Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Chirurgiczna perfuzja i izolacja trzustki świni w celu izolacji wysp trzustkowych

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66350

⸱

7 czerwca 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Section of Vascular Surgery, Washington University School of Medicine, 2CardioVascular Research Innovation in Surgery and Engineering Center, Washington University School of Medicine, 3Department of Medicine, Division of Nephrology, Washington University School of Medicine, 4Department of Medicine, Division of Endocrinology, Washington University School of Medicine, 5Department of Surgery, Section of Transplant Surgery, Washington University School of Medicine, 6Division of Molecular Cell Biology, Washington University School of Medicine, 7Department of Biomedical Engineering, Washington University McKelvey School of Engineering

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący pobierania trzustki świni do izolacji i oczyszczania wysp trzustkowych.

Streszczenie

Przeszczep wysp trzustkowych jest nowym sposobem leczenia cukrzycy typu I; jednak jest ograniczony przez dopasowanie dawców i dostępność. Ksenotransplantacja wysepek trzustkowych świń stanowi obiecującą alternatywę dla allotransplantacji, z potencjałem do produkcji na dużą skalę funkcjonalnych wysepek trzustkowych na żądanie. Wydajność i żywotność izolowanych wysp trzustkowych jest wysoce podatna na jakość trzustki dawcy i sposób jej pozyskiwania, a zwłaszcza czas trwania ciepłego niedokrwienia. Aby poprawić zachowanie narządów, a następnie wydajność i żywotność wysp trzustkowych, opracowaliśmy protokół chirurgicznej perfuzji i resekcji trzustki świni. Protokół ten wykorzystuje bezpośrednią kaniulację aorty podnerkowej i perfuzję narządów, aby zarówno zminimalizować czas ciepłego niedokrwienia, jak i uprościć procedurę dla operatorów, którzy nie mają rozległej wiedzy chirurgicznej. Późniejsza perfuzja tętnicza trzustki przez aortę wypłukuje zastój krwi z mikrokrążenia, zmniejszając w ten sposób zakrzepicę i oksydacyjne uszkodzenie tkanki. Manuskrypt ten zawiera szczegółowy protokół chirurgicznej perfuzji i resekcji trzustki świni, a następnie izolacji i oczyszczenia wysp trzustkowych.

Wprowadzenie

Cukrzyca typu 1 jest spowodowana autoimmunologicznym niszczeniem komórek beta trzustki1. W związku z tym pacjenci są uzależnieni od egzogennej insuliny, co naraża ich na wysokie ryzyko wahań glikemii z epizodami hiper- i hipoglikemii2. Allotransplantacja wysp trzustkowych jest potencjalnym lekarstwem na cukrzycę typu I; Jednak ograniczona dostępność dawców narządów trzustki pozostaje główną przeszkodą w powszechnym przyjęciu tej procedury2,3. Ksenotransplantacja wysp trzustkowych od dawców świń jest obiecującą alternatywą, ponieważ zwierzęta te są łatwo dostępne. Optymalizacja i skalowanie izolacji wysp trzustkowych trzustki świń będzie miało kluczowe znaczenie dla postępu ksenotransplantacji wysp trzustkowych.

Chociaż kilka technik pobierania trzustki od świń zostało wcześniej opublikowanych, wiele z tych procedur opisuje pankreatektomię po indukcji śmierci sercowej lub wykrwawieniu4,5,6,7,8,9,10. Jedną z głównych wad tych technik jest zmienny ciepły czas niedokrwienny (WIT) występujący między czasem zgonu sercowego a rozpoczęciem dotętniczej i/lub wewnątrzprzewodowej infuzji roztworu konserwującego. Nawet 10 minut WIT negatywnie wpłynie na wydajność i żywotność wysepek5. Minimalizacja WIT wymaga szybkiej perfuzji trzustki roztworem konserwującym. Podczas pobierania narządów jamy brzusznej kaniulacja aorty, a następnie perfuzja śródustrojowa roztworem University of Wisconsin (UW) ma kluczowe znaczenie dla usuwania krwi, zapobiegania zakrzepicy wewnątrznaczyniowej, ochrony przed uszkodzeniem niedokrwiennym i minimalizacji uszkodzeń komórkowych11,12.

