AQRNA-seq do ilościowego oznaczania małych RNA

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS), znane również jako sekwencjonowanie masowo równoległe, to technologia sekwencjonowania DNA, która obejmuje fragmentację DNA, ligację oligonukleotydów adaptorowych, amplifikację opartą na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), sekwencjonowanie DNA i ponowne składanie sekwencji fragmentów w genom. Adaptacja NGS do sekwencji RNA (sekwencja RNA) to potężne podejście do identyfikacji i ilościowego określania transkryptów RNA i ich wariantów¹. Innowacyjne osiągnięcia w procesach przygotowywania bibliotek RNA i potokach analizy bioinformatycznej, w połączeniu z postępem w oprzyrządowaniu laboratoryjnym, poszerzyły repertuar aplikacji sekwencyjnych RNA, przechodząc poza sekwencjonowanie egzomu do zaawansowanej funkcjonalnej omiki, takiej jak profilowanie RNA bez kodowania², analiza pojedynczych komórek³, transkryptomika przestrzenna^4,5, alternatywne łączenie analysis⁶, między innymi. Te zaawansowane metody sekwencjonowania RNA ujawniają złożone funkcje RNA poprzez analizę ilościową transkryptomu w normalnych i chorych komórkach i tkankach.

Pomimo tych postępów w sekwencjonowaniu RNA, kilka kluczowych cech technicznych ogranicza ilościową moc tej metody. Podczas gdy większość metod sekwencjonowania RNA pozwala na precyzyjną i dokładną kwantyfikację zmian poziomów RNA między zmiennymi eksperymentalnymi (tj. próbkami biologicznymi i/lub stanami fizjologicznymi), nie mogą one zapewnić ilościowych porównań poziomów cząsteczek RNA w próbce. Na przykład większość metod sekwencjonowania RNA nie może dokładnie określić ilościowo względnej liczby kopii pojedynczych cząsteczek izoakceptora tRNA w puli komórkowej wyrażonych tRNA. Jak podkreślono w publikacji towarzyszącej⁷, to ograniczenie do sekwencjonowania RNA wynika z kilku cech struktury RNA i biochemii przygotowania biblioteki. Na przykład na aktywność enzymów ligacyjnych używanych do przyłączania łączników sekwencjonowania końca 3' i 5' do cząsteczek RNA duży wpływ ma tożsamość końcowych nukleotydów RNA i łączników sekwencjonowania. Prowadzi to do dużych różnic w wydajności ligacji łączników i głębokiego wzrostu liczby odczytów sekwencjonowania^8,9,10.

Drugi zestaw ograniczeń wynika z nieodłącznych właściwości strukturalnych cząsteczek RNA. W szczególności tworzenie drugorzędowej struktury RNA i dynamiczne zmiany w dziesiątkach potranskrypcyjnych modyfikacji RNA epitranskryptomu mogą powodować spadek lub mutację polimerazy podczas odwrotnej transkrypcji. Błędy te skutkują niekompletną lub skróconą syntezą cDNA lub zmienioną sekwencją RNA. Chociaż oba te zjawiska można wykorzystać do mapowania struktur drugorzędowych lub pewnych modyfikacji, pogarszają one ilościową dokładność sekwencji RNA, jeśli kolejne etapy przygotowania biblioteki nie zdołają uchwycić obciętych cDNA lub jeśli przetwarzanie danych wyrzuca zmutowane sekwencje niepasujące do referencyjnego zestawu danych^11,12. Co więcej, ogromna różnorodność chemiczna, długotrwała i strukturalna transkryptów RNA, a także brak narzędzi do jednolitej fragmentacji długich RNA, zmniejsza możliwość zastosowania większości metod sekwencjonowania RNA do wszystkich gatunków RNA¹³.

Metoda AQRNA-seq (sekwencjonowanie RNA w absolutnej kwantyfikacji) została opracowana w celu usunięcia kilku z tych technicznych i biologicznych ograniczeń, które ograniczają dokładność ilościową⁷. Minimalizując zależne od sekwencji odchylenia w wychwytywaniu, ligacji i amplifikacji podczas przygotowywania biblioteki sekwencjonowania RNA, AQRNA-seq osiąga lepszą liniowość w porównaniu z innymi metodami, dokładnie określając ilościowo 75% biblioteki referencyjnej 963 miRNA z 2-krotną dokładnością. Ta liniowa korelacja sekwencjonowania, liczby odczytów i obfitości RNA jest również obserwowana w analizie puli oligonukleotydów o zmiennej długości oraz w odniesieniu do metod ortogonalnych, takich jak northern blotting. Ustalenie liniowości między sekwencjonowaniem, liczbą odczytów a obfitością RNA umożliwia AQRNA-seq osiągnięcie dokładnej, bezwzględnej kwantyfikacji wszystkich gatunków RNA w próbce.

Oto opis protokołu do przygotowania biblioteki AQRNA-seq i towarzyszącego mu potoku analizy danych. Metodę zastosowano w celu wyjaśnienia dynamiki liczebności tRNA podczas stanu spoczynku wywołanego głodem, a następnie reanimacji w modelu gruźlicy Mycobacterium bovis bacilli de Calmette et Guérin (BCG). Wyniki przedstawiono w celu eksploracyjnej wizualizacji danych sekwencjonowania, wraz z późniejszymi analizami grupowania i różnicowej ekspresji, które ujawniły dostrzegalne wzorce obfitości tRNA związane z różnymi fenotypami.

