Opisujemy szczegółowe procedury chirurgiczne ubytków kompozytowych szwów kalwarycznych u szczurów, a także badania nad krótko- i długoterminowymi prognozami modelu. Naszym celem jest skonstruowanie ustandaryzowanego modelu do opracowania terapii regeneracyjnych szwów.
Artykuł metodologiczny
Ustalenie ubytków kompozytowych szwów kalwarycznych u szczurów: ustandaryzowany model badania terapii regeneracyjnej szwów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Duże defekty calwaryczne często zbiegają się z przerwaniem szwów czaszkowych, prowadząc do upośledzenia w przywracaniu wad kalwarycznych i rozwoju czaszki (ten ostatni występuje w rozwijającej się czaszce). Jednak brak ustandaryzowanego modelu utrudnia postęp w badaniach nad terapiami regeneracyjnymi szwów i stanowi wyzwanie dla przeprowadzania analiz porównawczych w różnych badaniach. Aby rozwiązać ten problem, obecny protokół opisuje szczegółowy proces modelowania ubytków kompozytowych szwów kalwarycznych i kostnych u szczurów.
Model został wygenerowany przez wiercenie prostokątnych otworów o pełnej grubości wymiarach 4,5 mm × 2 mm w poprzek szwów koronalnych. Szczury zostały poddane eutanazji, a próbki czaszki pobrano po operacji w dniu 0, tygodniu 2, tygodniu 6 i tygodniu 12. Wyniki tomografii komputerowej μCT z próbek pobranych bezpośrednio po operacji potwierdziły pomyślne ustalenie ubytku kompozytowego szwowo-kostnego, polegającego na usunięciu szwu koronalnego i przyległych tkanek kostnych.
Dane z6 i 12tygodnia po operacji wykazały naturalną tendencję do gojenia się wady. Barwienie histologiczne dodatkowo potwierdziło ten trend, wykazując zwiększoną zawartość zmineralizowanych włókien i nowej kości w centrum ubytku. Wyniki te wskazują na postępujące zrastanie szwów w czasie po wadach kalwarii, podkreślając znaczenie interwencji terapeutycznych w regeneracji szwów. Przewidujemy, że protokół ten ułatwi rozwój terapii regeneracyjnych szwów, oferując świeże spojrzenie na funkcjonalne przywracanie ubytków kalwarii kalwarycznej i zmniejszając niekorzystne skutki związane z utratą szwów.
Wprowadzenie
Szwy czaszkowe to gęste włókniste połączenia między kośćmi czaszki, pełniące rolę stawów ułatwiających lekkie ruchy czaszki i zapewniające poduszkę ochronną dla mózgu pod ciśnieniem1. W ostatnich latach wzmożone badania podkreśliły kluczową rolę szwów czaszkowych w rozwoju czaszki, homeostazie twarzoczaszki i wrodzonym potencjale osteoreparacyjnym2,3,4,5,6,7,8. W okresach wzrostu i rozwoju szwy czaszkowe działają jako główne centra wzrostu w skull4. Nowe tworzenie kości zachodzi na frontach osteogennych po obu stronach szwów, podczas gdy komórki w szwach utrzymują niezróżnicowany stan mezenchymalny, zapewniając zrównoważoną ekspansję czaszki wraz ze wzrostem mózgu1. Utrata szwów czaszkowych w tym czasie powoduje rozbieżność między wzrostem czaszki i mózgu, co prowadzi do poważnych problemów, takich jak urazy mózgu, wodogłowie, zwiększone ciśnienie śródczaszkowe i dysfunkcje poznawcze3,9.
Poza tym, szwy czaszkowe odgrywają kluczową rolę w określaniu rokowania wad kości nazębnej5,7,10. Potencjał regeneracyjny na powierzchni kości kalwarycznej jest nierównomiernie rozłożony, przy czym szwy czaszkowe wykazują znacznie lepsze możliwości w porównaniu z obszarami bez szwów10,11. Jedno z badań wskazuje, że szybkość gojenia się ubytku kości łośniowej odwrotnie koreluje z odległością między szwem czaszkowym a miejscem urazu10. W szczególności usunięcie szwów czołowych i strzałkowych prowadzi do niegojenia się ubytków kości ciemieniowej7, podkreślając konieczność regeneracji szwów w ubytkach kości łodkowej. Jednak obecne badania koncentrują się głównie na odbudowie struktury kostnej czaszki, zaniedbując regenerację mezenchymy szwów.
