Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test aspiracji mikropipet fluorescencyjnych w celu zbadania mechanosensacji czerwonych krwinek

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66265

⸱

12 stycznia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering, The University of Sydney, 2Charles Perkins Centre, The University of Sydney, 3Heart Research Institute, 4The University of Sydney Nano Institute (Sydney Nano), The University of Sydney

W tym artykule

Podsumowanie

Badanie zachowania komórek pod wpływem stresu mechanicznego jest kluczowe dla postępów w mechanice komórkowej i mechanobiologii. Wprowadzamy technikę aspiracji mikropipetami fluorescencyjnymi (fMPA), nowatorską metodę łączącą kontrolowaną stymulację mechaniczną z kompleksową analizą sygnalizacji wewnątrzkomórkowej w pojedynczych komórkach. Technika ta pozwala na przeprowadzenie nowych, dogłębnych badań nad mechanobiologią żywych komórek.

Streszczenie

Testy aspiracji mikropipet od dawna stanowią kamień węgielny w badaniach mechaniki żywych komórek, oferując wgląd w reakcje komórek na stres mechaniczny. W artykule opisano innowacyjną adaptację testu aspiracji mikropipet sprzężonych z fluorescencją (fMPA). Test fMPA wprowadza możliwość precyzyjnego administrowania siłami mechanicznymi przy jednoczesnym monitorowaniu procesów mechanotransdukcji żywych komórek, w których pośredniczą kanały jonowe. Wyrafinowana konfiguracja obejmuje precyzyjnie zaprojektowaną mikropipetę ze szkła borokrzemianowego podłączoną do precyzyjnie regulowanego zbiornika na wodę i pneumatycznego systemu zasysania, ułatwiając kontrolowane stosowanie ciśnienia z dokładnością ± 1 mmHg. Znaczącym ulepszeniem jest integracja obrazowania epi-fluorescencyjnego, co pozwala na jednoczesną obserwację i kwantyfikację zmian morfologicznych komórek i wewnątrzkomórkowych przepływów wapnia podczas aspiracji. Test fMPA, dzięki synergicznemu połączeniu obrazowania epifluorescencyjnego z aspiracją mikropipet, ustanawia nowy standard w badaniu mechanoczujników komórek w trudnych mechanicznie środowiskach. To wieloaspektowe podejście można dostosować do różnych konfiguracji eksperymentalnych, dostarczając krytycznych informacji na temat mechanizmów mechanodetekcji pojedynczych komórek.

Wprowadzenie

Rozwijające się odkrycia w świecie zachowań komórkowych uwydatniły rolę bodźców mechanicznych, takich jak napięcie, naprężenie ścinające płyn, kompresja i sztywność podłoża, w dyktowaniu dynamicznych aktywności komórkowych, takich jak adhezja, migracja i różnicowanie. Te mechanobiologiczne aspekty mają ogromne znaczenie w wyjaśnianiu, w jaki sposób komórki oddziałują i reagują na swoje środowisko fizjologiczne, wpływając na różne procesy biologiczne1,2.

W ciągu ostatniej dekady, testy aspiracji oparte na mikropipetach wyróżniały się jako wszechstronne narzędzie do badania różnych reakcji komórkowych na bodźce mechaniczne. Technika ta dostarcza cennych informacji na temat wewnętrznych właściwości mechanicznych żywych komórek na poziomie pojedynczej komórki, w tym modułu sprężystości komórek, sztywności i napięcia korowego. Testy te umożliwiają pomiar różnych parametrów mechanicznych, takich jak napięcie błony komórkowej, nacisk wywierany na błonę komórkową i napięcie kory mózgowej (podsumowane w tabeli 1). Badanie sił aspiracyjnych wzbogaciło naszą wiedzę na temat tego, w jaki sposób wpływają one na funkcje i procesy komórkowe, szczególnie w dziedzinie dynamiki błony, w tym fragmentacji, wydłużania i pączkowania3,4.

