Ułatwienie powtórnych iniekcji do tętnicy szyjnej w modelach mysich za pomocą nowatorskiej techniki naprawy miejsca wstrzyknięcia

Podsumowanie

Naprawa tętnicy wewnątrzszyjnej w modelu mysim po wstrzyknięciu przywraca przepływ krwi do tętnicy bez negatywnego wpływu na dystrybucję wstrzykniętego materiału. Naprawa miejsca wstrzyknięcia ułatwia kolejne wstrzyknięcia przez tę samą tętnicę i zapobiega niedokrwieniu mózgu u szczepów myszy, które nie mają pełnego koła Willisa.

Streszczenie

Biorąc pod uwagę ostatnie postępy w dostarczaniu nowych leków przeciwnowotworowych za pomocą wewnątrznaczyniowych metod selektywnego dostarczania dotętniczego w neuroonkologii, istnieje pilna potrzeba opracowania metod iniekcji dotętniczych w modelach mysich, w tym metod naprawy tętnicy szyjnej u myszy po wstrzyknięciu, aby umożliwić kolejne zastrzyki. Opracowaliśmy metodę iniekcji do tętnicy szyjnej w modelu mysim w celu dostarczenia leków do tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA) za pomocą dwóch alternatywnych procedur.

Podczas iniekcji, igła jest wprowadzana do tętnicy szyjnej wspólnej (CCA) po zawiązaniu szwu wokół tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA) i wstrzykiwane leki są dostarczane do ICA. Po wstrzyknięciu tętnica szyjna wspólna (CCA) może zostać podwiązana, co ogranicza liczbę wstrzyknięć do tętnicy szyjnej do jednego. Alternatywna procedura opisana w tym artykule obejmuje modyfikację, w której po wstrzyknięciu do tętnicy szyjnej następuje naprawa CCA w miejscu wstrzyknięcia, co przywraca przepływ krwi w CCA i pozwala uniknąć powikłań niedokrwienia mózgu obserwowanych w niektórych modelach mysich.

Porównaliśmy również dostarczanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego (BM-hMSC) do guzów wewnątrzczaszkowych, gdy są dostarczane przez wstrzyknięcie do tętnicy szyjnej z i bez naprawy miejsca wstrzyknięcia po wstrzyknięciu. Dostarczanie BM-hMSC nie różni się znacząco między tymi metodami. Nasze wyniki pokazują, że naprawa CCA w miejscu wstrzyknięcia pozwala na powtórne wstrzyknięcia przez tę samą tętnicę i nie upośledza dostarczania i dystrybucji wstrzykniętego materiału, zapewniając w ten sposób model o większej elastyczności, który bardziej naśladuje wstrzyknięcie do tętnicy szyjnej u ludzi.

Wprowadzenie

Dostarczanie leków na guzy mózgu jest trudne ze względu na nieprzepuszczalność bariery krew-mózg (BBB) i bariery krew-nowotwór (BTB). Bezpośrednie wstrzyknięcie do guza środków terapeutycznych w celu obejścia bariery krew-mózg można osiągnąć za pomocą cewnika zbiornikowego Ommaya, mikroinfuzji o niskim przepływie w celu wspomagania konwekcji lub miejscowego wstrzyknięcia do jamy reekcyjnej lub sąsiedniej tkanki¹. Jednak całkowita objętość tkanki nowotworowej, która jest osiągana za pomocą tych metod, jest ograniczona^2,3,4. Wstrzyknięcia dotętnicze były wcześniej stosowane do dostarczania środków terapeutycznych do guzów mózgu w celu dotarcia do większej liczby guzów^5,6,7^,8 a w ostatnich czasach postępy zarówno w technikach dostarczania dotętniczego, jak i nowych środkach terapeutycznych wykazały korzyści płynące z zastosowania tego podejścia w leczeniu guzów mózgu^{7, 9}. Postępy te obejmują opracowanie mikrocewników, wewnątrznaczyniowe selektywne podawanie dotętnicze (ESIA) z zaawansowanym obrazowaniem, stosowanie środków osmotycznych w celu przerwania bariery krew-mózg i BTB oraz opracowanie celowanych terapii biologicznych. W związku z tym, aby przeprowadzić badania przedkliniczne nowych środków terapeutycznych, które są podawane w iniekcjach dotętniczych, niezbędne są odpowiednie modele badań translacyjnych^9,10.

W mysich modelach guzów mózgu, środki terapeutyczne dostarczane dootrzewnowo lub dożylnie (przez żyłę ogonową) przechodzą odpowiednio przez wątrobę lub serce i płuca, zanim zostaną rozprowadzone do całego ciała, w tym do mózgu. Te efekty pierwszego przejścia mogą wychwytywać i usuwać czynnik lub rozcieńczać czynnik przed dotarciem do mózgu i mogą powodować toksyczność ograniczającą dawkę przed osiągnięciem dawki terapeutycznej w mózgu. W przeciwieństwie do tego, wstrzyknięcie do tętnicy szyjnej umożliwia skoncentrowane dostarczanie do mózgu przed krążeniem, omijając metabolizm pierwszego przejścia i ograniczając dostarczanie poza celem. Podczas gdy wstrzyknięcie do tętnicy szyjnej u myszy jest bardziej pracochłonne, specyficzność i powtarzalność tej techniki skutkują zmniejszeniem liczby zwierząt do ukończenia badań^11,12.

Ogólnie, w wcześniej opisanych metodach wstrzykiwania tętnicy szyjnej u myszy, tętnica szyjna wspólna jest podwiązywana po wstrzyknięciu, a krążenie do mózgu jest zapewnione przez przeciwległą tętnicę szyjną i tylne krążenie mózgowe poprzez koło Willisa^11,12. Metoda ta ma nieodłączne ograniczenie polegające na tym, że pozwala na maksymalnie pojedyncze wstrzyknięcie do tętnicy szyjnej wewnętrznej lub zewnętrznej. Bardzo ważne jest również, aby szczepy myszy używane w eksperymentach, w których tętnica szyjna jest podwiązana, miały pełny krąg Willisa, aby zapobiec niedokrwieniu mózgu z powodu podwiązanej tętnicy¹³. Wykazano również, że niedrożność tętnicy szyjnej zmniejsza przepływ krwi w mózgu i ogranicza dystrybucję wstrzykiwanych cząstek¹⁴. Ponadto niedrożność tętnicy szyjnej u myszy po wstrzyknięciu nie naśladuje wstrzyknięcia do tętnicy szyjnej u ludzi.