UWAGA: Rysunek 1 przedstawia graficzną ilustrację procedur związanych z przygotowaniem biblioteki AQRNA-seq. Szczegółowe informacje na temat odczynników, substancji chemicznych oraz kolumn/zestawów stosowanych w procedurze można znaleźć w Tabeli Materiałów. Zaleca się przeprowadzenie kompleksowej oceny czystości, integralności i ilości wejściowych próbek RNA przy użyciu (i) 3% elektroforezy w żelu agarozowym, (ii) zautomatyzowanych narzędzi do elektroforezy do kontroli jakości próbek biomolekuł (patrz tabela materiałów) oraz (iii) spektrofotometrii UV-visible i/lub kwantyfikacji fluorometrycznej. Obowiązkowe jest przechowywanie wszystkich reakcji i mieszanek wzorcowych na lodzie, chyba że określono inaczej. Odczynniki (np. enzymy) należy transportować w chłodziarkach do i z magazynu w temperaturze -20 °C, aby zachować ich trwałość i uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania półproduktów bibliotecznych.

1. Defosforylacja RNA

UWAGA: Usunięcie 5'-fosforanu (Donor) zapobiega samoligacji do 3'-hydroksylu (OH; akceptor) RNA. Łączniki nie będą się samoligować, ponieważ ich koniec 3' jest zmodyfikowany tak, aby zawierał dideoksycytydynę (Linker 1) lub przekładkę (Linker 2). Łączniki można ligować tylko przez dołączenie ich 5'-P do 3'-OH RNA lub cDNA.

1. Przygotować reakcję defosforylacji w sterylnej probówce do PCR (np. probówka o pojemności 200 μl lub 500 μl) przez dodanie do 2 μl próbki RNA, 0,5 μl 40 μl inhibitora RNazy U/μL, 1 μL 0,5 μM wzorca wewnętrznego (tabela 1), 0,5 μL 10x buforu reakcyjnego ligazy RNA T4, 1 μl fosfatazy alkalicznej krewetek o zawartości 1 μl i wystarczająca ilość wody wolnej od RNaz, aby zwiększyć całkowitą objętość do 5 μl.
   UWAGA: W przypadku typowych próbek 75 ng RNA (lub około 2 pmol dla 80 nt RNA) jest uważane za wystarczające do ilościowego określenia małych RNA przy użyciu tego protokołu.
2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w celu defosforylacji RNA, a następnie w temperaturze 65 °C przez 5 minut w celu inaktywacji enzymu i denaturacji RNA. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 10 minut, aby zapobiec renaturyzacji.

2. Ligacja łącznika 1 do końca 3' RNA

1. Przygotować reakcję ligacji Linker 1 w sterylnej probówce PCR, dodając 5 μL defosforylowanych RNA (produkty z kroku 1), 0,5 μL 40 U/μL inhibitora RNazy, 1 μL 100 μM Linker 1 (Tabela 1), 3 μL 10 mM ATP, 2,5 μL 10x buforu reakcyjnego ligazy RNA T4, 15 μl PEG8000 (50% roztwór), 2 μl 30 μl ligazy T4 RNA 1 i 1 μl wody wolnej od RNaz.
   UWAGA: Odczynniki można przekształcić w mieszankę wzorcową, aby ułatwić przetwarzanie próbek. Nie należy włączać PEG8000 i ligazy T4 RNA 1 do mieszaniny wzorcowej.
2. Inkubować w temperaturze 25 °C przez 2 godziny, a następnie w temperaturze 16 °C przez 16 godzin w celu podwiązania łącznika 1 do RNA.
3. Oczyść kolumnowo RNA ligowane przez Linker-1. Użyj zestawu do odzyskiwania i oczyszczania DNA/RNA (patrz Tabela materiałów).
   UWAGA: Ten protokół oczyszczania kolumn ma zastosowanie do wszystkich kolejnych oczyszczania kolumn przy użyciu tego samego zestawu. Zestawy, które wykorzystują technologię filtracji żelowej do usuwania terminatorów barwnika z reakcji sekwencjonowania (patrz tabela materiałów) nie mogą być tutaj stosowane, ponieważ PEG8000 jest niekompatybilny z filtrami żelowymi takich zestawów. Zaleca się zachowanie podwielokrotności (1,2 μl) każdej próbki po oczyszczeniu. W razie potrzeby podwielokrotności te można wykorzystać do sprawdzenia wydajności ligacji poprzez uruchomienie komercyjnego analizatora kwasów nukleinowych. Pozostałe oczyszczone próbki należy przechowywać na lodzie lub w temperaturze -20 °C do czasu dalszych etapów.
   1. Aby uzyskać objętość próbki < 50 μl, dodaj wodę wolną od RNaz, aby uzyskać 50 μl. Dodać 2 objętości buforu wiążącego oligonukleotydy (dostarczonego w zestawie) do 1 objętości próbki. Dodać 8 objętości 100% etanolu do 1 objętości próbki.
   2. Załaduj próbkę (jednorazowo do 750 μl) do kolumny umieszczonej w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml (dostarczonej w zestawie). Aby związać RNA z kolumną, odwirować przy 10 000 x g przez 30 s i wyrzucić przepływający (tj. ciecz z probówki zbiorczej). Umieść kolumnę z powrotem w probówce zbiorczej.
   3. Aby zmyć zanieczyszczenia z kolumny, dodaj 750 μl buforu do przemywania DNA (dostarczonego w zestawie) do kolumny. Wirować przy 10 000 x g przez 30 s i odrzucić przepływ. Umieść kolumnę z powrotem w probówce zbiorczej.
   4. Wirować z maksymalną prędkością (np. 16 000 x g dla mikrowirówki stołowej) przez dodatkowy 1 minutę w celu usunięcia resztkowego buforu do płukania DNA.
   5. Aby wymyć RNA, ostrożnie przenieś kolumnę do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml, dodaj do niej wodę wolną od RNaz. Użyj większej objętości niż jest to konieczne podczas elucji RNA, aby uwzględnić potencjalną utratę objętości podczas procesu elucji. Na przykład, jeśli do następnego kroku wymagane jest 15 μl, dodaj 17 μl wody wolnej od RNaz do elucji. Wirować przy 10 000 x g przez 30 s.