Jeśli chodzi o postęp w regeneracji szwów, obiecujące wyniki zaobserwowano dzięki przeszczepom płatów kostnych zawierających szwy, mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) i sztucznych biomateriałów. Kiedy płaty kostne ze szwami zostały przeszczepione do ubytków kalwarii, pomyślnie się zintegrowały i zagoiły, w przeciwieństwie do tych bez szwów wykazujących brak zrostu i niezdolność do tworzenia okostnej, opony twardej lub osteocytów5. Podobnie, implantacja MSCs pochodzących ze szpiku kostnego do ubytków kompozytowych szwów strzałkowych i kostnych ułatwiła tworzenie szczelin przypominających szwy12. Warto zauważyć, że niedawne badanie podkreśliło realizację regeneracji szwów za pomocą MSCs Gli1+, co pozwala na kontrolę ciśnienia śródczaszkowego, korekcję deformacji czaszki i poprawę funkcji neurokognitywnych13. Wraz z rozwojem medycyny regeneracyjnej i inżynierii biomedycznej, naukowcy coraz częściej koncentrują się na biomateriałach inżynierii tkankowej ze względu na ich adaptowalne i konfigurowalne cechy14. Warto zauważyć, że udowodniono, że membrany politetrafluoroetylenowe są skuteczne w jednoczesnej rekonstrukcji kości czaszki i mezenchymy szwów15,16.
Jednak w badaniach twarzoczaszki brakuje sprawdzonych modeli do badania mezenchymalnych terapii regeneracyjnych szwów, w przeciwieństwie do stosunkowo dojrzałych modeli w naprawie innych tkanek, takich jak kości, skóra, chrząstki i mięśnie17. Brak ustandaryzowanego modelu ogranicza badania nad terapiami regeneracyjnymi szwów i utrudnia przeprowadzenie analizy porównawczej między różnymi badaniami. W związku z tym w naszym badaniu ustalono praktyczny i powtarzalny ubytek kompozytowy szwu kalwarycznego i kostnego szczura. Poprzez tę metodę dążymy do opracowania odpowiednich interwencji klinicznych w zakresie rekonstrukcji szwów czaszkowych, oferując nowe perspektywy funkcjonalnej naprawy ubytków calwarii i zmniejszając niekorzystne wyniki wynikające z utraty szwów.
Protokół
Wszystkie procedury na zwierzętach w tym badaniu zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet Etyczny Zachodniochińskiej Szkoły Stomatologii Uniwersytetu Sichuan (WCHSIRB-D-2021-597). W sumie 12 (3 szczury w każdym z czterech punktów czasowych) szczurów Sprague-Dawley (SD) (samiec, 300 g, 8 tygodni) uzyskano ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów).
1. Przygotowanie przedoperacyjne
- Artykuły chirurgiczne
- Przygotuj narzędzia chirurgiczne wyświetlane w Rysunek 1A, w tym zakrzywione kleszcze, jednorazowy sterylny skalpel, windę okostną, igłę do irygacji, waciki, wolnoobrotową rękojeść, silnik chirurgiczny, okrągłe wiertła dentystyczne o niskiej prędkości (Rysunek 1B, odpowiednio średnica 1,2 mm i 0,8 mm), uchwyt na igłę, 3-0 nici monofilamentowe i proste nożyczki.
- Sterylizacja i dezynfekcja
- Wcześniej wysterylizuj narzędzia przez sterylizację parową (125-135 °C, 20-25 min).
- Używaj etanolu do sterylizacji wrażliwego na ciepło sprzętu medycznego, takiego jak golarki elektryczne.
- Użyj sterylnych włóknin medycznych do przykrycia platformy operacyjnej i zdezynfekuj otaczające środowisko 75% etanolem.
- znieczulenie
- Przygotuj zwierzęta do operacji z 1-tygodniowym okresem aklimatyzacji.
- Wstrzyknąć szczurom dootrzewnowo ksylazynę (10 mg/kg) i ketaminę (100 mg/kg) 20 minut przed zabiegiem w celu znieczulenia lub zastosować dowolny odpowiedni protokół znieczulenia w celu uzyskania znieczulenia ogólnego.
UWAGA: Koktajl znieczulający ketaminowo-ksylazynowy podawany dootrzewnowo szczurom zwykle działa w ciągu 10-15 minut, osiągając szczytowe znieczulenie około 35-40 minut po wstrzyknięciu. Aby zapobiec hipotermii podczas znieczulenia, szczury najlepiej umieścić na poduszce grzewczej. - Przedoperacyjne wstrzyknięcie podskórne karprofenu w dawce 5 mg/kg mc. w celu znieczulenia.
- Użyj "metody szczypania palców", aby określić, czy szczury są przytomne i reagują.
2. Proces chirurgiczny
- Przygotowanie strony
- Ułóż szczura w pozycji leżącej z głową naturalnie wysuniętą pionowo, bez konieczności stosowania specjalnych urządzeń lub ograniczeń w celu utrzymania tej postawy (Rysunek 2A).
