Artykuł metodologiczny

Szybkie oznaczanie ilościowe utlenionych i zredukowanych form glutationu przy użyciu orto-ftaldehydu w hodowanych komórkach ssaków in vitro

DOI:

10.3791/66267

⸱

28 czerwca 2024

 ,  ,  ,  , 
1School of Health and Life Sciences, Teesside University, 2Institute of Biochemical Chemistry, Biophysics, and Bioengineering, Heriot-Watt University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kwantyfikacja zarówno utlenionych, jak i zredukowanych form glutationu (odpowiednio GSSG i GSH) została osiągnięta dzięki zastosowaniu aldehydu ortoftaldehydu (OPA). OPA staje się wysoce fluorescencyjny po sprzęgnięciu z GSH, ale nie jest w stanie sprzęgnąć GSSG, dopóki nie zostanie zredukowany. W tym miejscu opisujemy test wieloparametryczny do ilościowego określenia obu przy użyciu kwantyfikacji białka w celu normalizacji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glutation od dawna uważany jest za kluczowy biomarker do określania odpowiedzi antyoksydacyjnej komórki. W związku z tym jest podstawowym markerem w badaniach reaktywnych form tlenu. Metoda wykorzystuje aldehyd ortoftalowy (OPA) do ilościowego określenia stężenia glutationu (glutationów) w komórkach. OPA koniugatuje się ze zredukowanym glutationem (GSH) poprzez wiązanie sulfhydrylu, tworząc następnie izoindol, w wyniku czego powstaje wysoce fluorescencyjny koniugat. Aby uzyskać dokładny wynik zarówno utlenionego glutationu (GSSG), jak i GSH, wymagana jest kombinacja środków maskujących i redukujących, które zostały zaimplementowane w tym protokole. Leczenie może również wpływać na żywotność komórek. W związku z tym normalizacja za pomocą testu białkowego jest przedstawiona w tym wieloparametrycznym teście. Test wykazuje pseudoliniowy zakres wykrywania 0,234 - 30 μM (R2 = 0,9932±0,007 (N = 12)) specyficzny dla GSH. Proponowany test pozwala również na oznaczenie utlenionego glutationu z dodatkiem środka maskującego N-etylomaleimidu w celu związania zredukowanego glutationu, a środek redukujący tris(2-karboksetylo)fosfinę jest wprowadzany w celu rozszczepienia wiązania dwusiarczkowego w GSSG w celu wytworzenia dwóch cząsteczek GSH. Test stosuje się w połączeniu ze zwalidowanym testem kwasu bicinchoninowego do oznaczania ilościowego białka i testem kinazy adenylanowej do oceny cytotoksyczności.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reaktywne formy tlenu (ROS) są głównym induktorem stresu oksydacyjnego; stres oksydacyjny jest dobrze znany w generowaniu mutacji DNA, starzeniu się / śmierci komórek, różnych nowotworach, cukrzycy, chorobach neurologicznych (takich jak Parkinson i Alzheimer) i kilku innych stanach wyniszczających życie1,2,3,4,5. Kluczowym zabezpieczeniem przed ROS są tiolowe, nieenzymatyczne przeciwutleniacze, które są zdolne do redukcji utleniaczy lub rodników, działając jako dawcy protonów6,7. Glutation (GSH) i cysteina to dwa najbardziej rozpowszechnione tiole występujące u ssaków8, podczas gdy istnieją różne inne tiole o niskiej masie cząsteczkowej (takie jak ergotioneina), GSH i cysteina są najczęściej mierzonymi nieenzymatycznymi przeciwutleniaczami znajdującymi się w literaturze9,10,11 i mają największe znaczenie w walce z ROS8,12,13,14.

Gdy GSH jest używany jako przeciwutleniacz, dwie cząsteczki GSH są kowalencyjnie połączone ze sobą wiązaniem dwusiarczkowym, tworząc dwusiarczek glutationu (GSSG). Wyczerpanie GSH jest często używane jako wskaźnik stresu oksydacyjnego15,16. Ocena ta może być również połączona z wykrywaniem GSSG, chociaż wzrost GSSG w komórkach jest często ograniczony przez aktywne procesy eksportowe, ponieważ GSSG może być stosunkowo reaktywny w komórkach, prowadząc do tworzenia wiązań dwusiarczkowych z innymi tiolami białkowymi16.

Tradycyjne metody pomiaru GSH i GSSG nie są prostymi procesami i wymagają wielu etapów, w tym ekstrakcji komórkowej za pomocą odczynników litycznych17,18. Przedstawiony tutaj protokół upraszcza te metody i umożliwia dokładny pomiar nieenzymatycznych tioli oraz normalizację za pomocą zawartości białek komórkowych lub uwalniania kinazy adenylanowej. Ponadto możliwe jest zmierzenie żywotności komórek przed ekstrakcją GSH/GSSG. Kilka metod próbowało wcześniej skutecznie celować i oznaczać ilościowo zredukowane i utlenione nieenzymatyczne tiole; metody, w tym wykorzystanie HPLC19,20,21, test płytkowy (biochemiczny)22,23,24,25, i które używają popularnych odczynników do koniugacji tiolowej, takich jak 5,5-dithio-bis-(kwas 2-nitrobenzoesowy) (DTNB/ odczynnik Ellmana)19, Monochlorobimane (mBCI)26,27,28. Kilka firm przygotowało również autorskie zestawy do wykrywania glutationu; Nie publikują jednak niezgodności odczynników, co stwarza problemy w zależności od zastosowanych metod leczenia29.