Nasza grupa wcześniej korzystała z iniekcji do tętnicy szyjnej, aby skutecznie dostarczać mezenchymalne komórki macierzyste do mózgu^{10,15,16,17,18,19}. W tym artykule szczegółowo opisujemy tę metodę iniekcji do tętnicy szyjnej i uwzględniamy modyfikację opracowanej przez nas metody, w której miejsce iniekcji jest naprawiane bez zamykania tętnicy, unikając ograniczeń wynikających z podwiązania tętnicy szyjnej po iniekcji. W tej metodzie tętnica szyjna wspólna (CCA) jest przygotowywana do wstrzyknięcia poprzez założenie dwóch szwów, po jednym na każdym końcu zamierzonego miejsca wstrzyknięcia, a dolny szew (poniżej miejsca wstrzyknięcia) jest zaciśnięty. Tętnica szyjna zewnętrzna (ECA) jest uszczelniana za pomocą innego szwu. Igła jest wprowadzana do CCA, a leki są dostarczane do tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA). Następnie górny szew na CCA jest zaciśnięty, aby zapobiec cofaniu się z ICA. Na tym etapie wstrzyknięte CCA może zostać podwiązane lub naprawione. Jeśli CCA ma być podwiązane, szwy są zaciskane i pozostawiane na miejscu. Jeśli miejsce wstrzyknięcia zostanie naprawione, szwy są usuwane po naprawie, a przepływ krwi zostaje przywrócony. Szczegółowe informacje na temat tych alternatywnych procedur znajdują się poniżej.

Protokół

Wszystkie kroki opisane poniżej są zgodne z naszym protokołem, który jest zgodny z wytycznymi ustalonymi i zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Teksańskim MD Anderson Cancer Center.

1. Przygotowanie stołu operacyjnego i myszy do zabiegu chirurgicznego

1. Przygotowanie stołu chirurgicznego i myszy do zabiegu chirurgicznego (patrz Rysunek 1A,B)
   1. Umieść mikroskop preparacyjny i źródło światła przed parownikiem izofluranu z aktywnym systemem oczyszczania lub umieść na stole zstępującym. Umieść elektryczną poduszkę grzewczą na podstawie mikroskopu preparacyjnego (lub najlepiej pod mikroskopem, jeśli podstawa jest solidna i może przepuszczać ciepło) i przykryj sterylną serwetą chirurgiczną.
      UWAGA: Wszystkie narzędzia chirurgiczne i obłożenia powinny być sterylizowane w autoklawie przed użyciem, a wszystkie materiały jednorazowego użytku powinny być sterylne i pakowane pojedynczo. Sterylne rękawice powinny być używane przez cały czas przygotowania i procedury oraz zmieniane w razie potrzeby, aby zachować sterylność.
   2. Przygotuj łóżko (4-5 cali długości x 2 cale szerokości) na serwety chirurgicznej za pomocą winylowej taśmy laboratoryjnej. Wytnij kwadrat gazy o wymiarach 1,5 cala x 1,5 cala, zwiń go ciasno, a zwiniętą gazę umieść pod 3-calowym kawałkiem taśmy winylowej u "wezgłowia" łóżka, aby utworzyć poduszkę (pochylenie głowy za pomocą poduszki pozwala na większe wydłużenie brzusznej części szyi).
   3. Połóż 4-calowe kawałki taśmy chirurgicznej wzdłuż boków łóżka (na wierzchu taśmy winylowej). [Jeśli używasz izofluranu, umieść stożek do znieczulenia nosa z przymocowanym ciężarkiem (lub taśmą) w pobliżu wezgłowia łóżka. Dostosuj go do określonego umieszczenia, gdy mysz jest znieczulona i unieruchomiona.] Zobacz Rysunek 1A,B.
   4. Za pomocą wkrętaka do igieł lub ciężkich kleszczy oderwij małe kawałki bawełny od wacika i zwiń w kulki o różnych rozmiarach o średnicy od 0,5 do 1 mm (8-10 kawałków bawełny na mysz). Trzymaj bawełnę na serwety chirurgicznej w pobliżu wezgłowia łóżka.
   5. Za pomocą sterylnych narzędzi przetnij nić 6-0 do szwów na 1 cm kawałki (3-4 sztuki na mysz). Przygotowane odcinki szwów należy umieścić na sterylnym serwecie. Przygotować strzykawkę o pojemności 1 ml do podania buprenorfiny lub innego odpowiedniego środka przeciwbólowego (zatwierdzonego przez protokół Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt [IACUC]). Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne zgodnie ze standardami IACUC przed umieszczeniem ich w sterylnym polu.
2. Przygotowanie myszy do zabiegu chirurgicznego (patrz Rysunek 1C-F)
   1. Znieczulić jedną mysz zgodnie z metodami zatwierdzonymi przez IACUC do dużych operacji przeżycia (użyć izofluranu 1%-4%, w zależności od wrażliwości poszczególnych myszy, lub koktajlu 10 mg / ml ketaminy, 1 mg / ml ksylazyny w 100-200 mg / kg (ketaminy) masy ciała). Przytnij futro lub depilate, jeśli to konieczne. Podawać 0,5-1,0 mg/kg buprenorfiny ER (o przedłużonym uwalnianiu) we wstrzyknięciu podskórnym 30 minut przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego.
   2. Ustaw znieczuloną mysz tak, aby poduszka spoczywała pod szyją (Rysunek 1C). Poduszka pomaga przedłużyć i podeprzeć szyję, gdy jest używana ze stożkiem do znieczulenia. Jeśli używasz koktajlu ketaminy/ksylazyny, umieść obciążoną listwę do zębów lub podobne narzędzie w ustach, za siekaczami, aby przechylić głowę i wyprostować szyję.
   3. Unieruchomić kończyny przednie za pomocą taśmy chirurgicznej umieszczonej wcześniej wzdłuż boków łóżka chirurgicznego (Ryc. 1D). Dostosuj pozycję myszy pod mikroskopem tak, aby brzuszna powierzchnia szyi była widoczna i dostosuj powiększenie, aby wygodnie obserwować pole operacyjne (Rysunek 1E).
      UWAGA: Powiększenie mikroskopu preparacyjnego powinno być dostosowane przez chirurga do jego poziomu komfortu dla każdego kroku.
   4. Nałóż sztuczne łzy za pomocą sterylnego bawełnianego wacika. Zdezynfekuj miejsce operowane, naprzemiennie używając okrągłych wacików z betadyną lub chlorheksydyną i alkoholem trzy razy na środek dezynfekujący (Rysunek 1F).
   5. Potwierdź głębokość znieczulenia, upewniając się, że mysz nie chowa nogi w odpowiedzi na uszczypnięcie palca. Monitoruj częstość oddechów i upewnij się, że mysz nie sapie, ponieważ jest to oznaką nadmiernego znieczulenia podczas stosowania izofluranu. W razie potrzeby należy dostosować natężenie przepływu tlenu i izofluranu, aby osiągnąć odpowiednią głębokość znieczulenia i równomierne oddychanie.

