Artykuł metodologiczny

Szybkie oznaczanie ilościowe utlenionych i zredukowanych form glutationu przy użyciu orto-ftaldehydu w hodowanych komórkach ssaków in vitro

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66267

⸱

28 czerwca 2024

 ,  ,  ,  , 
1School of Health and Life Sciences, Teesside University, 2Institute of Biochemical Chemistry, Biophysics, and Bioengineering, Heriot-Watt University

W tym artykule

Podsumowanie

Kwantyfikacja zarówno utlenionych, jak i zredukowanych form glutationu (odpowiednio GSSG i GSH) została osiągnięta dzięki zastosowaniu aldehydu ortoftaldehydu (OPA). OPA staje się wysoce fluorescencyjny po sprzęgnięciu z GSH, ale nie jest w stanie sprzęgnąć GSSG, dopóki nie zostanie zredukowany. W tym miejscu opisujemy test wieloparametryczny do ilościowego określenia obu przy użyciu kwantyfikacji białka w celu normalizacji.

Streszczenie

Glutation od dawna uważany jest za kluczowy biomarker do określania odpowiedzi antyoksydacyjnej komórki. W związku z tym jest podstawowym markerem w badaniach reaktywnych form tlenu. Metoda wykorzystuje aldehyd ortoftalowy (OPA) do ilościowego określenia stężenia glutationu (glutationów) w komórkach. OPA koniugatuje się ze zredukowanym glutationem (GSH) poprzez wiązanie sulfhydrylu, tworząc następnie izoindol, w wyniku czego powstaje wysoce fluorescencyjny koniugat. Aby uzyskać dokładny wynik zarówno utlenionego glutationu (GSSG), jak i GSH, wymagana jest kombinacja środków maskujących i redukujących, które zostały zaimplementowane w tym protokole. Leczenie może również wpływać na żywotność komórek. W związku z tym normalizacja za pomocą testu białkowego jest przedstawiona w tym wieloparametrycznym teście. Test wykazuje pseudoliniowy zakres wykrywania 0,234 - 30 μM (R2 = 0,9932±0,007 (N = 12)) specyficzny dla GSH. Proponowany test pozwala również na oznaczenie utlenionego glutationu z dodatkiem środka maskującego N-etylomaleimidu w celu związania zredukowanego glutationu, a środek redukujący tris(2-karboksetylo)fosfinę jest wprowadzany w celu rozszczepienia wiązania dwusiarczkowego w GSSG w celu wytworzenia dwóch cząsteczek GSH. Test stosuje się w połączeniu ze zwalidowanym testem kwasu bicinchoninowego do oznaczania ilościowego białka i testem kinazy adenylanowej do oceny cytotoksyczności.

Wprowadzenie

Reaktywne formy tlenu (ROS) są głównym induktorem stresu oksydacyjnego; stres oksydacyjny jest dobrze znany w generowaniu mutacji DNA, starzeniu się / śmierci komórek, różnych nowotworach, cukrzycy, chorobach neurologicznych (takich jak Parkinson i Alzheimer) i kilku innych stanach wyniszczających życie1,2,3,4,5. Kluczowym zabezpieczeniem przed ROS są tiolowe, nieenzymatyczne przeciwutleniacze, które są zdolne do redukcji utleniaczy lub rodników, działając jako dawcy protonów6,7. Glutation (GSH) i cysteina to dwa najbardziej rozpowszechnione tiole występujące u ssaków8, podczas gdy istnieją różne inne tiole o niskiej masie cząsteczkowej (takie jak ergotioneina), GSH i cysteina są najczęściej mierzonymi nieenzymatycznymi przeciwutleniaczami znajdującymi się w literaturze9,10,11 i mają największe znaczenie w walce z ROS8,12,13,14.

Gdy GSH jest używany jako przeciwutleniacz, dwie cząsteczki GSH są kowalencyjnie połączone ze sobą wiązaniem dwusiarczkowym, tworząc dwusiarczek glutationu (GSSG). Wyczerpanie GSH jest często używane jako wskaźnik stresu oksydacyjnego15,16. Ocena ta może być również połączona z wykrywaniem GSSG, chociaż wzrost GSSG w komórkach jest często ograniczony przez aktywne procesy eksportowe, ponieważ GSSG może być stosunkowo reaktywny w komórkach, prowadząc do tworzenia wiązań dwusiarczkowych z innymi tiolami białkowymi16.

Tradycyjne metody pomiaru GSH i GSSG nie są prostymi procesami i wymagają wielu etapów, w tym ekstrakcji komórkowej za pomocą odczynników litycznych17,18. Przedstawiony tutaj protokół upraszcza te metody i umożliwia dokładny pomiar nieenzymatycznych tioli oraz normalizację za pomocą zawartości białek komórkowych lub uwalniania kinazy adenylanowej. Ponadto możliwe jest zmierzenie żywotności komórek przed ekstrakcją GSH/GSSG. Kilka metod próbowało wcześniej skutecznie celować i oznaczać ilościowo zredukowane i utlenione nieenzymatyczne tiole; metody, w tym wykorzystanie HPLC19,20,21, test płytkowy (biochemiczny)22,23,24,25, i które używają popularnych odczynników do koniugacji tiolowej, takich jak 5,5-dithio-bis-(kwas 2-nitrobenzoesowy) (DTNB/ odczynnik Ellmana)19, Monochlorobimane (mBCI)26,27,28. Kilka firm przygotowało również autorskie zestawy do wykrywania glutationu; Nie publikują jednak niezgodności odczynników, co stwarza problemy w zależności od zastosowanych metod leczenia29.

Ten protokół przedstawia wieloparametryczny test, który wykrywa zredukowane tiole (takie jak GSH) poprzez koniugację orto-ftaldehydu (OPA) w celu wytworzenia sygnału fluorescencyjnego wykrywalnego odpowiednio przy 340/450 Ex/Em. Test ten ułatwia jednoczesne wykrywanie zarówno GSH, jak i GSSG (na płytce), poprzez zastosowanie środków maskujących (N-etylomaleimid) i redukujących GSSG (tris(2-karboksetylo)fosfina). Ten protokół wielobiomarkerowy daje również możliwość ilościowego oznaczania białek na etapie lizy komórkowej za pomocą testu kwasu bicinchoninowego w celu normalizacji próbek po zakończeniu końcowego pomiaru lub za pomocą testu kinazy adenylanowej z pożywki komórkowej. Ten test można przeprowadzić przy użyciu kilku odczynników łatwo dostępnych w większości laboratoriów i wymaga tylko kilku dodatkowych rzadkich substancji chemicznych do wykonania. Proces jest prosty, przystępny i można go wykonać bez pracochłonnych etapów w mniej niż 2 godziny.

