oderwij zewnętrzne warstwy szalotki i wyrzuć zielone liście. Zachowaj białą część szalotki (Rysunek 1A) i umyj ją sterylną wodą, powtarzając proces płukania trzy razy. Pokrój białą część szalotki na 1-2 cm pokrojone w kostkę kawałki za pomocą nożyczek (patrz Tabela materiałów) wysterylizowanych 75 % roztworem EtOH (wspomnianym w kroku 2.5) do późniejszego wykorzystania.
  2. Zważ 50 g pokrojonej w kostkę szalotki i umieść ją w robocie kuchennym (patrz tabela materiałów). Dodaj 50 ml wysterylizowanej wody i zmiel je pięć razy po 2 minuty. Wszystkie pokrojone w kostkę szalotki powinny być zmielone na konsystencję pasty (Rysunek 2A).
  3. Za pomocą pęsety przenieś 10 sztuk larw D. antiqua w trzecim stadium rozwojowym do probówki wirówkowej o pojemności 10 ml zawierającej 10 ml 1x PBS i zmiel je jednorazowym tłuczkiem do mielenia (patrz Tabela materiałów) przez około 5 minut, aby uzyskać płyn do mielenia larw.
  4. Wlać pastowatą ciecz z szalotki i płyn do mielenia larw do czystej kolby stożkowej o pojemności 500 ml (patrz tabela materiałów). Owinąć stożkowe ujście kolby dwiema warstwami przezroczystej folii uszczelniającej, a następnie umieścić kolbę w inkubatorze do wytrząsania (patrz Tabela Materiałów) do fermentacji w temperaturze 25 °C i 180 obr./min przez 12 godzin (Rysunek 2B).
  5. Wytnij nożyczkami siedem warstw kwadratowej gazy o bokach 10 cm (nie ma potrzeby sterylności) i ułóż je razem, aby utworzyć proste urządzenie filtrujące. Powoli wlej sfermentowany płyn z szalotki na gazę i wyciśnij przefiltrowany płyn do nowej stożkowej kolby o pojemności 500 ml. Pozostałe resztki szalotki zawiń na gazie w folię aluminiową do późniejszego wykorzystania.
  6. Przefiltrować filtrat otrzymany w poprzednim kroku za pomocą pompy próżniowej (patrz tabela materiałów) i lejka Buchnera. Umieść bibułę filtracyjną zwilżoną wodą dejonizowaną na lejku Buchnera, a następnie wlej filtrat i trzykrotnie wykonaj filtrację ssącą za pomocą innej bibuły filtracyjnej. Zebrać końcowy filtrat do kolby stożkowej o pojemności 500 ml.
  7. Wykonaj kolejną filtrację za pomocą butelki filtrującej 0,22 μM i pompy próżniowej. Przykręć pokrywę kolby z filtrem ssącym w ultra czystej ławce (patrz Tabela materiałów) w celu dalszego użycia. W tym momencie otrzymuje się sfermentowaną pozostałość szalotki i filtrat (Rysunek 2C).
    UWAGA: Przefiltrowana ciecz uzyskana na tym etapie będzie sterylna. (Butelka filtrująca 0,22 μM to sterylny system filtracji próżniowej do sterylizacji filtratu).
  8. Powtórz poprzednie kroki, aby uzyskać niesfermentowaną pozostałość szalotki i przesączenie. Tutaj różnica polega na tym, że fermentacja nie jest potrzebna.
  9. Odważyć 0,24 g chlorku choliny i 0,56 g kwasu L-askorbinowego (patrz tabela materiałów) w probówce wirówkowej o pojemności 10 ml. Dodaj 3 ml wody dejonizowanej i energicznie wstrząsaj, aż całkowicie się rozpuszczą. Na ultra czystej ławce użyj nowej strzykawki o pojemności 5 ml i podłącz trzy filtry strzykawkowe 0,22 μM (patrz tabela materiałów), aby wysterylizować roztwór i umieść go w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 10 ml do późniejszego użycia.
    UWAGA: Chlorek choliny jest niezbędnym neuroprzekaźnikiem do wzrostu owadów, podczas gdy kwas L-askorbinowy działa jako środek konserwujący.
  10. Odważyć 2 g agaru w proszku i 6 g TSB (patrz Tabela Materiałów) i wlać je do kolby stożkowej o pojemności 500 ml. Następnie dodaj 100 ml wody dejonizowanej, aby przygotować pożywkę hodowlaną. Po spłukaniu szklanego pręta wodą dejonizowaną użyj go do mieszania mieszaniny, aż dobrze się wymiesza. Następnie uszczelnić kolbę stożkową za pomocą dwóch warstw przezroczystej folii uszczelniającej.
  11. Zawiń sfermentowane szalotki i niesfermentowane szalotki (wymienione w kroku 1.5 i kroku 1.8) w folię aluminiową i sterylizuj je, wraz z pożywką, w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut.
  12. Na ultra czystej ławce wlej wysterylizowany chlorek choliny, kwas L-askorbinowy i sterylny filtrat do pożywki hodowlanej, delikatnie obracając, aby dokładnie je wymieszać. Na koniec dodaj sfermentowaną i niesfermentowaną szalotkę i energicznie wstrząśnij ręcznie, aby uzyskać sterylną dietę. Wlej diety do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml (sterylne; nasadka odpowietrzająca z hydrofobową membraną PVDF 0,22 μM) (patrz tabela materiałów) pod kątem (Rysunek 2D).
    UWAGA: Po sterylizacji temperatura pożywki hodowlanej powinna być utrzymywana w zakresie 65-80 °C, aby zapobiec szybkiemu schłodzeniu i zestaleniu podczas dodawania szalotki lub innych składników. Poza tym do każdej probówki wlej około 10-15 ml diety. Po zestaleniu się pokarmu należy przechowywać probówki w lodówce w temperaturze 4 °C, jeśli nie zostaną natychmiast zużyte.