3. Usuwanie metylacji potranskrypcyjnych przez demetylazę AlkB

UWAGA: AlkB to enzym bakteryjny, który usuwa grupy metylowe z niektórych, ale nie wszystkich, metylowanych nukleotydów w DNA i RNA. Usunięcie kilku typów metylowanych rybonukleotydów w RNA zapobiega zanikowi odwrotnej transkryptazy, umożliwiając bardziej szczegółowe odczyty i identyfikację miejsc modyfikacji. Ten etap musi być kontrolowany przy niskim pH, aby zapobiec nieoczekiwanej degradacji RNA.

1. Przygotować roztwór podstawowy 1 M 2-ketoglutaranu, rozpuszczając 1,4611 g 2-ketoglutaranu (146,11 g na M) w 10 ml wody wolnej od RNaz. Filtr Wysterylizuj roztwór przez filtr strzykawkowy 0,2 μm. Podwielokrotność roztworu podstawowego rozlać do sterylnych probówek o objętości 2 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
2. Przygotować roztwór podstawowy 0,5 M kwasu L-askorbinowego, rozpuszczając 0,88 g kwasu L-askorbinowego (176,12 g na M) w 10 ml wody wolnej od RNaz. Filtr Wysterylizuj roztwór przez filtr strzykawkowy 0,2 μm. Podwielokrotność roztworu podstawowego rozlać do sterylnych probówek o objętości 2 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
3. Przygotować roztwór podstawowy 0,25 M sześciowodnego siarczanu żelazawego amonu, rozpuszczając 0,9835 g sześciowodnego siarczanu amonu żelazawego (392,14 g na M) w 10 ml wody wolnej od RNaz. Filtr Wysterylizuj roztwór przez filtr strzykawkowy 0,2 μm. Podwielokrotność roztworu podstawowego rozlać do sterylnych probówek o objętości 2 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
4. Przygotować roztwór podstawowy 1 M HEPES, rozpuszczając 2,383 g HEPES (238,30 g na M) w 10 ml wody wolnej od RNaz. Dostosuj pH roztworu do 8 za pomocą NaOH i przesterylizuj roztwór przez filtr strzykawkowy 0,2 μm. Podwielokrotność roztworu podstawowego rozlać do sterylnych probówek o objętości 2 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
5. Przygotować 2x AlkB bufor reakcyjny. Aby uzyskać 10 ml buforu, należy połączyć 1,5 μl 1 M 2-ketoglutaranu (wytworzonego w kroku 3.1), 80 μl 0,5 M kwasu L-askorbinowego (wykonanego w kroku 3.2), 6 μl sześciowodnego siarczanu żelazawego 0,25 M (wykonanego w kroku 3.3), 100 μl 10 mg/ml BSA, 1000 μl 1 M HEPES (wytworzonego w kroku 3.4; dodać ostatni), i 8812,5 μl wody wolnej od RNaz. Filtr wysterylizuj bufor przez filtr strzykawkowy 0,2 μm.
   UWAGA: Bufor reakcyjny 2x AlkB musi być przygotowany na świeżo bezpośrednio przed każdym eksperymentem ze względu na labilność chemiczną składników.
6. Przygotować reakcję trawienia AlkB w sterylnej probówce PCR, dodając 20 μl RNA ligowanych Linker-1 (produkty z kroku 2), 50 μl buforu reakcyjnego 2x AlkB (wykonanego w kroku 3.5), 2 μl demetylazy AlkB, 1 μl inhibitora RNazy i 27 μl wody wolnej od RNazy.
7. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny w celu usunięcia metylacji potranskrypcyjnych z RNA.
8. Aby usunąć AlkB z reakcji, wykonaj czynności opisane poniżej.
   1. W celu rozdzielenia czystej fazy należy dodać 50 μl wody wolnej od RNaz do reakcji AlkB, a następnie dodać 100 μl fenolu: chloroform: alkohol izoamylowy 25:24:1 (pH = 5,2).
   2. Wstrząsać ręcznie przez 10 s, a następnie wirować przy 16 000 x g przez 10 minut. Upewnij się, że wirnik wirówki stołowej jest kompatybilny z probówkami do PCR. W razie potrzeby użyj adapterów.
   3. Przenieś RNA (tj. warstwę wodną na wierzchu; około 140 μl) do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml. Jeśli chloroform (tj. dolna warstwa) zostanie zmieszany z warstwą wodną, należy ponownie odwirować z tymi samymi ustawieniami.
   4. Dodać 100 μl chloroformu do wyekstrahowanych RNA, aby usunąć resztki fenolu. Wstrząsać ręcznie przez 10 s, a następnie odwirowywać przy 16 000 x g przez 10 minut.
   5. Przenieść RNA (tj. warstwę wodną na wierzchu; około 120 μl) do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml.
9. Oczyść kolumnowo wyekstrahowane RNA. Użyj zestawu do odzyskiwania i czyszczenia DNA/RNA (patrz tabela materiałów). Postępuj zgodnie z protokołem opisanym w kroku 2.3, aby przeprowadzić oczyszczanie kolumny.