- Nałóż maść weterynaryjną, tj. wazelinę, na oczy szczura, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
- Usuń włosy ze skóry głowy między grzbietem nosa a stawem szyjnym kręgosłupa za pomocą golarki elektrycznej (Rysunek 2B). Zdezynfekuj obszar operacyjny okrężnymi ruchami promieniującymi ze środka za pomocą 2% roztworu jodoforu, a następnie 75% etanolu. Zastosuj serwetę chirurgiczną, aby zakryć grzbiet zwierzęcia i sierść otaczającą nacięcie.
- Otwarcie pola operacyjnego
- Zaczynając od środka kości nosowej, wykonaj 2-centymetrowe podłużne nacięcie skóry za pomocą jednorazowego skalpela wzdłuż linii środkowej czaszki (Rysunek 2C).
- Wykonaj nacięcie okostnej w linii środkowej, odzwierciedlając punkt początkowy i zasięg warstwy skóry za pomocą skalpela (Rysunek 2D). Następnie delikatnie unieś okostną po obu stronach nacięcia za pomocą windy okostnej (Rysunek 2E1), aby odsłonić kości ciemieniowe, kości czołowe i szwy koronalne (Rysunek 2E2).
UWAGA: Podczas nacinania okostnej należy uważać, aby nie uszkodzić szwów czaszkowych, aby zapobiec nadmiernemu krwawieniu podczas cięcia. Odpowiednie odsłonięcie szwu koronalnego ma ogromne znaczenie dla kolejnych zabiegów. - Przepłukać ranę roztworem soli fizjologicznej i osuszyć pole operacyjne wacikami.
- Ustalenie modelu ubytku kompozytowego szwowo-kostnego
- Ustaw silnik chirurgiczny na 35 000 obr./min, obracając pokrętło (Rysunek 1A, żółta strzałka), a następnie włącz przełącznik (Rysunek 1A, biała strzałka).
- Zaczynając od dowolnego punktu szwu koronalnego, przykładaj siłę pionową za pomocą okrągłego wiertła o średnicy 1,2 mm, aż poczujesz przebicie.
UWAGA: Jako punkt wyjścia do penetracji należy zalecić punkt środkowy szwu koronalnego (oznaczony żółtymi strzałkami w Rysunek 2E2). Podczas szlifowania wiertła dentystyczne powinny być trzymane prostopadle do powierzchni czaszki. Zachowaj ostrożność, aby nie kontynuować wiercenia po penetracji całej grubości czaszki, aby zapobiec dalszym szkodom szczurów, w tym uszkodzeniu mózgu lub wylewowi krwi do mózgu. - Od punktu penetracji przesuń wiertło na boki wzdłuż szwu koronalnego, aby utworzyć rowek pozycjonujący o długości około 4 mm (Rysunek 2F1). Usuń tkankę kostną za pomocą wiertła po obu stronach rowka pozycjonującego, aby początkowo utworzyć prostokątny defekt o pełnej grubości (Rysunek 2F2).
- Zastosuj okrągły wiertło o średnicy 0,8 mm do dopracowania szczegółów (Rysunek 2G1), obejmujące szlifowanie kątów prostych i wygładzanie marginesów defektów, ostatecznie uzyskując standardową prostokątną wadę o wymiarach 2 mm szerokości i 4,5 mm długości (Rysunek 2G2).
UWAGA: Aby osiągnąć całkowite usunięcie szwu koronalnego przy jednoczesnym zachowaniu szwów strzałkowych i czołowych u szczurów SD o wadze 300 g, maksymalna możliwa długość ubytku wynosi około 4,5 mm. Biorąc pod uwagę szerokość szwu koronalnego w kierunku przednio-tylnym (rysunek uzupełniający S1), szerokość ubytku ustalono na 2 mm. - Utwórz dwie ubytki w lewej i prawej połowie szwu koronowego do samodzielnego porównania.
- Utrzymuj ciągłe nawadnianie roztworem soli fizjologicznej podczas wiercenia, aby zabezpieczyć się przed uszkodzeniem termicznym czaszki i mózgu. W międzyczasie użyj wacików, aby wysuszyć obszar operacji.
- Weryfikacja wymiarów próbki
- Regularnie sprawdzaj długość i szerokość wad za pomocą suwmiarki z noniuszem (Rysunek 2H1, H2), aby zapewnić spójność we wszystkich próbkach.
- Zamknięcie pola operacyjnego
- Zamknij skórę za pomocą szwów monofilamentowych 3-0 (Rysunek 2I).
- Bezpośrednia pooperacyjna mikrotomografia komputerowa in vivo (μCT)
- Jeśli to możliwe, należy przeprowadzić skany μCT in vivo u wszystkich szczurów natychmiast po operacji, aby potwierdzić powodzenie zabiegu chirurgicznego i monitorować trendy odzyskiwania wad u każdej osoby.