2. Zabieg chirurgiczny (Rysunek 2, Rysunek 3, Rysunek 4, Rysunek 5, Rysunek 6, oraz Rysunek 7)

1. Pierwotne nacięcie i rozwarstwienie
   1. Zacznij od wykonania 1 cm podłużnego nacięcia w linii środkowej, zaczynając od czaszki do manubrium (wystający guzek na końcu czaszki mostka) i kontynuuj nad tchawicą za pomocą sterylnego ostrza skalpela lub podobnego narzędzia, zgodnie z zatwierdzonymi przez użytkownika wytycznymi IACUC (Rysunek 2A).
   2. Włóż końcówkę zamkniętych nożyczek do nacięcia i delikatnie je otwórz, aby wykonać wypreparowanie podskórnej tkanki łącznej, oddzielając dwa gruczoły ślinowe. Za pomocą cienkich kleszczyków delikatnie przeciągnij prawy gruczoł ślinowy przez nacięcie, aby spoczęł na aseptyki przygotowanej powierzchni skóry lub cofnij gruczoł ślinowy na boki za pomocą zwijacza hakowego (Rysunek 2B, C). Jeśli zewnętrzny gruczoł wydaje się suchy lub lepki, zwilż go sterylnym roztworem soli fizjologicznej.
   3. Kontynuuj rozwarstwianie tkanki łącznej, aż mięśnie mostkowo-obojczykowo-sutkowe i dwubrzuścowe będą widoczne (Rysunek 2D).
      UWAGA: Trójkąt mięśniowy utworzony przez mięsień tchawicy / mostkowo-gnykowy (sh), mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy (sm) i mięsień dwubrzuścowy (dg) (brzuch ogonowy) zostanie wykorzystany do zlokalizowania prawego CCA i rozwidlenia tętnicy szyjnej w protokole. Ogólnie rzecz biorąc, mniejszy mięsień omohyoidalny (oh) można również zobaczyć leżący poprzecznie w poprzek CCA (Ryc. 2D); Jednak mięsień ten różni się wielkością i nierzadko zdarza się, że mięsień omohyoidalny jest całkowicie nieobecny u młodych lub małych myszy.
2. Izolacja CCA
   1. Używając kleszczyków z kątową końcówką, kontynuuj ostrożne preparowanie tkanki łącznej (otwierając końcówki kleszczy) w pobliżu ogonowego końca trójkąta mięśniowego, aby odsłonić tętnicę szyjną wspólną, żyłę szyjną i nerw błędny.
      UWAGA: Tętnica szyjna wspólna jest największym naczyniem krwionośnym przylegającym do tchawicy i generalnie można ją łatwo zidentyfikować u podstawy trójkąta mięśniowego (Rysunek 2E, strzałka). Zachowaj szczególną ostrożność z cienkimi kleszczami wokół naczyń krwionośnych, ponieważ końcówki mogą łatwo naciąć naczynia, powodując nadmierne i potencjalnie śmiertelne krwawienie.
   2. Kontynuuj staranne preparowanie tkanki łącznej wokół części wspólnej tętnicy szyjnej od podstawy trójkąta mięśniowego aż do mięśnia omohyoidalnego. Użyj małych, sterylnych wacików, aby zatamować drobne krwawienie i w razie potrzeby wchłonąć wydzielane płyny z gruczołów ślinowych.
   3. Ostrożnie wypreparuj tkankę łączną, aby oddzielić CCA od nerwu błędnego. Zachowaj szczególną ostrożność, aby zminimalizować obchodzenie się i uszkodzenie nerwu błędnego, łatwo identyfikowanego jako gruby, biały pęczek nerwowy przylegający do CCA (Rysunek 2F).
3. Przygotowanie CCA
   1. Gdy CCA zostanie całkowicie zmobilizowane od mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego, a tam, gdzie jest widoczny, aż do mięśnia omohyoidalnego, umieść 1 cm kawałek szwu 6-0 na aseptycznie przygotowanej skórze mostka myszy (dla łatwego wydobycia) i przełóż kleszcze z kątową końcówką pod CCA (uważając, aby odizolować CCA od nerwu błędnego i żyły szyjnej) (Rysunek 3A). Jeśli mięsień omohyoidalny nie jest obecny, należy oczyścić obszar wokół CCA na tyle, aby możliwe było założenie szwów na CCA, czaszkę i ogon do proponowanego miejsca wstrzyknięcia i wprowadzenie igły.
   2. Z cienkimi kleszczami w lewej ręce, przełóż szew do kleszczyków z kątową końcówką, chwytając w pobliżu końca szwu. Delikatnie przeciągnij połowę długości szwu pod CCA za pomocą kleszczyków z kątową końcówką (Rysunek 3B).
   3. Powtórz ten proces z drugim szwem, równolegle do pierwszego szwu (Rysunek 3C).
   4. Luźno zawiąż każdy szew wokół CCA, ale nie zaciskaj węzłów ani nie ograniczaj przepływu krwi (Rysunek 3D).
4. Izolacja i przygotowanie tętnicy szyjnej zewnętrznej
   1. Za pomocą kleszczyków z kątową końcówką ostrożnie usuń tkankę łączną na czaszkowym końcu trójkąta mięśniowego, czaszkowego do mięśnia omohyoidalnego, aby zlokalizować CCA i rozwidlenie na ECA i ICA (Rysunek 4A).