W tym protokole wybrano różne nanomateriały, które wcześniej wykazano, że wywołują ROS lub podejrzewa się, że wywołują stres oksydacyjny30,31. Zbadano zakres stężeń, aby zobaczyć wpływ ekspozycji tych nanomateriałów na różne linie komórkowe oraz skuteczność testu w ilościowym określaniu tioli przeciwutleniających.

Protokół

UWAGA: Poniższy protokół został opracowany z możliwością zastosowania w połączeniu z testem białek kwasem bicinchonininowym (BCA) oraz testem kinazy adenylanowej (AK) w celu normalizacji próbek względem zastosowanych zabiegów. Należy upewnić się, że operator przez cały czas przygotowywania i używania materiałów nosi odpowiednią odzież oraz niezbędny sprzęt ochronny, taki jak fartuch laboratoryjny Howie, rękawice nitrylowe i okulary ochronne klasy I. Protokół podzielony jest na kilka etapów.

1. Przygotowanie roztworów zapasowych i roboczych

  1. Przygotować roztwory zapasowe standardu GSH o stężeniu 100 mM w 1 mM HCl (przygotowanym z 37% HCl w wodzie dwukrotnie destylowanej (ddH2O)).2O)).
    UWAGA: W przypadku rozcieńczania silnie skoncentrowanego kwasu, takiego jak 37% HCl, należy przestrzegać prawidłowej procedury dodawania kwasu do wody w dygestorium klasy I.
  2. Przygotować roztwór zapasowy OPA o stężeniu 22,35 mM w etanolu bezwodnym. Krok ten należy wykonać w dygestorium klasy I. Przygotować roztwór N-etylomaleimidu (NEM) o stężeniu 25 mM w wodzie ddH2O2O. Należy wykonać ten krok w dygestorium klasy I.
    UWAGA: Te trzy roztwory można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 3 miesięcy.
  3. Przygotować 0,01 M fosfinę Tris(2-karboksyetylową) (TCEP) do całkowitej objętości 500 µL, wymagane dla 100 studzienek. Przygotować 100 µL standardu GSH 1 mM, rozcieńczonego z roztworu zapasowego 100 mM przy użyciu ddH2O2O.
  4. Należy użyć buforu do lizy do immunoprecypitacji (IP) lub następującego składu: 394 mg Tris-HCl (stężenie końcowe 25 mM), 877 mg NaCl (stężenie końcowe 150 mM), 29 mg EDTA (stężenie końcowe 1 mM), 1 ml NP-40 100% lub IGEPAL CA-630 (stężenie końcowe 1% V/V), 5 ml glicerolu (stężenie końcowe 5% V/V), 84 ml ddH2O.2O. Wymieszać składniki, delikatnie mieszając, i dostosować pH do wartości 7,4. Przenieść do kolby miarowej o pojemności 100 ml i uzupełnić objętość wodą ddH2O.2do osiągnięcia końcowej objętości 100 ml. Przefiltrować sterylnie przez 0.22 µm przefiltrować i przechowywać w temperaturze 2-8 °C do 6 miesięcy.
    UWAGA: Roztwory lizujące działają jako zanieczyszczenia/substancje interferujące w tym teście; dlatego określono powyższe składniki.
  5. Przygotuj 1 L 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem z dodatkiem kwasu etylendiaminotetraoctowego (PBS-EDTA) o trzech różnych wartościach pH: 7,2, 8,5 i 9,0. Użyj gotowego komercyjnego buforu 0,1 M PBS z dodatkiem 1 mM EDTA (292,24 mg/L) lub następującego składu 10x (1 L): 80 g NaCl, 2,0 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4, 800 ml ddH2O2O. Dodać i wymieszać; uzupełnić objętość do 1 l. Roztwór wysterylizować w autoklawie i przechowywać przez 12 miesięcy w temperaturze pokojowej. Z 10-krotnego roztworu zapasu przygotować roztwór roboczy PBS i uzupełnić go o EDTA (stężenie zgodnie z wcześniejszymi informacjami).
    UWAGA: Wartość pH ma krytyczne znaczenie; przed rozpoczęciem protokołu należy upewnić się, że pH jest prawidłowe.
  6. Przeprowadź seryjne rozcieńczenia 1 mM GSH w stosunku 1:2, używając ddH2O2O (1 mM, 500 µM, 250 µM, 125 µM, 62.5 µM, 31.25 µM, 15.625 µMi 7.8125 µM). Dodaj 10 µL każdego stężenia do standardowych dołków (wykonanych w duplikacie). Próbki zostaną następnie rozcieńczone w buforze lizującym; w związku z tym stężenia wyniosą 1/5th ich pierwotnego stężenia w dalszej kolejności (200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1.5625 µM).
    UWAGA: Końcowe stężenia do kalibracji będą wynosić 30 µm,15 µm,7.5 µm, 3.75 µm, 1.875 µm, 937,5 nm, 468,8 nm oraz 234,4 nm.

2. Przygotowanie testu

UWAGA: W niniejszym protokole zastosowano ludzkie linie komórkowe HepG2, A549 i J774, zakupione komercyjnie z ATCC. Linie komórkowe te były wykorzystywane zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi określonymi przez przepisy i regulacje Uniwersytetu dotyczące hodowli tkanek i zwierząt.