Parametr mechanicznyopisNowatorskie podejścia
Sztywność komórkiPomiar sztywności mechanicznej i elastyczności ogniwa.Aspiracja błony komórkowej i analiza reakcji na odkształcenia na podciśnienie20,21.
Siła przyczepnościOcena, jak silnie komórki przylegają do powierzchni.Zastosowanie kontrolowanego ssania w celu oderwania przylegających komórek od podłoża2,22.
Naprężenie membranyOcena napięcia lub stresu w błonach komórkowych.Pomiar odkształcenia membrany w odpowiedzi na przyłożone ciśnienie23,24.
Właściwości lepkosprężysteCharakterystyka połączonego lepkości i sprężystości komórki.Analiza zależnej od czasu reakcji na odkształcenie na aspirację23,25.
OdkształcalnośćOkreślenie, jak łatwo komórka może zmienić kształt.Ocena zakresu odkształcenia pod wpływem kontrolowanego ssania20,24.
napięcie powierzchniowePomiar napięcia na powierzchni ogniwa.Ocena ciśnienia wymaganego do wytworzenia wystającego elementu membrany mikropipety26.
Interakcja komórka-materiałBadanie interakcji między komórkami a materiałami lub substratami.Aspiracja komórek mających kontakt z różnymi materiałami i obserwacja oddziaływań2,24.
Interakcja komórka-komórkaBadanie oddziaływań między sąsiednimi komórkami.Aspiracja grupy komórek i analiza ich sił międzykomórkowych27.

Tabela 1: Parametry mechaniczne scharakteryzowane przez test aspiracji mikropipet.

Technika aspiracji oparta na mikropipetach jest szeroko stosowana do badania czerwonych krwinek (RBC), oceny odkształcalności i różnych cech mechanicznych krwinek czerwonych, co jest niezbędne do zrozumienia ich funkcji w układzie krążenia. Erytrocyty czerwone wykazują niezwykłą zdolność adaptacji, zachowując swoją mechaniczną wszechstronność przed deformacją podczas poruszania się po skomplikowanej sieci naczyń włosowatych i szczelinach międzyśródbłonkowych5,6. Podczas tej podróży RBC muszą pokonywać przejścia o szerokości zaledwie 0,5-1,0 μm, poddając się wielu siłom mechanicznym, w tym rozciąganiu i ściskaniu7,8,9. Mają również wysoką wrażliwość na naprężenia ścinające generowane przez przepływ krwi podczas krążenia10. Procesy te sprzyjają aktywacji mechanizmów regulacyjnych związanych z napływem wapnia, kluczowym zdarzeniem sygnalizacyjnym o dobrze ugruntowanej roli w odpowiedziach komórkowych na bodźce mechaniczne11,12. Złożone mechanizmy rządzące mechanosensacją za pośrednictwem wapnia pozostają fascynującymi przedmiotami trwających badań.

W tym kontekście, fMPA jest skutecznym podejściem do ujawnienia zakresu mobilizacji wapnia pod precyzyjnie kontrolowanymi siłami mechanicznymi, pozwalając na jednoczesne zastosowanie modulacji mechanicznej (przy użyciu systemu aspiracji mikropipet) i wizualizację intensywności wapnia (za pomocą wskaźników fluorescencyjnych). W szczególności naśladuje fizjologiczny scenariusz, w którym RBC przemieszcza się przez zwężające się naczynia krwionośne. Warto podkreślić, że opracowany przez nas system fMPA może generować ciśnienie z rozdzielczością 1 mmHg. Zaimplementowana kamera szybkoobrotowa może osiągnąć rozdzielczość czasową 100 ms oraz rozdzielczość przestrzenną na poziomie submikrometrów. Konfiguracje te zapewniają precyzyjne przyłożenie sił mechanicznych do żywych komórek i jednocześnie przechwytują powstałą sygnalizację komórkową. Co więcej, ze względu na zintegrowany charakter tej konfiguracji, test aspiracji mikropipet można łatwo dostosować do innych urządzeń lub technik, umożliwiając dalsze badanie zawiłości mechaniki komórek. Ta wszechstronność jest dodatkowym atutem tego podejścia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Niniejszy protokół jest zgodny z wytycznymi i został zatwierdzony przez Komisję Etyki Badań z Udziałem Ludzi Uniwersytetu w Sydney. Od dawców biorących udział w tym badaniu uzyskano świadomą zgodę.

1. Izolacja ludzkich erytrocytów (RBC)

UWAGA: Krok 1.1 powinien być wykonany przez przeszkolonego flebotomistę zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Komisję Bioetyczną (Institutional Review Board).