Poprzednie badania wykazały, że podczas pobierania trzustki u świń, niskociśnieniowe płukanie pnia trzewnego i tętnicy krezkowej górnej roztworem UW poprawia wydajność i czystość wysp trzustkowych4. Jednak wcześniej opublikowane metody pozyskiwania trzustki świń obejmują otwartą kaniulację aorty, która może być technicznie trudna, szczególnie w przypadku mniejszych świń13,14,15. W tym manuskrypcie przedstawiamy szczegółowy protokół krok po kroku wraz z towarzyszącymi pomocami wizualnymi do chirurgicznej perfuzji i pobrania trzustki świni, a następnie izolacji i oczyszczenia wysp trzustkowych. Ta nowa technika kaniulacji aorty podczas izolacji trzustki została opracowana specjalnie w celu zminimalizowania WIT i umożliwienia pobrania trzustki w polu bezkrwawym jako sposób na maksymalizację wydajności i żywotności izolacji wysp trzustkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt są zatwierdzane przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Wydziale Medycyny Porównawczej Szkoły Medycznej Uniwersytetu Waszyngtońskiego. Dorosłe świnie Yorkshire o wadze od 35 do 35 kg są idealne do tej procedury; Protokół może być jednak dostosowany do świń o różnej wielkości, w zależności od kontekstu doświadczalnego. Cała procedura powinna być wykonana w sposób sterylny w układzie sali operacyjnej.

1. Przygotowanie przedoperacyjne i znieczulenie

  1. Uspokoić świnię koktajlem składającym się z 4 mg/kg tiletaminy i zolazepamu, 20 mg/kg ketaminy i 2 mg/kg ksylazyny wstrzykniętych domięśniowo.
  2. Ustalić obwodowy dostęp żylny przez żyłę uszną.
  3. Wywołaj znieczulenie ogólne wziewnym 1%-3% izofluranem w 100% tlenu i zaintubuj intubację dotchawiczą świni.
    UWAGA: Może być preferowane użycie propofolu lub innego środka do indukcji dożylnej zamiast inhalacji do indukcji w celu płynniejszej procedury indukcji i intubacji. Parametry życiowe, końcowo-oddechowy CO2 , nasycenie tlenem i przebieg fali serca są stale monitorowane w celu oceny i utrzymania głębokości znieczulenia. Płaszczyzna operacyjna jamy brzusznej jest potwierdzana za pomocą przyłóżkowych ultradźwięków.
  4. Ogolić i przygotować świnię glukonianem chlorheksydyny od wcięcia mostka do obustronnych pachwin.
  5. Ułóż pole operacyjne tak, aby było dobrze widoczne całe ciało brzucha (Ryc. 1A).

2. Operacja i odsłonięcie części zaotrzewnowej

  1. Wykonaj nacięcie laparotomii w linii środkowej (Ryc. 1B).
    1. Użyj skalpela z 10 ostrzami i elektrokoagulacji, aby wykonać laparotomię w linii środkowej od wyrostka mieczykowatego do kości łonowej. Uważaj, aby zakrzywić nacięcie wokół dolnego ujścia układu moczowo-płciowego w jamie brzusznej.
  2. Wykonaj rotację trzewną w prawo.
    1. Uzewnętrznij prawą okrężnicę i jelito cienkie, owijając je sterylnym ręcznikiem.
    2. Delikatnie cofnij okrężnicę i jelito w lewo, aby odsłonić prawą zaotrzewnową, unikając skrętu jelita lub malrotacji.
  3. Opróżnij pęcherz (opcjonalnie).
    1. Jeśli pęcherz jest pełny i narażony na ekspozycję, chwyć pęcherz między dwoma kleszczami DeBakeya i użyj skalpela z 11 ostrzami, aby naciąć brzuszną ścianę pęcherza.
    2. Umieść końcówkę ssącą Yankauer w pęcherzu, aby odprowadzić mocz i odbarczyć pęcherz.
  4. Ustaw zestaw retraktora brzusznego, aby ułatwić optymalne odsłonięcie prawej części zaotrzewnowej (Rysunek 1C).