Ten protokół przedstawia wieloparametryczny test, który wykrywa zredukowane tiole (takie jak GSH) poprzez koniugację orto-ftaldehydu (OPA) w celu wytworzenia sygnału fluorescencyjnego wykrywalnego odpowiednio przy 340/450 Ex/Em. Test ten ułatwia jednoczesne wykrywanie zarówno GSH, jak i GSSG (na płytce), poprzez zastosowanie środków maskujących (N-etylomaleimid) i redukujących GSSG (tris(2-karboksetylo)fosfina). Ten protokół wielobiomarkerowy daje również możliwość ilościowego oznaczania białek na etapie lizy komórkowej za pomocą testu kwasu bicinchoninowego w celu normalizacji próbek po zakończeniu końcowego pomiaru lub za pomocą testu kinazy adenylanowej z pożywki komórkowej. Ten test można przeprowadzić przy użyciu kilku odczynników łatwo dostępnych w większości laboratoriów i wymaga tylko kilku dodatkowych rzadkich substancji chemicznych do wykonania. Proces jest prosty, przystępny i można go wykonać bez pracochłonnych etapów w mniej niż 2 godziny.

W tym protokole wybrano różne nanomateriały, które wcześniej wykazano, że wywołują ROS lub podejrzewa się, że wywołują stres oksydacyjny30,31. Zbadano zakres stężeń, aby zobaczyć wpływ ekspozycji tych nanomateriałów na różne linie komórkowe oraz skuteczność testu w ilościowym określaniu tioli przeciwutleniających.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Poniższy protokół został opracowany z myślą o możliwości wykorzystania w połączeniu z testem białka z kwasem bicinchoninowym (BCA) i testem kinazy adenylanowej (AK) w celu normalizacji próbek do leczenia. Upewnij się, że operator ma na sobie odpowiedni strój i niezbędny sprzęt ochronny, taki jak fartuch laboratoryjny Howie, rękawice nitrylowe i okulary ochronne klasy I, podczas przygotowywania i użytkowania materiałów. Protokół podzielony jest na kilka etapów.

1. Przygotowanie roztworów podstawowych i roboczych

  1. Przygotować roztwory podstawowe 100 mM wzorca GSH w 1 mM HCl (przygotowane z 37% HCl w wodzie podwójnie destylowanej (ddH2O)).
    UWAGA: W przypadku rozcieńczania z silnie stężonego kwasu, takiego jak 37% HCl, należy upewnić się, że proces dodawania kwasu do wody w dygestoriach klasy I.
  2. Przygotuj zapas 22,35 mM OPA w absolutnym etanolu. Wykonaj ten krok w okapie wyciągowym klasy I. Przygotować 25 mM N-etylomaleimidu (NEM) w ddH2O. Wykonać ten krok w dygestorii klasy I.
    UWAGA: Te trzy roztwory można przechowywać w temperaturze -20 °C do 3 miesięcy.
  3. Przygotować 0,01 M tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP) do całkowitej objętości 500 μl, wymaganej na 100 studzienek. Przygotować 100 μl 1 mM wzorca GSH, rozcieńczonego ze 100 mM bulionu przy użyciu ddH2O.
  4. Użyć buforu do lizy immunoprecypitacji (IP) lub następującego preparatu: 394 mg Tris-HCl (stężenie końcowe 25 mM), 877 mg NaCl (stężenie końcowe 150 mM), 29 mg EDTA (stężenie końcowe 1 mM), 1 ml 100% NP-40 lub IGEPAL CA-630 (stężenie końcowe 1% V/V), 5 ml glicerolu (stężenie końcowe 5% V/V), 84 ml ddH2O. Wymieszaj składniki delikatnie mieszając i dostosuj pH do 7,4. Zdekantować do kolby miarowej o pojemności 100 ml i dodać pozostałą objętość ddH2O, aby osiągnąć końcową objętość 100 ml. Sterylny filtr przepuszcza przez filtr 0,22 μm i przechowuje w temperaturze 2-8 °C przez okres do 6 miesięcy.
    UWAGA: Roztwory lizujące działają jako zanieczyszczenie/zakłócenie w tym teście; W związku z tym określono powyższe sformułowania.
  5. Przygotować 1 l 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem uzupełnionej kwasem etylenodiaminotetraoctowym (PBS-EDTA) przy 3 różnych wartościach pH, konkretnie 7,2, 8,5 i 9,0. Użyj komercyjnego buforu 0,1 M PBS uzupełnionego 1 mM EDTA (292,24 mg/L) lub następującym 10x (1 L) preparatu: 80 g NaCl, 2,0 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4, 800 ml ddH2O. Dodaj i wymieszaj; uzupełnić do 1 l. Roztwór do sterylizacji należy przelać w autoklawie i przechowywać przez 12 miesięcy w temperaturze pokojowej. Z 10-krotnego roztworu podstawowego przygotuj roztwór roboczy PBS i uzupełnij go EDTA (stężenie jak podano wcześniej).
    UWAGA: pH ma kluczowe znaczenie; upewnij się, że pH jest dokładne przed rozpoczęciem protokołu.
  6. Wykonać seryjne rozcieńczanie 1:2 1 mM GSH przy użyciu ddH2O (1 mM, 500 μM, 250 μM, 125 μM, 62,5 μM, 31,25 μM, 15,625 μM i 7,8125 μM). Dodać 10 μl każdego stężenia do standardowych studzienek (wykonywanych w dwóch powtórzeniach). Próbki są dalej rozcieńczane w buforze do lizy; w związku z tym stężenia będą wynosić 1/5 ichpierwotnego stężenia (200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,5625 μM).
    UWAGA: Końcowe stężenia do kalibracji wynoszą 30 μm, 15 μm, 7,5 μm, 3,75 μm, 1,875 μm, 937,5 nm, 468,8 nm i 234,4 nm.

2. Przygotowanie testu

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje ludzkie linie komórkowe HepG2, A549 i J774, które zostały zakupione komercyjnie od ATCC. Te linie komórkowe zostały wykorzystane zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi określonymi w ustawach i rozporządzeniach Uniwersytetu dotyczących hodowli zwierząt i kultur tkankowych.