4. Usunięcie nadmiaru Linkera 1

UWAGA: Zaleca się zapisanie podwielokrotności (1,2 μL) każdej próbki po oczyszczeniu. W razie potrzeby podwielokrotności te można wykorzystać do sprawdzenia wydajności trawienia RecJf poprzez uruchomienie komercyjnego analizatora kwasów nukleinowych. Natychmiast należy przystąpić do pracy z oczyszczonymi próbkami w celu odwrócenia transkrypcji.

1. Przygotować reakcję martwego zapalenia w sterylnej probówce PCR, dodając 15 μl RNA ligowanych Linker-1 (produkty z kroku 3), 1 μl 40 U/μL inhibitora RNazy, 2 μl 10x buforu zestawu 2 (patrz tabela materiałów) i 2 μl 50 U/μL 5'-deadenylazy.
2. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 1 godzinę w celu usunięcia adeniny na końcu 5' łącznika 1. Dodać 2 μl z 30 U/μL RecJf do reakcji mardenylacji.
3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w celu wytrawienia nadmiaru Łącznika 1. Dodać kolejne 2 μl 30 U/μL RecJf do reakcji.
4. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby kontynuować trawienie nadmiaru łącznika 1, a następnie w temperaturze 65 °C przez 20 minut, aby dokonać denaturacji enzymu.
5. Oczyść kolumnowo RNA ligowane przez Linker-1. Użyj zestawu, który wykorzystuje technologię filtracji żelowej do usuwania terminatorów barwnika z reakcji sekwencjonowania (patrz tabela materiałów), ponieważ jest on skuteczny w usuwaniu krótkich pozostałości (np. oligonukleotydów o długości od 2 do 10 pz). Postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej, aby oczyścić.
   1. Przygotuj kolumny żelowo-filtracyjne zgodnie z protokołem producenta. Umieścić kolumnę w sterylnej probówce o pojemności 1,5 ml i załadować do niej 24 μl próbki.
   2. Aby oczyścić RNA, odwirować przy 800 x g przez 3 minuty i wyrzucić kolumnę. Oczyszczone RNA znajdują się w eluencie.

5. Reakcja odwrotnej transkrypcji (RT)

UWAGA: Następująca konfiguracja reakcji RT (patrz Tabela Materiałów) jest zgodna z protokołem producenta, z niewielkimi modyfikacjami, aby umożliwić kompatybilność z AQRNA-seq.

1. Przygotować reakcję wyżarzania startera RT w sterylnej probówce PCR, dodając 24 μl matrycy RNA (produkty z kroku 4), 1 μl startera 2 μM RT (Tabela 1) i 1 μL dNTP (10 mM każdego rodzaju nukleotydów).
2. Inkubować w temperaturze 80 °C przez 2 minuty w celu wyżarzania starterów RT do matrycy RNA, a następnie natychmiast schłodzić na lodzie przez 2 minuty.
3. Przygotować reakcję RT, dodając 6 μl 5x buforu reakcyjnego RT, 1 μl 40 U/μL inhibitora RNazy i 1 μl odwrotnej transkryptazy do probówki reakcyjnej wyżarzania.
4. Inkubować w temperaturze 50 °C przez 2 godziny w celu odwrotnej transkrypcji matryc RNA, a następnie w temperaturze 70 °C przez 15 minut w celu inaktywacji enzymu. Produkty RT (tj. hybrydy RNA-cDNA) mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C lub -20 °C przez noc.

6. Hydroliza RNA

1. Dodać 1 μl 5 M NaOH do hybrydy RNA-cDNA (produkty z kroku 5). Inkubować w temperaturze 93 °C przez 3 minuty w celu hydrolizy nici RNA hybrydy RNA-cDNA.
2. Dodać 0,77 μl 5 M HCl, aby zneutralizować reakcję. Po dodaniu HCl przesuń w celu wymieszania i odkręć probówkę. Neutralizacja jest natychmiastowa.
   UWAGA: Zaleca się przetestowanie dokładnej ilości 5 M HCl, która jest potrzebna do zneutralizowania 1 μL NaOH (np. przy użyciu pasków pH) w warunkach buforowych.
3. Oczyść kolumnowo jednoniciowe cDNA. Użyj zestawu do odzyskiwania i czyszczenia DNA/RNA (patrz tabela materiałów). Postępuj zgodnie z protokołem opisanym w kroku 2.3, aby przeprowadzić oczyszczanie kolumny.
   UWAGA: Zestawy, które wykorzystują technologię filtracji żelowej do usuwania terminatorów barwnika z reakcji sekwencjonowania (patrz Tabela materiałów) nie mogą być tutaj używane ze względu na zmiany pH w poprzednich krokach.
4. Szybko odkurzyć oczyszczone cDNA do < 5 μl, a następnie dodać wodę wolną od RNaz, aby przywrócić objętość do 5 μl. Uważaj, aby nie przyspieszyć odkurzania cDNA do całkowitego wyschnięcia.
5. Przenieś oczyszczone cDNA do sterylnej probówki do PCR. Oczyszczone cDNA można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 1 tygodnia.