      UWAGA: ECA jest pochylony w kierunku linii środkowej i jest nieco bardziej powierzchowny, podczas gdy ICA pochyla się na boki i przesuwa się głębiej w szyję. Należy zachować szczególną ostrożność, aby zapobiec uszkodzeniu nerwu podjęzykowego (HN) przechodzącego przez ICA tuż nad rozwidleniem.
   2. Ostrożnie usunąć tkankę łączną ze wszystkich stron ECA w pobliżu rozwidlenia. Po usunięciu wystarczającej ilości tkanki łącznej z ECA należy umieścić kawałek szwu na asepcie przygotowanej skórze na mostku myszy i wprowadzić kleszcze z kątową końcówką pod ECA. Trzymając cienkie kleszczyki w lewej ręce, przełóż szew do kleszczyków z uchyloną końcówką w przestrzeni między ICA a ECA i delikatnie przeciągnij połowę długości szwu przez (Rysunek 4B). Luźno zawiąż szew wokół ECA, ale nie zaciskaj węzła.
      UWAGA: Ważne jest, aby usunąć wystarczającą ilość tkanki łącznej z ECA, aby można było chwycić szew kleszczami z kątową końcówką bez przypadkowego chwytania tkanki łącznej otaczającej tętnice, powodując uszkodzenie tętnic podczas pobierania szwu.
5. Przygotowanie igły i strzykawki
   UWAGA: Na tym etapie wstrzyknięcie można wykonać za pomocą prostej igły, co pozwala na oparcie strzykawki o ciało myszy i ustabilizowanie jej przez nie (Rysunek 5A). Alternatywnie, wstrzyknięcie można wykonać za pomocą igły, która jest zgięta w pobliżu końcówki, co pozwala na trzymanie strzykawki jak ołówka z ręką spoczywającą na stole operacyjnym (Rycina 5B). Obie techniki działają dobrze, a wybór techniki jest osobistymi preferencjami.
   1. Aby przygotować wygiętą igłę, przytrzymaj igłę o wadze 33 G, 1/2 cala skosem skierowanym do góry i chwyć końcówkę sterylnym wkrętakiem do igieł (Rysunek 5C). Zegnij igłę o około 30-40° bezpośrednio w kierunku skosu (Rysunek 5D).
   2. Napełnić strzykawkę odpowiednią objętością roztworu, który ma być wstrzyknięty (należy pamiętać o uwzględnieniu przestrzeni w ubytku igły, jeśli roztwór do wstrzykiwań nie jest pobierany przez igłę w celu naładowania strzykawki). Założyć igłę i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Upewnić się, że menisk roztworu jest widoczny na skosie igły.
6. Iniekcja do tętnicy szyjnej
   1. Zaciśnij węzeł szwu wokół ECA. Następnie przesuń dolny szew na CCA w dół w kierunku mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego tak daleko, jak to możliwe i zaciśnij węzeł. Upewnij się, że górny szew na CCA pozostaje luźny do momentu wstrzyknięcia. Umieścić sterylny wacik na krawędzi jamy, aby wchłonął wydzielany płyn i krew podczas wstrzyknięcia.
   2. Trzymając strzykawkę w prawej ręce i cienkie kleszcze w lewej ręce, przyłóż igłę do tętnicy bezpośrednio nad dolnym szwem na CCA. Za pomocą cienkich kleszczyków delikatnie pociągnij luźny koniec dolnego szwu w kierunku ogonowym, aby nadać niski poziom napięcia CCA (Rysunek 6A).
   3. Włóż igłę do CCA tuż za skosem i powoli zwolnij napięcie z szwu (Rysunek 6B).
      UWAGA: Tętnica ma znaczny przepływ krwi i prawdopodobnie będzie krwawić do jamy chirurgicznej po wprowadzeniu igły. Jednak po wprowadzeniu igły za skos tętnica utworzy uszczelnienie wokół igły, a krwawienie zostanie zatrzymane. Ciągłe krwawienie z założoną igłą wskazuje, że igła nie jest wystarczająco głęboko w tętnicy (przerwa od skosu umożliwia przepływ krwi) lub że igła została wepchnięta przez tylną część tętnicy. Ważne jest, aby trzymać igłę bardzo nieruchomo, aby nie rozerwać tętnicy lub nie dopuścić do wysunięcia się igły. Należy stale monitorować zwierzęta, u których wystąpiły krwotoki, a jeśli krwawienie jest znaczne (np. gdy zwierzę traci zabarwienie, wydaje się sine, staje się chłodne w dotyku lub jakikolwiek inny humanitarny punkt końcowy opisany w protokole stosowania zwierząt), konieczne jest zastosowanie humanitarnych punktów końcowych.
   4. Lewą ręką popchnij tłok strzykawki, aby bardzo powoli wstrzyknąć roztwór (Rysunek 5B, nie mniej niż 15 sekund, aby wstrzyknąć 100 μl roztworu). Nie należy wyjmować igły po zakończeniu wstrzykiwania roztworu. Aby zapobiec cofaniu się, za pomocą cienkich kleszczyków w lewej ręce, chwyć górny szew na CCA (nadal luźno zawiązany) za węzeł i unieś, aby zgiąć tętnicę (Ryc. 6C).
