Bezwzględna kwantyfikacja Sekwencjonowanie RNA (AQRNA-seq) to technologia opracowana do ilościowego określania krajobrazu wszystkich małych RNA w mieszaninach biologicznych. W tym miejscu zademonstrowano zarówno etapy przygotowania biblioteki, jak i przetwarzania danych AQRNA-seq, określając ilościowo zmiany w puli transferu RNA (tRNA) w Mycobacterium bovis BCG podczas spoczynku wywołanego głodem.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
AQRNA-seq do ilościowego oznaczania małych RNA
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
AQRNA-seq zapewnia bezpośrednią liniową zależność między liczbą odczytów sekwencjonowania a małą liczbą kopii RNA w próbce biologicznej, umożliwiając w ten sposób dokładną kwantyfikację puli małych RNA. Opisana tutaj procedura przygotowania biblioteki AQRNA-seq obejmuje użycie specjalnie zaprojektowanych łączników sekwencjonowania i etapu redukcji modyfikacji metylacji RNA, które blokują procesywność odwrotnej transkrypcji, co skutkuje zwiększoną wydajnością cDNA o pełnej długości. Ponadto przedstawiono szczegółową realizację towarzyszącego pipeline'u bioinformatycznego. Ta demonstracja AQRNA-seq została przeprowadzona poprzez analizę ilościową 45 tRNA w Mycobacterium bovis BCG zebranych w ciągu 5 wybranych dni w ciągu 20-dniowego okresu deprywacji składników odżywczych i 6 dni resuscytacji. W tym miejscu omówione zostaną również bieżące wysiłki na rzecz poprawy skuteczności i rygoru AQRNA-seq. Obejmuje to badanie metod zapobiegania oczyszczaniu żelu w celu złagodzenia problemów z dimerami starterów po amplifikacji PCR oraz zwiększenia udziału odczytów o pełnej długości, aby umożliwić dokładniejsze mapowanie odczytu. Przyszłe ulepszenia AQRNA-seq będą skoncentrowane na ułatwieniu automatyzacji i wysokoprzepustowego wdrożenia tej technologii do ilościowego oznaczania wszystkich małych gatunków RNA w próbkach komórkowych i tkankowych pochodzących z różnych organizmów.
Wprowadzenie
Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS), znane również jako sekwencjonowanie masowo równoległe, to technologia sekwencjonowania DNA, która obejmuje fragmentację DNA, ligację oligonukleotydów adaptorowych, amplifikację opartą na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), sekwencjonowanie DNA i ponowne składanie sekwencji fragmentów w genom. Adaptacja NGS do sekwencji RNA (sekwencja RNA) to potężne podejście do identyfikacji i ilościowego określania transkryptów RNA i ich wariantów1. Innowacyjne osiągnięcia w procesach przygotowywania bibliotek RNA i potokach analizy bioinformatycznej, w połączeniu z postępem w oprzyrządowaniu laboratoryjnym, poszerzył....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Rysunek 1 przedstawia graficzną ilustrację procedur związanych z przygotowaniem biblioteki AQRNA-seq. Szczegółowe informacje na temat odczynników, substancji chemicznych oraz kolumn/zestawów stosowanych w procedurze można znaleźć w Tabeli Materiałów. Zaleca się przeprowadzenie kompleksowej oceny czystości, integralności i ilości wejściowych próbek RNA przy użyciu (i) 3% elektroforezy w żelu agarozowym, (ii) zautomatyzowanych narzędzi do elektroforezy do kontroli jakości próbek biomolekuł (patrz tabela materiałów) oraz (iii) spektrofotometrii UV-visible i/lub kwantyfikacji fluorometrycznej. Obowiązk....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Mycobacterium bovis BCG (bacilli de Calmette et Guérin) szczep 1173P2 w fazie wzrostu wykładniczego poddano serii czasowej (0, 4, 10 i 20 dni) głodzenia nutrientowego, po czym przeprowadzono 6-dniową resuscyjację w pożywce bogatej w składniki odżywcze, zgodnie z metodą opisaną wcześniej przez Hu i wsp.7. Małe RNA wyizolowano z hodowli bakteryjnej, w trzech powtórzeniach biologicznych, w każdym z pięciu wyznaczonych punktów czasowych. Biblioteki Illumina przygotowano zgodnie z opisanym pow.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przebieg przygotowania biblioteki AQRNA-seq został zaprojektowany tak, aby zmaksymalizować wychwytywanie RNA w próbce i zminimalizować spadek polimerazy podczas odwrotnej transkrypcji7. Poprzez dwuetapową ligację łącznikową, nowe oligonukleotydy DNA (Linker 1 i Linker 2) są ligowane w nadmiarze, aby w pełni uzupełnić RNA w próbce. Nadmiar łączników można skutecznie usunąć za pomocą RecJf, egzonukleazy od 5 'do 3' specyficznej dla jednoniciowych DNA, pozostawiając nienaruszone produkty ligowane. Po.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
P.C.D. jest wynalazcą dwóch patentów (PCT/US2019/013714, US 2019/0284624 A1) związanych z opublikowaną pracą.