  1. W ciągu 24 godzin przed rozpoczęciem oznaczania, komórki nasienne w stężeniach przedstawionych w tabeli 1; jednakże, w zależności od zastosowanej linii/typu komórek i zastosowanego traktowania, w razie potrzeby dostosować gęstość. Hoduj komórki w kompletnym pożywce wzrostowej (Eagles modified essentials medium (EMEM) z 10% inaktywowaną termicznie surowicą cielęcą płodu (HIFS), 1% Pentrepem (10 000 U/ml penicyliny/10 mg/ml streptomycyny) i 1% aminokwasami endogennymi.
  2. Komórki nasienne przy użyciu konwencjonalnych metod wysiewu komórek32. Komórki nasienne na całkowicie czarnych płytkach, jeśli nie są używane pod mikroskopem po teście. Oceń komórki pod kątem zbieżności i ogólnego stanu zdrowia w kolbie T75 przed użyciem za pomocą mikroskopii.
  3. W czystej, sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II i zgodnie ze ścisłą techniką aseptyczną wyrzuć pożywkę komórkową, delikatnie umyj komórki ~15 ml sterylnego PBS o temperaturze pokojowej (RT) i wyrzuć.
  4. Do kolby komórkowej dodać 5 ml sterylnej 1x trypsyny, delikatnie rozkołysać, aby zapewnić pokrycie monowarstwy komórek, i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 5 minut, aby ułatwić oddzielenie komórek.
  5. Zatrzymaj trypsynizację przez dodanie pożywki wzrostowej zawierającej inaktywowaną termicznie surowicę cielęcą płodu (10%), około 10 ml.
  6. Przenieść komórki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i osadzać w 200 x g przez 5 minut. Wyrzuć pożywkę i zastąp ją 5 ml tej samej pożywki. Ponownie zawiesić komórki w probówce, aż staną się jednorodne i nie będzie można zaobserwować zbrylania.
  7. Usunąć 20 μl zawiesiny komórek i umieścić w hemocytometrze w celu zliczenia. Po obliczeniu wymaganej liczby komórek wykonaj rozcieńczenie, aby uzyskać roztwór o odpowiedniej gęstości komórek.
  8. Pożywka do pipet zawierająca komórki w 96-dołkowych płytkach (pojemność 350 μl), o maksymalnej objętości 200 μl na studzienkę. Umieścić komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 24 godziny, aby przylegały do powierzchni płytki.
  9. Aby ocenić zarówno całkowity glutation, jak i GSSG, należy traktować próbki pod kątem obu schorzeń. Wysiej i zapraw 6 dołków, aby zapewnić po 2 zestawy GSH i GSSG z 3 powtórzeniami technicznymi (Rysunek 1 przedstawia układ).
  10. Upewnij się, że wszystkie odczynniki są odpowiednio przygotowane przed rozpoczęciem testu; upewnij się, że wszystkie składniki buforu i odczynniki mają temperaturę RT przed rozpoczęciem budowy lub użycia w teście, z wyjątkiem pH 7,4 PBS (bez EDTA), które powinny być przechowywane na lodzie/w lodówce do czasu użycia.
    UWAGA: Niezwykle ważne jest, aby tworzenie się pęcherzyków było ograniczone do minimum, aby umożliwić zajście pożądanych reakcji w teście i umożliwić dokładne określenie ilościowe za pomocą czytnika płytek.

Linia komórkowaGęstość wysiewu (płytka 96-dołkowa)
Wirus HepG210 000 komórek / studzienka
Ciągnik siodłowy A5495 000 komórek / studzienka
Zobacz materiał J77410 000 komórek / studzienka

Tabela 1: Sugerowane gęstości wysiewu dla wybranych linii komórkowych. Wykazano różne gęstości wysiewu dla trzech różnych linii komórkowych użytych w reprezentowanych danych, w szczególności A549, J774 i HepG2.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Proponowany układ do wysiewu 96 płytek dołkowych do jednoczesnego oznaczania całkowitego glutationu i dwusiarczku glutationu. Demonstrowane są również studzienki do kalibracji i kontroli. Studnie, które nie są używane, są reprezentowane przez krzyżyk. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Obróbka nanomateriałów

  1. Zważ nanomateriały (w szczególności ZnO, TiO2, CuO i Ag) w skali o grubości μg. Należy wykonać obliczenia, aby uzyskać początkowe stężenie 1 mg/ml na nanomateriał.
  2. Przenieś roztwory nanomateriałów do sonikatora i poddaj je sonikacji przez 16 minut przy użyciu kąpieli sonicyjnej (38 W) w celu uzyskania jednorodnego roztworu. Wykonać serię rozcieńczeń dla każdego nanomateriału przy 125, 62,5, 31,25, 15,625 μg/ml.
  3. Wyjąć komórki z inkubatora i lekko przemyć roztworem RT PBS. Po upewnieniu się, że wszystkie PBS zostały usunięte, dodać 100 μl zabiegów do płytki z kontrolami (pożywki hodowlane bez HIFS). Po zastosowaniu obróbki na komórkach inkubować z nanomateriałami w inkubatorze w temperaturze 37°C (5% CO2) przez 4 godziny; następnie użyj poniższego protokołu, aby określić ilościowo GSH: GSSG, stężenie białka i uwalnianie AK.