3. Opieka pooperacyjna
- Zgodnie z protokołami opieki nad zwierzętami, po operacji należy podawać ustalone leki przeciwbólowe, na przykład karprofen (5 mg/kg, podanie podskórne).
- Przenieś szczury do stałej poduszki grzewczej (37 °C) w celu rekonwalescencji pooperacyjnej.
- Gdy szczury będą w pełni przytomne, przenieś je do klatki zawierającej czystą ściółkę.
UWAGA: Stale monitoruj szczury po operacji. Nie zostawiaj ich bez opieki, dopóki nie będą w stanie utrzymać pozycji leżącej mostka. Operowane szczury należy odizolować od innych do czasu pełnego wyzdrowienia. - Prowadź leczenie przeciwbólowe i monitorowanie pooperacyjne przez 24 godziny, a następnie codzienną ocenę przez pierwszy tydzień po operacji. Następnie monitoruj szczury co najmniej 1-2 razy w tygodniu.
4. Pobieranie próbek i analiza danych
- Przygotowanie próbki
- Zbierz próbki czaszki w 0. dniu pooperacyjnym, 2. tygodniu, 6. i 12. tygodniu. Poddaj szczury eutanazji za pomocą inhalacji CO2 .
- Utrwalić próbki w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4 °C przez 24 godziny przed dalszą analizą.
- Ocena μCT
- Wykonać tomografię komputerową μCT kości czaszki w 0. dniu pooperacyjnym, 6. tygodniu, 12. tygodniu z następującymi parametrami skanowania: potencjał lampy rentgenowskiej, 70 kVp; natężenie promieniowania rentgenowskiego, 0,2 mA; filtr, AL 0,5 mm; czas integracji, 1 x 300 ms; i wielkość woksela 10 μm.
- Uzyskaj rekonstrukcję 3D i obrazy przekrojowe za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu (patrz tabela materiałów).
- Zmierz objętość wad resztkowych i przeprowadź analizę statystyczną za pomocą odpowiedniego oprogramowania (patrz tabela materiałów).
- Barwienie histologiczne
- Odwapnić kości czaszki w 12% (m/v) roztworze kwasu etylenodiaminotetraoctowego (pH = 7,2) w temperaturze 4 °C przez 6 tygodni.
UWAGA: Odwapniać próbki za pomocą zmian roztworu co 3 dni. Użyj shakera, aby przyspieszyć proces. Zakończenie jest wskazane, gdy igła o sile 25 G z łatwością wnika w próbkę. - Kontynuuj odwadnianie, zatapianie parafiny i przygotowanie skrawków 6 μm przy użyciu standardowych protokołów18.
- Przeprowadź analizę histologiczną przy użyciu hematoksyliny i eozyny (H&E) oraz barwienia trichromowego Massona zgodnie z protokołem zestawu18.
- Odwapnić kości czaszki w 12% (m/v) roztworze kwasu etylenodiaminotetraoctowego (pH = 7,2) w temperaturze 4 °C przez 6 tygodni.
Wyniki
W niniejszym badaniu u szczurów utworzono złożony defekt kostno-szwowy czaszki poprzez wywiercenie prostokątnego otworu o wymiarach 4,5 mm x 2 mm w obrębie szwu czołowego. Schemat zabiegu chirurgicznego oraz schemat przebiegu badań przedstawiono na Rysunku 3. Obraz 3D oraz przekrój poprzeczny próbek pobranych w 0. dniu po operacji, czyli bezpośrednio po zabiegu, potwierdziły pomyślne utworzenie pełnowarstwowego defektu czaszki, obejmującego całkowite usunięcie szwu czołowego oraz przyległych struktur kostnych po obu stronach (Rysunek 4A). Obrazy µCT oraz odpowiadające im wyniki analizy statystycznej w 6. tygodniu po operacji wykazały naturalną tendencję do zamykania się defektu, której towarzyszyło tworzenie się nieregularnych zwapniałych guzków w obrębie ubytku (Rysunek 4). Tendencja ta stała się bardziej wyraźna 12 tygodni po operacji (Rysunek 4), co wskazuje na potencjalne zrastanie się szwu wraz z upływem czasu. Dalsza analiza histologiczna została przeprowadzona z zastosowaniem barwienia H&E oraz barwienia trichromem Massona. Dwa tygodnie po operacji zaobserwowano znaczną rozległość i ciągłość okostnej oraz opony twardej, które utworzyły gęstą i grubą tkankę włóknistą, skutecznie zamykając obszar defektu (Rysunek 5). Co istotne, w tym wczesnym punkcie czasowym wykryto pojawienie się niebieskich zmineralizowanych włókien, których obecność uległa znacznemu zwiększeniu do 6. tygodnia po operacji (Rysunek 5). W 12. tygodniu po operacji w centrum defektu zaobserwowano duże fragmenty nowej kości (Rysunek 5), co ponownie potwierdziło niekorzystne rokowania związane z wapnieniem podścieliska i zamknięciem szwu. Niekorzystne rezultaty naturalnego gojenia złożonych defektów kostno-szwowych podkreślają konieczność regeneracji szwów czaszkowych poprzez interwencje terapeutyczne, takie jak implantacja biomateriałów13,15,16.