7. Ligacja łącznika 2 do końca 3' cDNA

1. Przygotować reakcję ligacji Linker 2 w sterylnej probówce PCR, dodając 5 μL cDNA (produkty z kroku 6), 1 μL 50 μM Linker 2 (Tabela 1), 2 μL 10x buforu reakcyjnego ligazy DNA T4, 1 μL 10 mM ATP, 9 μL PEG8000 (50% roztwór), i 2 μl 400 U/μL ligazy DNA T4.
   UWAGA: Odczynniki można przekształcić w mieszankę wzorcową, aby ułatwić przetwarzanie próbek. Nie włączaj PEG8000 i ligazy DNA T4 do mieszanki wzorcowej.
2. Inkubować w temperaturze 16 °C przez 16 godzin w celu podwiązania Linkera 2 do cDNA.
3. Oczyść kolumnowo cDNA ligowane przez Linker-2. Użyj zestawu do odzyskiwania i czyszczenia DNA/RNA (patrz tabela materiałów). Postępuj zgodnie z protokołem opisanym w kroku 2.3, aby przeprowadzić oczyszczanie kolumny.

8. Usunięcie nadmiaru Linkera 2

1. Przygotuj reakcję deadenylacji w sterylnej probówce PCR, dodając 16 μl cDNA ligowanych Linker-2, 2 μl 10x zestawu buforowego 2 i 2 μl 50 U / μL 5'-deadenylazy. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 1 godzinę w celu usunięcia adeniny na końcu 5' łącznika 2.
2. Dodać 2 μl z 30 U/μL RecJf do reakcji mardenylacji. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w celu wytrawienia nadmiaru Linkera 2. Dodać kolejne 2 μl 30 U/μL RecJf do reakcji.
3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby kontynuować trawienie nadmiaru Linkera 2, a następnie w temperaturze 65 °C przez 20 minut, aby dokonać denaturacji enzymu.

9. Amplifikacja PCR cDNA za pomocą starterów sekwencjonowania

1. Przypisz startery PCR do próbek. Każda próbka wymaga unikalnej kombinacji starterów do przodu i do tyłu (Tabela 1) w celu skutecznego multipleksowania.
2. Dodaj wodę wolną od RNaz, aby zwiększyć objętość próbki do 25 μl. Zapisz 5 μl każdej próbki w sterylnej probówce do PCR jako kopię zapasową na wypadek konieczności powtórzenia PCR.
3. Przygotować reakcję PCR (patrz Tabela materiałów zestawu do PCR), dodając 20 μl cDNA (produkty z kroku 8), 1 μl startera 2,5 μM do przodu, 1 μl startera odwrotnego 2,5 μM, 25 μL buforu 2x polimerazy DNA, 2 μl wody wolnej od RNaz i 1 μl polimerazy DNA.
   UWAGA: Odczynniki można przekształcić w mieszankę wzorcową, aby ułatwić przetwarzanie próbek. Nie dodawaj polimerazy DNA do mieszanki wzorcowej.
4. Przeprowadzić PCR ze wstępną denaturacją w temperaturze 94 °C przez 1 minutę, a następnie 18 cyklami denaturacji w temperaturze 98 °C przez 20 s - wyżarzanie w temperaturze 58 °C przez 20 s - przedłużenie w temperaturze 68 °C przez 1 minutę
   UWAGA: Nie należy PCR amplifikować poza zakresem liniowym. W sumie 18 cykli będzie optymalnych dla większości eksperymentów, ale może to być zależne od kontekstu.
5. Przyspiesz odkurzanie produktów PCR do mniej niż 25 μl, a następnie dodaj wodę wolną od RNaz, aby przywrócić objętość do 25 μl. Przenieś 5 μl produktów PCR do sterylnej probówki o pojemności 0,5 ml w celu sprawdzenia rozkładu wielkości (patrz krok 9.6). Pozostałe 20 μl produktów PCR należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszych kroków.
6. Sprawdź rozkład wielkości produktów PCR zgodnie z poniższym opisem.
   1. Przygotować 3% żel agarozowy w buforze TAE.
      UWAGA: W tym protokole bromek etydyny (EtBr) jest używany do barwienia żelem po elektroforezie (patrz krok 9.6.5). Na tym etapie do roztworu żelu można dodać odpowiednie barwniki DNA lub użyć ich później do barwienia żelem.
   2. Wymieszaj 1 μl 6-krotnego barwnika ładującego z 5 μl produktów PCR (z kroku 9.5) i załaduj żel mieszaniną.
   3. Załadować 5 μl drabinek DNA do studzienki przed pierwszą próbką i do studzienki po ostatniej próbce. Użyj drabinek DNA 50 pz lub 100 pz, aby umożliwić lepszą dyskryminację wielkości produktów PCR w zakresie od 150 pz do 300 pz.
   4. Uruchom elektroforezę żelową, aby zlokalizować produkty PCR. Odpowiednie warunki pracy mogą być zależne od kontekstu. Tutaj uruchom przy napięciu 120 V, 400 mA przez 75 minut dla płyty żelowej o wymiarach 17,78 cm (szerokość) x 10,16 cm (wysokość) x 1 cm (grubość).
   5. Umieść żel w pudełku i napełnij pudełko wodą dejonizowaną (DI), aż żel zostanie całkowicie zanurzony. Dodaj 10 μl EtBr do wody DI, nasączając żel. Owiń pudełko folią i umieść je na shakerze. Plamić żel przez 30 minut, wstrząsając.
   6. Odpady zawierające EtBr wyrzucić do butelki na odpady umieszczonej w dygestorium. Spłucz żel raz wodą DI i wylej wodę zawierającą EtBr do butelki na odpady.
   7. Napełnij pudełko wodą DI, aż żel zostanie całkowicie zanurzony. Owiń pudełko folią i umieść je na shakerze. Żel myć przez 10 minut, wstrząsając.
   8. Wylać wodę zawierającą EtBr do butelki na odpady w okapie. Użyj imagera żelowego, aby zobrazować pasma. Uzyskaj obraz żelu w wysokiej rozdzielczości.