  1. Na 24 h przed rozpoczęciem analizy wysiać komórki w stężeniach podanych w Tabeli 1; jednak w zależności od linii/typu komórek oraz zastosowanej terapii, dostosować gęstość w razie potrzeby. Hodować komórki w pełnej pożywce wzrostowej (podstawkowa pożywka Eagle'a (EMEM) z 10% dezaktywowanym termicznie płodowym serum cielęcym (HIFS), 1% Penstrepem (10,000U/mL penicyliny/ 10mg/mL streptomycyny) oraz 1% nieistotnymi aminokwasami.
  2. Wysiać komórki, stosując konwencjonalne metody siania komórek32. W przypadku, gdy nie planowano mikroskopii po analizie, wysiać komórki na całkowicie czarnych płytkach. Przed użyciem ocenić konfluencję oraz ogólny stan zdrowia komórek w kolbie T75 za pomocą mikroskopu.
  3. W czystej, sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, stosując rygorystyczną technikę aseptyczną, usunąć pożywkę komórkową, delikatnie przemyć komórki ~15 mL sterylnego PBS w temperaturze pokojowej (RT), a następnie usunąć płuczkę.
  4. Do kolby z komórkami dodać 5 mL sterylnej trypsyny 1x, delikatnie potrząsnąć, aby zapewnić pokrycie monowarstwy komórek, i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 5 min w celu ułatwienia odrywania komórek.
  5. Zatrzymać trypsynizację poprzez dodanie około 10 mL pożywki wzrostowej zawierającej dezaktywowane termicznie płodowe serum cielęce (10%).
  6. Przenieść komórki do probówki do wirowania o pojemności 50 mL i odwirować przy 200 x g przez 5 min. Usunąć pożywkę i zastąpić ją 5 mL tej samej pożywki. Resuspendować komórki w probówce do uzyskania homogenicznej zawiesiny bez widocznych aglomeratów.
  7. Pobrać 20 µL zawiesiny komórkowej i nanieść do komory liczbowej (hemocytometru) w celu policzenia. Po obliczeniu wymaganej liczby komórek, przeprowadzić rozcieńczenie, aby przygotować roztwór o właściwej gęstości komórek.
  8. Napippetować pożywkę z komórkami do płytek 96-dołkowych (pojemność 350 µL), stosując maksymalną objętość 200 µL na dołek. Umieścić komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 24 h w celu ich przytwierdzenia do powierzchni płytki.
  9. W celu oceny zarówno całkowitego glutationu, jak i GSSG, przygotować próbki dla obu warunków. Wysiać i poddać działaniu czynników 6 dołków, aby uzyskać 2 zestawy dla GSH i GSSG z 3 powtórzeniami technicznymi (Rysunek 1 przedstawia układ).
  10. Przed rozpoczęciem analizy upewnić się, że wszystkie odczynniki są odpowiednio przygotowane; upewnić się, że wszystkie składniki buforów i odczynniki mają temperaturę RT przed rozpoczęciem przygotowania buforów lub ich użyciem w analizie, z wyjątkiem PBS o pH 7.4 (bez EDTA), który należy przechowywać w lodzie/w lodówce do momentu użycia.
    UWAGA: Krytycznie ważne jest ograniczenie powstawania pęcherzyków powietrza do minimum, aby umożliwić zachodzenie pożądanych reakcji w analizie i zapewnić dokładną kwantyfikację za pomocą czytnika płytek.

Linia komórkowaGęstość wysiewu (płytka 96-dołkowa)
HepG210 000 komórek / studzienka
A5495 000 komórek / studzienkę
J77410 000 komórek / studzienka

Tabela 1: Sugerowane gęstości wysiewu dla wybranych linii komórkowych. Przedstawiono różne gęstości wysiewu dla trzech różnych linii komórkowych użytych w prezentowanych danych, a konkretnie A549, J774 i HepG2.

Projekt płytki do kolorymetrycznego oznaczania GSH i GSSG; schemat analizy próbek i kalibracji wyników.
Rysunek 1: Proponowany układ rozmieszczenia próbek na płytkach 96-dołkowych do jednoczesnego oznaczania całkowitej zawartości glutationu oraz dysiarczku glutationu. Przedstawiono również dołki przeznaczone do kalibracji i kontroli. Dołki niewykorzystane są oznaczone krzyżykiem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Obróbka nanomateriałem

  1. Odważ nanomateriały (konkretnie ZnO, TiO2, CuO i Ag) za pomocą wagi o dokładności do µg. Wykonaj obliczenia, aby uzyskać stężenie początkowe 1 mg/mL dla każdego nanomateriału.
  2. Przenieś roztwory nanomateriałów do sonikatora i poddaj działaniu ultradźwięków przez 16 min w kąpieli sonikacyjnej (38 W), aby uzyskać jednorodny roztwór. Przygotuj szereg rozcieńczeń dla każdego nanomateriału o stężeniach 125, 62,5, 31,25, 15,625 µg/mL.
  3. Wyjmij komórki z inkubatora i delikatnie przemyj ich RT PBS. Po upewnieniu się, że cały PBS został usunięty, dodaj do płytki 100 µL odpowiednich preparatów, uwzględniając kontrole (pożywka hodowlana bez HIFS). Po zastosowaniu preparatów inkubuj komórki z nanomateriałami w inkubatorze w temperaturze 37°C incubator (5% CO2) przez 4 h; następnie zastosuj poniższy protokół w celu oznaczania ilościowego GSH:GSSG, stężenia białek oraz uwalniania AK.