   5. Wyjąć igłę, odłożyć strzykawkę na bok i prawą ręką podnieść kleszcze z końcówką kątową. Utrzymując załamanie w tętnicy, zaciśnij węzeł w górnym szwie na CCA (Rysunek 6D).
      UWAGA: W tym momencie nie powinno być dodatkowego krwawienia do jamy operacyjnej. Po tym kroku istnieją dwie alternatywne procedury opisane w krokach 2.7 i 2.8 poniżej. Jeśli CCA ma być podwiązane, wykonaj krok 2.7. Jeśli CCA ma zostać naprawione w miejscu wstrzyknięcia, należy postępować zgodnie z modyfikacją wymienioną w kroku 2.8.
7. Podwiązanie CCA
   1. W przypadkach, które nie wymagają przywrócenia krążenia do CCA, należy pozostawić tętnicę podwiązaną, pozostawiając oba szwy zaciśnięte na CCA. Przytnij końce szwów i upewnij się, że węzły szwów są całkowicie zaciśnięte.
   2. Przejdź do procedur zamykania i znieczulania opisanych w kroku 2.9.
8. Alternatywa dla podwiązania CCA-Miejsce iniekcji Naprawa i przywrócenie krążenia
   1. Za pomocą sterylnych wacików wchłonąć resztki krwi w jamie operacyjnej. Zlokalizuj miejsce wstrzyknięcia na CCA (Rysunek 7A) i określ liczbę szwów potrzebnych do zamknięcia. Dokładnie przepłukać miejsce wstrzyknięcia i światło izolowanego obszaru CCA, aby usunąć zakrzepłą krew.
   2. Za pomocą kleszczyków z kątową końcówką chwyć igłę do szwów 9-0 za korpus igły w pobliżu włóczenia. Używając cienkich kleszczyków do podparcia tętnicy z przeciwnej strony, umieść pojedynczy szew w CCA, penetrując ścianę tętnicy około 1-1,5 mm bocznie do miejsca wstrzyknięcia, prostopadle do tętnicy. Przytrzymaj tętnicę cienkimi kleszkami, otwierając miejsce wstrzyknięcia i przepuszczając igłę i szew indywidualnie przez prawą i lewą stronę. Alternatywnie, przytrzymaj tętnicę, delikatnie ściskając boki razem cienkimi kleszkami, przechodząc przez igłę i zszyj przez obie strony tętnicy jednym ugryzieniem.
      UWAGA: W przypadku każdej techniki należy uważać, aby igła i szew nie przebiły tylnej ściany wewnątrz tętnicy, ponieważ spowoduje to zamknięcie światła po zaciśnięciu.
   3. Zamknij miejsce wstrzyknięcia węzłem chirurgicznym, wykonując wiązanie narzędzi za pomocą cienkich kleszczy i kleszczyków z końcówką kątową, używając co najmniej czterech rzutów (Ryc. 7B). Ogólnie rzecz biorąc, należy użyć pojedynczego prostego przerwanego szwu, aby zamknąć miejsce wstrzyknięcia igły 33 G.
   4. Aby przywrócić krążenie za pomocą cienkich kleszczy, rozwiąż i usuń szew wokół ECA, a następnie górny szew na CCA (Rysunek 7C,D). Następnie powoli poluzuj dolny szew na CCA, ale nie rozwiązuj go od razu. Upewnij się, że miejsce wstrzyknięcia jest wystarczająco zamknięte, aby zapobiec poważnemu krwawieniu z przywróconym ciśnieniem i przepływem krwi (Rysunek 7D).
      UWAGA: Jeśli w miejscu wstrzyknięcia wystąpi duże krwawienie, dolny szew na CCA można szybko ponownie zacisnąć, a miejsce wstrzyknięcia można w razie potrzeby wyregulować lub ponownie zszyć.
   5. Usuń górne i dolne szwy CCA (Rysunek 7E). Przejdź do kroku 2.9.
9. Zamykanie i analgezja
   1. Zmień położenie ślinianki w jamie i zamknij nacięcie trzema prostymi przerwanymi szwami za pomocą sterylnego zestawu szwów. Usuń ograniczniki taśmy chirurgicznej i pozwól myszy dojść do siebie po znieczuleniu na poduszce grzewczej.
      UWAGA: Kolejne dawki leków przeciwbólowych powinny być podawane zgodnie z częstością i dawką określoną w zatwierdzonym przez użytkownika protokole IACUC. Zaleca się, aby okres gojenia między wstrzyknięciami wynosił jeden tydzień. Jeśli konieczne jest powtórzenie wstrzyknięć, po pierwszym wstrzyknięciu można zastosować naprawę miejsca wstrzyknięcia, a tę samą procedurę chirurgiczną można zastosować przy kolejnych wstrzyknięciach. Kolejne wstrzyknięcie można podać do czaszki CCA do naprawionego miejsca wstrzyknięcia, ponieważ wielokrotne szycie w celu naprawy tego samego miejsca wstrzyknięcia prawdopodobnie doprowadzi do bliznowacenia i zakrzepów krwi.