3. Rozwarstwienie zaotrzewnowe

  1. Rozpocznij rozwarstwienie zaotrzewnowe (Ryc. 2A).
    1. Za pomocą elektrokoagulacji naciąć otrzewną po prawej stronie linii środkowej, od poziomu prawej nerki do rozwidlenia aorty.
    2. Ostro odsłonić aortę podnerkową, żyłę główną dolną (IVC) oraz prawą tętnicę nerkową i żyłę
  2. Uzyskaj obwodową kontrolę dystalnej aorty podnerkowej z dużą pętlą naczyniową.
  3. Ligacja IVC (Rysunek 2B).
    1. Uzyskaj kontrolę obwodową IVC śródnerkowego.
    2. Liguj IVC za pomocą jedwabnego krawata 2-0.
  4. Podwiązywać naczynia nerkowe (Rysunek 2C).
    1. Uzyskaj kontrolę obwodową prawej i lewej tętnicy nerkowej i żył.
    2. Zwiąż te struktury za pomocą jedwabnych krawatów 2-0.
    3. Jeśli istnieje wiele tętnic nerkowych, podobnie wyizoluj i podwiąż każde z tych naczyń.

4. Rozwarstwienie wewnątrzklatki piersiowej

  1. Naciąć prawą półmembranę (Rysunek 3A).
    1. Delikatnie cofnij wątrobę dolnie, aby odsłonić prawą półprzeponę. Przyłóż dwa zaciski Allis do błoniastej części prawej półmembrany i naciąć membranę między dwoma zaciskami za pomocą elektrokoagulacji.
    2. Przedłuż miotomię przepony do około 7 cm w poziomie.
  2. Uzyskaj kontrolę obwodową IVC w obrębie klatki piersiowej (Rysunek 3B).
    1. Umieść jedwabny krawat 2-0 wokół IVC wewnątrz klatki piersiowej. Zatrzaśnij końce szwu małym hemostatem bez zamykania IVC.
  3. Rozszerz przeponę do lewej półmembrany (Rysunek 3C).
    1. Użyj dwóch zacisków Allis, aby cofnąć krawędź przepony dolnie i wysunąć do lewej półprzepony.
      UWAGA: Unikaj wchodzenia do osierdzia podczas diafragmotomii.
  4. Odsłoń zstępującą aortę piersiową w lewej tylno-przyśrodkowej okolicy klatki piersiowej.

5. Kanegulacja podnerkowa aorty, izolacja trzewna i perfuzja

  1. Ogólnoustrojowo przeciwzakrzepowe świnia.
    1. Podawać heparynę ogólnoustrojową (100 j./kg) przez obwodowy dostęp żylny. Odczekaj 3 minuty przed przystąpieniem do kaniulacji aorty.
  2. Uzyskaj dostęp do aorty podnerkowej za pomocą igły do mikronakłuwania 18 G (Rysunek 4A).
  3. Przełóż drut j przez igłę do aorty i wyjmij igłę z drutu.
  4. Umieść osłonę 10Fr na drucie w aorcie i wyjmij drut (Rysunek 4B).
  5. Podłącz rurkę dożylną do osłony 10Fr i w sterylny sposób wlej roztwór UW przez osłonę. Zaparzać roztwór UW w ilości 40-60 kropli/min.
    UWAGA: Przepływ nie rozpocznie się, dopóki aorta piersiowa nie zostanie zaciśnięta krzyżowo. Upewnij się, że rurka dożylna nie jest napięta, aby uniknąć przemieszczenia osłonki wewnątrzaortalnej.
  6. Wykonaj izolację trzewną i perfuzję w krótkich odstępach czasu.
    1. Zacisnąć aortę podnerkową za pomocą zacisku aortalnego.
    2. Zacisnąć zstępującą aortę piersiową za pomocą zacisku aortalnego.
    3. Zwiąż IVC w klatce piersiowej z wcześniej umieszczonym krawatem 2-0.
    4. Podawać 100 mg/kg KCl do eutanazji przez obwodowy dostęp żylny.
      UWAGA: Śmierć sercowa rozpoczyna się od podania KCl.
    5. Wykonaj janotomię w podnerkowym IVC, lepszym niż wiązanie 2-0, i wprowadź ssanie z końcówką kałużową przez wenotomię (Ryc. 4C).
    6. Ukrwić wnętrzności 2-3 litrami zimnego roztworu UW.
    7. Kontynuuj sekcję w celu całkowitej pankreatektomii podczas perfuzji.
      UWAGA: Wnętrzności, a w szczególności trzustka, powinny stać się blade, gdy roztwór UW jest przenikany do obszaru narządu stałego (Ryc. 5A).