2. Pozyskiwanie jaj aksenicznych

  1. Laboratoryjny system chowu D. antiqua
    1. Umieścić klatkę hodowlaną w inkubatorze o temperaturze 25 °C z wewnętrznym oświetleniem LED (24 godziny w cyklu, stosunek światła do ciemności wynosi 16:8), aby wychować dorosłe samce i samice, umożliwiając im łączenie się w pary i składanie jaj. Napełnij dystrybutor wody (Rysunek 1B) wodą i uszczelnij go zwilżoną watą, aby zapewnić wodę dorosłym.
    2. Umieść cztery dna szalek Petriego o wymiarach 35 mm x 12 mm w pokrywie szalki Petriego o wymiarach 94 mm x 16 mm. Zwilż watę zjonizowaną wodą, a następnie umieść wilgotną watę na dwóch dnie szalki Petriego, a na wierzch waty dodaj jedną łyżkę sacharozy.
    3. Wypełnij pozostałe dwie płytki Petriego dwiema łyżkami sacharozy i ekstraktu drożdżowego (patrz Tabela Materiałów), które służą jako pokarm dla dorosłych owadów (Rysunek 1C).
      UWAGA: Sacharoza i ekstrakt drożdżowy wymienione w krokach 2.1.2 i 2.1.3 nie muszą być sterylizowane.
    4. Umieść dno szalki Petriego o wymiarach 94 mm x 16 mm zawierające zwilżony piasek i kawałek nieukorzenionego, obranego ząbka czosnku (Rysunek 1D) do klatki na muchy, aby zebrać jaja. Samica zostanie zwabiona zapachem czosnku i złoży wokół niego jaja.
  2. Zbieranie jaj
    1. Wyjąć z klatki przyrząd do składania jaj, który jest szalką Petriego o wymiarach 94 mm x 16 mm zawierającą piasek i czosnek wymienione powyżej (krok 2.14). Wlej piasek razem z czosnkiem do zlewki o pojemności 500 ml i użyj wody z kranu, aby wypłukać pozostałe jajka z czosnku do zlewki. W tym momencie jaja unoszą się w wodzie.
    2. Weź sito o oczkach 100 (patrz Tabela materiałów) i zwilż je wodą z kranu. Następnie wlej wodę zawierającą pływające jajka ze zlewki na sito. Jajka pozostaną na sicie.
    3. Po naturalnym wyschnięciu jajek na sicie, za pomocą szczotki delikatnie przemieść jajka na szalkę Petriego.
  3. Pierwszego dnia przepłucz urządzenie do składania jaj, aby zebrać jaja bez dezynfekcji lub sterylizacji. Drugiego dnia o godzinie czwartej po południu ponownie spłucz jajka i zbierz je, przesiewając je czystą wodą.
    UWAGA: Zebranie jaj w drugim dniu ma zapewnić stałe tempo wzrostu w kolejnych etapach. Godzina czwarta po południu to szczyt składania jaj przez D. antiqua. Dlatego idealnie jest zbierać jaja w tym czasie.
  4. Umieść zebrane jaja na sterylnym sicie komórkowym (patrz Tabela Materiałów) na ultra czystej ławce (Rysunek 3A).
  5. Przygotuj roztwór do sterylizacji jaj
    1. Pobrać 5 ml 5,2% NaClO (patrz tabela materiałów) i przenieść do wysterylizowanej kolby stożkowej o pojemności 250 ml. Dodać 95 ml wysterylizowanej wody, aby uzyskać całkowitą objętość 100 ml, co daje 0,26% roztwór NaClO.
    2. Aby przygotować 75% roztwór EtOH, należy pobrać 75 ml 99,7% EtOH i przenieść go do wysterylizowanej kolby stożkowej o pojemności 250 ml. Dodaj 25 ml wysterylizowanej wody, aby uzyskać całkowitą objętość 100 ml, co daje 75% roztwór EtOH.
  6. Wlać 30 ml NaClO do szalki Petriego i wlać 30 ml EtOH do innej szalki Petriego. Umieścić sito komórkowe zawierające jaja, o których mowa w kroku 2.4, w naczyniu zawierającym NaClO. Namocz go w 0,26% roztworze NaClO na 0,5 minuty. Następnie przenieś sito do naczynia zawierającego EtOH, pozwalając mu zanurzyć się w 75% roztworze EtOH przez kolejne 0,5 minuty.
  7. Powtórz ten proces trzy razy, naprzemiennie 0,26% NaClO i 75% EtOH co 0,5 minuty. Następnie zostaną uzyskane jaja akseniczne. W tym momencie sito zawierające jaja należy zanurzyć w EtOH.
    UWAGA: Aby zapewnić dokładną sterylizację, użyj pipety o pojemności 1 ml do odessania NaClO i EtOH i rozproszenia jaj. Powtórz proces płukania wiele razy. Ten krok dodatkowo oczyści powierzchnię jaj z resztek bakterii i zanieczyszczeń, zapewniając czystą i sterylną powierzchnię.