4. Protokół analizy

  1. Po ekspozycji na preparat (Rysunek 2A), opcjonalnie oceń żywotność komórek poprzez pomiar aktywności adenylokinazy (AK). Do przeprowadzenia tego testu użyj komercyjnego zestawu zgodnie z instrukcją producenta.
  2. Wirować płytki w wirówce z prędkością 200 x g przez 5 min, aby lekko osadzić preparat i szczątki komórkowe (Rysunek 2B).
  3. Ostrożnie pobierz 20 µL nadsączu z pożywki z każdej studni z próbką i kontrolą (zgodnie z powyższym opisem) i przenieś pipetą do sąsiedniej białej płytki 96-dołkowej w tym samym układzie (Rysunek 2C).
  4. Do każdej studni dodaj 100 µL roztworu roboczego z zestawu AK, osłoń płytkę przed światłem i pozostaw na 10 min w temperaturze pokojowej w celu rozwoju reakcji. Zmierz luminescencję za pomocą czytnika płytek przy ustawieniu 1000 counts/s.
  5. W przypadku wzorców GSH, do każdej studni dodaj 40 µL buforu do całkowitej glutationu (Rysunek 2D; opcjonalnie, wymagane do kwantyfikacji).
  6. Odsuń pozostałą pożywkę z płytki i przemyj ją 3x lodowatym 0,1 M PBS o pH 7,2, wylewając każdy z roztworów przemywających (Rysunek 2E), z wyjątkiem wzorców. Pozostaw ostatni roztwór przemywający na płytce do czasu naniesienia kalibracji GSH.
  7. Do studni w trzech powtórzeniach nanieś 10 µL każdego stężenia glutationu oraz próbkę ślepą (ddH2O).
  8. Usuń ostatni przemyw PBS i dodaj do każdej studni mieszaniny zgodnie z Tabelą 2 dla pożądanej kwantyfikacji docelowej (Rysunek 2E). Oblicz wymagane objętości przed rozpoczęciem tego kroku ze względu na szybką utratę aktywności w kompletnych buforach. Upewnij się, że mieszaniny reagentów zostały przygotowane przed rozpoczęciem procesu analizy, ale nie mogą stać dłużej niż 30 min przed użyciem.
  9. Umieść płytkę na orbitalnym wytrząsarce i inkubuj przy 300 RPM przez 2 min (Rysunek 2F).
  10. Zdejmij z wytrząsarki i dodaj 5 µL roztworu 0,01M TCEP do każdej studni, z wyjątkiem studni kontrolnej NEM. Ponownie umieść płytkę na wytrząsarce i inkubuj przez 10 min (Rysunek 2F).
  11. Przenieś płytkę do wirówki i wiruj przy 200 x g przez 5 min. Przenieś 25 µL z każdej studni z próbką do innej (przezroczystej) płytki 96-dołkowej; zostanie ona wykorzystana do oznaczenia stężenia białka (patrz krok 4.15; Rysunek 2G). Nie przenoś wzorców ani kontrol analizy.
  12. Upewnij się, że końcowa objętość w każdej studni wynosi 30 µL; w przypadku kontroli i wzorców usuń nadmiar objętości, aby spełnić ten wymóg (Rysunek 2H).
  13. Do każdej studni dodaj 170 µL roboczego roztworu OPA, osłoń płytkę przed światłem i pozostaw na wytrząsarce na 15 min (Rysunek 2I).
  14. Zmierz fluorescencję za pomocą czytnika płytek przy Ex340/Em450 (Rysunek 2J). Upewnij się, że podczas pomiaru nie ma pęcherzyków powietrza; mogą one negatywnie wpłynąć zarówno na reakcję, jak i na kwantyfikację za pomocą czytnika płytek.
  15. Aby określić zawartość białka w lizowanych komórkach, użyj komercyjnego zestawu do testu BCA. Przenieś próbki pobrane w kroku 4.12 do nowej (przezroczystej) płytki 96-dołkowej w ilości 25 µL na studnię.
  16. Użyj wzorca albuminy surowicy bydlęcej (BSA) rozcieńczonego w buforze do lizy IP i nanieś na płytkę w trzech powtórzeniach po 25 µL na studnię. Dokładne stężenia są określone w protokole zestawu BCA.
  17. Przygotuj roztwór roboczy składający się z reagentów A i B z zestawu BCA w stosunku 50:1 i dodaj 200 µL do każdej studni zawierającej próbkę, wzorzec i kontrolę. Osłoń płytki przed światłem i inkubuj w 37°C przez 30 min (Rysunek 2K).
  18. Wyjmij próbki z inkubatora, pozostaw do wyrównania temperatury do temperatury pokojowej przez 5 min, a następnie zmierz absorbancję za pomocą czytnika płytek przy 562 nm (Rysunek 2L).
 Mieszanina odczynników lizujących do oznaczania całkowitego stężenia glutationu
KomponentTom
Bufor lizujący50µL
Objętość całkowita / studzienka50µL
 Mieszanina odczynnika lizującego do oznaczania stężenia utlenionego glutationu
KomponentTom
Bufor do lizy49.5µL
NEM (25 mM)0.5µL
Objętość całkowita / dołek50µL
OBIE ROZTWORY NALEŻY WYKORZYSTAĆ W CIĄGU 30 MINUT OD MOMENTU PRZYGOTOWANIA MIESZANINY
 Komponent roztworu detekcyjnego OPATom
OPA 3 mg/ml5µL
PBS (pH 9,0)165µL
Objętość całkowita / dołek170µL

Tabela 2: Niezbędne objętości odczynników do wykonania protokołu. Objętości wymagane na każdą studzienkę do oznaczenia całkowitego glutationu, dwusiarczku glutationu oraz wymagana objętość odczynnika roboczego. Należy upewnić się, że obliczono wymagane objętości i uwzględniono nadmiar, aby zrekompensować straty objętości podczas przenoszenia.

Schemat przebiegu analizy traktowania komórek z wirowaniem, przenoszeniem pożywki, analizą białek metodą BCA oraz ilościowym oznaczeniem GSH/GSSG.
Rysunek 2: Schematyczna reprezentacja protokołu. (A) Wstępne wysianie, inkubacja i traktowanie komórek. (B) Wirowanie w celu oddzielenia pożywki od zawiesiny. (C) Przenoszenie pożywki do analizy kinazy adenylanowej. (D) Dodawanie stężeń glutationu w celu stworzenia zakresu kalibracyjnego. (E) Etapy płukania i dodanie odczynnika lizującego. (F) Dodanie buforu oraz tris(2-karboksyetylo)fosfiny z etapem wstrząsania. (G) Wirowanie lizowanych komórek w celu usunięcia pożywki do analizy białek. (H) Usunięcie pożywki w celu wyrównania objętości na całej płytce. (I) Dodanie roztworu roboczego ortho-ftalaldehydu z inkubacją przy wstrząsaniu. (J) Pomiar fluorescencji ortho-ftalaldehydu za pomocą czytnika płytek. (K) Etapy inkubacji w analizie kwasem biczynkoninowym w celu oznaczenia białka. (L) Pomiar stężenia białka, umożliwiający normalizację wartości glutationu: dwusiarczku glutationu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki

Zgodnie z tym protokołem linie komórkowe A549 i J774 wysiano odpowiednio w gęstości 5,000 cells/well oraz 10,000 cells/well i inkubowano w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 48 h. Analizę AK po traktowaniu nanomateriałami przedstawiono w Tabeli uzupełniającej 1, a stężenie białka w Tabeli uzupełniającej 2.