4. Protokół testu

  1. Po ekspozycji na leczenie (Rysunek 2A), oceń żywotność na podstawie aktywności kinazy adenylanowej (AK) (opcjonalnie). Użyj komercyjnego zestawu do tego testu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Obracaj płytki w wirówce o sile 200 x g przez 5 minut, aby lekko granulować granulki i resztki komórek (Rysunek 2B).
  3. Delikatnie usunąć 20 μl supernatantu pożywki z każdej próbki i dołka kontrolnego (jak określono powyżej) i pipetować do sąsiedniej 96-dołkowej białej płytki w tym samym układzie (Rysunek 2C).
  4. Do każdej studzienki dodać 100 μl roztworu roboczego z zestawu AK, osłonić płytkę przed światłem i pozostawić do rozwinięcia na 10 minut w temperaturze pokojowej. Rejestruj luminescencję za pomocą czytnika płytek z prędkością 1000 zliczeń/s.
  5. W przypadku wzorców GSH dodaj 40 μl całkowitego buforu glutationu do każdego dołka (Rysunek 2D; opcjonalny, wymagany do oceny ilościowej).
  6. Odessać pozostałe podłoża z płytki i przemyć 3x lodowatym 0,1 M PBS, pH 7,2, odrzucając każde przepłukanie (Rysunek 2E) z wyjątkiem wzorców. Pozostaw końcowe mycie w płytce, aż kalibracja GSH zostanie załadowana do płytki.
  7. Dodać 10 μl każdego stężenia glutationu i ślepą próbę (ddH2O) do studzienek w trzech powtórzeniach.
  8. Usuń końcowe płukanie PBS i dodaj mieszaniny do każdej studzienki, zgodnie z tabelą 2 dla pożądanej docelowej kwantyfikacji ( Rysunek 2E). Oblicz wymagane woluminy przed rozpoczęciem tego kroku ze względu na wrażliwą na czas utratę aktywności z pełnymi. Upewnij się, że te mieszaniny odczynników zostały przygotowane przed rozpoczęciem procesu oznaczania, ale nie pozwól, aby pozostały dłużej niż 30 minut przed użyciem.
  9. Umieść na wytrząsarce orbitalnej i pozwól płycie trząść się z prędkością 300 obr./min przez 2 minuty (Rysunek 2F).
  10. Wyjąć z wytrząsarki i dodać 5 μl 0,01 M roztworu TCEP do każdej studzienki, z wyłączeniem studzienki kontrolnej NEM. Umieść płytkę z powrotem w wytrząsarce i inkubuj przez 10 minut (Rysunek 2F).
  11. Przenieść płytkę do odwirowania i wirować przy 200 x g przez 5 minut. Przenieść 25 μl z każdej studzienki na próbkę do innej 96-dołkowej płytki (przezroczystej); zostanie ona wykorzystana do zagęszczenia białka (patrz krok 4.15 ; Rysunek 2G). Nie należy przenosić wzorców ani testów kontrolnych.
  12. Upewnij się, że końcowa objętość dla każdej studzienki wynosi 30 μL; usuń objętość z kontroli i wzorców, aby spełnić ten wymóg (Rysunek 2H).
  13. Dodać 170 μl działającego roztworu OPA do każdej studzienki, osłonić płytkę przed światłem i umieścić na wytrząsarce na 15 minut (Rysunek 2I).
  14. Odczyt fluorescencji za pomocą czytnika płytek w Ex340/Em450 (Rysunek 2J). Upewnij się, że na etapie pomiaru nie ma pęcherzyków powietrza; Będą one miały szkodliwy wpływ zarówno na reakcję, jak i na oznaczanie ilościowe za pomocą czytnika płytek.
  15. Aby określić ilościowo zawartość białka w lizowanych komórkach, użyj komercyjnego zestawu do oznaczania BCA. Przenieść próbki pobrane z kroku 4.12 na nową 96-dołkową płytkę (przezroczystą) w temperaturze 25 μl na studzienkę.
  16. Użyć wzorca albuminy surowicy bydlęcej (BSA) rozcieńczonego w buforze do lizy IP i dodać do płytki w trzech egzemplarzach w ilości 25 μl na studzienkę. Dokładne stężenia są określone w protokole zestawu BCA.
  17. Przygotować roztwór roboczy składający się w stosunku 50:1 odczynników A i B z zestawu BCA i dodać 200 μl do każdej studzienki zawierającej próbkę, wzorzec i kontrolę. Osłoń płytki przed światłem i inkubuj w temperaturze 37°C przez 30 minut (Rysunek 2K).
  18. Wyjąć próbki z inkubatora, pozostawić do zrównoważenia w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie odczytać absorbancję za pomocą czytnika płytek przy 562 nm (rysunek 2L).
Mieszanina odczynników do lizy o całkowitym stężeniu glutationu
składnikgłośność
Bufor do lizy50μL
Całkowita objętość / studzienka50μL
Mieszanina odczynników do lizy o utlenionym zatężeniu glutationu
składnikgłośność
Bufor do lizy49,5 μl
NEM (25mM)0,5 μl
Całkowita objętość / studzienka50μL
UŻYJ OBU ROZTWORÓW W CIĄGU 30 MINUT OD PRZYGOTOWANIA MIESZANINY
Komponent rozwiązania do wykrywania OPAgłośność
OPA 3mg/ml5μL
PBS (pH 9,0)165μL
Całkowita objętość / studzienka170μL

Tabela 2: Niezbędne ilości odczynników do wykonania protokołu. Wymagane objętości na studzienkę do oznaczenia całkowitego glutationu, dwusiarczku glutationu i odczynnika roboczego. Upewnij się, że obliczono wymagane woluminy i uwzględniono nadwyżkę, aby uwzględnić utratę woluminu w wyniku transferu.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Schematyczne przedstawienie protokołu. (A) Wstępny siew, inkubacja i obróbka komórek. (B) Odwirowanie w celu oddzielenia pożywek od zawiesin ciał stałych. (C) Transfer pożywki do testu kinazy adenylanowej. (D) Dodanie stężeń glutationu dla zakresu kalibracji. (E) Etapy przemywania i dodawania odczynnika do lizy. (F) Dodanie buforu i dodanie tris(2-karboksyetylo)fosfiny z etapem wytrząsania. (G) Odwirowanie zlizowanych komórek w celu usunięcia pożywki do analizy białek. (H) Usuwanie nośnika w celu wyrównania objętości na płycie. (I) Dodanie roztworu roboczego aldehydu ortoftalowego z inkubacją wstrząsającą. (J) Pomiar fluorescencji aldehydu ortoftalowego za pomocą czytnika płytek. (K) Etapy inkubacji do oznaczania kwasu bicynchoninowego do oznaczania białka. (L) Pomiar stężenia białka, pozwalający na normalizację glutationu: wartości dwusiarczku glutationu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z tym protokołem, linie komórkowe A549 i J774 zostały zasiane w gęstości odpowiednio 5 000 komórek/studnię i 10 000 komórek/studnię, a następnie hodowane w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 48 godzin. Analizę AK po poddaniu działaniu nanomateriałów przedstawiono w tabeli uzupełniającej 1, a stężenie białka przedstawiono w tabeli uzupełniającej 2.