6. Całkowita pankreatektomia

  1. Uwolnij jelito cienkie z retrakcji, gdy roztwór UW przenika.
  2. Rozpocznij preparację płatów dwunastnicy, łączących i śledziony trzustki podczas perfuzji trzewnej. Cofnij żołądek wyżej, aby odsłonić trzustkę. Za pomocą kombinacji rozwarstwienia i elektrokoagulacji należy wypreparować trzustkę z jej przyczepów omentalnych.
    UWAGA: Trzon trzustki skutecznie owija się wokół żyły wrotnej. Należy uważać, aby żyła wrotna nie biegła do płata dwunastnicy, a następnie do przodu do mostu i płatów łączących.
  3. Odizoluj przewód trzustkowy (Rysunek 5B). Zlokalizuj przewód trzustkowy w miejscu, w którym wchodzi do dwunastnicy. Podkleić kanał za pomocą dwóch jedwabnych opasek 3-0 i przeciąć kanał między opaskami.
  4. Zakończ pankreatektomię (Rysunek 5C).
    1. Wypreparuj pozostałą część płata dwunastnicy od pętli C dwunastnicy, aż stanie się swobodnie ruchomy.
    2. Oddziel trzustkę od pozostałych przyczepów. Ostrożnie podwiązaj i podziel małe naczynia od tętnicy krezkowej górnej do trzustki.
    3. Oddziel trzustkę od żyły wrotnej. Wypreparuj trzon trzustki i płat łączący z żyły wrotnej. Podwiązać wszelkie gałęzie żylne od żyły wrotnej do trzustki, w tym żyłę śledzionową.
      1. Przeciąć mostek trzustki między płatem łączącym a płatem śledziony, aby umożliwić swobodną mobilizację z żyły wrotnej.
        UWAGA: Uważaj, aby nie zakłócić płata dwunastnicy trzustki od płata śledziony.
  5. Zanurz całą trzustkę w zimnym, sterylnym roztworze UW, natychmiast umieszczając pojemnik na lodzie. Przetransportuj trzustkę do sterylnego kaptura w celu odizolowania wysp trzustkowych. Kontynuuj izolację wysp trzustkowych (Ryc. 6).

7. Kaniulacja przewodu trzustkowego

  1. Umieść trzustkę na sterylnej tacy na lodzie wewnątrz szafki bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Wypreparuj nadmiar tkanki włóknistej i krwi z dala od trzustki.
  3. W razie potrzeby przeciąć kanał poprzecznie, aby lepiej uwidocznić światło. Zlokalizuj i wsuń kaniulę do kanału za pomocą cewnika o odpowiednim rozmiarze (16 G).
  4. Zabezpiecz cewnik na miejscu za pomocą jedwabnej opaski 2.0, ale unikaj zasłaniania światła.
  5. Przygotuj trzy roztwory odkażające i zanurz kaniulowaną trzustkę w każdym roztworze odkażającym na 60 sekund.

8. Perfuzja i rozdęcie trzustki

  1. Przygotuj roztwór do trawienia enzymatycznego (Rysunek 6).
    1. Wymieszaj 100 mg dostępnych w handlu roztworów kolagenazy 1 i 2 (więcej informacji znajduje się w Tabeli materiałów) z pożądaną ilością 1x HBSS i 10 000 U roztworu heparyny. Jeśli wyizolowana tkanka trzustki ma od 100 g do 200 g, wymieszaj enzym z 200 ml łącznie 1x roztwór HBSS i heparyny.
  2. Napełnij trzustkę roztworem enzymu.
    1. Z kontrolowaną umiarkowaną siłą wlać roztwór enzymu w 60 ml bolusów do przewodu trzustkowego. Kontynuuj ten proces, aż cały roztwór enzymu zostanie wstrzyknięty do trzustki.
      UWAGA: Skuteczna infuzja powinna spowodować rozciągnięcie tkanki trzustki.
    2. Jeśli jakiś roztwór enzymu wycieknie z tkanki trzustki do sterylnej tacy, należy ponownie wstrzyknąć pozostały roztwór do trzustki w kroku 8.3 lub umieścić go w komorze Ricordiego w kroku 9.2.
  3. Pozostały roztwór enzymu należy wstrzyknąć bezpośrednio do słabo rozdętych segmentów miąższu trzustki za pomocą igły 22 G.

