Test aspiracji mikropipet fluorescencyjnych w celu zbadania mechanosensacji czerwonych krwinek

Podsumowanie

Badanie zachowania komórek pod wpływem stresu mechanicznego jest kluczowe dla postępów w mechanice komórkowej i mechanobiologii. Wprowadzamy technikę aspiracji mikropipetami fluorescencyjnymi (fMPA), nowatorską metodę łączącą kontrolowaną stymulację mechaniczną z kompleksową analizą sygnalizacji wewnątrzkomórkowej w pojedynczych komórkach. Technika ta pozwala na przeprowadzenie nowych, dogłębnych badań nad mechanobiologią żywych komórek.

Streszczenie

Testy aspiracji mikropipet od dawna stanowią kamień węgielny w badaniach mechaniki żywych komórek, oferując wgląd w reakcje komórek na stres mechaniczny. W artykule opisano innowacyjną adaptację testu aspiracji mikropipet sprzężonych z fluorescencją (fMPA). Test fMPA wprowadza możliwość precyzyjnego administrowania siłami mechanicznymi przy jednoczesnym monitorowaniu procesów mechanotransdukcji żywych komórek, w których pośredniczą kanały jonowe. Wyrafinowana konfiguracja obejmuje precyzyjnie zaprojektowaną mikropipetę ze szkła borokrzemianowego podłączoną do precyzyjnie regulowanego zbiornika na wodę i pneumatycznego systemu zasysania, ułatwiając kontrolowane stosowanie ciśnienia z dokładnością ± 1 mmHg. Znaczącym ulepszeniem jest integracja obrazowania epi-fluorescencyjnego, co pozwala na jednoczesną obserwację i kwantyfikację zmian morfologicznych komórek i wewnątrzkomórkowych przepływów wapnia podczas aspiracji. Test fMPA, dzięki synergicznemu połączeniu obrazowania epifluorescencyjnego z aspiracją mikropipet, ustanawia nowy standard w badaniu mechanoczujników komórek w trudnych mechanicznie środowiskach. To wieloaspektowe podejście można dostosować do różnych konfiguracji eksperymentalnych, dostarczając krytycznych informacji na temat mechanizmów mechanodetekcji pojedynczych komórek.

Wprowadzenie

Rozwijające się odkrycia w świecie zachowań komórkowych uwydatniły rolę bodźców mechanicznych, takich jak napięcie, naprężenie ścinające płyn, kompresja i sztywność podłoża, w dyktowaniu dynamicznych aktywności komórkowych, takich jak adhezja, migracja i różnicowanie. Te mechanobiologiczne aspekty mają ogromne znaczenie w wyjaśnianiu, w jaki sposób komórki oddziałują i reagują na swoje środowisko fizjologiczne, wpływając na różne procesy biologiczne^1,2.

W ciągu ostatniej dekady, testy aspiracji oparte na mikropipetach wyróżniały się jako wszechstronne narzędzie do badania różnych re....

Protokół

Niniejszy protokół jest zgodny z wytycznymi i został zatwierdzony przez Komisję Etyki Badań z Udziałem Ludzi Uniwersytetu w Sydney. Od dawców biorących udział w tym badaniu uzyskano świadomą zgodę.

1. Izolacja ludzkich erytrocytów (RBC)

UWAGA: Krok 1.1 powinien być wykonany przez przeszkolonego flebotomistę zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Komisję Bioetyczną (Institutional Review Board).

1. Pobrać 5 ml krwi z żyły łokciowej środkowej, używając igły motylkowej 19 G.
2. Przenieś pobraną krew do probówki o pojemności 15 ml zawierającej enoksaparynę w stężeniu 1:200 w celu zap....

Wyniki

W celu przeprowadzenia testów aspiracji za pomocą mikropipety, najpierw skonstruowaliśmy specjalną komorę komórkową składającą się z dwóch metalowych kwadratów (miedzianego i aluminiowego) połączonych za pomocą uchwytu. Dwie docięte szklane przykrywki (40 mm × 7 mm × 0,17 mm) zostały przymocowane w celu utworzenia komory wypełnionej 200 µL RBC zawieszonych w buforze Tyrode'a. Po wprowadzeniu RBC do komory, dostosowaną mikropipetę borokrzemianową zamocowano w uchwycie i ostrożnie ustawiono wewnątrz komory za pomocą mikrom.......