Wykres kalibracji
Pokazane w Rysunek 3 to trzy kalibracje przy użyciu podanego zakresu stężeń (0,234 - 30 μM stężenie końcowe) z trzech oddzielnych płytek z trzech różnych typów komórek (choć nie powinny mieć wpływu na kalibrację) w trzech różnych, nienastępujących po sobie dniach. Podczas gdy pokazano 3 próbki, zaobserwowano N równe 12 i wykazano podobne regresje liniowe ze średnią wartością R2 wynoszącą 0,9932 ± 0,007.

figure-results-1
Rysunek 3: Wykresy kalibracji glutationu do testu. Trzy wykresy kalibracyjne z oddzielnych zakresów kalibracji glutationu w płytce, każda wykonana w odstępie tygodnia; słupki błędów ± SD (n=3, N=12) n=kontrpróby techniczne, N=kontrpróby biologiczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Przykładowe wyniki
Komórki HepG2, A549 i J774 wykorzystano do oceny różnych nanomateriałów podejrzanych o wywoływanie zmian w mechanizmach komórkowych poprzez stres oksydacyjny. Wykorzystano opisany protokół detekcji i kwantyfikacji.

Dane otrzymane z 3 pomiarów (AK, BCA i GSH/GSSG) zostały potraktowane w następujący sposób. W celu normalizacji wdrożono test AK i BCA; test AK, przy użyciu zalecanego zestawu, dostarczy najszybszych i najprostszych danych dotyczących ilości AK uwalnianego do pożywki komórkowej. Oczekuje się, że wzrost wartości AK zwiększy śmierć komórki. W związku z tym wymagana jest kontrolka -ve (Żywy) i +ve (Martwy). Pozwoli to na normalizację na podstawie procentów.

Test BCA jest dłuższym procesem, ale pozwoli na uzyskanie wymiernych wyników poprzez kwantyfikację białka (mg/mL). Nie wymaga to kontroli -ve lub +ve, jak w AK, ale nadal będzie wymagało ogólnej kontroli -ve (nieleczone komórki), aby umożliwić osiągnięcie normalizacji wartości.

W tej sekcji reprezentatywnych wyników stwierdzono, że leczenie (nanomateriały) miało potencjał do powodowania zakłóceń w teście AK. W związku z tym cała normalizacja została przeprowadzona przy użyciu danych BCA. W związku z tym informacje są przedstawiane jako stężenie wykrytych gatunków (GSH lub GSH+GSSG (jednak w celu uzyskania stężenia GSSG wykonuje się odjęcie stężenia GSH od całkowitego stężenia GSH+GSSG) na mg/ml białka (za pomocą testu BCA). W razie potrzeby można go następnie przekształcić w współczynnik, aby ocenić zmianę GSH: GSSG w stosunku do pożądanego leczenia.

Pokazane w Rysunek 4 to dane dotyczące stosunku GSH: GSSG z trzech różnych linii komórkowych (A549, J774 i HepG2) uzyskane przy użyciu protokołu OPA i znormalizowane do ekspresji białka przez BCA (μg/mL), dalsze dane określające dodatkowe wartości GSH i GSSG można znaleźć na rysunku uzupełniającym 1.

figure-results-2
Rysunek 4: Glutation: Stosunek dwusiarczku glutationu z przeprowadzenia testu. Pokazano stosunek glutationu: dwusiarczku glutationu w 3 liniach komórkowych, a mianowicie (A) A549, (B) J774 i (C) HepG2. Komórki inkubowano z zabiegami (różne nanomateriały w pożywkach bez surowicy) przez 4 godziny. Komórki zostały przetworzone przy użyciu tego protokołu w celu ilościowego określenia zmian w glutationie i dwusiarczku glutationu i znormalizowane za pomocą kwantyfikacji białek, słupków błędów ± SE (n = 3, N = 3) Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Tabliczka zawiera również szereg kontroli, aby upewnić się, że test przebiegł poprawnie. NEM jest dodawany jako pojedynczy komponent, aby wykazać brak interakcji z pożywką detekcyjną OPA. Wzorzec kalibracyjny wykazuje liniowy wzrost stężenia GSH, co świadczy o skutecznej zdolności odczynnika do wykrywania OPA do skutecznego wiązania się z rosnącymi stężeniami GSH.

Należy zauważyć, że ten test jest szczególnie ukierunkowany na wolne grupy sulfhydrylowe powszechnie występujące w tiolach (takich jak GSH, które są powszechnie uważane za przeciwutleniacze). Jedną z potencjalnych interakcji jest wiązanie OPA z tiolami białkowymi, co skutkowałoby niedokładnym gromadzeniem danych. W związku z tym test BCA jest kluczowym etapem normalizacji danych z białkiem i umożliwienia dokładnego odzwierciedlenia wolnego GSH.

Rysunek uzupełniający 1: Rysunki przedstawiające glutation, dwusiarczek glutationu i stosunek glutationu: dwusiarczek glutationu z 3 linii komórkowych, a mianowicie: (A) A549, (B) J774 i (C) HepG2. Komórki inkubowano z zabiegami (różne nanomateriały w pożywkach bez surowicy) przez 4 godziny. Komórki zostały przetworzone przy użyciu tego protokołu w celu ilościowego określenia zmian w glutationie i dwusiarczku glutationu i znormalizowane poprzez kwantyfikację białek, słupki błędów ± SE (n = 3, N = 3) Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Metadane wartości kinazy adenylanowej dla komórek A549 i J774. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Metadane wartości kwasu bicunchoninowego z kalibracją dla komórek A549, J774 i HepG2. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak już wspomniano, potrzeba zrozumienia redoks komórkowego, monitorowania stanów stresu oksydacyjnego i odpowiedzi antyoksydacyjnej zawsze miała kluczowe znaczenie dla zrozumienia i zapobiegania niezliczonym chorobom, takim jak nowotwory i neurodegeneracja33,34. Zademonstrowano tutaj sposób na ulepszenie krajobrazu translacyjnego poprzez zwiększenie dostępności dokładnego wykrywania GSH: GSSG przy szybkim, minimalnym przygotowaniu.