9. Trawienie trzustki

  1. Umieść zbiornik obwodowy zawierający 500 ml 1x HBSS w łaźni wodnej ustawionej na 47 °C, aby podgrzać roztwór zbiornika.
    UWAGA: Roztwór enzymu działa optymalnie w temperaturze 36-38 °C i ta temperatura musi zostać osiągnięta w ciągu 5 minut od uruchomienia pompy perystaltycznej. Temperatura zawartości leku Ricordi, w tym trzustki podawanej enzymem, wynosi początkowo 4 °C. Poprzez wstępne podgrzanie zbiornika obiegu do 47 °C, zawartość zbiornika i komory Ricordi wymieszają się, podnosząc temperaturę całego obiegu do 36-38 °C w ciągu 5 minut od uruchomienia pompy perystaltycznej.
  2. Wyjmij i wyrzuć cewnik z przewodu trzustkowego i pokrój trzustkę na ~1-3 cm kawałki.
  3. Przygotować obwód trawienia. Pompa perystaltyczna będzie cyrkulować roztwór ze zbiornika obwodu mineralizacji, przez wężownicę grzewczą i do komory Ricordi ( Rysunek 6).
  4. Umieść kawałki trzustki z dziewięcioma kulkami z azotku krzemu o średnicy 1,5 cm w komorze Ricordi i napełnij do poziomu filtra pozostałym roztworem enzymu.
  5. Aby uszczelnić komorę Ricordi, umieść filtr siatkowy i gumową uszczelkę, a następnie pokrywę na komorze Ricordi. Zabezpiecz pokrywę komory Ricordi, dokręcając i upewnij się, że komora jest dobrze uszczelniona przed kontynuowaniem.
  6. Umieść wężownicę grzewczą w gorącej łaźni wodnej o temperaturze 47 °C.
  7. Umieść kaniule doprowadzające i odpływowe w zbiorniku obwodu mineralizacyjnego zawierającym 500 ml 1x HBSS.
  8. Uruchomić pompę z natężeniem przepływu 450 ml/min, aż cała komora zostanie wypełniona roztworem wytrawiającym. Zmniejsz natężenie przepływu do 100 ml/min, gdy płyn krąży w obwodzie.
  9. Ręcznie potrząśnij komorą wytrawiania, aby poruszyć tkankę kulkami z azotku krzemu.
  10. Zaczynając od 8 minut trawienia, należy pobrać 1 ml próbki ze zbiornika obwodu do barwienia ditizonem (DTZ) w celu monitorowania postępu trawienia.
    1. Aby przygotować barwienie DTZ, rozpuścić 10 mg DTZ w 2 ml dimetylosulfotlenku (DMSO).
    2. Dodać 10 μl przygotowanego barwnika DTZ do 1 ml próbki do wytrawiania. Sprawdź próbkę pod 4-krotnym powiększeniem. Wysepki będą ciemnoczerwone lub czarne z barwieniem DTZ.
      UWAGA: Trawienie jest zakończone, gdy większość lub wszystkie obserwowane wysepki są "wolne" i nienaruszone, a tkanka groniasta jest rozproszona na mniejsze skupiska.
  11. Gdy trawienie zostanie uznane za zakończone, przenieś cewkę do łaźni lodowej, wyjmij kaniulę dopływową ze zbiornika i zwiększ prędkość pompy do 210-250 ml/min. Pozwól, aby strawiona tkanka spłynęła z komory Ricordiego do zbiornika obwodu.
    UWAGA: Typowe jest to, że po trawieniu w komorze Ricordi pozostaje bardzo mało tkanki. Zazwyczaj <10% niestrawionej tkanki trzustki pozostaje, chociaż może się to różnić w zależności od czynników specyficznych dla próbki.
  12. Zważ pozostałą tkankę, aby określić efektywność trawienia. Przenieś strawioną tkankę ze zbiornika obwodu do stożkowych probówek o pojemności 250 ml, które są utrzymywane w chłodzie na lodzie.