  1. Pobrać 5 ml krwi z żyły łokciowej środkowej, używając igły motylkowej 19 G.
  2. Przenieś pobraną krew do probówki o pojemności 15 ml zawierającej enoksaparynę w stężeniu 1:200 w celu zapobiegania krzepnięciu.
  3. Rozcieńczyć 5 µL przeciwkrzepliwej enoksaparyną krwi w 1 ml buforu węglanowo-wodorowęglanowego (bufor C, pH = 8,5-9; Tabela materiałów).
  4. Odwiruj rozcieńczoną próbkę krwi przy 900 × g przez 1 min, aby doprowadzić do sedymentacji erytrocytów. Ostrożnie odlej nadsącz, nie naruszając osadu.
  5. Przemyć osad RBC dwukrotnie, używając 1 ml buforu C (Tabela materiałów), każdorazowo wirując przy 900 × g przez 1 min.
  6. Następnie osad erytrocytów należy przemyć dwukrotnie 1 ml buforu Tyrode’a, stosując te same warunki wirowania, a następnie zawiesić końcowy osad w 1 ml buforu Tyrode’a, aby otrzymać przemyty roztwór zapasowy zawiesiny erytrocytów.

2. Obciążanie wskaźnikiem wapnia

  1. Dostosuj stężenie przemytej roztworu zapasowego RBC do 10 × 106 komórek/mL w buforze Tyrode'a, na podstawie liczby komórek uzyskanej za pomocą automatycznego licznika komórek (Tabela materiałów).
  2. Oznacz wapń wewnątrz RBC, inkubując je z 16,67 µM Cal-520 AM, barwnikiem wrażliwym na wapń, podczas mieszania na rotacyjnym mieszalniku do probówek przez 1 h.
  3. Rozcieńcz RBC w buforze Tyrode'a zawierającym 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w stosunku 1:50. Komórki są teraz gotowe do użycia w eksperymentach.

3. Wytwarzanie mikropipet

  1. Zamocuj borokrzemianową kapilarną rurkę szklaną (średnica zewnętrzna 1 mm x średnica wewnętrzna 0,6 mm) w wyciągaczu mikropipet P-1000, aby wytworzyć dwie odpowiadające sobie mikropipety z zamkniętymi końcówkami w miejscu wyciągania, korzystając z zaprogramowanego programu wyciągania. W tej konfiguracji zastosuj następujące wartości programu wyciągania: heat 516, pull 150, velocity 75, time 250, oraz pressure 500.
    UWAGA: Parametry grzania i wyciągania ustawione w programie wyciągania mogą być dostosowane i zależą od pożądanych ustawień projektu eksperymentalnego12. PUNKT KONTROLNY (patrz Supplemental Table S1).
  2. Otwórz zamkniętą końcówkę, mocując jedną z zamkniętych mikropipet uzyskanych po wyciąganiu w przecinaku do mikropipet. Ustaw temperaturę grzania na około 50-60 °C.
  3. Zlokalizuj mikropipetę za pomocą okularu 10x. Przesuń mikropipetę blisko borokrzemianowej kuleczki szklanej, korzystając z pokręteł regulacyjnych.
  4. Zmień okular na 30x przed ustawieniem mikropipety tak blisko borokrzemianowej kuleczki szklanej, jak to możliwe, bez wyginania końcówki pipety.
  5. Zmiękcz borokrzemianową kuleczkę szklaną za pomocą ciepła, naciskając pedał grzewczy. Delikatnie wprowadź surową, zamkniętą końcówkę mikropipety do zmiękczonej kuleczki, aż do osiągnięcia pożądanego punktu końcowego, czyli średnicy otworu.
  6. Zwolnij pedał i pozwól kuleczce szklanej ostygnąć. Upewnij się, że końcówka mikropipety przez cały czas pozostaje wewnątrz kuleczki.
    UWAGA: Dalsze wprowadzanie końcówki prowadzi do uzyskania większych średnic otworu.
  7. Delikatnie wyciągnij mikropipetę, co doprowadzi do uzyskania czystego, prostego cięcia na zamkniętej mikropipecie. Potwierdź, że końcowa średnica kapilary wynosi 1 µm.
    ​UWAGA: PUNKT KONTROLNY (patrz Supplemental Table S1)

4. Przygotowanie komory komórkowej

  1. Za pomocą rysika diamentowego podziel standardowe szkiełko nakrywowe o wymiarach 40 mm x 22 mm x 0,17 mm na trzy równe paski.
  2. Przymocuj jeden kawałek dociętego szkiełka nakrywki do dna wykonanego samodzielnie uchwytu komory, używając smaru próżniowego.
    UWAGA: Uchwyt do komory składa się z dwóch metalowych (miedzianych/aluminiowych) kwadratów połączonych zakrzywionym uchwytem. Odległość między blokami metalowymi musi wynosić mniej niż 40 mm, aby docięte szkiełko nakrywkowe przylegało do uchwytu, tworząc równoległą komorę.
  3. Przyklej drugi kawałek dociętego szkiełka nakrywki do górnej części wykonanego samodzielnie uchwytu komory, używając smaru próżniowego.
    UWAGA: PUNKT KONTROLNY (patrz Tabela uzupełniająca S1)
  4. Wstrzyknąć 200 µL zawiesiny znakowanych erytrocytów (RBC) pomiędzy dwiema szkiełkami nakrywkowymi za pomocą 200 µL dozownik automatyczny (Rysunek 1).