3. Hodowla larw aksenicznych

  1. Aby przenieść wysterylizowane jaja, użyj nożyczek, które zostały wysterylizowane lampą alkoholową, aby przeciąć końcową końcówkę pipety o pojemności 1 ml (Rysunek 3B). Upewnij się, że otwór końcowy pociętej pipety jest większy niż średnica jaj (około 2 mm). Następnie za pomocą pipety przenieś jaja z roztworu EtOH (jaja razem z roztworem) (Rysunek 3C) do probówki wirówkowej zawierającej sterylne diety, a każda probówka powinna zawierać około 20-50 jaj (Rysunek 3D). Powtarzaj ten proces, aż wszystkie jaja zostaną przeniesione.
    UWAGA: Średnica końcówki pipety powinna być jak największa, aby uniknąć rozbicia jaj podczas przenoszenia, co mogłoby doprowadzić do ich śmierci.
  2. Użyj pipety, aby usunąć nadmiar etanolu z probówki. Umieść probówkę wirówkową zamkniętą pokrywkami w samozamykającej się torbie i umieść kawałek bawełny w otworze worka, aby umożliwić cyrkulację powietrza. Na koniec umieść worek w inkubatorze o temperaturze 25 °C (wilgotność względna: 50%-70%; fotoperiod: 16 godzin światła: 8 godzin ciemności) w celu obserwacji i uprawy.
  3. Około trzy dni później zaczynają wykluwać się jaja akseniczne w diecie (Ryc. 4A). Wyklute larwy będą aktywne, a powierzchnia sterylnych diet nie będzie już gładka. Larwy zaczną żerować na dietach.
  4. Kontynuuj obserwację larw, aż osiągną stadium larw 2. stadium. Monitoruj ich wzrost i rozwój w tym okresie.
    5. Po 9-12 dniach ponad 80% jaj rozwinęło się w larwy w trzecim stadium rozwojowym (Ryc. 4B).
  5. Wskazuje to na pomyślny wzrost i rozwój larw.

