Tłumaczenie wyników mikroskopii przyżyciowej jest utrudnione ze względu na jego płytką głębokość penetracji w tkanki. W tym miejscu opisujemy mysi model komory z oknem grzbietowym, który umożliwia jednoczesną rejestrację mikroskopii przyżyciowej i klinicznie stosowanych metod obrazowania (np. CT, MRI) w celu bezpośredniej korelacji przestrzennej, potencjalnie usprawniając kliniczne tłumaczenie wyników mikroskopii przyżyciowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mysi model guza w komorze grzbietowego fałdu skórnego do połączonej mikroskopii przyżyciowej i obrazowania metodą rezonansu magnetycznego w translacyjnych badaniach nad rakiem
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przedkliniczne obrazowanie przyżyciowe, takie jak mikroskopia i optyczna koherentna tomografia, okazały się cennymi narzędziami w badaniach nad rakiem do wizualizacji mikrośrodowiska guza i jego odpowiedzi na terapię. Te metody obrazowania mają rozdzielczość w skali mikronowej, ale mają ograniczone zastosowanie w klinice ze względu na ich niewielką głębokość penetracji w tkankę. Bardziej klinicznie stosowane metody obrazowania, takie jak CT, MRI i PET, mają znacznie większą głębokość penetracji, ale mają stosunkowo niższą rozdzielczość przestrzenną (skala mm).
Aby przełożyć wyniki przedklinicznego obrazowania przyżyciowego na praktykę kliniczną, należy opracować nowe metody, które wypełnią tę lukę w rozdzielczości mikro i makro. W tym miejscu opisujemy mysi model guza w komorze grzbietowego fałdu skórnego, zaprojektowany w celu umożliwienia przedklinicznego obrazowania przyżyciowego i klinicznego (CT i MR) u tego samego zwierzęcia oraz platformę analizy obrazu, która łączy te dwie rozbieżne metody wizualizacji. Co ważne, opisane podejście oparte na komorze okiennej umożliwia jednoczesną rejestrację różnych modalności obrazowania w 3D przy użyciu znaczników odniesienia na komorze okiennej w celu uzyskania bezpośredniej zgodności przestrzennej. Model ten może być wykorzystany do walidacji istniejących metod obrazowania klinicznego, a także do opracowania nowych poprzez bezpośrednią korelację z "podstawowymi" wynikami o wysokiej rozdzielczości w trybie przyżyciowym.
Wreszcie, odpowiedź guza na różne metody leczenia - chemioterapię, radioterapię, terapię fotodynamiczną - może być monitorowana długodystansowo za pomocą tej metodologii przy użyciu przedklinicznych i klinicznie stosowanych metod obrazowania. Mysi model guza w komorze grzbietowego fałdu skórnego i opisane tutaj platformy obrazowania mogą być zatem wykorzystane w różnych badaniach nad rakiem, na przykład w przełożeniu wyników przedklinicznej mikroskopii przyżyciowej na bardziej klinicznie stosowane metody obrazowania, takie jak tomografia komputerowa lub rezonans magnetyczny.
Wprowadzenie
Mikrokrążenie guza jest ważnym składnikiem mikrośrodowiska guza, który może być celem terapii i determinantą odpowiedzi na leczenie. W warunkach przedklinicznych mikrokrążenie jest zwykle badane za pomocą mikroskopii przyżyciowej w ortotopowych lub heterotopowych modelach zwierzęcych z komory okiennej1,2. Ma to kilka zalet w porównaniu z badaniami histologicznymi, ponieważ obrazowanie odbywa się w żywych tkankach, a guz może być monitorowany podłużnie przez kilka tygodni lub nawet miesięcy2,3. Badania te mogą wykorzystać możliwości obrazowania w wysoki....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Guide to the Care and Use of Experimental Animals opracowanymi przez Canadian Council on Animal Care. Eksperymenty wykonano zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Institutional Animal Care and Use Committee w University Health Network w Toronto w Kanadzie.