Schemat komory do obserwacji przepływu krwi; erytrocyty pod szkiełkiem podstawowym w uchwycie komory.
Rysunek 1: Ilustracja komory z komórkami. Dwa docięte kawałki szkiełka podstawowego o wymiarach 40 mm x 22 mm x 0,17 mm są przytwierdzone do uchwytu komory za pomocą smaru. Między dwa docięte szkiełka podstawowe nanosi się około 200 µL zawiesiny komórek w buforze Tyrode'a. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

5. Montaż zestawu do aspiracji mikropipetą

  1. Zamocuj komorę komórkową do uchwytu znajdującego się na platformie mikroskopu. Dostosuj pozycję tak, aby komora komórkowa znajdowała się bezpośrednio nad obiektywem (Rysunek 2B).
  2. Obniż uchwyt mikropipety poniżej poziomu cieczy w podłączonym zbiorniku z wodą.
  3. Wprowadź wodę zdemineralizowaną lub bufor Tyroda do wykonanej mikropipety i ostrożnie usuń wszystkie pęcherzyki powietrza za pomocą strzykawki z igłą 34 G (patrz Tabela Materiałów).
  4. Odkręć końcówkę uchwytu mikropipety do połowy i pozwól wodzie ściekać z uchwytu mikropipety przez kilka sekund.
    UWAGA: PUNKT KONTROLNY (patrz Tabela uzupełniająca S1)
  5. Wsuń mikropipetę do końcówki uchwytu. Dokręć śrubę uchwytu, aby upewnić się, że mikropipeta jest stabilna.
  6. Wprowadź mikropipetę do komory komórkowej, a następnie zlokalizuj mikropipetę i erytrocyty (RBCs) pod mikroskopem. Użyj mikromanipulatora do regulacji pozycji.
  7. Obniż dalej końcówkę mikropipety, aby upewnić się, że znajduje się ona na tym samym poziomie co zlokalizowany erytrocyt.
    UWAGA: PUNKT KONTROLNY (patrz Tabela uzupełniająca S1)
  8. Wyzeruj ciśnienie hydrauliczne na końcówce mikropipety, regulując wysokość zbiornika z wodą. Następnie lekko podnieś zbiornik z wodą, aby wytworzyć niewielkie ciśnienie dodatnie na końcówce.

6. Przeprowadzenie testu aspiracji mikro-pipetą z detekcją fluorescencyjną

  1. Włącz źródło światła wzbudzenia fluorescencyjnego o długości fali 488 nm. Na tym etapie nie otwieraj migawki fluorescencyjnej, aby uniknąć fotoblaknięcia (Rysunek 2C). Włącz kamerę fluorescencyjną oraz kamerę do obrazowania w świetle przechodzącym.
    UWAGA: Obie kamery są obsługiwane za pomocą odpowiedniego oprogramowania (patrz Tabela materiałów).
  2. W oprogramowaniu ustaw pożądany czas ekspozycji (100 ms dla obu kamer w niniejszym badaniu), obszar zainteresowania (ROI) oraz rozmiar binningu (brak w niniejszym badaniu) dla obu kamer. Otwórz panel akwizycji wielowymiarowej, aby ustawić liczbę klatek akwizycji (2 000 w niniejszym badaniu) oraz katalog zapisu.
    UWAGA: Liczba klatek akwizycji zależy od pożądanej liczby zdarzeń aspiracji, które mają zostać zarejestrowane. Dla 1 zdarzenia aspiracji zakres liczby klatek akwizycji powinien zostać ustawiony w przedziale 100-500, co odpowiada około 10-50 s.
  3. Używając mikromanipulatora, zlokalizuj mikropipetę w polu widzenia.
  4. Włącz pneumatyczny zacisk ciśnieniowy, w tym jednostkę sterującą i system zaciskowy (Rysunek 2A). Upewnij się, że jednostka sterująca znajduje się w trybie EXTRNL. Skompensuj wszelkie ciśnienie offsetowe wewnątrz systemu, powoli obracając pokrętłem.
  5. Uruchom osobne oprogramowanie sterujące zaciskiem pneumatycznym. Oprogramowanie posiada panel sterowania elektrycznego do kontroli dyskretnego wejścia analogowego systemu zacisku. Ciśnienie jest regulowane z wykorzystaniem współczynnika konwersji 20 mV/mmHg.
  6. Wyzeruj ciśnienie wewnątrz systemu. Ostrożnie przesuń mikropipetę w pobliże RBC. Dostosuj położenie zbiornika z wodą, aż przy końcówce mikropipety zostanie zauważone subtelne ciśnienie dodatnie.
  7. Rozpocznij akwizycję w oprogramowaniu do obsługi kamer. Otwórz migawkę fluorescencyjną.
  8. Wykonaj aspirację RBC, wpisując w panelu sterowania obliczoną wartość napięcia, aby osiągnąć pożądane ciśnienie.
    UWAGA: Ciśnienie do aspiracji RBC mieści się zazwyczaj w zakresie Δp = -5 do -40 mmHg. W końcówce mikropipety powinno być widoczne wyraźne wydłużenie języczka komórki (Rysunek 2D).
  9. Utrzymaj ciśnienie przez zaprogramowany czas, a następnie je zwolnij.
  10. Przesuń mikropipetę, aby pobrać kolejną komórkę i powtórz eksperyment.