Protokół ten przedstawia wieloparametryczną sekwencję testów do oznaczania wewnątrzkomórkowych gatunków glutationu/tiolu (zredukowanych i utlenionych), z 2 sposobami normalizacji za pomocą testu białka BCA i / lub testu AK. Test ten można również zmodyfikować w celu wykrycia różnych innych markerów na początkowym etapie ekstrakcji mediatorem i można go uprościć w sposób, który po prostu da stosunek utlenionego / zredukowanego tiolu z wyłączeniem zakresu kalibracji.

Rozważając ocenę analitów, zbadano i porównano zarówno mBCI, jak i OPA pod kątem zastosowania. Podczas gdy mBCl początkowo wykazywał dobry potencjał sygnałowy, odkryto znaczne ograniczenia w użyciu. Przede wszystkim zastosowanie żywych komórek pokazuje najlepsze wykorzystanie mBCl; jednak po lizie komórek stwierdzono, że sygnał jest wygaszony i jest na ogół zmniejszony w formacie wielodołkowym w porównaniu z OPA35. Inną kwestią jest pomiar GSSG za pomocą mBCl, literatura na ten temat jest skąpa, a poprzez optymalizację/eksplorację protokołu nie udało się osiągnąć dokładnego wykrywania GSSG przez mBCl.

Wykazaliśmy, że test OPA przedstawia niezwykle wiarygodne zakresy kalibracji, ze średnią R2 wynoszącą 0,9932 ± 0,007 (N = 12) w zakresie stężeń 0,234 - 30 μM GSH. Zakres ten został wybrany ze względu na wcześniejsze zakresy referencyjne znalezione w literaturze35. Teoretycznie możliwe jest wykrycie glutationu poza tymi zakresami, ale będzie to wymagało modyfikacji stężenia odczynników, czasu inkubacji i potencjalnie sprzętu wykorzystywanego do wykrywania. Należy zauważyć, że każda tabliczka wymaga własnego standardowego zakresu do oznaczania ilościowego; Najmniejsza różnica w czasie pomiędzy płytami wykonywanymi w różnych dniach może mieć znaczący wpływ na wartości uzyskane podczas pomiaru.

Uzyskanie dokładnych i wiarygodnych danych z tego protokołu zależy od ścisłego przestrzegania kilku kluczowych kroków. Podczas konstruowania różnych wymaganych w protokole ważne jest, aby pH było dokładne. W związku z tym wymagające pH 9 nie powinny mieć odchylenia większego niż ± 0,1 tej wartości. Wynika to z możliwości wytrącania się składników buforowych z roztworu o niewłaściwym pH; Dokładne przestrzeganie tego protokołu zapobiegnie temu problemowi.

Całkowite usunięcie obróbki i dokładne mycie przed lizą mają również kluczowe znaczenie dla zapobiegania artefaktom i niedokładnemu pozyskiwaniu danych na etapie odczytu płytki. Po lizie komórek (krok 4.8) usunięcie leczenia nie jest możliwe, a płytki nie będzie można uratować. Ze względu na to, że objętości/odczynników dodawanych w całym protokole różnią się w zależności od próbki i wzorca, bardzo ważne jest, aby użytkownik był świadomy różnych objętości w kroku 4.12 i 4.13. Operator testu jest również informowany o tych zróżnicowanych objętościach i instruowany, aby upewnić się, że wszystkie objętości są takie same, aby umożliwić uzyskanie dokładnego pomiaru. Ponieważ objętości między próbkami a wzorcami nie są widocznie znaczące, łatwo jest popełnić błąd w odniesieniu do nadmiaru roztworu w studzience próbki.

Istnieją ograniczenia tego protokołu, które opierają się na kluczowych krokach, które mają kluczowe znaczenie dla uzyskania dokładnych i wiarygodnych danych. Użytkownicy wykonujący ten test muszą posiadać rozsądny poziom umiejętności laboratoryjnych, aby zapobiec niepożądanym problemom, takim jak tworzenie się pęcherzyków. Powstawanie pęcherzyków ma drastyczny wpływ zarówno na zdolność do zachodzenia reakcji w obrębie mikropłytki, jak i na pomiar fluorescencji. Środek lizujący zastosowany w tym protokole zawiera detergent, co stanowi trudność dla początkującego badacza, który może mieć trudności z zapobieganiem tworzeniu się pęcherzyków. Natychmiastowe odwirowanie może uratować ten błąd. Protokół jest również potencjalnie ograniczony pod względem typu komórki; Linie komórkowe A549, J774 i HepG2 zostały wykorzystane zarówno do optymalizacji, jak i generowania danych dla tego protokołu. Inne linie komórkowe mogą wymagać różnych gęstości wysiewu i optymalizacji protokołu w celu uzyskania dokładnych danych.

Protokół ten oferuje wiele zalet w porównaniu z kilkoma istniejącymi testami. Chociaż wykrywanie tioli za pomocą aldehydu ftalowego nie jest nową koncepcją, wykorzystanie w formacie testu kombinowanego, takiego jak ten, na mikropłytce, z ograniczonymi wymaganymi materiałami i sprzętem, oferuje wszystkim laboratoriom ogromny potencjał dostępu do tego protokołu. Większość zestawów Thiol/GSH od dostawców komercyjnych nie ujawnia składu swoich odczynników. W związku z tym może być trudno przewidzieć potencjalne niezgodności/zakłócenia. Poniżej przedstawiamy każdy składnik wszystkich stosowanych odczynników, aby ograniczyć ten potencjał.