Krzywa kalibracyjna
Na Rysunku 3 przedstawiono trzy kalibracje z zastosowaniem określonego zakresu stężeń (stężenie końcowe 0,234 - 30 µM) z trzech osobnych płytek z trzech różnych typów komórek (co nie powinno wpływać na kalibrację), wykonane w trzy różne, nienastępujące po sobie dni. Choć pokazano 3 próbki, zaobserwowano N = 12, które wykazały podobne regresje liniowe ze średnią wartością R2 wynoszącą 0,9932 ± 0,007.

Wykres stężenia GSH w stosunku do fluorescencji; zawarto równania do analizy krzywej kalibracyjnej.
Rycina 3: Wykresy kalibracyjne glutationu dla analizy. Trzy wykresy kalibracyjne z oddzielnych zakresów kalibracji glutationu w płytce, z których każdy był wykonywany w odstępie tygodnia; słupki błędów ± SD (n=3, N=12), gdzie n=powtórzenia techniczne, N=powtórzenia biologiczne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Przykładowe wyniki
W ocenie różnych nanomateriałów, których podejrzewano, że wywołują zmiany w mechanizmach komórkowych poprzez stres oksydacyjny, wykorzystano komórki HepG2, A549 oraz J774. Zastosowano opisany protokół detekcji i kwantyfikacji.

Dane otrzymane z 3 pomiarów (AK, BCA oraz GSH/GSSG) przetworzono w następujący sposób. Testy AK i BCA zastosowano do normalizacji; test AK, z wykorzystaniem zalecanego zestawu, dostarczy najszybszych i najprostszych danych dotyczących ilości AK uwolnionej do pożywki komórkowej. Wraz ze wzrostem śmiertelności komórek spodziewany jest wzrost wartości AK. Dlatego wymagana jest kontrola ujemna (żywe komórki) i dodatnia (martwe komórki). Pozwoli to na normalizację w oparciu o wartości procentowe.

Analiza BCA jest procesem bardziej czasochłonnym, ale pozwala na uzyskanie mierzalnych wyników poprzez kwantyfikację białek (mg/mL). Nie wymaga ona kontroli ujemnej (-ve) ani dodatniej (+ve), tak jak w przypadku testu AK, jednak nadal niezbędna jest ogólna kontrola ujemna (niepoddane działaniu komórki), aby umożliwić normalizację wartości.

W tej sekcji z wynikami reprezentatywnymi stwierdzono, że zastosowana metoda (nanomateriały) może powodować zakłócenia w teście AK. W związku z tym całą normalizację przeprowadzono w oparciu o dane z testu BCA. Informacje są zatem przedstawione jako stężenie wykrytych związków (GSH lub GSH+GSSG (przy czym w celu uzyskania stężenia GSSG odejmuje się stężenie GSH od całkowitego stężenia GSH+GSSG)) na mg/mL białka (oznaczone testem BCA). W razie potrzeby można następnie przekształcić te dane w stosunek, aby ocenić zmianę GSH:GSSG pod wpływem danej kuracji.

Na Rysunku 4 przedstawiono dane dotyczące stosunku GSH:GSSG z trzech różnych linii komórkowych (A549, J774 i HepG2), uzyskane zgodnie z protokołem OPA i znormalizowane do ekspresji białek za pomocą metody BCA (µg/mL); dodatkowe dane określające wartości GSH i GSSG znajdują się na Rysunku dodatkowym 1.

Wykres stosunku glutationu; GSH:GSSG w zależności od stężenia nanomateriału; analiza CuO, Ag, ZnO, TiO2.
Rycina 4: Stosunek glutationu do disiarczku glutationu uzyskany w wyniku przeprowadzenia analizy. Przedstawiono stosunki glutationu do disiarczku glutationu dla 3 linii komórkowych, mianowicie (A) A549, (B) J774 oraz (C) HepG2. Komórki inkubowano z preparatami (różne nanomateriały w pożywce bez surowicy) przez 4 h. Komórki przetworzono zgodnie z niniejszym protokołem w celu ilościowego oznaczenia zmian w poziomie glutationu i disiarczku glutationu, a następnie znormalizowano poprzez oznaczanie białka; słupki błędów ± SE (n=3, N=3) Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Płytka zawiera również serię kontroli, aby upewnić się, że analiza została przeprowadzona prawidłowo. NEM jest dodawany jako oddzielny składnik, aby wykazać brak oddziaływania z podłożem detekcyjnym OPA. Standard kalibracyjny wykazuje liniowy wzrost wraz z koncentracją GSH, co potwierdza zdolność odczynnika detekcyjnego OPA do skutecznego wiązania się z rosnącymi stężeniami GSH.

Należy zauważyć, że ten test jest skierowany specyficznie przeciwko wolnym grupom sulfhydrylowym, powszechnie występującym w tiolach (takich jak GSH, które są zazwyczaj uważane za przeciwutleniacze). Potencjalną interakcją jest wiązanie OPA z tiolami białkowymi, co mogłoby prowadzić do uzyskania nieprawidłowych danych. Dlatego test BCA jest kluczowym etapem służącym do normalizacji danych względem białka, co pozwala na dokładne odzwierciedlenie poziomu wolnego GSH.