4. Walidacja larw aksenu za pomocą testów zależnych od hodowli

  1. Losowo wybierz trzy larwy 3. stadium osiowego z probówki wirówkowej.
  2. Umieścić larwy na szalce Petriego o wymiarach 94 mm x 16 mm zawierającej 75% alkoholu w celu oczyszczenia. Następnie przenieś je do pojemnika ze sterylną wodą w celu dalszego płukania.
  3. Użyj zdezynfekowanych kleszczy preparacyjnych, które zostały wysterylizowane 75% roztworem EtOH, aby chwycić larwy (głowa i ogon są pokazane na Rysunek 5A). Użyj nożyczek preparacyjnych, aby usunąć końce głowy i ogona (Rysunek 5B). Przytrzymaj ogon larw kleszczami i użyj innych kleszczy, aby delikatnie ścisnąć od ogona do głowy i wydobyć narządy wewnętrzne (wynik pokazany w Rysunek 5C). Umieść narządy wewnętrzne w wodzie dejonizowanej i delikatnie oderwij jelito, naciskając kleszczami na tkankę tłuszczową, a następnie umieść wyekstrahowaną wewnętrzną (Rysunek 5D) w sterylnej wodzie do dalszego użytku.
  4. Umieść jelito w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml, dodaj 500 μl wysterylizowanego buforu 1x PBS i użyj jednorazowego tłuczka do zmielenia tkanki jelitowej na homogenat.
  5. Weź 100 μl homogenatu i dodaj go do pożywki agarowej. Użyj rozsiewacza w kształcie litery L (patrz Tabela materiałów) do smugowania płytki agarowej.
  6. Umieścić szalkę Petriego w inkubatorze biochemicznym w temperaturze 28 °C i inkubować przez 72 godziny, aby obserwować wzrost kolonii.

5. Walidacja larw aksenu za pomocą testów niezależnych od hodowli

  1. Ekstrahować całkowite DNA z tkanki jelitowej larw aksenicznych za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Zmierz stężenie DNA za pomocą spektrofotometru UV.
  3. Przeprowadzić reakcję PCR przy użyciu uniwersalnych bakteryjnych starterów 16S rRNA (1492R: 5'- GGTTACCTTGTTACGACTT -3', 27F: 5'- AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3'). Całkowita objętość reakcyjna wynosi 25 μl i składa się z 1 μl matrycy DNA, 0,5 μl startera do przodu, 0,5 μl startera wstecznego, 10,5 μl ddH2O i 12,5 μl 2x Taq PCR Master Mix (patrz tabela materiałów). Ustawić warunki reakcji PCR w następujący sposób: początkowa denaturacja w temperaturze 94 °C przez 3 min; 35 cykli denaturacji w temperaturze 94 °C przez 30 s, wyżarzania w temperaturze 55 °C przez 30 s i przedłużania w temperaturze 72 °C przez 90 s; końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 min. Produkty PCR należy przechowywać w temperaturze 4 °C do dalszej analizy.
  4. Przeprowadzić reakcję PCR przy użyciu uniwersalnych starterów ITS grzybów (ITS1: 5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3', ITS4: 5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3'). Całkowita objętość reakcyjna wynosi 25 μl i składa się z 1 μl matrycy DNA, 0,5 μl startera do przodu, 0,5 μl startera odwrotnego, 10,5 μl ddH2O i 12,5 μl 2x Taq PCR Master Mix. Ustawić warunki PCR w temperaturze 95 °C na 5 minut; 35 cykli w temperaturze 95 °C przez 30 s, 55 °C przez 1 min i 72 °C przez 90 s; następnie w temperaturze 72 °C przez 10 min. Produkty PCR należy przechowywać w temperaturze 4 °C do dalszej analizy.