Rysunek 1: Narzędzia chirurgiczne. (A) Przedmioty chirurgiczne zostały ponumerowane zgodnie z kolejnością użycia: (1) pęseta zakrzywiona, (2) jednorazowy sterylny skalpel, (3) elewator okostnowy, (4) igła do irygacji, (5) kulki watowe, (6) końcówka niskobiegowa, (7) silnik chirurgiczny (żółta strzałka wskazuje pokrętło RPM, a biała strzałka przełącznik), (8) okrągłe wiertła dentystyczne niskobiegowe, (9) uchwyt do igieł, (10) nici chirurgiczne monofilamentowe 3-0 oraz (11) nożyczki proste. (B) Okrągłe wiertła niskobiegowe o średnicach 1,2 mm i 0,8 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Procedura chirurgiczna. (A) Ułożenie szczura w pozycji brzusznej. (B) Ogolenie włosów ze skóry głowy za pomocą maszynki elektrycznej. (C) Nacięcie skóry jednorazowym skalpelem. (D) Nacięcie okostnej skalpelem. (E1, E2) Odwarstwienie okostnej za pomocą elewatora do okostnej w celu odsłonięcia szwów wieńcowych. Żółte strzałki wskazują szwy wieńcowe. (F1) Wywiercenie rowka pozycjonującego. (F2) Wstępne wykonanie prostokątnego defektu za pomocą okrągłego wiertła 1,2 mm. (G1, G2) Doprecyzowanie defektu za pomocą okrągłego wiertła 0,8 mm w celu uzyskania standardowego prostokątnego kształtu o wymiarach 4,5 x 2 mm. (H1, H2) Kalibracja szerokości i długości defektu za pomocą suwmiarki. (I) Zamknięcie skóry za pomocą jednowłóknowych szwów 3-0. Na ilustracji wykorzystano preparat pośmiertny, który celowo pozostawiono bez przykrycia w celu lepszej wizualizacji anatomicznej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Schematyczny rysunek defektu złożonego z szwu czaszkowego i tkanki kostnej oraz strategia badawcza niniejszej pracy.Skróty: H&E = hematoksylina i eozyna; µCT = mikrotomografia komputerowa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4: Tendencja do zamykania się złożonego defektu szwu czaszkowego i kości. (A) Reprezentatywne obrazy µCT oraz widoki przekroju poprzecznego złożonych defektów szwu i kości w dniu 0 po operacji, w 6. oraz 12. tygodniu. Przekroje poprzeczne przedstawiają lokalizacje wskazane żółtymi przerywanymi liniami na obrazach 3D. Paski skali = 2 mm. (B) Ilościowa analiza pozostałej objętości defektu po operacji na podstawie oceny µCT. n = 6 powtórzeń/grupa. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. Jednoczynnikowa analiza wariancji ANOVA z następującym testem porównań wielokrotnych Dunnetta. ***p<0,001. Skróty: PO = po operacji; µCT = mikrotomografia komputerowa. Krok tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 5: Zmiany histologiczne w złożonych defektach szwu i kości. (A) Barwienie H&E oraz (B) barwienie trichromem Massona złożonych defektów szwu i kości w 2., 6. i 12. tygodniu PO. Czerwone przerywane linie obrysowują tkankę włóknistą otaczającą obszar defektu. Czarne pentagramy oznaczają zmineralizowane włókna zabarwione na niebiesko. Żółte pentagramy wskazują nową kość powstałą w centrum defektu. Paski skali = 500 µm; 200 µm (powiększenia). Skróty: PO = pooperacyjny; H&E = hematoksylina i eozyna. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Rysunek uzupełniający S1: Szerokość szwu czołowego w kierunku przednio-tylnym (obraz czaszki w płaszczyźnie strzałkowej). Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Konwencjonalne modele ubytków kalwarii, niezależnie od tego, czy obejmują szwy czaszkowe, czy nie, koncentrują się przede wszystkim na naprawie tkanek twardych, często zaniedbując niezbędną regenerację mezenchymy szwów19,20. W badaniach nad regeneracją szwów wcześniejsze modele, takie jak te Mardasa i wsp.15,16, wykorzystujące wiertło trepanacyjne do stworzenia 5-milimetrowego okrągłego defektu w poprzek szwu strzałkowego szczurów, spowodowały znaczną utratę tkanek twardych, odchodząc w ten sposób od głównego celu, jakim jest regeneracja szwów. Podobnie metodologia Wilka i wsp.7, obejmująca usunięcie zarówno szwów strzałkowych, jak i prawych koronalnych oraz stworzenie krytycznego ubytku kostnego