10. Pobieranie tkanki trzustki

  1. Odwirować strawioną tkankę trzustkową w stożkowych probówkach o pojemności 250 ml przy 250 × g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C bez hamowania.
  2. Ostrożnie wyjąć probówki z wirówki i odessać supernatant za pomocą pipety serologicznej, unikając rozerwania osadu.
  3. Delikatnie zawiesić granulki w każdej stożkowej probówce i połączyć je w jedną stożkową probówkę o pojemności 250 ml. Jeśli w organizmie znajduje się ≤50 ml tkanki, zawiesić osad do całkowitej objętości 100 ml w roztworze do pobierania wysp trzustkowych. Jeśli w organizmie znajduje się >50 ml tkanki, należy ponownie zawiesić osad do całkowitej objętości 200 ml w roztworze do pobierania wysp trzustkowych. W przypadku, gdy zostanie pobranych ponad 100 ml tkanki, uruchom dwa cykle oczyszczania procesora komórkowego.
  4. Ponownie zawiesić tkankę w pożywce RPMI, aby uzyskać całkowitą objętość 100 ml (zakładając, że zebrano 50 ml tkanki) i załadować do procesora komórkowego.

11. Oczyszczanie wysepek metodą ciągłego gradientu

  1. Zalać procesor komórkowy zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Załaduj 125 ml roztworu gradientu o wysokiej gęstości do ciągłego formownika gradientu, a następnie załaduj roztwór gradientu o wysokiej gęstości do procesora komórkowego za pomocą pompy ustawionej na 200 ml / min.
  3. Uruchom funkcję wirówki Cell Processor przy 1,000 obr./min.
  4. Uwolnij powietrze z systemu i ponownie zalej roztworem gradientowym o dużej gęstości.
  5. Dodać 125 ml roztworu gradientu o dużej gęstości i 130 ml roztworu o niskiej gęstości do roztworu gradientowego.
  6. Załadować 100 ml strawionej zawiesiny tkankowej.
  7. Zwiększ prędkość procesora komórkowego do 2,000 obr./min na 3 min.
  8. Przygotować 16 stożkowych probówek o pojemności 50 ml do zbierania oczyszczonej frakcji wysp trzustkowych. Dodaj 25 ml pożywki RPMI do każdej probówki i ułóż wszystkie probówki w kolejności rosnącej.
  9. Zebrać oczyszczone frakcje wysp trzustkowych w przygotowanych stożkowych probówkach zbiorczych.

12. Ocena i barwienie wysepek

  1. Zebrać 100-200 μl podwielokrotności z każdej z oczyszczonych frakcji wysp trzustkowych i umieścić je na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej w celu barwienia DTZ w celu oceny zawartości wysp trzustkowych i z każdej frakcji oczyszczającej. Zbadaj każdą frakcję za pomocą mikroskopii świetlnej z 4-krotnym powiększeniem. Wysepki będą ciemnoczerwone do czarnych z zabarwieniem DTZ.
  2. Po zidentyfikowaniu wysepek wybierz frakcje o największej zawartości wysepek. Odwirować oczyszczoną frakcję w temperaturze 250 × g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C bez hamowania.
  3. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad wysepki w pożywce do wzrostu wysp. Przenieść oczyszczone wysepki do 1-4 kolb hodowlanych T-125.
  4. Po oczyszczeniu oceń wysepki pod względem ilości, żywotności i funkcji.
    1. Użyj licznika komórek wysepek, aby ocenić liczbę wysepek i rozkład wielkości (Rysunek 7A). Cała trzustka zazwyczaj daje 1-2 miliony ekwiwalentów wysp trzustkowych.
    2. W celu barwienia żywotności zmieszaj 2 μl kalceiny AM i 2 μl homodimeru etydyny-1 (CaAM/EthD-1) z 1,000 μl PBS (Figura 7B). Pozwól wysepkom być zabarwionymi przez 30 minut, a następnie oceń je pod 4-krotnym lub 10-krotnym powiększeniem. Żywotne wysepki będą barwione na zielono, podczas gdy nieżywotne wysepki będą barwione na czerwono.