7. Analiza intensywności fluorescencji

  1. Wczytaj zapisane obrazy fluorescencyjne do oprogramowania do analizy.
  2. Dostosuj próg intensywności (intensity threshold) za pomocą karty regulacji wyświetlania (display adjustment). Można to zrobić, wpisując wartości ręcznie lub korzystając z suwaka, aby zapewnić wyraźny kontrast komórki na obrazach fluorescencyjnych w oprogramowaniu do analizy (patrz: Supplemental File 1-Supplemental Figure S1).
  3. Przewiń do osi czasu na dole ekranu oprogramowania. Zlokalizuj wyznaczone zdarzenie aspiracji.
  4. Kliknij Add new surfaces. Zdefiniuj ROI (obszar zainteresowania) dla analizy.
    UWAGA: Oprogramowanie oferuje prowadzony w pięciu krokach proces dostrajania i kończenia segmentacji (patrz: Supplemental File 1-Supplemental Figure S2 oraz Supplemental Figure S3).
    UWAGA: Utrzymuj ROI w możliwie najmniejszym rozmiarze, aby zaoszczędzić zasoby obliczeniowe.
  5. Użyj suwaka odejmowania tła oraz dostosuj próg segmentacji za pomocą suwaka, aby uzyskać najlepszy wynik segmentacji.
    UWAGA: Oznacza to, że poza zdarzeniem aspiracji, tło powinno być segmentowane jak najdokładniej (patrz: Supplemental File 1-Supplemental Figure S4 oraz Supplemental Figure S5).
  6. Dodaj filtr powierzchni (area), aby wykluczyć szumy tła (patrz: Supplemental File 1-Supplemental Figure S6).
    UWAGA: Jest to wykonywane na etapie post-processingu.
  7. Wybierz kartę statistics | kartę detailed | kartę average values. Przewiń, aby znaleźć i zaznaczyć średnią intensywność (intensity mean) (patrz: Supplemental File 1-Supplemental Figure S7).
  8. Wyeksportuj przebieg sygnału fluorescencji w czasie do pliku .csv.
  9. Otwórz wyeksportowany plik csv. Odejmij sygnały tła, Fb, od wszystkich pomiarów.
  10. Oblicz zmianę intensywności wapnia, ΔFmax, korzystając z równania (1):
    Wzór na statyczną równowagę równanie ΔFmax do celów edukacyjnych.     (1)
    Gdzie ΔFmax to maksymalna zmiana intensywności wapnia, Fb to intensywność tła, a F0 to intensywność spoczynkowa.