w prawej kości ciemieniowej, choć pouczająca, wprowadziła złożoność i potencjalne zmienne zakłócające ze względu na obecność wielu miejsc ubytku. W przeciwieństwie do tego, nasz protokół tworzy obustronne prostokątne ubytki wzdłuż szwu koronalnego, dążąc do bardziej usprawnionego i ukierunkowanego modelu badawczego. Główne szwy czaszkowe obejmują szwy czołowe, strzałkowe, metopowe i lambdoidalne21. W odróżnieniu od szwów metopowych i strzałkowych, które są ułożone wzdłużnie na czaszce, szwy koronalne i lambdoidalne są usytuowane poprzecznie i można je podzielić na dwie połowy, co ułatwia powstanie dwóch wad o identycznych warunkach. W przeciwieństwie do szwu lambdoidowego, pole operacyjne odsłonięte przez nacięcie skóry głowy jest bardziej dostępne dla serii zabiegów w szwie koronalnym. Tworzenie ubytków zarówno w lewej, jak i prawej połowie szwu koronalnego i stosowanie różnych interwencji w każdym miejscu ułatwia prostsze porównanie różnych terapii poprzez samokontrolę. Co więcej, podejście to pozwala na porównanie stron leczonych i nieleczonych, dostarczając wglądu w rozbieżności między interweniowanym procesem gojenia a naturalnym procesem gojenia. Dlatego nasze badanie sugeruje, że tworzenie ubytków kompozytowych szwowo-kostnych po obu stronach szwów koronalnych u szczurów jest odpowiednim modelem chirurgicznym do badania terapii regeneracyjnych szwów.
Przy doborze wymiarów ubytku skrupulatnie kierujemy się względami praktycznymi i anatomicznymi. W przypadku tego konkretnego modelu zwierzęcego głównym wyzwaniem jest całkowite usunięcie szwu koronalnego przy jednoczesnym zachowaniu szwów strzałkowych i czołowych, przy minimalnym usunięciu tkanki kostnej. Optymalna strategia polega zatem na stworzeniu precyzyjnego ubytku prostokątnego wzdłuż szwu koronalnego. Ta strategiczna decyzja jest niezbędna, ponieważ pozostała mezenchyma w szwie koronalnym lub sąsiednich szwach może wprowadzić nieścisłości w ocenie rzeczywistego wpływu regeneracyjnego zabiegu. W związku z tym ustaliliśmy największą możliwą długość wady dla 300 g samców szczurów SD na poziomie około 4,5 mm. Ponadto, biorąc pod uwagę szerokość szwu koronalnego w kierunku przednio-tylnym (około 1,5 mm w płaszczyźnie strzałkowej, jak pokazano na rysunku uzupełniającym S1), ustalamy szerokość ubytku na 2 mm, aby zapewnić całkowite usunięcie szwu z powierzchni czaszki na jej głębokość. Warto zauważyć, że konkretne wymiary wady, zarówno pod względem długości, jak i szerokości, mogą wymagać dostosowania w oparciu o takie czynniki, jak rodzaj i wiek zwierzęcia, a także cele doświadczalne. W innym badaniu stworzono smukły prostokątny ubytek o szerokości 0,3-0,4 mm wzdłuż szwu koronalnego, dostosowany do mniejszych rozmiarów myszy13.
Warto zauważyć, że trudność w wygenerowaniu tego modelu chirurgicznego polega na skonstruowaniu standardowych i jednolitych wad prostokątnych. Konieczne jest zachowanie spójności kształtu defektu, aby zagwarantować równomierne dozowanie czynników bioaktywnych we wszystkich próbkach, minimalizując w ten sposób zarówno różnice międzygrupowe, jak i wewnątrzgrupowe. W związku z tym, podczas procesu usuwania kompleksu szwowo-kostnego, początkowo zastosowaliśmy okrągły wiertło o średnicy 1,2 mm do zlokalizowania szwu koronalnego i stworzenia przybliżonego zarysu prostokątnego ubytku o pełnej grubości (ryc. 1B). Następnie przeszliśmy na najmniejszy okrągły wiertło (o średnicy 0,8 mm), aby udoskonalić skręty pod kątem prostym i wygładzić krawędzie wad (ilustracja 1B). Aby zapewnić spójność długości i szerokości każdej wady, zastosowano suwmiarkę z noniuszem, aby uniknąć nadmiernego lub niedostatecznego szlifowania podczas procesu wiercenia. Pomimo takiego podejścia, tomografia komputerowa μCT wykazała, że wygenerowany przez nas prostokątny defekt nadal ma kształt łuku (ryc. 4), co sugeruje konieczność dalszej optymalizacji metody modelowania w celu uzyskania precyzyjnych kształtów szlifowania.