Protokół ten jest również wykonywany dość szybko po zakończeniu początkowego okresu leczenia. Biorąc pod uwagę przetwarzanie przez użytkownika między etapami inkubacji, aspekt kwantyfikacji tiolu w tym protokole można przeprowadzić w czasie krótszym niż 1 godzina. Próbki są jednocześnie poddawane lizie i wiązane, aby zapobiec samoutlenianiu próbek, co jest optymalne dla tych rodzajów reakcji. Chociaż nie zostało to określone w protokole, próbki mogą być technicznie poddawane lizie na płytce i zamykane, co pozwala na ich zamrożenie do przyszłej analizy. Jednak ta zmiana w protokole nie została zbadana.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane przez europejskie projekty GRACIOUS (GA760840) i SUNSHINE (GA952924). Autorzy pragną również wyrazić uznanie dla wysiłków wszystkich tych, którzy w jakiś sposób przyczynili się do opracowania tego protokołu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 i mikro; m filtr (opcjonalnie-do buforu do lizy)Fisher scientific12561259
100mL kolba miarowaFisher scientific15290866
1L Kolba miarowa Fisher scientific15230876
Zlewka 250 ml (opcjonalnie - do buforu do lizy)8-kanałowascientific 15409083
(20-200 i mikro; L)SLSFA10011D2
8-kanałowa mikropipeta (2-20 i mikro; L)Płytki SLSB2B06492
96-dołkowe - czarne z przezroczystym dnem, Impregnowane TCFisher scientific10000631Preferowana płytka do wysiewu i fluorescencji, użyj przezroczystej płytki 96-dołkowej poddanej obróbce TC, jeśli nie są dostępne
Płytki 96-dołkowe - przezroczyste (TC poddane działaniu i niepoddane obróbce)Fisher Scientific10141161Jeśli czarne płytki z przezroczystym dnem nie są dostępne/odpowiednie zastosowanie: przezroczyste
płytki 96-dołkowe poddane działaniu TC - białe, Nie leczony TCFisher scientific11457009
Linia komórkowa A549 (rak płuc)ATCCCCL-185
Etanol absolutnyMerck (Sigma-Aldrich)1.08543
Folia aluminiowaFisher scientific11779408Do ochrony płytek przed światłem
Zestaw testowy BCAWirówka23225
( z wirnikiem 96-płytkowym)Eppendorf5804
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Merck (Sigma-Aldrich)E9884
Glutation (GSH)Merck (Sigma-Aldrich)G6013
Dwusiarczek glutationu (GSSG)Merck (Sigma-Aldrich)G4501
GlicerolMerck (Sigma-Aldrich)G5516
HCl, 37% Merck (Sigma-Aldrich)258148Rozcieńczyć do 1mM dla materiału GSH, dostosowanie pH również
linia komórkowa HepG2 (rak wątroby)ATCCHB-8065
IGEPAL  CA-630 Merck (Sigma-Aldrich)18896Użyj IGEPAL CA-630 lub NP-40 do roztworu, a nie obu
do lizy IP Fisher scientific11825135
Linia komórkowa J774 (monocyty, makrofagi)ATCCTIB-67
KClMerck (Sigma-Aldrich)P3911
KH2PO4 Mikropipeta Merck (Sigma-Aldrich)P0662
(20-200&mikro; L)SLSB2B06482
Mikropipeta (2-20 i mikro; L)SLSB2B06478
Wytrząsarka do mikropłytekVWR444-0041
Na2HPO4Merck (Sigma-Aldrich)S9763
NaClMerck (Sigma-Aldrich)S9888
NaOH, 10MMerck (Sigma-Aldrich)72068Tylko do regulacji pH
N-etylomaleimid (NEM)& nbsp;Merck (Sigma-Aldrich)E3876
NP-40Merck (Sigma-Aldrich)492016Do roztworu należy użyć IGEPAL CA-630 lub NP-40, a nie obu. Sugerowana alternatywa NP-40
Orto-dialdehyd ftalowy (OPA)Merck (Sigma-Aldrich)P1378
PBS 0,1 MMerck (Sigma-Aldrich)P2272PBS można nabyć wstępnie przygotowany lub wykonany we własnym zakresie, patrz uwagi
Czytnik płytek (o pojemności fluorescencji)TecanSPARK
Stir bar mieszający (opcjonalnie-Do buforu do lizy)Fisher scientific16265731
Zestaw do testów biologicznych Toxilight (test AK)LonzaLT17-217
Chlorowodorek tris(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP) 0,5M  w H2OAlfa AesarH51864Można również kupić skrystalizowany i zawieszony
TRIS-HClMerck (Sigma-Aldrich)93363
X100 fosfataza i koktajl proteazy 10025743naukowy Fishera
mikropipeta Fisher stołowa Thermo