Ustawienie mikroskopu odwróconego do mikromanipulacji; schemat pola jasnego i fluorescencji dla analizy RBC.
Rysunek 2: Zespół do aspiracji mikropipetą sprzężonej z fluorescencją. (A>) Przegląd sprzętowy systemu fMPA obejmujący mikroskop odwrócony połączony z kamerami pola jasnego i fluorescencji. Lewa strona obrazu przedstawia wykonany własnoręcznie manometr wodny oraz skrzynkę sterującą, która pozwala na precyzyjne dostrojenie ciśnienia pompy pneumatycznej. (B>) Stolik mikroskopu przedstawiający komorę eksperymentalną z komórkami oraz system mikromanipulatora z pojedynczą mikropipetą. (C>) Schemat ustawienia systemu fMPA. Równoczesne obrazowanie sygnałów pola jasnego (żółty) i fluorescencji (emisja niebieska, wzbudzenie zielone) z wykorzystaniem dwóch luster dichroicznych do kierowania ścieżek światła ze źródła światła fluorescencyjnego (niebieski) do celu, a następnie do kamer do obrazowania (zielony). (D>) Górny rząd przedstawia obrazy w polu jasnym, natomiast dolny rząd prezentuje obrazy fluorescencyjne. Po lewej znajduje się pozycja mikropipety przed aspiracją, gdy RBC spoczywa. Środkowa kolumna ukazuje proces aspiracji, w którym RBC poddano ujemnemu ciśnieniu -40 mmHg. Po prawej przedstawiono morfologię komórki po poddaniu jej ujemnemu ciśnieniu aspiracyjnemu. Pasek skali = 5 µm. Skróty: fMPA = Fluorescence-coupled Micropipette Aspiration; DM = lustro dichroiczne; RBC = czerwony krwinek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W celu przeprowadzenia testów aspiracji za pomocą mikropipety, najpierw skonstruowaliśmy specjalną komorę komórkową składającą się z dwóch metalowych kwadratów (miedzianego i aluminiowego) połączonych za pomocą uchwytu. Dwie docięte szklane przykrywki (40 mm × 7 mm × 0,17 mm) zostały przymocowane w celu utworzenia komory wypełnionej 200 µL RBC zawieszonych w buforze Tyrode'a. Po wprowadzeniu RBC do komory, dostosowaną mikropipetę borokrzemianową zamocowano w uchwycie i ostrożnie ustawiono wewnątrz komory za pomocą mikrom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Testy aspiracyjne mikropipet ucieleśniają udoskonaloną metodologię, wykorzystując znaczną modulację ciśnienia, dokładną orkiestrację przestrzenną i niezawodne rozeznanie czasowe w celu zbadania głębokich zawiłości biomechaniki komórkowej. W badaniu tym położono szczególny nacisk na zastosowanie fMPA jako kluczowego narzędzia do ujawnienia zniuansowanych reakcji mechanowrażliwych prezentowanych przez erytrocyty pod wpływem różnych bodźców. Równoczesne wykorzystanie sygnałów jasnego pola i fluorescencji umożliwiło wieloasp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych sprzecznych interesów do zgłoszenia w odniesieniu do niniejszego badania.