Aby ocenić rokowanie, skany μCT zapewniają najbardziej bezpośrednie środki, w tym ocenę gojenia się tkanki kostnej i stanu szwów czaszkowych, niezależnie od tego, czy są zamknięte, czy drożne. Ponadto badania na poziomie histopatologicznym są niezbędne do badania regeneracji szwów czaszkowych. Barwienie histopatologiczne pomaga w różnicowaniu braku zamykania się ubytków spowodowanych tworzeniem tkanki mezenchymalnej, hamowaniem odbudowy kości lub zajmowaniem przestrzeni materialnej. Tylko metody, które ułatwiają regenerację tkanki mezenchymalnej, mogą mieć potencjał do regeneracji szwów czaszkowych. Ponadto, pomimo braku odpowiednich eksperymentów podczas budowy modelu, zdecydowanie zaleca się wykrywanie ekspresji markerów MSC na poziomie białka w zregenerowanej tkance po interwencjach terapeutycznych. Analiza ta, wykorzystująca techniki takie jak immunofluorescencja, immunohistochemia czy cytometria przepływowa, przyczynia się do potwierdzenia sukcesu regeneracji szwów. Specyficzne markery MSC szwów obejmują Cd51, Cd200, Gli1, Axin2, Prrx1, Ctsk i inne 1,22.
Podsumowując, w badaniu przedstawiono szczegółowy proces modelowania ubytków kompozytowych szwów kalwarycznych i kostnych u szczurów w celu zbadania rokowania ubytków kalwarii krzyżowej i opracowania odpowiednich terapii regeneracji szwów czaszkowych. Należy zauważyć, że dziedzina regeneracji szwów czaszkowych jest rzeczywiście niszowa, a w literaturze nie ma standardowych modeli ani metod regeneracji szwów czaszkowych. W związku z tym uważamy, że nasz protokół stanowi solidną podstawę metodologiczną do badania podejść regeneracyjnych szwów i wprowadza innowacyjne perspektywy funkcjonalnego przywracania ubytków kalwarii, mając na celu poprawę jakości życia pacjentów.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez National Natural Science Foundation of China 82100982 (F.L.), 82101000 (H.W.), 82001019 (B.Y.), Science and Technology Department of Sichuan Province 2022NSFSC0598 (B.Y.), 2023NSFSC1499 (H.W.) oraz finansowanie badań przez West China School/Hospital of Stomatology Sichuan University (RCDWJS2021-5). Rysunek 3 został utworzony za pomocą Biorender.com.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 4% paraformaldehyd | Biosharp | BL539A | |
| Chengdu Jinshan Chemical Reagent Co., Ltd. | Brak | ||
| 75% etanolu | Chengdu Jinshan Chemical Reagent Co., Ltd. | Brak | |
| Waciki | Haishi Hainuo Group Co., Ltd. | Brak | |
| Waciki bawełniane | Lakong Medical Devices Co., | Brak | |
| Kleszcze zakrzywione | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Brak Przeglądarka | |
| danych i oprogramowanie Ctan do oceny objętości wad resztkowych | Bruker | Brak | |
| Okrągłe wiertła dentystyczne o niskiej prędkości | Dreybird Medical Equipment Co., Ltd. | RA3-012 RA1-008 | |
| Jednorazowy sterylny skalpel | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd. | Brak | |
| Strzykawki jednorazowe (22 G) | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | SB1-089(IX) | |
| Golarka elektryczna | JASE | BM320210 | |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) | BioFroxx | 1340GR500 | |
| Zestaw barwników hematoksyliny i eozyny Igła | Biosharp | BL700B | |
| (23 G) | Sichuan New Century Medical Polymer Products Co., Ltd. | Brak | |
| Rękojeść wolnoobrotowa | Guangzhou Dental Guard Technology Co., Ltd. | Brak | |
| Massona" s Zestaw bejc trichromowych | Solarbio | G1340 | |
| Włókniny medyczne | Henan Yadu Industrial Co., Ltd. | Brak Tomografia | |
| mikrokomputerowa (&mikro; CT) | Scanco Medical AG | & mikro; CT45 | |
| Naśladuje 20.0 dla obrazów przekrojowych | Materialise | Brak | |
| Uchwyty na igły | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Brak | |
| Winda okostnowa | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Brak Roztwór | |
| soli | Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. | Brak | |
| Oprogramowanie do wizualizacji medycznej Scanco do rekonstrukcji obrazów 3D | Scanco Medical AG | Brak | |
| SPSS Statistics 20.0 do analizy statystycznej | IBM | Brak | |
| Szczury Sprague-Dawley | Byrness Weil Biotech Ltd | Brak | |
| Nożyczki proste | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Brak | |
| Silnik chirurgiczny | MARATHON | N3-140232 | |
| Szwy chirurgiczne (monofilament 3-0) | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd. | żaden |
Bibliografia
- Li, B., et al. Cranial suture mesenchymal stem cells: insights and advances. Biomolecules. 11 (8), 1129(2021).