  5. Użyj barwnika kwasu nukleinowego Super Green (patrz Tabela materiałów), aby równomiernie wymieszać z każdym z dwóch rodzajów produktów PCR i przeanalizować je za pomocą elektroforezy na 1% żelu agarozowym w 1x buforze TAE (rozcieńczonym z 50x TAE, patrz Tabela Materiałów). Jako odniesienie należy użyć 3 μl markera DNA (patrz tabela materiałów).
  6. Użyj transiluminatora UV, aby obserwować żel i zlokalizować docelowy fragment.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Etapy życia D. antiqua przedstawiono na Rysunku 4. Pełny cykl życiowy obejmuje jaja, larwy, poczwarkę (Rysunek 4C) oraz osobniki dorosłe (Rysunek 4D). Są one hodowane w sterylnych probówkach wirówkowych, a ich wygląd i przeżywalność nie różnią się od osobników D. antiqua hodowanych w warunkach nieaksenicznych. Czas wzrostu i rozwoju dla każdego etapu życia D. antiqua znajduje się na Ry...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Owady posiadają wysoce złożoną mikrobiotę jelitową20,21, co wymaga wykorzystania owadów aksenicznych zaszczepionych specyficznymi szczepami drobnoustrojów jelitowych do badania interakcji między owadami a mikroorganizmami. Przygotowanie owadów aksenicznych ma kluczowe znaczenie dla takich przedsięwzięć badawczych. Antybiotykoterapia to metoda stosowana w celu wyeliminowania mikrobioty jelitowej. Na przykład Jung i Kim(22 l.) karmili Sp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32272530), Projekt New Twenty Policies for University in Jinan (2021GXRC040), Główne Projekty Innowacji Naukowych i Technologicznych w prowincji Shandong (2021TZXD002) oraz Projekt Integracji Nauki i Edukacji Uniwersytetu Technologicznego Qilu (2022PYI009, 2022PY016, 2022PT105).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &m; Butelka filtrująca MThermo Scientific450-0045
0,22 μ M Filtr strzykawkowyBiosharpBS-QT-011
Sito o oczkach 100Zhejiang Shangyu Jinding Standardowe sito FabrykaNr Numery
1x roztwór PBSSolarbioP1020
2x Taq PCR Master MixGENVIEWGR1113-1ML
5,2% roztwór NaClOSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.
500 ml Kolba stożkowaThermo Scientific4103-0500
50 mL wentylowana probówka wirówkowaJET BIOFILBRT-011-050
50x bufor TAEGENVIEWGT1307
Proszek agarowyDing GuoDH010-1.1
Inkubator biochemicznySTIK21040121500010
Sito komórkoweSAINING5022200
Chlorek cholinySangon BiotechA600299-0100
ddH2ODing GuoPER018-2
Jednorazowy tłuczek do mieleniaJET BIOFILCSP-003-002
Zestaw do ekstrakcji DNASangon BiotechB518221-0050
Marker DNASangon BiotechB600335-0250
Absolutny etanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.
Bibuła filtracyjnaNEWSTAR1087309025
Robot kuchennyGuangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd.
Oświetlony  inkubatorShanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd.
Kwas L-askorbinowySangon BiotechA610021-0100
Rozsiewacz w kształcie litery LSAINING6040000
Pożywka agarowaHope BioHB0109
NożyczkiBing Yu  Zakup BY-103wstrząsowy Jingdong
Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd.
SacharozaGENVIEWCS326-500G
Super zielony barwnik kwasu nukleinowegoBiosharpBS355A
Super czysty stółHeal ForceAC130052
TSBHope BioHB4114
Pompa próżniowaZhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd.
Ekstrakt drożdżowyThermo ScientificLP0021B
katalogowe8001042810009218WBL25B26A16110768 na inkubator 202000001422051031