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barnham, K. J., Masters, C. L., Bush, A. I. Neurodegenerative diseases and oxidative stress. Nat Rev Drug Discov. 3 (3), 205-214 (2004).
  2. Arfin, S., et al. Oxidative stress in cancer cell metabolism. Antioxidants. 10 (5), 642(2021).
  3. Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. The FASEB Journal. 17 (10), 1195-1214 (2003).
  4. Ghezzi, P., Jaquet, V., Marcucci, F., Schmidt, H. H. H. W. The oxidative stress theory of disease: levels of evidence and epistemological aspects. Br J Pharmacol. 174 (12), 1784-1796 (2017).
  5. Bhattacharyya, A., Chattopadhyay, R., Mitra, S., Crowe, S. E. Oxidative stress: An essential factor in the pathogenesis of gastrointestinal mucosal diseases. Physiol Rev. 94 (2), 329-354 (2014).
  6. Yin, F., Sancheti, H., Cadenas, E. Mitochondrial thiols in the regulation of cell death pathways. Antioxi Redox Sig. 17 (12), 1714-1727 (2012).
  7. Balcerczyk, A., Bartosz, G. Thiols are main determinants of total antioxidant capacity of cellular homogenates. Free Rad Res. 37 (5), 537-541 (2003).
  8. McBean, G. J. Cysteine, glutathione, and thiol redox balance in astrocytes. Antioxidants. 6 (3), 62(2017).
  9. Nimse, S. B., Pal, D. Free radicals, natural antioxidants, and their reaction mechanisms. RSC Adv. 5 (35), 27986-28006 (2015).
  10. Nordberg, J., Arnér, E. S. J. Reactive oxygen species, antioxidants, and the mammalian thioredoxin system1. Free Rad Biol Med. 31 (11), 1287-1312 (2001).
  11. Pham-Huy, L. A., He, H., Pham-Huy, C. Free radicals, antioxidants in disease and health. Int J Biomed Sci. 4 (2), 89(2008).
  12. Harris, I. S., DeNicola, G. M. The complex interplay between antioxidants and ROS in cancer. Trend Cell Biol. 30 (6), 440-451 (2020).
  13. Traverso, N., et al. Role of glutathione in cancer progression and chemoresistance. Oxid Med Cell Longev. 2013, 972913(2013).
  14. Day, R. M., Suzuki, Y. J. Cell proliferation, reactive oxygen and cellular glutathione. Dose-Resp. 3 (3), 425-442 (2005).
  15. Aquilano, K., Baldelli, S., Ciriolo, M. R. Glutathione: new roles in redox signaling for an old antioxidant. Front Pharmacol. 5, 196(2014).
  16. Zitka, O., et al. Redox status expressed as GSH: GSSG ratio as a marker for oxidative stress in paediatric tumour patients. Onco Lett. 4 (6), 1247-1253 (2012).
  17. Childs, S., Haroune, N., Williams, L., Gronow, M. Determination of cellular glutathione: glutathione disulfide ratio in prostate cancer cells by high performance liquid chromatography with electrochemical detection. J Chrom A. 1437, 67-73 (2016).
  18. Giustarini, D., et al. glutathione disulfide, and S-glutathionylated proteins in cell cultures. Free Rad Biol Med. 89, 972-981 (2015).
  19. Özyürek, M., et al. Determination of biothiols by a novel on-line HPLC-DTNB assay with post-column detection. Analytica Chimica Acta. 750, 173-181 (2012).
  20. Zhang, L., Lu, B., Lu, C., Lin, J. Determination of cysteine, homocysteine, cystine, and homocystine in biological fluids by HPLC using fluorosurfactant-capped gold nanoparticles as postcolumn colorimetric reagents. J Sep Sci. 37 (1-2), 30-36 (2014).
  21. Tsiasioti, A., Georgiadou, E., Zacharis, C. K., Tzanavaras, P. D. Development and validation of a direct HPLC method for the determination of salivary glutathione disulphide using a core shell column and post column derivatization with o-phthalaldehyde. J Chromat B. 1197, 123216(2022).
  22. Huang, D., Ou, B., Prior, R. L. The chemistry behind antioxidant capacity assays. J Agri Food Chem. 53 (6), 1841-1856 (2005).
  23. Berker, K. I., Güçlü, K., Tor, İ, Demirata, B., Apak, R. Total antioxidant capacity assay using optimized ferricyanide/prussian blue method. Food Anal Meth. 3 (3), 154-168 (2010).
  24. Rahman, I., Kode, A., Biswas, S. K. Assay for quantitative determination of glutathione and glutathione disulfide levels using enzymatic recycling method. Nat Prot. 1 (6), 3159-3165 (2007).
  25. Kampa, M., et al. A new automated method for the determination of the Total Antioxidant Capacity (TAC) of human plasma, based on the crocin bleaching assay. BMC Clin Pathol. 2 (1), 3(2002).
  26. Fernández-Checa, J. C., Kaplowitz, N. The use of monochlorobimane to determine hepatic GSH levels and synthesis. Anal Biochem. 190 (2), 212-219 (1990).
  27. Nauen, R., Stumpf, N. Fluorometric microplate assay to measure glutathione S-transferase activity in insects and mites using monochlorobimane. Anal Biochem. 303 (2), 194-198 (2002).
  28. Stevenson, D., Wokosin, D., Girkin, J., Grant, M. H. Measurement of the intracellular distribution of reduced glutathione in cultured rat hepatocytes using monochlorobimane and confocal laser scanning microscopy. Toxicol in vitro. 16 (5), 609-619 (2002).
  29. McBeth, C., Stott-Marshall, R. J. Interference of reversible redox compounds in enzyme catalysed assays–Electrochemical limitations. Anal Biochem. 662, 114972(2023).
  30. Yu, Z., et al. Reactive oxygen species-related nanoparticle toxicity in the biomedical field. Nanoscale Res Lett. 15 (1), 115(2020).
  31. Boyles, M., et al. Development of a standard operating procedure for the DCFH2-DA acellular assessment of reactive oxygen species produced by nanomaterials. Toxicol Mech Meth. 32 (6), 439-452 (2022).
  32. Segeritz, C. P., Vallier, L. Cell culture: Growing cells as model systems in vitro. Basic Sci Meth Clin Res. , 151-172 (2017).
  33. Ma, Q. Role of nrf2 in oxidative stress and toxicity. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 53, 401-426 (2013).
  34. Calabrese, V., Cornelius, C., Dinkova-Kostova, A. T., Calabrese, E. J., Mattson, M. P. Cellular stress responses, the hormesis paradigm, and vitagenes: novel targets for therapeutic intervention in neurodegenerative disorders. Antioxid redox Signal. 13 (11), 1763-1811 (2010).
  35. Ishkaeva, R. A., Zoughaib, M., Laikov, A. V., Angelova, P. R., Abdullin, T. I. Probing cell redox state and glutathione-modulating factors using a monochlorobimane-based microplate assay. Antioxidants. 11 (2), 391(2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Glutathione QuantificationOxidized GlutathioneReduced GlutathioneOrtho Phthalaldehyde AssayReactive Oxygen SpeciesProtein NormalizationFluorescence DetectionMammalian Cell CultureBicinchoninic Acid AssayCytotoxicity Assessment

Powiązane artykuły