- Opperman, L. A. Cranial sutures as intramembranous bone growth sites. Dev Dyn. 219 (4), 472-485 (2000).
- Lenton, K. A., Nacamuli, R. P., Wan, D. C., Helms, J. A., Longaker, M. T. Cranial suture biology. Curr Top Dev Biol. 66 (4), 287-328 (2005).
- Slater, B. J., et al. Cranial sutures: A brief review. Plast Reconstr Surg. 121 (4), 170-178 (2008).
- Zhao, H., et al. The suture provides a niche for mesenchymal stem cells of craniofacial bones. Nat Cell Biol. 17 (4), 386-396 (2015).
- Maruyama, T., Jeong, J., Sheu, T. -J., Hsu, W. Stem cells of the suture mesenchyme in craniofacial bone development, repair and regeneration. Nat Commun. 7 (1), 10526(2016).
- Wilk, K., et al. Postnatal calvarial skeletal stem cells expressing PRX1 reside exclusively in the calvarial sutures and are required for bone regeneration. Stem Cell Reports. 8 (4), 933-946 (2017).
- Doro, D. H., Grigoriadis, A. E., Liu, K. J. Calvarial suture-derived stem cells and their contribution to cranial bone repair. Front Physiol. 8, 956(2017).
- Kajdic, N., Spazzapan, P., Velnar, T. Craniosynostosis-recognition, clinical characteristics, and treatment. Bosn J Basic Med Sci. 18 (2), 110-116 (2018).
- Park, S., Zhao, H., Urata, M., Chai, Y. Sutures possess strong regenerative capacity for calvarial bone injury. Stem Cells Dev. 25 (23), 1801-1807 (2016).
- Quarto, N., Behr, B., Longaker, M. T. Opposite spectrum of activity of canonical Wnt signaling in the osteogenic context of undifferentiated and differentiated mesenchymal cells: Implications for tissue engineering. Tissue Eng Part A. 16 (10), 3185-3197 (2010).
- Kaku, M., et al. Mesenchymal Stem Cell-Induced Cranial Suture-Like Gap in Rats. Plast Reconstr Surg. 127 (1), 69-77 (2011).
- Yu, M., et al. Cranial suture regeneration mitigates skull and neurocognitive defects in craniosynostosis. Cell. 184 (1), e18 243-256 (2021).
- Koons, G. L., Diba, M., Mikos, A. G. Materials design for bone-tissue engineering. Nat Rev Mater. 5 (8), 584-603 (2020).
- Mardas, N., Kostopoulos, L., Karring, T. Bone and suture regeneration in calvarial defects by e-PTFE-membranes and demineralized bone matrix and the impact on calvarial growth: an experimental study in the rat. J Craniofac Surg. 13 (3), 453-462 (2002).
- Kostopoulos, L., Karring, T. Regeneration of the sagittal suture by GTR and its impact on growth of the cranial vault. J Craniofac Surg. 11 (6), 553-561 (2000).
- Mosaddad, S. A., Hussain, A., Tebyaniyan, H. Exploring the use of animal models in craniofacial regenerative medicine: A narrative review. Tissue Eng Part B Rev. , (2023).
- Tan, X., et al. PgC3Mg metal-organic cages functionalized hydrogels with enhanced bioactive and ROS scavenging capabilities for accelerated bone regeneration. J Mater Chem B. 10 (28), 5375-5387 (2022).
- Yazdanian, M., et al. Fabrication and properties of βTCP/Zeolite/Gelatin scaffold as developed scaffold in bone regeneration: in vitro and in vivo studies. Biocybern Biomed Eng. 40 (4), 1626-1637 (2020).
- Soufdoost, R. S., et al. In vitro and in vivo evaluation of novel Tadalafil/β-TCP/Collagen scaffold for bone regeneration: A rabbit critical-size calvarial defect study. Biocybern Biomed Eng. 39 (3), 789-796 (2019).
- Russell, W. P., Russell, M. R. Anatomy, head and neck, coronal suture. StatPearls. , (2022).
- Menon, S., et al. Skeletal stem and progenitor cells maintain cranial suture patency and prevent craniosynostosis. Nat Commun. 12 (1), 4640(2021).
Przedruki i uprawnienia