Podziękowania
Autorzy niniejszej pracy są wdzięczni autorom oryginalnego artykułu opisującego technologię AQRNA-seq7. Prace te były wspierane przez granty z National Institutes of Health (ES002109, AG063341, ES031576, ES031529, ES026856) oraz National Research Foundation of Singapore za pośrednictwem Singapore-MIT Alliance for Research and Technology Antimicrobial Resistance IRG.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 2-ketoglutaran | Sigma-Aldrich | 75890 | Przygotować roztwór roboczy (1 M) i przechowywać go w temperaturze -20º C |
| 2100 Bioanalizator | Agilent | G2938C | |
| 5'-trifosforan adenozyny (ATP) | New England Biolabs | M0437M (składnik #: N0437AVIAL) | NEB M0437M zawiera ligazę T4 RNA 1 (30 U/μ L), bufor reakcyjny ligazy RNA T4 (10X), PEG 8000 (1X) i ATP (100 mM); przygotować roztwór roboczy (10 mM) i przechowywać go w temperaturze -20º C |
| AGAROZA GPG/LE | AmericanBio | AB00972-00500 | Przechowywać w temperaturze otoczenia |
| Sześciowodny siarczan amonu żelaza(II) | Sigma-Aldrich | F2262 | Przygotować roztwór roboczy (0,25 M) i przechowywać go w temperaturze -20 stopni; C |
| Bioanalyzer Analiza małego RNA | Agilent | 5067-1548 | Analiza małego RNA służy do sprawdzania jakości wejściowych RNA i wydajności reakcji enzymatycznych (np. ligacja Linker 1) |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA; 10 mg/ml) | New England Biolabs | B9000 | Ten produkt został wycofany z produkcji 15.12.2022 r. i został zastąpiony albuminą rekombinowaną, klasy biologii molekularnej (NEB B9200). |
| Chloroform | Macron Fine Chemicals | 4441-10 | |
| Demetylaza | ArrayStar | AS-FS-004 | jest dostarczana z obróbką wstępną tRNA rtStar i Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA (AS-FS-004) |
| Mieszanina roztworów deoksynukleotydów (dNTP) | New England Biolabs | N0447L (składnik #: N0447LVIAL) | Ta mieszanina roztworów dNTP zawiera równomolowe stężenia dATP, dCTP, dGTP i dTTP (po 10 mM) |
| Cyfrowy podwójny blok grzewczy | VWR Scientific Products | 13259-052 | Blok grzewczy jest używany z QIAquick Zestaw do ekstrakcji żelu |
| Barwnik Ex Zestaw wirowania 2.0 | Qiagen | 63204 | Skuteczny w usuwaniu krótkich pozostałości (np. oligonukleotydów o długości mniejszej niż 10 pz) |
| Zasilanie do elektroforezy | Bio-Rad | PowerPac 300 | |
| Eppendorf PCR (0,5 ml) | Probówki Eppendorf | 0030124537 | |
| Eppendorf Safe-Lock (0,5 ml) | Probówki Eppendorf | 022363611 | |
| Eppendorf Safe-Lock (1,5 ml) | Probówki Eppendorf | 022363204 | |
| Eppendorf Safe-Lock (2 ml) | Eppendorf | 022363352 | |
| Alkohol etylowy (etanol), czysty | Sigma-Aldrich | E7023 | Czysty etanol jest używany z zestawem Oligo Clean and Concentrator Kit firmy Zymo Research |
| Gel Imaging System | Alpha Innotech | FluorChem 8900 | |
| Gel Loading Dye, fioletowy (6X), bez SDS | New England Biolabs | N0556S (składnik #: B7025SVIAL) | NEB N0556S zawiera Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder i Gel Loading Dye, fioletowy (6X), bez SDS |
| GENESYS 180 Spektrofotometr UV-Vis | Thermo Fisher Scientific | 840-309000 | Spektrofotometr służy do pomiaru stężeń oligonukleotydów przy użyciu prawa Beera |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | Przygotować roztwór roboczy (1 M; pH = 8 z NaOH) i przechowywać go w temperaturze -20 & stopni; C |
| Kwas solny (HCl) | Produkty naukowe VWR | BDH3028 | Przygotować roztwór roboczy (5 M) i przechowywać go w temperaturze otoczenia |
| Alkohol izopropylowy (Isopropanol), czysty | Macron Fine Chemicals | 3032-16 | Izopropanol jest używany z QIAquick Zestaw do ekstrakcji żelu |