Wyniki

Poprzednie raporty wykazały, że ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące ze szpiku kostnego (BM-hMSC) dostarczane przez wstrzyknięcie do tętnicy szyjnej z powodzeniem zadomowiły się w glejakach wewnątrzczaszkowych u myszy¹⁹. Zastosowaliśmy ten model do porównania efektów podwiązania CCA w porównaniu z naprawą CCA z przywróconym krążeniem po wstrzyknięciu BM-hMSC do tętnicy szyjnej u myszy z glejakiem. Nagim myszom atymicznym wszczepiono komórki glejaka U87, a następnie wstrzyknięto BM-hMSC znakowane GFP, a następnie podwiązano CCA lub naprawę CCA z przywróconym krążeniem. Po 3 dniach myszy uśmiercono, a mózgi zebrano, utrwalono i przeprowadzono immunohistochemię w celu wykrycia GFP, a następnie policzono komórki GFP dodatnie (Figura 8A-D).

Ogólne naprowadzanie GFP-BM-hMSC do glejaków wewnątrzczaszkowych oceniano na podstawie całkowitej liczby komórek GFP-dodatnich w obrębie granicy guza na dwóch różnych szkiełkach (sekcje oddalone od siebie o >75 μm) z tej samej próbki. Porównanie średnich za pomocą niesparowanego testu >t sugerowało, że nie ma znaczącej różnicy między średnim bazowaniem obserwowanym między dwiema procedurami (P = 0,6858) (Rysunek 8E). Dyspersję GFP-BM-hMSC w guzie oceniano, zliczając komórki GFP-dodatnie w 10 polach o dużej mocy w guzie. Zwiększona liczba komórek w polach o dużej mocy może wskazywać na zmiany w rozproszeniu komórek w guzie wynikające ze zmian w procedurze. Porównanie wartości mediany za pomocą testu Wilcoxon Signed Rank wykazało, że nie było znaczącej różnicy między medianą liczby komórek GFP-dodatnich w polach o dużej mocy między ligacją CCA a grupami naprawczymi CCA (Rysunek 8F).

Rysunek 1: Przygotowanie stołu chirurgicznego i myszy do operacji. (A,B) Łóżko chirurgiczne (etykiety A. Taśma winylowa tworząca łóżko, B. Taśma chirurgiczna krępująca kończyny przednie, C. Poduszka, D. Waga, E. Stożek nosowy anestezjologiczny, F. zwijacz, G. Szwy 1 cm w 70% etanolu, H. Kleszcze cienkie, I. Kleszcze z kątową końcówką, J. Wąskie nożyczki, K. Sterylne waciki). (C,D) Ustawianie myszy. (E,F) Pole operacyjne i dezynfekcja pola operacyjnego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Nacięcie i odsłonięcie struktur w miejscu wstrzyknięcia. (A) Nacięcie linii środkowej. (B,C) Retrakcja prawego ślinianka. (D) Widoczny jest również trójkąt mięśniowy utworzony przez mięsień tchawicy / mostkowo-gnykowy, mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy i mięsień dwubrzuścowy, mięsień omohyoidalny. (E) Tętnica szyjna wspólna, oznaczona strzałką. (F) Nerw błędny i tętnica szyjna wspólna, oznaczone strzałkami. Skróty: sh = tchawica/mięsień mostkowo-gnykowy; sm = mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy; DG = mięsień dwubrzuścowy; oh = mięsień omohyoidalny; CCA = tętnica szyjna wspólna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Przygotowanie CCA do wstrzyknięcia. (A) Kleszcze z kątową końcówką przepuszczone pod CCA. (B) Szew został wciągnięty do połowy pod CCA za pomocą kleszczy z kątową końcówką. (C) Drugi szew został wciągnięty do połowy pod CCA. (D) Zszyte wiązane luźnymi knowami wokół CCA. Skrót: CCA = tętnica szyjna wspólna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Izolacja i przygotowanie tętnicy szyjnej zewnętrznej. (A) CCA, tętnica szyjna zewnętrzna i tętnica szyjna wewnętrzna. (B) Szew przeciągnięty do połowy w ramach ECA. Skróty: CCA Tętnica szyjna wspólna; ECA = tętnica szyjna zewnętrzna; ICA = tętnica szyjna wewnętrzna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Przygotowanie igły i strzykawki. (A) Wstrzyknięcie prostą igłą ze strzykawką przylegającą do ciała myszy. (B) Wstrzyknięcie za pomocą zgiętej igły, z ręką spoczywającą na stole operacyjnym. (C,D) Przygotowanie wygiętej igły. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Wstrzyknięcie do tętnicy szyjnej. (A) Górny szew jest luźny, dolny szew jest zaciśnięty na CCA, igła jest umieszczona powyżej dolnego szwu. (B) Igła jest wprowadzana tuż za skosem, tętnica jest uszczelniona wokół igły. (C) Górny szew jest podnoszony, aby zagiąć tętnicę w górę i zapobiec cofaniu się. (D) Górny szew na CCA jest zaciśnięty. Skrót: CCA = tętnica szyjna wspólna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Naprawa miejsca wstrzyknięcia i przywrócenie krążenia. (A) Miejsce wstrzyknięcia oznaczone strzałką. (B) Miejsce wstrzyknięcia zamknięte węzłem chirurgicznym, minimum cztery rzuty. (C,D) Poluzowanie szwów górnych i dolnych na CCA po naprawie miejsca iniekcji; Brak krwawienia po poluzowaniu szwów. (E) Szwy są usuwane po ustaleniu, że miejsce wstrzyknięcia jest wystarczająco naprawione. Skrót: CCA = tętnica szyjna wspólna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Wstrzyknięcie GFP-BM-hMSC do tętnicy szyjnej i porównanie naprowadzania do guzów glejaka wewnątrzczaszkowego po podwiązaniu CCA lub naprawie CCA z przywróconym krążeniem. Skrawki tkanki mózgowej myszy z guzem wybarwiono pierwotnymi przeciwciałami anty-GFP i drugorzędowymi przeciwciałami anty-GFP 488 w celu znakowania GFP-BM-hMSC (zielony). Jądra barwiono farbą Hoechst 33342 (niebieską). Reprezentatywne pola małej mocy znakowanych odcinków pokazujące ogólne naprowadzanie na guz i pola dużej mocy pokazujące rozkład komórek GFP-dodatnich po naprawie (A,C) CCA lub (B,D) ligacji CCA. (E) Ogólne naprowadzanie GFP-BM-hMSC na guzy oceniano na podstawie całkowitej liczby komórek GFP-dodatnich w granicach guza na dwóch różnych szkiełkach, a średnie porównano za pomocą testu t. Nie zaobserwowano istotnej różnicy w ogólnym bazowaniu między alternatywnymi procedurami (P = 0,6858). (F) Dyspersję GFP-BM-hMSC w guzie oceniano poprzez zliczanie komórek GFP-dodatnich w 10 polach o dużej mocy w guzie. Porównanie wartości mediany za pomocą testu Wilcoxon Signed Rank nie wskazuje na istotną różnicę między osobami, niezależnie od procedury (P = 0,1914, 0,5000, 0,1641, 0,9512, 0,8828, 0,2207). Skróty: GFP = zielone białko fluorescencyjne; GFP-BM-hMSCs = ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące ze szpiku kostnego znakowane GFP; CCA = tętnica szyjna wspólna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Iniekcje do tętnicy szyjnej są coraz częściej stosowane w ostatnich latach w celu dostarczania leków na guzy mózgu. W związku z tym ważne jest, aby w celach badawczych ustalić modele mysie, które odzwierciedlają wstrzyknięcia do tętnicy szyjnej u ludzi. Wcześniej iniekcje do tętnicy szyjnej u myszy wykonywano z późniejszym podwiązaniem tętnicy, co ogranicza liczbę wstrzyknięć do tętnicy^11,12. Ponadto niedrożność tętnicy szyjnej u myszy może prowadzić do niedokrwienia mózgu u niektórych szczepów myszy, które nie mają pełnego koła Willisa¹³. Opracowaliśmy metodę naprawy wstrzykniętej tętnicy szyjnej, aby przezwyciężyć ograniczenia poprzednich metod. Naprawa miejsca wstrzyknięcia powoduje przywrócenie przepływu krwi do wstrzykniętej tętnicy, zmniejszenie ryzyka niedokrwienia mózgu i ułatwienie kolejnych wstrzyknięć do tej samej tętnicy szyjnej wewnętrznej.