10. Oczyszczanie żelu

1. Przygotować 3% żel agarozowy w buforze TAE. Przygotować żel o grubości 1 cm za pomocą szerokich grzebieni (1 mm grubości; 5 mm szerokości; 15 mm głębokości), tak aby każda studzienka mogła zawierać co najmniej 25 μl mieszaniny barwników ładujących próbkę.
2. Wymieszaj 4 μl barwnika 6x ładującego z 20 μl produktów PCR (od kroku 9.5) i załaduj żel mieszaniną. Pozostaw puste pasy między próbkami, aby zminimalizować zanieczyszczenie krzyżowe podczas wycinania żelu.
3. Załaduj drabinki DNA, uruchom elektroforezę żelu, wybarwić i umyć żel, a następnie wykonaj zdjęcia żelu zgodnie z opisem w kroku 9.6.
4. Wyciąć bloki żelu, które zawierają produkty PCR w docelowym zakresie wielkości. Aby zminimalizować zanieczyszczenie dimerami starterów (łączniki 175 pz bez wkładek), ekstrahuj produkty PCR o wielkości powyżej 195 pz (łączniki 175 pz + 20 pz miRNA).
5. Oczyść produkty PCR za pomocą ekstrakcji żelowej. Użyj zestawu do ekstrakcji żelu (patrz tabela materiałów). Protokół oczyszczania oparty jest na protokole producenta, z niewielkimi modyfikacjami w celu zapewnienia kompatybilności z AQRNA-seq. Wszystkie etapy wirowania należy przeprowadzać przy 17 900 x g przez 1 minutę przy użyciu wirówki stołowej w temperaturze pokojowej, chyba że określono inaczej. Postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej.
   1. Zmierz wagę bloków żelu wewnątrz probówek. Dodać 6 objętości Buffer QG (dołączonych do zestawu) do 1 objętości bloku żelu (1 mg żelu to około 1 μl).
   2. Inkubować w temperaturze 50 °C przez 10 minut lub do całkowitego rozpuszczenia bloków żelu. Rurki wirowe co 2 minuty, aby ułatwić rozpuszczanie żelu. Po rozpuszczeniu żelu mieszanina powinna przypominać kolorem Buffer QG bez rozpuszczonego żelu. Jeśli kolor jest pomarańczowy lub fioletowy, dodać 10 μl 3 M octanu sodu (pH = 5,0) i dokładnie wymieszać.
   3. Dodaj 1 objętość żelu izopropanolu do mieszaniny i dokładnie wymieszaj. Umieść kolumnę wirującą w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml (dostarczonej w zestawie).
   4. Aby związać DNA, należy nanieść próbkę (za każdym razem do 750 μl) do kolumny i odwirować. Odrzucić przepływ i umieścić kolumnę z powrotem w tej samej probówce zbiorczej. Maksymalna ilość żelu na kolumnę wirową wynosi 400 mg.
   5. Dodać 500 μl buforu QG do kolumny i odwirować. Odrzucić przepływ i umieścić kolumnę z powrotem w tej samej probówce zbiorczej.
   6. Aby zmyć zanieczyszczenia, dodaj 750 μl buforu PE (dostarczonego w zestawie) do kolumny, pozostaw kolumnę na 5 minut i odwiruj. Odrzucić przepływ i umieścić kolumnę z powrotem w tej samej probówce zbiorczej. Odwirować ponownie, aby usunąć resztki buforu do płukania.
   7. Umieścić kolumnę w sterylnej probówce o pojemności 1,5 ml. Aby wymyć DNA, dodaj 30 μl buforu EB (dostarczonego w zestawie) do środka membrany kolumny, pozostaw kolumnę na 4 minuty i odwiruj.
   8. Speed-vac i ponownie zawiesić oczyszczone żelem produkty PCR w 12 μl buforu EB.
6. Zmierz stężenie w skonstruowanych bibliotekach za pomocą spektrofotometrii UV-Visible i/lub kwantyfikacji fluorometrycznej.

11. Sekwencjonowanie biblioteki

1. Prześlij zbudowane biblioteki do zewnętrznego centrum sekwencjonowania w celu oceny jakości i sekwencjonowania Illumina. Aby zapewnić wystarczającą czułość w ilościowym mapowaniu małych krajobrazów RNA, należy zdecydować się na sekwencjonowanie sparowanych końców z odczytami 75 pz z każdego kierunku (tj. PE75), dążąc do odczytów co najmniej 1,5 M surowej sekwencji w każdym kierunku dla każdej próbki. Użyj niestandardowych starterów (Tabela 1) do sekwencjonowania NextSeq, ale jest to opcjonalne dla sekwencjonowania na MiSeq.
   UWAGA: Sekwencjonowanie można wykonać za pomocą platform MiSeq lub NextSeq500. Wybór platformy może zależeć od charakteru próbek i całkowitej liczby próbek.

12. Potok analizy danych

UWAGA: Rysunek 2 przedstawia graficzną ilustrację uproszczonych procedur związanych z potokiem analizy danych, który przyjmuje surowe odczyty sekwencji (w formacie FASTQ) jako dane wejściowe i generuje macierz obfitości z wierszami reprezentującymi członków małych gatunków RNA będących przedmiotem zainteresowania i kolumnami reprezentującymi próbki. W przypadku sekwencjonowania sparowanych końców każda próbka odpowiada dwóm plikom FASTQ, jednemu dla odczytów do przodu, a drugi dla odczytów wstecznych. Kompletny potok analizy danych ze wszystkimi powiązanymi skryptami i podręcznikiem z obszernymi adnotacjami dla każdego kroku jest dostępny w serwisie GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git).