| Kwas L-askorbinowy | Sigma-Aldrich | A5960 | Przygotować roztwór roboczy (0,5 M) i przechowywać go w temperaturze -20º C |
| Mikrowirówka | Eppendorf | 5415D | |
| NanoDrop 2000 Spektrofotometr | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| NEBuffer 2 (10X) | New England Biolabs | M0264L (składnik #: B7002SVIAL) | NEB M0264L zawiera RecJf (30 U/μ L) oraz NEBuffer 2 (10X); Przechowywać w temperaturze -20 & C |
| Woda wolna od nukleaz (nie poddawana działaniu DEPC) | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
| Oligo Czysty & Zestaw koncentratora | Badania Zymo | D4061 | Przechowywać w temperaturze otoczenia |
| PEG 8000 (50% roztwór) | New England Biolabs | M0437M (składnik #: B1004SVIAL) | NEB M0437M zawiera ligazę T4 RNA 1 (30 U/μ L), bufor reakcyjny ligazy RNA T4 (10X), PEG 8000 (1X) i ATP (100 mM); przygotować roztwór roboczy (10 mM) i przechowywać go w temperaturze -20º C |
| Peltier Thermal Cycler | MJ Research | PTC-200 | |
| Fenol:choloroform:izoamyl alkohol 25:24:1 pH = 5,2 | Thermo Fisher Scientific | J62336 | |
| Bufor PrimeScript (5X) | TaKaRa | 2680A | |
| Odwrotna transkryptaza | PrimeScript TaKaRa | 2680A | |
| QIAszybki Zestaw do ekstrakcji żelu | Qiagen | 28704 | Ten zestaw wymaga bloku grzewczego i izopropanolu do pracy z |
| Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder | New England Biolabs | N0551S (składnik #: N0551SVIAL) | |
| Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder | New England Biolabs | N0556S (składnik #: N0556SVIAL) | NEB N0556S zawiera Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder i Gel Loading Dye, fioletowy (6X), bez SDS |
| RecJf (30 U/μ L) | New England Biolabs | M0264L (składnik #: M0264LVIAL) | NEB M0264L zawiera RecJf (30 U/μ L) oraz NEBuffer 2 (10X); Przechowywać w temperaturze -20 & |
| Inhibitor RNazy C (mysi; 40 U/μ L) | Nowa Anglia Biolabs | M0314L ( składnik #: M0314LVIAL) | Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C |
| SeqAMP Polimeraza DNA | TaKaRa | 638509 | TaKaRa 638509 zawiera SeqAMP Polimeraza DNA oraz SeqAMP Bufor PCR (2X) |
| SeqAMP Bufor PCR (2X) | TaKaRa | 638509 | TaKaRa 638509 zawiera SeqAMP Polimeraza DNA oraz SeqAMP Bufor PCR (2X) |
| Fosfataza alkaliczna krewetek (1 U/μ L) | New England Biolabs | M0371L ( składnik #: M0371LVIAL) | |
| Wodorotlenek sodu (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | Przygotować roztwór roboczy (5 M) i przechowywać go w temperaturze otoczenia |
| Ligaza DNA T4 (400 U/μ L) | Nowa Anglia Biolabs | M0202L ( składnik #: M0202LVIAL)NEB | M0202L zawiera ligazę DNA T4 (400 U/μ L) i bufor reakcyjny ligazy DNA T4 (10X) |
| Bufor reakcyjny ligazy DNA T4 (10X) | Nowa Anglia Biolabs | M0202L ( składnik #: B0202SVIAL)NEB | M0202L zawiera ligazę DNA T4 (400 U/μ L) i bufor reakcyjny ligazy DNA T4 (10X) |
| Ligaza RNA T4 1 (30 U /μ L) | New England Biolabs | M0437M (składnik #: M0437MVIAL) | NEB M0437M zawiera ligazę RNA T4 1 (30 U/μ L), bufor reakcyjny ligazy RNA T4 (10X), PEG 8000 (1X) i ATP (100 mM) |
| Bufor reakcyjny ligazy RNA T4 (10X) | New England Biolabs | M0437M (składnik #: B0216SVIAL) | NEB M0437M zawiera ligazę T4 RNA 1 (30 U/μ L), bufor reakcyjny ligazy RNA T4 (10X), PEG 8000 (1X) i ATP (100 mM) |
Bibliografia
- Byron, S. A., Van Keuren-Jensen, K. R., Engelthaler, D. M., Carpten, J. D., Craig, D. W. Translating RNA sequencing into clinical diagnostics: opportunities and challenges. Nat Rev Gen. 17 (5), 257-271 (2016).
- Grillone, K., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