Bibliografia

  1. Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
  2. Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-microbial interactions. Methods in Molecular Biology. 1438, 123-135 (2016).
  3. Douglas, A. E. Multiorganismal insects: diversity and function of resident microorganisms. Annual Review of Entomology. 60 (1), 17-34 (2015).
  4. Wang, G. -H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219(2022).
  5. Nishide, Y., et al. Aseptic rearing procedure for the stinkbug Plautia stali (Hemiptera: Pentatomidae) by sterilizing food-derived bacterial contaminants. Applied Entomology and Zoology. 52 (3), 407-415 (2017).
  6. Ma, M., Liu, P., Yu, J., Han, R., Xu, L. Preparing and rearing axenic insects with tissue cultured seedlings for host-gut microbiota interaction studies of the leaf beetle. Journal of Visualized Experiments. 176, e63195(2021).
  7. Zhu, Z., Wang, D., Liu, Y., Tang, T., Wang, G. H. Optimizing the rearing procedure of germ-free wasps. Journal of Visualized Experiments. 197, e65292(2023).
  8. Somerville, J., Zhou, L. Q., Raymond, B. Aseptic rearing and infection with gut bacteria improve the fitness of transgenic diamondback moth, Plutella xylostella. Insects. 10 (4), 89(2019).
  9. Shuoying, N., Jiufeng, W., Jinian, F., Hugo, R. Predicting the current potential and future world wide distribution of the onion maggot, Delia antiqua using maximum entropy ecological niche modeling. PLoS ONE. 12 (2), e0171190(2017).
  10. Ellis, P. R., Eckenrode, C. J. Factors influencing resistance in Allium sp. to onion maggot. Bulletin of the Entomological Society of America. 25 (2), 151-154 (1979).
  11. Nault, B. A., Straub, R. W., Taylor, A. G. Performance of novel insecticide seed treatments for managing onion maggot (Diptera : Anthomyiidae) in onion fields. Crop Protection. 25 (1), 58-65 (2006).
  12. Leach, A., Reiners, S., Fuchs, M., Nault, B. Evaluating integrated pest management tactics for onion thrips and pathogens they transmit to onion. Agriculture Ecosystems & Environment. 250, 89-101 (2017).
  13. Zhou, F., et al. Bacterial Inhibition on Beauveria bassiana Contributes to Microbiota Stability in Delia antiqua. Frontiers in Microbiology. 12, 710800(2021).
  14. Zhou, F., et al. Symbiotic bacterium-derived organic acids protect delia antiqua larvae from entomopathogenic fungal infection. mSystems. 5 (6), 00778-00820 (2020).
  15. Jing, T. Z., Qi, F. H., Wang, Z. Y. Most dominant roles of insect gut bacteria: digestion, detoxification, or essential nutrient provision. Microbiome. 8 (1), 38(2020).
  16. Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), e52(2018).
  17. Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402(2018).
  18. Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
  19. Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942(2021).
  20. Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
  21. Zhang, W., et al. Differences between microbial communities of pinus species having differing level of resistance to the pine wood nematode. Microbial Ecology. 84 (4), 1245-1255 (2022).
  22. Jung, S., Kim, Y. Synergistic effect of Xenorhabdus nematophila K1 and Bacillus thuringiensis subsp aizawai against Spodoptera exigua (Lepidoptera : Noctuidae). Biological Control. 39 (2), 201-209 (2006).
  23. Raymond, B., et al. A mid-gut microbiota is not required for the pathogenicity of Bacillus thuringiensis to diamondback moth larvae. Environmental Microbiology. 11 (10), 2556-2563 (2009).
  24. Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Y. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
  25. Llop, P., Latorre, A., Moya, A. Experimental epidemiology of antibiotic resistance: looking for an appropriate animal model system. Microbiology Spectrum. 6 (1), (2018).
  26. Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. The use of peracetic acid to obtain germfree invertebrate eggs for gnotobiotic studies. American Midland Naturalist. 6 (1), 239(1963).
  27. Dillon, R., Charnley, K. Mutualism between the desert locust Schistocerca gregaria and its gut microbiota. Research in Microbiology. 153 (8), 503-509 (2002).
  28. Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. Oxygen affects gut bacterial colonization and metabolic activities in a gnotobiotic cockroach model. Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).
  29. Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y. M., Shi, Z. H. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-Protocol. 9 (24), e3456(2019).
  30. Bavani, M. M., et al. Sterilization of Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) Eggs for maggot debridement therapy. Journal of Medical Entomology. 59 (3), 1076-1080 (2022).
  31. Han, L. Z., Li, S. B., Liu, P. L., Peng, Y. F., Hou, M. L. New artificial diet for continuous rearing of Chilo suppressalis (Lepidoptera: Crambidae). Annals of the Entomological Society of America. 105 (2), 253-258 (2012).
  32. Bezerra, C. E. S., Amaral, B. B., Souza, B. Rearing Chrysoperla externa larvae on artificial diets. Neotropical Entomology. 46 (1), 93-99 (2017).
  33. Feng, H. Q., Jin, Y. L., Li, G. P., Feng, H. Y. Establishment of an artificial diet for successive rearing of Apolygus lucorum (Hemiptera: Miridae). Journal of Economic Entomology. 105 (6), 1921-1928 (2012).
  34. Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. J. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352(2020).
  35. Li, X. Y., et al. Dynamics of the intestinal bacterial community in black soldier fly larval guts and its influence on insect growth and development. Insect Science. 30 (4), 947-963 (2023).
  36. Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and Evolution of heritable bacterial symbionts. Annual Review of Genetics. 42, 165-190 (2008).
  37. Weinert, L. A., Araujo-Jnr, E. V., Ahmed, M. Z., Welch, J. J. The incidence of bacterial endosymbionts in terrestrial arthropods. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 282 (1807), 20150249(2015).
  38. Weeks, A. R., Turelli, M., Harcombe, W. R., Reynolds, K. T., Hoffmann, A. A. From parasite to mutualist: Rapid evolution of Wolbachia in natural populations of Drosophila. PLOS Biology. 5 (5), 997-1005 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

owady akseniczneekologia mikrobówmikrobiota jelitowasterylizacja jaj owadówhodowla larwmikroflora jelitowaanalizy zależne od hodowlihodowla bezantybiotykowa
Hodowla Axenic Delia antiqua z częściowo fermentowaną, sterylną dietą
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.