Kilka kroków, które mają kluczowe znaczenie dla sukcesu, wymaga starannego obchodzenia się z narzędziami chirurgicznymi lub tkankami, które obejmują: prawidłowe wprowadzenie igły do światła tętnicy, aby uniknąć krwawienia podczas wstrzyknięcia do tętnicy szyjnej; staranne wypreparowanie tkanki łącznej z miejsca wstrzyknięcia przed wkłuciem igły; usunięcie wszystkich grudek i pęcherzyków powietrza ze strzykawki i igły przed wstrzyknięciem; i prawidłowe zamknięcie miejsca wstrzyknięcia, aby zapobiec zamknięciu światła tętnicy podczas naprawy. Aby zapobiec krwawieniu po wkłuciu igły, należy upewnić się, że igła została wprowadzona do tętnicy za skosem, aby utworzyć uszczelnienie wokół trzonu igły. Aby uniknąć rozdarcia tylnej ściany tętnicy, należy wprowadzić igłę pod płytkim kątem i delikatnie odchylić strzykawkę i igłę do tyłu, aby końcówka igły nie przylegała do tylnej ściany tętnicy. Jeśli wstrzyknięty roztwór wycieknie podczas wstrzyknięcia, sugeruje to, że igła została wprowadzona tylko do tkanki łącznej otaczającej tętnicę; Staranne wypreparowanie nadmiaru tkanki łącznej z miejsca wstrzyknięcia przed wstrzyknięciem zapobiegnie temu problemowi.

Jeśli chodzi o wybór techniki szwu i zamykania, jeśli w początkowym wstrzyknięciu użyto igły 33 G i wykonano czyste wprowadzenie do tętnicy, jeden prosty szew ze szwem 9-0 wystarczy do naprawy tętnicy. Jeśli do wstrzykiwania używa się większej igły (30 G itp.) lub podczas wprowadzania igły dochodzi do rozdarcia (np. gdy igła jest przesunięta lub tętnica porusza się, ponieważ mysz oddycha), powoduje to powstanie nieco większej, którą należy naprawić. Dwa proste szwy lub ósemka zwykle wystarczają do naprawy tego typu większego otworu. Wybór między tymi dwiema technikami opiera się na preferencjach chirurga w tej sytuacji. Należy zauważyć, że technika naprawy nie została oceniona w sytuacjach, w których otwór w miejscu iniekcji jest znacznie większy niż w sytuacji opisanej powyżej. Jeśli rozdarcie w miejscu wstrzyknięcia rozciąga się na boki (tworząc szerszy otwór, większy niż jedna trzecia obwodu tętnicy), naprawa tą metodą może spowodować skurcz tętnicy i zwiększone ryzyko zakrzepicy.

Jeśli podczas zdejmowania szwów występuje krwawienie z naprawionego miejsca wstrzyknięcia, może to być spowodowane rozciąganiem naprawionego miejsca w miarę wznawiania normalnego krążenia; Można to naprawić, delikatnie przykrywając naprawione miejsce wstrzyknięcia sterylną bawełną i lekko uciskając przez 30 s. Alternatywnie, jeśli występuje krwawienie z naprawionego miejsca wstrzyknięcia bez widocznego przepływu krwi i proksymalnie rozdętej tętnicy, oznacza to, że igła do szycia przeszła przez tylną ścianę tętnicy podczas naprawy. W takim przypadku delikatnie otwórz krawędzie miejsca wstrzyknięcia podczas naprawy, przełóż igłę do szwu przez tętnicę pod płytkim kątem i wizualnie potwierdź, że szew nie przeszedł przez tylną ścianę przed zawiązaniem węzła szwu.