1. Pobieraj odczyty nieprzetworzonych sekwencji z zewnętrznego centrum sekwencjonowania i oceniaj jakość sekwencjonowania za pomocą programów typu open source, takich jak FastQC¹⁴ lub fastp¹⁵.
2. Utwórz bibliotekę sekwencji referencyjnych w formacie FASTA.
   UWAGA: Kluczem do zdolności adaptacji rurociągu do różnych klas małych RNA jest odpowiednia biblioteka sekwencji referencyjnych. Aby uzyskać dokładne oszacowania liczebności członków określonych klas RNA będących przedmiotem zainteresowania (np. miRNA), oczekuje się, że użytkownicy skrupulatnie opracują bibliotekę sekwencji referencyjnych do użytku z potokiem. Wszystkie inne instrukcje dotyczące wykonywania potoku pozostają spójne w różnych klasach małych RNA.
3. Utwórz katalog o nazwie AQRNA-seq do implementowania potoku analizy danych i umieść w nim wszystkie skrypty, odczyty sekwencji filtrowane pod względem jakości oraz bibliotekę sekwencji referencyjnych. Postępuj zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami na GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git), aby przygotować podkatalogi i wprowadzić niezbędne modyfikacje plików do kierowania na różne organizmy i/lub małe gatunki RNA, a także kompatybilność systemu operacyjnego i/lub harmonogramu zadań.
4. Zaimplementuj potok analizy danych, postępując zgodnie z krokami opisanymi w podręczniku w usłudze GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git), który zawiera opisy, pliki wejściowe i wyjściowe, a także wiersze poleceń dla każdego kroku. Podsumowując, potok obejmuje (i) przycinanie sekwencji łącznikowych i losowych nukleotydów z odczytów, (ii) filtrowanie odczytów na podstawie ich długości, (iii) mapowanie odczytów do sekwencji referencyjnych, (iv) rozwiązywanie niejednoznacznych mapowań oraz (v) generowanie macierzy obfitości.

Mycobacterium bovis BCG (bacilli de Calmette et Guérin) szczep 1173P2 ulegający wykładniczemu wzrostowi został poddany szeregowi czasowemu (0, 4, 10 i 20 dni) głodu składników odżywczych, po którym nastąpiła 6-dniowa reanimacja w pożywce bogatej w składniki odżywcze, jak wcześniej przedstawiono w Hu et al.7. Małe RNA wyizolowano z hodowli bakteryjnej, z trzema powtórzeniami biologicznymi, w każdym z pięciu wyznaczonych punktów czasowych. Biblioteki Illumina zostały zbudowane przy użyciu opisanego powyżej przepływu pracy przygotowania biblioteki AQRNA-seq (Rysunek 1), a następnie sekwencjonowania na sekwenserze w BioMicro Center of the Massachusetts Institute of Technology. Dane sekwencjonowania zostały następnie przetworzone przy użyciu potoku analizy danych AQRNA-seq (Rysunek 2) dostosowanego do ilościowego oznaczania obfitości tRNA.

Po amplifikacji PCR biblioteki cDNA za pomocą starterów sekwencjonowania, zaobserwowano obecność produktów PCR o wielkości 175 par zasad (bp) we wszystkich próbkach (Rysunek 3A), co sugeruje tworzenie się dimerów starterowych. Aby złagodzić przenoszenie dimerów starterów, produkty PCR o wielkości przekraczającej 195 pz zostały wycięte z żelu i oczyszczone (Figura 3B).

Jakościowo filtrowane i przycięte sekwencje odczytów zostały zmapowane do niestandardowej biblioteki sekwencji referencyjnych, w tym 45 izoakceptorów tRNA, wewnętrznego standardu i sekwencji kontrolnych (tj. 23S rRNA, 16S rRNA, 5S rRNA, rnpB i ssr). Izoakceptory tRNA stanowiły od 10,5% do 40,2% wszystkich zmapowanych odczytów danej próbki i wykazywały znacznie większą obfitość niż sekwencje kontrolne (Rysunek 4). Co ważne, stosunkowo niskie proporcje odczytu izoakceptorów tRNA można przypisać wyższej względnej obfitości wzorców wewnętrznych. W związku z tym proporcje odczytu izoakceptorów tRNA w stosunku do wzorców wewnętrznych (Rysunek 4, różowe i zielone bloki koloru) mogą być kontrolowane przez operatora, poprzez precyzyjne dostrojenie ilości wzorca wewnętrznego wprowadzonego do reakcji.

Surowe dane dotyczące obfitości tRNA zostały znormalizowane przy użyciu metody mediany współczynników zaimplementowanej w wersji pakietu DESeq2 (zwanej dalej v) 1.36.016 w R Statistical Programming Environment (dalej określanym jako R) v 4.2.117. Po normalizacji uzyskuje się ilościowy krajobraz izoakceptorów tRNA w Mycobacterium bovis BCG podczas trwania głodu składników odżywczych i resuscytacji (Rysunek 5).