Rycina uzupełniająca 1: Ryciny przedstawiające poziom glutationu, powszechnie występującego dwusiarczku glutationu oraz stosunek glutationu do dwusiarczku glutationu w 3 liniach komórkowych, mianowicie: (A) A549, (B) J774 oraz (C) HepG2. Komórki inkubowano z substancjami testowymi (różne nanomateriały w mediach bezsurowiczych) przez 4 h. Komórki opracowano zgodnie z tym protokołem w celu ilościowego oznaczenia zmian w poziomie glutationu i dwusiarczku glutationu, a następnie znormalizowano poprzez oznaczanie białka; słupki błędów ± SE (n=3, N=3) Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Metadane wartości kinazy adenylanowej dla komórek A549 i J774. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Metadane wartości kwasu bicinchonininowego wraz z kalibracją dla komórek A549, J774 i HepG2. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Jak już wspomniano, potrzeba zrozumienia redoks komórkowego, monitorowania stanów stresu oksydacyjnego i odpowiedzi antyoksydacyjnej zawsze miała kluczowe znaczenie dla zrozumienia i zapobiegania niezliczonym chorobom, takim jak nowotwory i neurodegeneracja33,34. Zademonstrowano tutaj sposób na ulepszenie krajobrazu translacyjnego poprzez zwiększenie dostępności dokładnego wykrywania GSH: GSSG przy szybkim, minimalnym przygotowaniu.

Protokół ten przedstawia wieloparametryczną sekwencję testów do oznaczania wewnątrzkomórkowych gatunków glutationu/tiolu (zredukowanych i utlenionych), z 2 sposobami normalizacji za pomocą testu białka BCA i / lub testu AK. Test ten można również zmodyfikować w celu wykrycia różnych innych markerów na początkowym etapie ekstrakcji mediatorem i można go uprościć w sposób, który po prostu da stosunek utlenionego / zredukowanego tiolu z wyłączeniem zakresu kalibracji.

Rozważając ocenę analitów, zbadano i porównano zarówno mBCI, jak i OPA pod kątem zastosowania. Podczas gdy mBCl początkowo wykazywał dobry potencjał sygnałowy, odkryto znaczne ograniczenia w użyciu. Przede wszystkim zastosowanie żywych komórek pokazuje najlepsze wykorzystanie mBCl; jednak po lizie komórek stwierdzono, że sygnał jest wygaszony i jest na ogół zmniejszony w formacie wielodołkowym w porównaniu z OPA35. Inną kwestią jest pomiar GSSG za pomocą mBCl, literatura na ten temat jest skąpa, a poprzez optymalizację/eksplorację protokołu nie udało się osiągnąć dokładnego wykrywania GSSG przez mBCl.

Wykazaliśmy, że test OPA przedstawia niezwykle wiarygodne zakresy kalibracji, ze średnią R2 wynoszącą 0,9932 ± 0,007 (N = 12) w zakresie stężeń 0,234 - 30 μM GSH. Zakres ten został wybrany ze względu na wcześniejsze zakresy referencyjne znalezione w literaturze35. Teoretycznie możliwe jest wykrycie glutationu poza tymi zakresami, ale będzie to wymagało modyfikacji stężenia odczynników, czasu inkubacji i potencjalnie sprzętu wykorzystywanego do wykrywania. Należy zauważyć, że każda tabliczka wymaga własnego standardowego zakresu do oznaczania ilościowego; Najmniejsza różnica w czasie pomiędzy płytami wykonywanymi w różnych dniach może mieć znaczący wpływ na wartości uzyskane podczas pomiaru.

Uzyskanie dokładnych i wiarygodnych danych z tego protokołu zależy od ścisłego przestrzegania kilku kluczowych kroków. Podczas konstruowania różnych wymaganych w protokole ważne jest, aby pH było dokładne. W związku z tym wymagające pH 9 nie powinny mieć odchylenia większego niż ± 0,1 tej wartości. Wynika to z możliwości wytrącania się składników buforowych z roztworu o niewłaściwym pH; Dokładne przestrzeganie tego protokołu zapobiegnie temu problemowi.

Całkowite usunięcie obróbki i dokładne mycie przed lizą mają również kluczowe znaczenie dla zapobiegania artefaktom i niedokładnemu pozyskiwaniu danych na etapie odczytu płytki. Po lizie komórek (krok 4.8) usunięcie leczenia nie jest możliwe, a płytki nie będzie można uratować. Ze względu na to, że objętości/odczynników dodawanych w całym protokole różnią się w zależności od próbki i wzorca, bardzo ważne jest, aby użytkownik był świadomy różnych objętości w kroku 4.12 i 4.13. Operator testu jest również informowany o tych zróżnicowanych objętościach i instruowany, aby upewnić się, że wszystkie objętości są takie same, aby umożliwić uzyskanie dokładnego pomiaru. Ponieważ objętości między próbkami a wzorcami nie są widocznie znaczące, łatwo jest popełnić błąd w odniesieniu do nadmiaru roztworu w studzience próbki.

Istnieją ograniczenia tego protokołu, które opierają się na kluczowych krokach, które mają kluczowe znaczenie dla uzyskania dokładnych i wiarygodnych danych. Użytkownicy wykonujący ten test muszą posiadać rozsądny poziom umiejętności laboratoryjnych, aby zapobiec niepożądanym problemom, takim jak tworzenie się pęcherzyków. Powstawanie pęcherzyków ma drastyczny wpływ zarówno na zdolność do zachodzenia reakcji w obrębie mikropłytki, jak i na pomiar fluorescencji. Środek lizujący zastosowany w tym protokole zawiera detergent, co stanowi trudność dla początkującego badacza, który może mieć trudności z zapobieganiem tworzeniu się pęcherzyków. Natychmiastowe odwirowanie może uratować ten błąd. Protokół jest również potencjalnie ograniczony pod względem typu komórki; Linie komórkowe A549, J774 i HepG2 zostały wykorzystane zarówno do optymalizacji, jak i generowania danych dla tego protokołu. Inne linie komórkowe mogą wymagać różnych gęstości wysiewu i optymalizacji protokołu w celu uzyskania dokładnych danych.

Protokół ten oferuje wiele zalet w porównaniu z kilkoma istniejącymi testami. Chociaż wykrywanie tioli za pomocą aldehydu ftalowego nie jest nową koncepcją, wykorzystanie w formacie testu kombinowanego, takiego jak ten, na mikropłytce, z ograniczonymi wymaganymi materiałami i sprzętem, oferuje wszystkim laboratoriom ogromny potencjał dostępu do tego protokołu. Większość zestawów Thiol/GSH od dostawców komercyjnych nie ujawnia składu swoich odczynników. W związku z tym może być trudno przewidzieć potencjalne niezgodności/zakłócenia. Poniżej przedstawiamy każdy składnik wszystkich stosowanych odczynników, aby ograniczyć ten potencjał.