Dzięki tym środkom metoda naprawy miejsca wstrzyknięcia jest precyzyjna i powtarzalna we wszystkich kohortach zwierząt, niezależnie od tła genetycznego i wieku. Z naszego doświadczenia wynika, że wskaźnik sukcesu wynosił 100% dzięki trzem różnym chirurgom wykonującym zabieg. Mając odpowiednie doświadczenie i starannie przestrzegając dostarczonego protokołu, nie przewidujemy żadnych trudności dla innych chirurgów w wykonaniu tej procedury. Przy odrobinie wprawy wykwalifikowany chirurg może wykonać zabieg w 15-20 minut. Jeśli eksperyment na to pozwala, czas przypadający na zwierzę można również skrócić, pozostawiając nienaruszone górne i dolne szwy CCA, rezygnując z naprawy miejsca wstrzyknięcia. Jednak, jak wspomniano powyżej, specyficzne dla szczepu różnice w anatomii naczyń mózgowych zostały udokumentowane i ważne jest, aby przed rozpoczęciem eksperymentu sprawdzić, czy szczep myszy użyty w procedurze może to tolerować.

Ponieważ jest to zabieg chirurgiczny, należy wziąć pod uwagę powrót do zdrowia myszy. Tolerancja na stres i gojenie się ran to ważne czynniki, które będą się różnić w zależności od różnych szczepów myszy. Ponadto stan zapalny w miejscu operacji i tworzenie się tkanki bliznowatej mogą wydłużyć czas rekonwalescencji po wielokrotnych operacjach. Z powodzeniem przeprowadziliśmy wielokrotne wstrzyknięcia w odstępie 7 dni, ale jeśli konieczne są częstsze wstrzyknięcia, należy je dokładnie ocenić w przypadku konkretnych szczepów myszy, które mają być użyte. Siłowe obchodzenie się z CCA i stres na CCA (podczas izolacji, wiązania i zdejmowania szwów oraz wstrzykiwania) może uszkodzić i osłabić ściany tętnic, prowadząc do rozerwania podczas wielokrotnych wstrzyknięć. Ważne jest, aby zminimalizować rozwarstwienie podporowej tkanki łącznej wokół CCA i rozwidlenia oraz powstrzymać się od nadmiernego napięcia tętnicy.

Nasze wyniki sugerują, że w tym konkretnym modelu podwiązanie CCA lub naprawa CCA z przywróconym krążeniem po wstrzyknięciu nie różnią się ogólną częstotliwością naprowadzania lub dystrybucją wstrzykiwanych BM-hMSC w guzach wewnątrzczaszkowych. Chociaż może się to różnić w różnych szczepach myszy, zastosowanie naprawy miejsca wstrzyknięcia ma tę zaletę, że przywraca przepływ krwi do wstrzykniętej tętnicy, umożliwiając kolejne wstrzyknięcia do tej samej tętnicy i, co ważne, przypomina wstrzyknięcia do tętnicy szyjnej u ludzi. Wybór podwiązania a naprawy wstrzykniętej tętnicy zależy od rodzaju eksperymentu i używanego modelu mysiego. Jeśli potrzebne jest drugie wstrzyknięcie lub jeśli model myszy nie ma pełnego kręgu Willisa, należy zastosować naprawę miejsca wstrzyknięcia. Możliwość ponownego wstrzyknięcia CCA do modeli mysich może ułatwić dodatkowe manipulacje eksperymentalne. Na przykład, aby przetestować wiele dawek potencjalnego środka terapeutycznego podawanego w czasie, naprawa wstrzykniętej tętnicy jest niezbędna do wykonania kolejnych wstrzyknięć. Metoda ta byłaby również przydatna w eksperymentach polegających na wstrzykiwaniu kombinacji środków leczniczych, które muszą być wstrzykiwane w różnym czasie. Zwiększona elastyczność w iniekcjach doszyjnych do tętnicy szyjnej zapewniona przez naprawę wstrzykniętej tętnicy poprawia użyteczność translacyjną mysich modeli guzów mózgu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Strzykawki 1 ml (niska martwa przestrzeń)	Air-tite Products Co.	A1
26 G; Igła 1/2"	Air-tite Products Co.	N2612
33 G; igła 1/2"	JBP, Air-tite Products Co.
3 cm szalka Petriego	Sokół, Fisher Scientific	08-772A Taśma
chirurgiczna 3M durapore	Fisher Scientific	19-071-152
6-0 nić do szwów	Fine Science Tools	18020-60
70% etanolu	Fisher Scientific	04-355-122
9-0 szew mikrochirurgiczny z igłą	Fine Science Tools	12052-09
Środek przeciwbólowy do poważnych operacji
Sztuczne łzy/maść okulistyczna	Covetrus	8897
Sterylizator koralików	Fisher Scientific	14-955-341
Betadine/Chlorheksydyna	McKesson, Fisher Scientific	NC1696484
zwijacz hakowy	Fine Science Narzędzia	17022-13
Mikroskop preparacyjny	Zeiss Microscopy, LLC	491903-0010-000
Elektryczna poduszka grzewcza	Insource, Fisher Scientific	NC0667724
Bardzo wąskie nożyczki	Fine Science Tools	14088-10
Szczypce do cienkich kleszczy - Dumont #5 Kleszcze z mikrostępionymi końcówkami	Narzędzia do nauki precyzyjnej	11253-20
Cienkie kleszcze - Kleszczyki kątowe Dumont #5/45 z mikrostępionymi końcówkami	Fine Science Tools	11253-25
Waporyzator izofluranowy (lub koktajl ketamina/ksylazyna)	Kent Scientific	VetFlo-1231
Źródło światła	Laxco, Fisher Scientific	AMPSILED21
Stożek nosowy do znieczulenia myszy	Braintree Scientific, Inc	XENO-M
Sterownik igieł i nbsp;	Fine Science Tools	12002-12
Sterylne waciki bawełniane	Texwipe, Fisher Scientific	18-366-472
Sterylne gaziki	Covidien, Fisher Scientific	22-037-907
Sterylna sól fizjologiczna (0,9%)	KD Medical, Fisher Scientific	50-103-1363
Sterylne obłożniki chirurgiczne	Fisher Scientific	50-129-6666
Sterylny stół
Sterylny pakiet szwów (dowolna odpowiednia średnica dla Zamykanie ran na myszy)	Ethicon, Fisher Scientific	50-209-2811
Narzędzia
Taśma laboratoryjna winylowa	Fisher Scientific	15-901