Podziękowania

Dziękujemy Nurul Aisha Zainal Abidin i Laura Moldovan za dodatkową rekrutację dawców, pobranie krwi i wsparcie w zakresie flebotomii. Dziękujemy Tomasowi Andersonowi i Arianowi Nasserowi za zorganizowanie sprzętu i odczynników. Badania te zostały sfinansowane przez Australijską Radę ds. Badań Naukowych (ARC) Discovery Project (DP200101970-L. A.J.); Narodowa Rada Zdrowia i Badań Medycznych (NHMRC) Australia Ideas Grant (APP2003904-L. A.J.); Dotacja na sprzęt NHMRC-L.A.J.; Program Budowania Zdolności Sercowo-Naczyniowych Nowej Południowej Walii (Grant Researcher Grant-L.A.J.); Grant na innowacje badawcze NSW CVRN-VCCRI; Biuro ds. Zaangażowania Globalnego i Badawczego (Sydney-Glasgow Partnership Collaboration Award-L.A.J.); L.A.J. jest stypendystą National Heart Foundation Future Leader Fellow Level 2 (105863) oraz Snow Medical Research Foundation (2022SF176).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
&mikro; ManagerMicro-ManagerWersja 2.0.0
Strzykawka 1 ml Terumo210320DWspółpracuj z Microfil 
200 i mikro; L Pipeta Eppendorf 3123000055Preparat komórek czerwonego kloodu
22 x 40 mm Szkiełka nakrywkoweKnittel Glass MS0014Zespół komory celi
50 ml Strzykawka Terumo220617EPodłącz do wieży ciśnień
Chlorek wapnia (CaCl2)Sigma-AldrichC1016Preparat buforowy Tryoda - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl i 5,5 mM D-glukozy uzupełnione 1 mM CaCl2. Końcowe pH = 7,2
Wirówka 5425Eppendorf 5405000280Preparat komórek czerwonego clood
ClexaneSigma-Aldrich1235820Aby zapobiec krzepnięciu pobranej krwi. 10 000 U/ml
DAQamiDiligent
Fluorescencyjne źródło światłaCoolLEDpE-300sprzętowy do aspiracji mikropipet
Kapilara szklanaNarishigeG-1Produkcja
PreparatSigma-AldrichG8270Tryode - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl i 5,5 mM D-glukozy uzupełniony 1 mM CaCl2. Końcowe pH = 7,2
HepesThermo Fisher15630080Tryode's  przygotowanie buforu - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl i 5,5 mM D-glukozy uzupełnione 1 mM CaCl2. Końcowe pH = 7,2
Szybka kamera GigEMantaG-040Bsprzętowy do aspiracji mikropipet
Zacisk ciśnieniowy o dużej prędkościInstrument naukowyHSPC-2-SBWspółpracuj z pompą ciśnieniową
Stopień głowicy zaciskowej o dużej prędkości Instrument naukowyHSPC-2-SBWspółpracuje z pompą ciśnieniową
ImarisOxford Instruments
Mikroskopia odwrócona Olimpia sprzętowy do aspiracji mikropipetOlympus IX83
Mikrofil Światowe instrumenty precyzyjne MF34G-534 G (67 mm długości)
Odkręcić pęcherzyki powietrza w naciętej mikropipecie i sprawdzić otwarcie końcówki pipety 
Ściągacz do mikropipet Instrument SutterP1000Produkcja mikropipet 
Milli Q EQ 7000 System oczyszczania wody ultraczystejMerck MilliporeZEQ7000T0CBufor węglanowy/wodorowęglanowy i Przygotowanie buforu Tryode
Pipeta microforge NarishigeMF-900Produkcja mikropipet
Chlorek potasu (KCl)Sigma-AldrichP9541Preparat buforowy Tryoda - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl i 5,5 mM D-glukoza uzupełniona 1 mM CaCl2. Końcowe pH = 7,2
Pompa ciśnieniowa Instrument naukowyPV-PUMPIndukuj kontrolowane ciśnienie podczas eksperymentu
Kamera Prime 95B FotometriaPrime 95B sCMOSObrazowanie fluorescencyjne
Jednostka zdalna z kołem obrotowym Sensapex uM-RM3Panel sterowania do regulacji pozycji mikropipet 
Scepter 3.0 Ręczny licznik komórekMerck MilliporePHCC340KITAutomatyczny licznik komórek
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761Preparat buforowy węglanowy/wodorowęglanowy - 2,65 g NaHCO3 z 2,1 g Na2CO3 w 250 ml wody Mili Q - Końcowe pH = 8-9.
Węglan sodu (Na2CO3)Sigma-AldrichS2127Preparat buforowy węglanowy/wodorowęglanowy - 2,65 g NaHCO3 z 2,1 g Na2CO3 w 250 ml wody Mili Q - Końcowe pH = 8-9.
Chlorek sodu (NaCl)Sigma-AldrichS7653Preparat buforowy Tryoda - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl i 5,5 mM D-glukozy uzupełnione 1 mM CaCl2. Końcowe pH = 7,2
Fosforan sodu jednozasadowy
jednowodny (NaH2PO4 i byk; H2O)		Sigma-AldrichS9638Preparat buforowy Tryode - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl i 5,5 mM D-glukoza uzupełnione 1 mM CaCl2. Końcowe pH = 7,2
Jednostka sterująca z ekranem dotykowym Sensapex uM-TSCPanel sterowania do regulacji pozycji mikropipet 
X suchy obiektyw Olimpia Olympus 60x/0,70 LUCPlanFLdo aspiracji mikropipet
System mikropipet buforowy Glucose System System System