13. Hodowla komórkowa wysp trzustkowych

  1. W ciągu początkowych 48 godzin hodować wysepki w pożywce regeneracyjnej w temperaturze 37 °C, aby zapewnić wystarczającą ilość składników odżywczych (~1 000 wysepek/ml pożywki regeneracyjnej).
  2. Od 2 do 21 dni hodować wysepki w standardowym podłożu w temperaturze 37 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Układ operacyjny oraz laparotomię po linii środkowej przedstawiono na Rysunku 1. Cięcie laparotomijne powinno być zakrzywione, aby uniknąć otworu urogenitalnego (Rysunek 1B). Podczas przygotowania rozwieraka należy przymocować wspornik rozwieraka Omni lub Bookwaltera do lewego, dolnego rogu stołu. Optymalna retrakcja obejmuje dwa ramiona rozwieraka dla prawej ściany brzucha, dwa dla lewej ściany brzucha oraz 1-2 ramiona dla prawej strony okrężnicy i jelita cienk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ksenotransplantacja wysp trzustkowych z wykorzystaniem dawców trzody chlewnej jest obiecującą strategią leczenia cukrzycy typu I. Izolacja wysp trzustkowych jest trudna, a końcowa żywotność i wydajność wysp trzustkowych są bardzo podatne na niedociśnienie i niedokrwienie tkanek występujące podczas pobierania narządów16,17. Aby zoptymalizować pobieranie i zachowanie trzustki, protokół ten przedstawia nową metodę kaniulacji aorty, izolacji trzewnej i perfuzji podcz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Podziękowania

Ten manuskrypt został wsparty grantem na innowacje kliniczne od Mid-America Transplant Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 M NaOH, 100 mlMillipore Sigma1310-73-2
10x HBSS, 500 ml (15 do 30 ° C)Thermo Fisher14065056
1x D-PBS, 500 mlThermo Fisher14200075
1x HBSS, 1 LThermo Fisher14025076
250 ml Probówki stożkoweMillipore SigmaCLS430236-6EA
Amfoterycyna B [50 mg]Millipore SigmaPHR1662
Antyseptyczny Powidon Jod 10%Millipore Sigma25655-41-8
BioRad Gradient FormerBioRad395
Chlorek wapnia dwuwodnyThermo Fisher10035-04-8
Procesor komórkowy COBEEbay317690 
Zbiornik obwodu trawienia, butelka Gibco, 1 LThermo Fisher10341001
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Thermo Fisher85190
DithizoneThermo Fisher60-10-6
Zestaw do łączenia gradientowegoBioRad1652008
Heparyna [1000 U/mL]Produkty ratownictwa medycznego0409-2720-01
Bufor HEPES (1 m), 100 mlThermo Fisher15630080
Albumina surowicy ludzkiej 25%, 100 mlCelprogenHSA2001-25-1
IsofluraneCovetrusPozycja#:11695067772
KetaminaPattersonPozycja #:07-894-8462
Liberaza (100 mg)Millipore Sigma5401020001
ŻYWY/MARTWY Zestaw do żywotności/cytotoksycznościThermo FisherL3224
Limpholyte 1.1 Media 500 mlCedarlane LabsCL5020
Masterflex LS 16 RurkaMasterfle96419-16
Masterflex Pompa perystaltycznaMasterflex07522-30
PenStrep (2 mg/ml)CelprogenPS-30-002
Pulmozyme (1 mg/ml, 2,5 ml/fiolkę)Dornase Alfa8931278
Pożywka do odzysku, PIM(R)Prodo Laboratories, Inc.PIM-R001GMP
RPMI 1640Millipore SigmaR8758-1L
Standardowa pożywka hodowlana, PIM(S)Prodo Laboratories, Inc.PIM-S001GMP
Tzed™ (tiletamina i zolazepam) Wstrzyknięcie CPattersonPozycja #:07-894-6240
Roztwór Uniwersytetu Wisconsin (UW), 3 lGlobalne roztwory do przeszczepów1000-0046-06
Kąpiel wodnaSigma AlderichCLS6783-1EA
KsylazynaPattersonPozycja #:07-891-6165