Aby ujawnić odrębne klastry próbek o różnych fenotypach na podstawie wzorców obfitości izoakceptorów tRNA, przeprowadzono Analizę Głównych Składowych (PCA) na znormalizowanych danych o obfitości tRNA przy użyciu pakietu statystyk v 4.2.117 w R (Rysunek 6). W analizie rozróżniono próbki z dnia głodu 0 i dnia resuscytacji 6 od próbek z 4, 10 i 20 dnia głodu, co sugeruje znaczną różnicę w krajobrazie tRNA Mycobacterium bovis BCG uprawianego na pożywce pozbawionej składników odżywczych i bogatej w składniki odżywcze

Aby sprofilować dynamikę obfitości każdego izoakceptora tRNA w pięciu wyznaczonych punktach czasowych, przeprowadzono analizę różnicową ekspresji na znormalizowanych danych dotyczących obfitości tRNA przy użyciu pakietu DESeq2 v 1.36.0 w R (Rysunek 7). Analiza wykazała, że 17 z 20 rodzin izoakceptorów zawierało izoakceptory, które ulegały zróżnicowanej ekspresji (tj. znacznie regulowanej w górę lub w dół) w co najmniej jednym z punktów czasowych, co sugeruje potencjalną rolę regulacji puli tRNA w trwałym stanie Mycobacterium bovis BCG podczas gruźlicy.

Rysunek 1: Schemat procesu przygotowania biblioteki AQRNA-seq. Kluczowe kroki opisane w przepływie pracy są wymienione na środku schematu i połączone z odpowiednimi ilustracjami graficznymi za pomocą przerywanych linii. Szczegółowy opis każdego kroku znajduje się w sekcji Protokół. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Schemat potoku analizy danych AQRNA-seq. Kluczowe kroki nakreślone w potoku są wymienione na środku schematu i połączone z odpowiednimi ilustracjami graficznymi za pomocą przerywanych linii. Szczegółowy opis każdego kroku jest dostępny na GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Elektroforeza fragmentów cDNA w żelu agarozowym po amplifikacji PCR za pomocą starterów sekwencjonujących. (A) Obraz żelu przed ekstrakcją i oczyszczeniem żelu. Pasy 7 i 14 od lewej strony zawierają po 5 μl drabinki DNA o stężeniu 50 pz, podczas gdy pozostałe pasy zawierają po 20 μl każdej z 15 próbek. Lokalizacja wielkości produktów PCR wskazuje na ich najwyższe stężenie w zakresie od 175 pz (dimery starterów) do 300 pz (dwa startery + 120 pz 5S rRNA). (B) Obraz żelu po ekstrakcji i oczyszczeniu żelu. Dla każdej próbki blok żelu o stężeniu od 200 pz do 400 pz został wycięty, aby zminimalizować zanieczyszczenie dimerów starterów w bibliotece sekwencjonowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Liczba odczytów sekwencji pomyślnie zmapowanych do biblioteki sekwencji referencyjnych. Oś x pokazuje nazwy próbek (np. D18-69XX) pogrupowane według punktu czasowego (np. Dzień głodu 0). Dla każdej próbki liczba odczytów powiązana z różnymi kategoriami tematów docelowych jest reprezentowana za pomocą kolorowych bloków ułożonych jeden na drugim. Liczby znajdujące się w środku kolorowych bloków reprezentują proporcje odczytów odpowiadających poszczególnym obiektom docelowym w ramach danej próbki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Ilościowy krajobraz izoakceptorów tRNA Mycobacterium bovis BCG w różnych punktach czasowych na trasie głodu i reanimacji. Surowe dane dotyczące obfitości tRNA znormalizowano przy użyciu metody mediany stosunków. Tutaj każdy wiersz przedstawia znormalizowane obfitości tRNA (oś y) jako średni błąd ± standardowy dla 3 kontrprób biologicznych w każdym punkcie czasowym. Na osi x izoakceptory z tej samej rodziny zostały zgrupowane razem i znakowane odpowiednim aminokwasem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Wykres kwadratowo-cosinusowy próbek pochodzących z analizy głównych składowych (PCA). PCA wykonano w oparciu o znormalizowaną obfitość tRNA. Podniesiony do kwadratu cosinus wskazuje na znaczenie głównych składników dla próbek, a próbki zostały wykreślone w odniesieniu do kwadratu cosinusa pierwszych dwóch głównych składników. Próbki zostały oznaczone za pomocą identyfikatorów próbek i oznaczone kolorami według punktu czasowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Różnicowa ekspresja izoakceptorów tRNA w różnych punktach czasowych. Znormalizowane obfitości tRNA podsumowano jako średnie (węzły linii) ± błąd standardowy (słupki błędów) w 3 powtórzeniach biologicznych. Ze względu na ograniczoną ilość miejsca warunki zostały skrócone w następujący sposób: S0-S20 = dni głodu 0-20; R6 = 6 dzień resuscytacji. Dla każdego izoakceptora tRNA przeprowadzono różnicową analizę ekspresji, porównując parami różne punkty czasowe za pomocą testu ilorazu prawdopodobieństwa i testu Walda. Kompaktowe litery wykorzystano do przedstawienia istotności statystycznej, w której obfitość danego izoakceptora tRNA w punktach czasowych dzielących co najmniej jedną wspólną literę nie różniła się istotnie od siebie. Na przykład obfitość tRNA-Lys-CTT-1-1 (w panelu lizyny) była znacznie obniżona z S0 do S4 i z S4 do S10, ale nie z S10 do S20. Następnie został znacznie podwyższony z S20 do R6. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Oligonukleotydy biorące udział w procesie przygotowania biblioteki AQRNA-seq. Wzorcem wewnętrznym jest RNA, podczas gdy wszystkie inne oligonukleotydy to DNA. Wymienione startery PCR i niestandardowe startery sekwencjonowania są specyficzne dla platform sekwencjonowania. Można zaprojektować dodatkowe startery PCR z nowatorskimi sekwencjami indeksowymi. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

P.C.D. jest wynalazcą dwóch patentów (PCT/US2019/013714, US 2019/0284624 A1) związanych z opublikowaną pracą.