Protokół ten jest również wykonywany dość szybko po zakończeniu początkowego okresu leczenia. Biorąc pod uwagę przetwarzanie przez użytkownika między etapami inkubacji, aspekt kwantyfikacji tiolu w tym protokole można przeprowadzić w czasie krótszym niż 1 godzina. Próbki są jednocześnie poddawane lizie i wiązane, aby zapobiec samoutlenianiu próbek, co jest optymalne dla tych rodzajów reakcji. Chociaż nie zostało to określone w protokole, próbki mogą być technicznie poddawane lizie na płytce i zamykane, co pozwala na ich zamrożenie do przyszłej analizy. Jednak ta zmiana w protokole nie została zbadana.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez europejskie projekty GRACIOUS (GA760840) i SUNSHINE (GA952924). Autorzy pragną również wyrazić uznanie dla wysiłków wszystkich tych, którzy w jakiś sposób przyczynili się do opracowania tego protokołu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 i mikro; m filtr (opcjonalnie-do buforu do lizy)Fisher scientific12561259
100mL kolba miarowaFisher scientific15290866
1L Kolba miarowa Fisher scientific15230876
Zlewka 250 ml (opcjonalnie - do buforu do lizy)8-kanałowascientific 15409083
(20-200 i mikro; L)SLSFA10011D2
8-kanałowa mikropipeta (2-20 i mikro; L)Płytki SLSB2B06492
96-dołkowe - czarne z przezroczystym dnem, Impregnowane TCFisher scientific10000631Preferowana płytka do wysiewu i fluorescencji, użyj przezroczystej płytki 96-dołkowej poddanej obróbce TC, jeśli nie są dostępne
Płytki 96-dołkowe - przezroczyste (TC poddane działaniu i niepoddane obróbce)Fisher Scientific10141161Jeśli czarne płytki z przezroczystym dnem nie są dostępne/odpowiednie zastosowanie: przezroczyste
płytki 96-dołkowe poddane działaniu TC - białe, Nie leczony TCFisher scientific11457009
Linia komórkowa A549 (rak płuc)ATCCCCL-185
Etanol absolutnyMerck (Sigma-Aldrich)1.08543
Folia aluminiowaFisher scientific11779408Do ochrony płytek przed światłem
Zestaw testowy BCAWirówka23225
( z wirnikiem 96-płytkowym)Eppendorf5804
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Merck (Sigma-Aldrich)E9884
Glutation (GSH)Merck (Sigma-Aldrich)G6013
Dwusiarczek glutationu (GSSG)Merck (Sigma-Aldrich)G4501
GlicerolMerck (Sigma-Aldrich)G5516
HCl, 37% Merck (Sigma-Aldrich)258148Rozcieńczyć do 1mM dla materiału GSH, dostosowanie pH również
linia komórkowa HepG2 (rak wątroby)ATCCHB-8065
IGEPAL  CA-630 Merck (Sigma-Aldrich)18896Użyj IGEPAL CA-630 lub NP-40 do roztworu, a nie obu
do lizy IP Fisher scientific11825135
Linia komórkowa J774 (monocyty, makrofagi)ATCCTIB-67
KClMerck (Sigma-Aldrich)P3911
KH2PO4 Mikropipeta Merck (Sigma-Aldrich)P0662
(20-200&mikro; L)SLSB2B06482
Mikropipeta (2-20 i mikro; L)SLSB2B06478
Wytrząsarka do mikropłytekVWR444-0041
Na2HPO4Merck (Sigma-Aldrich)S9763
NaClMerck (Sigma-Aldrich)S9888
NaOH, 10MMerck (Sigma-Aldrich)72068Tylko do regulacji pH
N-etylomaleimid (NEM)& nbsp;Merck (Sigma-Aldrich)E3876
NP-40Merck (Sigma-Aldrich)492016Do roztworu należy użyć IGEPAL CA-630 lub NP-40, a nie obu. Sugerowana alternatywa NP-40
Orto-dialdehyd ftalowy (OPA)Merck (Sigma-Aldrich)P1378
PBS 0,1 MMerck (Sigma-Aldrich)P2272PBS można nabyć wstępnie przygotowany lub wykonany we własnym zakresie, patrz uwagi
Czytnik płytek (o pojemności fluorescencji)TecanSPARK
Stir bar mieszający (opcjonalnie-Do buforu do lizy)Fisher scientific16265731
Zestaw do testów biologicznych Toxilight (test AK)LonzaLT17-217
Chlorowodorek tris(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP) 0,5M  w H2OAlfa AesarH51864Można również kupić skrystalizowany i zawieszony
TRIS-HClMerck (Sigma-Aldrich)93363
X100 fosfataza i koktajl proteazy 10025743naukowy Fishera
mikropipeta Fisher stołowa Thermo