1. Wyznaczanie punktów inokulacji guza
UWAGA: „Landmarking” odnosi się do procesu znakowania skóry myszy w celu wskazania miejsca wstrzyknięcia komórek nowotworowych, aby zoptymalizować rozmieszczenie DSFC. Procedurę znakowania należy przeprowadzić w tym samym d....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W celu uzyskania trójwymiarowych obrazów mikro naczyniowych o szerokim polu widzenia (FOV) (6 x 6 mm2 w płaszczyźnie bocznej x 1 mm głębokości) przeprowadzono optyczną koherentną tomografię z analizą wariancji plamek (svOCT). Do wykonania tych obrazów wykorzystano wcześniej opisany system OCT ze źródłem typu swept-source, oparty na interferometrze kwadraturowym23. Obrazy OCT uzyskano poprzez zestawienie dwóch sąsiadujących bocznie skanów o polu widzenia 3 x 6 mm2. Każdy skan .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tej pracy opracowaliśmy przepływ pracy do wykonywania zarówno mikroskopii przyżyciowej, jak i obrazowania klinicznego (CT, MRI i PET) u tego samego zwierzęcia. Miało to na celu przełożenie wyników mikroskopii przedklinicznej na praktykę kliniczną poprzez bezpośrednią korelację mikroskopii przyżyciowej z metodami obrazowania klinicznego, takimi jak rezonans magnetyczny. Chociaż konwencjonalne projekty DSFC są wykonane z metalu 2,3, dostosowaliśmy DSFC tak, aby b.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy dr Carli Calçada (doktorantce, Princess Margaret Cancer Centre) i dr Timothy Samuelowi (doktorantowi, Princess Margaret Cancer Centre) za pomoc w hodowli komórek nowotworowych i opracowaniu protokołu szczepień. Dr Kathleen Ma, dr Anna Pietraszek i dr Alyssa Goldstein (Centrum Badań nad Zwierzętami, Centrum Raka Księżniczki Małgorzaty) pomogły w opracowaniu protokołu operacyjnego. Jacob Broske (technolog inżynierii medycznej, Princess Margaret Cancer Centre) i Wayne Keller (kierownik ds. klienta sprzętu, Javelin Technologies - firma TriMech Group) wydrukowali w 3D komory okienne. James Jonkman (Advanced Optical Microscopy Facility, University Health Network)....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Cell Culture Materials | |||
| BxPC-3 Ludzkie komórki raka trzustki | ATCC (American Type Culture Collection) | CRL-1687 | |
| Corning Matrigel Podstawna matryca membranowa, bez LDEV, 10 ml | Corning | 354234 | |
| Kontroler Corning Stripettor Ultra Pipet | Corning | 07-202-350 | |
| Dulbecco Fospphate buforowana sól fizjologiczna bez czerwieni wapniowej, magnezowej i fenolowej, 500 ml | Gibco | 14190144 | |
| Płodowa surowica bydlęca (Kanada), 500 ml | Sigma-Aldrich | F1051-500ML | |
| Penicylina-Streptomycyna 100x (płynna, stabilizowana, sterylnie filtrowana, testowana na kulturach komórkowych) | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| RPMI Medium 1640 (1x), płyn; z L-Glutaminą, 500 ml | Gibco | ||
| Enzym TrypLE Express, 500 ml | Gibco | 12605028 | |
| Window Chamber Materiały | |||
| 12 mm Szklane szkiełko nakrywkowe | Aparat Harvard | CS-12R No. 1.5 | |
| Drukarka 3D Connex 500 | Stratasys | N/A | |
| Biokompatybilna przezroczysta żywica MED610 | Stratasys | RGD810 | |
| Loctite AA 3105 Klej utwardzany promieniami UV | Loctite | LCT1214249 | |
| Tylna rama komory okiennej | Trimech Inc | Nie dotyczy | |
| Znacznik odniesienia komory okiennej | Trimech Inc | /A | |
| Rama przednia komory okiennej | Trimech Inc | N/A | |
| Klips podtrzymujący komorę okienną | Trimech Inc | N/A | |
| inokulacja i materiały chirurgiczne | |||
| BD SafetyGlide Strzykawki insulinowe z trwale przymocowanymi igłami, 0,5 mL, 29 G x 1/2" | BD | CABD305932 | |
| Roztwór Betadine | Betadine | AP-B002C2R98U | |
| Cidex OPA 14-dniowy roztwór 3,8 l | ASP | JOH20394 | |
| jednorazowe podkładki chirurgiczne 23 cale x 24 cale | Kendall | 7134 | |
| Smar do oczu | Optixcare | 50-218-8442 | |
| Krem do depilacji | Nair | | |
| Kleszcze hemostatyczne Halstead | Almedic | 7742-A12-150 | |
| Poduszka grzewcza | Sunbeam | ||
| Nożyczki do tęczówki | Almedic | 7601-A8-690 | |
| Isoflurane | Sigma | 792632 | |
| Metacam | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc | NDC 0010-6015-03 | |
| NOD. Cg-Rag1tm1Mama Mysz Il2rgtm1Wjl/SzJ | laboratorium Jacksona | 7799 | |
| Maszynka do strzyżenia orzechów ziemnych & Trymer | Wahl | 8655-200 | |
| Niewchłanialny szew chirurgiczny SOFSILK #5-0 z igłą stożkową 3/8" (17 mm) (pokryty woskiem, pleciony jedwab, sterylny) | Synetura | VS880 | |
| Kleszcze przeciwodłamkowe | Almedic | 7725-A10-634 | |
| MR Obrazowanie< / strong> | |||
| 3D drukowane urządzenie do unieruchamiania komory okiennej. | niestandardowe drukowane w 3D, szczegółowe informacje można znaleźć na rysunku 3. | ||
| Konwekcyjne urządzenie grzewcze | 3M Bair Hugger | 70200791401 | |
| System wstrzykiwania leków | Aparatura Harvarda | PY2 70-2131 | PHD 22/2200 Pompa strzykawkowa kompatybilna z MRI |
| Gadovist 1.0 | Bayer | 2241089 | |
| System monitorowania oddechu | SAII | Model 1030 | z systemem monitorowania i bramkowania dla małych zwierząt. |
| Cewnik do żył ogonowych (27 G 0,5 cala) | Terumo Medical Corp | 15253 | |
| Optical Imaging | |||
| 3D drukowany etap | Niestandardowe drukowane 3D, szczegółowe informacje można znaleźć na rysunku uzupełniającym 3. | ||
| 12 V 7 W Elastyczna poliamidowa płyta grzewcza Cienka folia grzewcza PI Klej 25 mm x 50 mm | BANRIA | B09X16XCVS | Element grzejny służący do regulacji temperatury ciała myszy. |
| Zasilacz prądu stałego | BK Precission | 1761 | Służy do zasilania elementu grzejnego. |
| Leica MZ FLIII | System | ||
| Autorski | Szczegóły można znaleźć w odnośniku 23. | ||
| Software | |||
| MATLAB Software | MathWorks | R2020A |
Bibliografia
- Fukumura, D., Duda, D. G., Munn, L. L., Jain, R. K. Tumor microvasculature and microenvironment: Novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17 (3), 206-225 (2010).
- Demidov, V., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