Bibliografia

  1. González-Bermúdez, B., Guinea, G. V., Plaza, G. R. Advances in micropipette aspiration: applications in cell biomechanics, models, and extended studies. Biophysical Journal. 116 (4), 587-594 (2019).
  2. Mierke, C. T. Physics of Cancer, Volume 3 (Second Edition): Experimental biophysical techniques in cancer research. , IOP Publishing. (2021).
  3. Chen, Y., et al. Loss of the F-BAR protein CIP4 reduces platelet production by impairing membrane-cytoskeleton remodeling. Blood. 122 (10), 1695-1706 (2013).
  4. Shin, J. -W., Swift, J., Spinler, K. R., Discher, D. E. Myosin-II inhibition and soft 2D matrix maximize multinucleation and cellular projections typical of platelet-producing megakaryocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 11458-11463 (2011).
  5. Liapis, H., Foster, K., Miner, J. H. Red cell traverse through thin glomerular basement membrane. Kidney International. 61 (2), 762-763 (2002).
  6. Wang, H., et al. Fluorescence-coupled micropipette aspiration assay to examine calcium mobilization caused by red blood cell mechanosensing. European Biophysics Journal. 51 (2), 135-146 (2022).
  7. Danielczok, J. G., et al. Red blood cell passage of small capillaries is associated with transient Ca2+-mediated adaptations. Frontiers in Physiology. 8, 979(2017).
  8. Diez-Silva, M., Dao, M., Han, J., Lim, C. -T., Suresh, S. Shape and biomechanical characteristics of human red blood cells in health and disease. MRS Bulletin. 35 (5), 382-388 (2010).
  9. Maître, J. -L., Niwayama, R., Turlier, H., Nédélec, F., Hiiragi, T. Pulsatile cell-autonomous contractility drives compaction in the mouse embryo. Nature Cell Biology. 17 (7), 849-855 (2015).
  10. Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals. eLife. 5, e15447(2016).
  11. Bogdanova, A., Makhro, A., Wang, J., Lipp, P., Kaestner, L. Calcium in red blood cells-a perilous balance. International Journal of Molecular Sciences. 14 (5), 9848-9872 (2013).
  12. Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018. , Available from: https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf (2018).
  13. Cahalan, S. M., et al. Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume. eLife. 4, e07370(2015).
  14. Sforna, L., et al. Piezo1 controls cell volume and migration by modulating swelling-activated chloride current through Ca2+ influx. Journal of Cellular Physiology. 237 (3), 1857-1870 (2022).
  15. High speed pressure clamp. ALA Scientific Instruments. , ALA Scientific. Available from: https://alascience.com/products/hspc-2sb/ (2023).
  16. Teledyne Imaging Prime 95BTM Scientific CMOS Camera Datasheet. , Available from: https://www.photometrics.com/wp-content/uploads/2019/10/Prime-95B-Datasheet-07172020.pdf (2020).
  17. Lee, L. M., Lee, J. W., Chase, D., Gebrezgiabhier, D., Liu, A. P. Development of an advanced microfluidic micropipette aspiration device for single cell mechanics studies. Biomicrofluidics. 10 (5), 054105(2016).
  18. Weaver, W. M., et al. Advances in high-throughput single-cell microtechnologies. Current Opinion in Biotechnology. 25, 114-123 (2014).
  19. Zhou, E. H., Lim, C. T., Quek, S. T. Finite element simulation of the micropipette aspiration of a living cell undergoing large viscoelastic deformation. Mechanics of Advanced Materials and Structures. 12 (6), 501-512 (2005).
  20. Oh, M. -J., Kuhr, F., Byfield, F., Levitan, I. Micropipette aspiration of substrate-attached cells to estimate cell stiffness. Journal of Visualized Experiments. (67), e3886(2012).
  21. Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical properties of the red cell membrane. Biophysical journal. 4 (4), 303-316 (1964).
  22. Hogan, B., Babataheri, A., Hwang, Y., Barakat, A. I., Husson, J. Characterizing cell adhesion by using micropipette aspiration. Biophysical Journal. 109 (2), 209-219 (2015).
  23. Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration. The European Physical Journal E. 14 (2), 149-167 (2004).
  24. Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of Biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
  25. Pu, H., et al. Micropipette aspiration of single cells for both mechanical and electrical characterization. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 66 (11), 3185-3191 (2019).
  26. Guevorkian, K., Maître, J. -L. Chapter 10 - Micropipette aspiration: A unique tool for exploring cell and tissue mechanics in vivo. Methods in Cell Biology. , 187-201 (2017).
  27. Biro, M., Maître, J. -L. Chapter 14 - Dual pipette aspiration: A unique tool for studying intercellular adhesion. Methods in Cell Biology. 125, 255-267 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Obrazowanie fluorescencyjneczerwone krwinkiwewnątrzkomórkowy wapńmechanotransdukcjaaspiracja pneumatycznaborokrzemianowa mikropipetaobrazowanie epi-fluorescencyjnestres mechaniczny
Test aspiracji mikropipet fluorescencyjnych w celu zbadania mechanosensacji czerwonych krwinek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.