Bibliografia

  1. Barnham, K. J., Masters, C. L., Bush, A. I. Neurodegenerative diseases and oxidative stress. Nat Rev Drug Discov. 3 (3), 205-214 (2004).
  2. Arfin, S., et al. Oxidative stress in cancer cell metabolism. Antioxidants. 10 (5), 642(2021).
  3. Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. The FASEB Journal. 17 (10), 1195-1214 (2003).
  4. Ghezzi, P., Jaquet, V., Marcucci, F., Schmidt, H. H. H. W. The oxidative stress theory of disease: levels of evidence and epistemological aspects. Br J Pharmacol. 174 (12), 1784-1796 (2017).
  5. Bhattacharyya, A., Chattopadhyay, R., Mitra, S., Crowe, S. E. Oxidative stress: An essential factor in the pathogenesis of gastrointestinal mucosal diseases. Physiol Rev. 94 (2), 329-354 (2014).
  6. Yin, F., Sancheti, H., Cadenas, E. Mitochondrial thiols in the regulation of cell death pathways. Antioxi Redox Sig. 17 (12), 1714-1727 (2012).
  7. Balcerczyk, A., Bartosz, G. Thiols are main determinants of total antioxidant capacity of cellular homogenates. Free Rad Res. 37 (5), 537-541 (2003).
  8. McBean, G. J. Cysteine, glutathione, and thiol redox balance in astrocytes. Antioxidants. 6 (3), 62(2017).
  9. Nimse, S. B., Pal, D. Free radicals, natural antioxidants, and their reaction mechanisms. RSC Adv. 5 (35), 27986-28006 (2015).
  10. Nordberg, J., Arnér, E. S. J. Reactive oxygen species, antioxidants, and the mammalian thioredoxin system1. Free Rad Biol Med. 31 (11), 1287-1312 (2001).
  11. Pham-Huy, L. A., He, H., Pham-Huy, C. Free radicals, antioxidants in disease and health. Int J Biomed Sci. 4 (2), 89(2008).
  12. Harris, I. S., DeNicola, G. M. The complex interplay between antioxidants and ROS in cancer. Trend Cell Biol. 30 (6), 440-451 (2020).
  13. Traverso, N., et al. Role of glutathione in cancer progression and chemoresistance. Oxid Med Cell Longev. 2013, 972913(2013).
  14. Day, R. M., Suzuki, Y. J. Cell proliferation, reactive oxygen and cellular glutathione. Dose-Resp. 3 (3), 425-442 (2005).
  15. Aquilano, K., Baldelli, S., Ciriolo, M. R. Glutathione: new roles in redox signaling for an old antioxidant. Front Pharmacol. 5, 196(2014).
  16. Zitka, O., et al. Redox status expressed as GSH: GSSG ratio as a marker for oxidative stress in paediatric tumour patients. Onco Lett. 4 (6), 1247-1253 (2012).
  17. Childs, S., Haroune, N., Williams, L., Gronow, M. Determination of cellular glutathione: glutathione disulfide ratio in prostate cancer cells by high performance liquid chromatography with electrochemical detection. J Chrom A. 1437, 67-73 (2016).
  18. Giustarini, D., et al. glutathione disulfide, and S-glutathionylated proteins in cell cultures. Free Rad Biol Med. 89, 972-981 (2015).
  19. Özyürek, M., et al. Determination of biothiols by a novel on-line HPLC-DTNB assay with post-column detection. Analytica Chimica Acta. 750, 173-181 (2012).
  20. Zhang, L., Lu, B., Lu, C., Lin, J. Determination of cysteine, homocysteine, cystine, and homocystine in biological fluids by HPLC using fluorosurfactant-capped gold nanoparticles as postcolumn colorimetric reagents. J Sep Sci. 37 (1-2), 30-36 (2014).
  21. Tsiasioti, A., Georgiadou, E., Zacharis, C. K., Tzanavaras, P. D. Development and validation of a direct HPLC method for the determination of salivary glutathione disulphide using a core shell column and post column derivatization with o-phthalaldehyde. J Chromat B. 1197, 123216(2022).
  22. Huang, D., Ou, B., Prior, R. L. The chemistry behind antioxidant capacity assays. J Agri Food Chem. 53 (6), 1841-1856 (2005).
  23. Berker, K. I., Güçlü, K., Tor, İ, Demirata, B., Apak, R. Total antioxidant capacity assay using optimized ferricyanide/prussian blue method. Food Anal Meth. 3 (3), 154-168 (2010).
  24. Rahman, I., Kode, A., Biswas, S. K. Assay for quantitative determination of glutathione and glutathione disulfide levels using enzymatic recycling method. Nat Prot. 1 (6), 3159-3165 (2007).
  25. Kampa, M., et al. A new automated method for the determination of the Total Antioxidant Capacity (TAC) of human plasma, based on the crocin bleaching assay. BMC Clin Pathol. 2 (1), 3(2002).
  26. Fernández-Checa, J. C., Kaplowitz, N. The use of monochlorobimane to determine hepatic GSH levels and synthesis. Anal Biochem. 190 (2), 212-219 (1990).
  27. Nauen, R., Stumpf, N. Fluorometric microplate assay to measure glutathione S-transferase activity in insects and mites using monochlorobimane. Anal Biochem. 303 (2), 194-198 (2002).
  28. Stevenson, D., Wokosin, D., Girkin, J., Grant, M. H. Measurement of the intracellular distribution of reduced glutathione in cultured rat hepatocytes using monochlorobimane and confocal laser scanning microscopy. Toxicol in vitro. 16 (5), 609-619 (2002).
  29. McBeth, C., Stott-Marshall, R. J. Interference of reversible redox compounds in enzyme catalysed assays–Electrochemical limitations. Anal Biochem. 662, 114972(2023).
  30. Yu, Z., et al. Reactive oxygen species-related nanoparticle toxicity in the biomedical field. Nanoscale Res Lett. 15 (1), 115(2020).
  31. Boyles, M., et al. Development of a standard operating procedure for the DCFH2-DA acellular assessment of reactive oxygen species produced by nanomaterials. Toxicol Mech Meth. 32 (6), 439-452 (2022).
  32. Segeritz, C. P., Vallier, L. Cell culture: Growing cells as model systems in vitro. Basic Sci Meth Clin Res. , 151-172 (2017).
  33. Ma, Q. Role of nrf2 in oxidative stress and toxicity. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 53, 401-426 (2013).
  34. Calabrese, V., Cornelius, C., Dinkova-Kostova, A. T., Calabrese, E. J., Mattson, M. P. Cellular stress responses, the hormesis paradigm, and vitagenes: novel targets for therapeutic intervention in neurodegenerative disorders. Antioxid redox Signal. 13 (11), 1763-1811 (2010).
  35. Ishkaeva, R. A., Zoughaib, M., Laikov, A. V., Angelova, P. R., Abdullin, T. I. Probing cell redox state and glutathione-modulating factors using a monochlorobimane-based microplate assay. Antioxidants. 11 (2), 391(2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oznaczanie ilości glutationuglutation utlenionyglutation zredukowanytest z orto-ftalaldehydemreaktywne formy tlenunormalizacja białekdetekcja fluorescencyjnahodowla komórek ssakówtest kwasu biczninowegoocena cytotoksyczności
Szybkie oznaczanie ilościowe utlenionych i zredukowanych form glutationu przy użyciu orto-ftaldehydu w hodowanych komórkach ssaków in vitro
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.