Bibliografia

  1. Gillespie, K. M. Type 1 diabetes: pathogenesis and prevention. CMAJ. 175 (2), 165-170 (2006).
  2. Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nat Rev Endocrinol. 13 (5), 268-277 (2017).
  3. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343 (4), 230-238 (2000).
  4. Anazawa, T., et al. Improved method of porcine pancreas procurement with arterial flush and ductal injection enhances islet isolation outcome. Transplant Proc. 42 (6), 2032-2035 (2010).
  5. Dufrane, D., et al. Parameters favouring successful adult pig islet isolations for xenotransplantation in pig-to-primate models. Xenotransplantation. 13 (3), 204-214 (2006).
  6. Hilling, D. E., Rijkelijkhuizen, J. K., Tons, H. A., Terpstra, O. T., Bouwman, E. Porcine islet isolation outcome is not affected by the amount and distribution of collagen in the pancreas. Xenotransplantation. 17 (3), 250-255 (2010).
  7. Lamb, M., et al. In vitro maturation of viable islets from partially digested young pig pancreas. Cell Transplant. 23 (3), 263-272 (2014).
  8. Otsuka, R., et al. Pancreas preservation with a neutrophil elastase inhibitor, alvelestat, contributes to improvement of porcine islet isolation and transplantation. J Clin Med. 11 (15), 4290(2022).
  9. Vanderschelden, R., Sathialingam, M., Alexander, M., Lakey, J. R. T. Cost and scalability analysis of porcine islet isolation for islet transplantation: comparison of juvenile, neonatal and adult pigs. Cell Transplant. 28 (7), 967-972 (2019).
  10. Weegman, B. P., et al. Temperature profiles of different cooling methods in porcine pancreas procurement. Xenotransplantation. 21 (6), 574-581 (2014).
  11. Hart, N. A., et al. Determination of an adequate perfusion pressure for continuous dual vessel hypothermic machine perfusion of the rat liver. Transpl Int. 20 (4), 343-352 (2007).
  12. Tullius, S. G., et al. Accumulation of crystal deposits in abdominal organs following perfusion with defrosted University of Wisconsin solutions. Am J Transplant. 2 (7), 627-630 (2002).
  13. Ching, C. D., et al. A reliable method for isolation of viable porcine islet cells. Arch Surg. 136 (3), 276-279 (2001).
  14. Lu, Y., et al. Adult pig islet isolation. J Vis Exp. (176), (2021).
  15. Taylor, M. J., Baicu, S., Greene, E., Vazquez, A., Brassil, J. Islet isolation from juvenile porcine pancreas after 24-h hypothermic machine perfusion preservation. Cell Transplant. 19 (5), 613-628 (2010).
  16. Iwanaga, Y., Sutherland, D. E., Harmon, J. V., Papas, K. K. Pancreas preservation for pancreas and islet transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 13 (4), 445-451 (2008).
  17. Pratschke, J., et al. Brain death and its influence on donor organ quality and outcome after transplantation. Transplantation. 67 (3), 343-348 (1999).
  18. vander Windt, D. J., et al. Early islet damage after direct exposure of pig islets to blood: has humoral immunity been underestimated. Cell Transplant. 21 (8), 1791-1802 (2012).
  19. Wright, M. J., Cavanagh, T. J., Fetterhoff, T. J., Wile, K. J. Effect of blood content on porcine pancreatic dissociation and islet yield. Transplant Proc. 26 (6), 3442(1994).
  20. Toso, C., et al. Isolation of adult porcine islets of Langerhans. Cell Transplant. 9 (3), 297-305 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Wyspy trzustkoweksenotransplantacjakaniulacja aortykonserwacja organówtrawienie trzustkioczyszczanie wyspwirowanie gradientowe
Chirurgiczna perfuzja i izolacja trzustki świni w celu izolacji wysp trzustkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.