Dyskusja

Testy aspiracyjne mikropipet ucieleśniają udoskonaloną metodologię, wykorzystując znaczną modulację ciśnienia, dokładną orkiestrację przestrzenną i niezawodne rozeznanie czasowe w celu zbadania głębokich zawiłości biomechaniki komórkowej. W badaniu tym położono szczególny nacisk na zastosowanie fMPA jako kluczowego narzędzia do ujawnienia zniuansowanych reakcji mechanowrażliwych prezentowanych przez erytrocyty pod wpływem różnych bodźców. Równoczesne wykorzystanie sygnałów jasnego pola i fluorescencji umożliwiło wieloasp.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
&mikro; Manager	Micro-Manager		Wersja 2.0.0
Strzykawka 1 ml	Terumo	210320D	Współpracuj z Microfil
200 i mikro; L Pipeta	Eppendorf	3123000055	Preparat komórek czerwonego kloodu
22 x 40 mm Szkiełka nakrywkowe	Knittel Glass	MS0014	Zespół komory celi
50 ml Strzykawka	Terumo	220617E	Podłącz do wieży ciśnień
Chlorek wapnia (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016	Preparat buforowy Tryoda - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl i 5,5 mM D-glukozy uzupełnione 1 mM CaCl2. Końcowe pH = 7,2
Wirówka 5425	Eppendorf	5405000280	Preparat komórek czerwonego clood
Clexane	Sigma-Aldrich	1235820	Aby zapobiec krzepnięciu pobranej krwi. 10 000 U/ml
DAQami	Diligent
Fluorescencyjne źródło światła	CoolLED	pE-300	sprzętowy do aspiracji mikropipet
Kapilara szklana	Narishige	G-1	Produkcja
Preparat	Sigma-Aldrich	G8270	Tryode - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl i 5,5 mM D-glukozy uzupełniony 1 mM CaCl2. Końcowe pH = 7,2
Hepes	Thermo Fisher	15630080	Tryode's  przygotowanie buforu - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl i 5,5 mM D-glukozy uzupełnione 1 mM CaCl2. Końcowe pH = 7,2
Szybka kamera GigE	Manta	G-040B	sprzętowy do aspiracji mikropipet
Zacisk ciśnieniowy o dużej prędkości	Instrument naukowy	HSPC-2-SB	Współpracuj z pompą ciśnieniową
Stopień głowicy zaciskowej o dużej prędkości	Instrument naukowy	HSPC-2-SB	Współpracuje z pompą ciśnieniową
Imaris	Oxford Instruments
Mikroskopia odwrócona	Olimpia	sprzętowy do aspiracji mikropipet	Olympus IX83
Mikrofil	Światowe instrumenty precyzyjne	MF34G-5	34 G (67 mm długości) Odkręcić pęcherzyki powietrza w naciętej mikropipecie i sprawdzić otwarcie końcówki pipety
Ściągacz do mikropipet	Instrument Sutter	P1000	Produkcja mikropipet
Milli Q EQ 7000 System oczyszczania wody ultraczystej	Merck Millipore	ZEQ7000T0C	Bufor węglanowy/wodorowęglanowy i Przygotowanie buforu Tryode
Pipeta microforge	Narishige	MF-900	Produkcja mikropipet
Chlorek potasu (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	Preparat buforowy Tryoda - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl i 5,5 mM D-glukoza uzupełniona 1 mM CaCl2. Końcowe pH = 7,2
Pompa ciśnieniowa	Instrument naukowy	PV-PUMP	Indukuj kontrolowane ciśnienie podczas eksperymentu
Kamera Prime 95B	Fotometria	Prime 95B sCMOS	Obrazowanie fluorescencyjne
Jednostka zdalna z kołem obrotowym	Sensapex	uM-RM3	Panel sterowania do regulacji pozycji mikropipet
Scepter 3.0 Ręczny licznik komórek	Merck Millipore	PHCC340KIT	Automatyczny licznik komórek
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761	Preparat buforowy węglanowy/wodorowęglanowy - 2,65 g NaHCO3 z 2,1 g Na2CO3 w 250 ml wody Mili Q - Końcowe pH = 8-9.
Węglan sodu (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S2127	Preparat buforowy węglanowy/wodorowęglanowy - 2,65 g NaHCO3 z 2,1 g Na2CO3 w 250 ml wody Mili Q - Końcowe pH = 8-9.
Chlorek sodu (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Preparat buforowy Tryoda - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl i 5,5 mM D-glukozy uzupełnione 1 mM CaCl2. Końcowe pH = 7,2
Fosforan sodu jednozasadowy jednowodny (NaH2PO4 i byk; H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	Preparat buforowy Tryode - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl i 5,5 mM D-glukoza uzupełnione 1 mM CaCl2. Końcowe pH = 7,2
Jednostka sterująca z ekranem dotykowym	Sensapex	uM-TSC	Panel sterowania do regulacji pozycji mikropipet
X suchy obiektyw	Olimpia	Olympus 60x/0,70 LUCPlanFL	do aspiracji mikropipet

System mikropipet buforowy Glucose System System System