Przewlekłe uszkodzenie zwężenia dystalnego nerwu podoczodołowego u myszy wywołuje zmiany w spontanicznym zachowaniu (zwiększona aktywność pielęgnacji twarzy) i zachowaniu nocyfensyjnym w odpowiedzi na stymulację dotykową (nadreaktywność na stymulację włosów von Freya), które są oznakami trwającego bólu i allodynii oraz służy jako model dla trójdzielnego bólu neuropatycznego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przewlekłe uszkodzenie zwężenia dystalnego nerwu podoczodołowego (DIoN-CCI) u myszy w celu zbadania bólu neuropatycznego nerwu trójdzielnego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Modele zwierzęce pozostają niezbędnymi narzędziami do badania bólu neuropatycznego. Ten manuskrypt opisuje model przewlekłego uszkodzenia zwężenia dystalnego nerwu podoczodołowego (DIoN-CCI) do badania bólu neuropatycznego nerwu trójdzielnego u myszy. Obejmuje to zabiegi chirurgiczne w celu wykonania przewlekłego urazu zwężonego oraz pooperacyjne testy behawioralne w celu oceny zmian w spontanicznym i wywołanym zachowaniu, które są oznakami trwającego bólu i allodynii mechanicznej. Metody i odczyty behawioralne są podobne do modelu przewlekłego uszkodzenia zwężenia nerwu podoczodołowego (IoN-CCI) u szczurów. Konieczne są jednak istotne zmiany w celu dostosowania modelu IoN-CCI do myszy. Po pierwsze, podejście wewnątrzoczodołowe zostaje zastąpione podejściem bardziej rostralnym z nacięciem między okiem a opuszką wąsa. IoN jest zatem podwiązany dystalnie na zewnątrz jamy oczodołu. Po drugie, ze względu na wyższą aktywność lokomotoryczną u myszy, umożliwienie szczurom swobodnego poruszania się w małych klatkach zostało zastąpione umieszczaniem myszy w specjalnie zaprojektowanych i skonstruowanych urządzeniach krępujących. Po podwiązaniu DIoN myszy wykazują zmiany w spontanicznym zachowaniu i w odpowiedzi na stymulację włosów von Freya, które są podobne do tych u szczurów IoN-CCI, tj. zwiększoną ukierunkowaną pielęgnację twarzy i nadreaktywność na stymulację włosów von Freya na terytorium IoN.
Wprowadzenie
Ból neuropatyczny wynika z uszkodzenia somatosensorycznego układu nerwowego, co prowadzi do nieprawidłowego przekazywania sygnałów czuciowych do mózgu. Somatosensoryczne uszkodzenie nerwów nie zawsze prowadzi do bólu neuropatycznego, ale częstość występowania wzrasta wraz z nasileniem klinicznej neuropatii1,2. Pacjenci z bólem neuropatycznym doświadczają specyficznych objawów, takich jak spontaniczne odczucia (pieczenie, mrowienie, odczucia elektryczne) oraz nienormalnie intensywny lub długotrwały ból po nieszkodliwą lub szkodliwą stymulację, która ma tendencję do stawania się przewlekłym i opornym na leczenie konwencjonalnymi lekami przeciwbólowymi3. Znaczący postęp w dziedzinie badań nad bólem neuropatycznym wynika z odkrycia, że luźno zaciskające się więzadła wokół nerwu kulszowego u szczurów prowadzi do zachowań przypominających ludzkie stany bólu neuropatycznego4. Zwierzęta wykazują obniżone progi na ciepło, zimno i stymulację mechaniczną oraz wykazują zachowania nocyfensywne. Pomimo nieodłącznych różnic biologicznych w przetwarzaniu bólu między ludźmi a gryzoniami, modele zwierzęce są cennym narzędziem do badania mechanizmów leżących u podstaw rozwoju bólu neuropatycznego i testowania nowo zaproponowanych strategii leczenia.
Paradygmaty testowania bólu oparte na odruchach sensorycznych były szeroko stosowane w modelach bólu neuropatycznego, ale pomiar trwającego bólu lub innych często towarzyszących zaburzeń (zaburzenia snu, depresja, lęk) nie otrzymał wystarczającej uwagi, biorąc pod uwagę, że są to powszechne objawy kliniczne wpływające na jakość życia5,6,7,8. Zachowanie związane z pielęgnacją twarzy u szczurów zostało udokumentowane jako miara spontanicznego bólu neuropatycznego po przewlekłym urazie zwężenia (CCI) nerwu podoczodołowego (IoN)9,10. Ponadto u szczurów rozwija się również nadreaktywność na łagodną stymulację dotykową terytorium IoN, co wskazuje na allodynię mechaniczną.
W porównaniu do myszy, ze względu na ich większe rozmiary, szczury lepiej nadają się do urazów chirurgicznych. Jednak myszy oferują oszczędność kosztów i miejsca oraz wymagają mniejszych ilości leków. Pojawienie się technologii transgenicznej jeszcze bardziej zwiększyło wykorzystanie myszy11,12. Dlatego ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie chirurgicznego uszkodzenia nerwu podoczodołowego u myszy, podobnego do tego u szczurów, które wywołuje zmiany w spontanicznym i wywołanym zachowaniu w celu zbadania bólu neuropatycznego nerwu trójdzielnego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Zwierzęta są leczone i opiekowane zgodnie z wytycznymi Międzynarodowego Stowarzyszenia Badań nad Bólem Zwierząt (International Association for the Study of PAIN) dotyczącymi badań nad bólem oraz zgodnie z flamandzkimi i europejskimi przepisami dotyczącymi badań na zwierzętach oraz wytycznymi ARRIVE. Protokół jest zatwierdzany przez instytucjonalny Komitet ds. Etyki.
1. Zwierzęta
- Użyj samców i samic myszy C57BL/6J (Janvier, 10 tygodni w momencie przybycia).
- Samce i samice myszy należy trzymać oddzielnie w standardowych klatkach z pełnym dnem w pomieszczeniu kolonijnym o wilgotności 40%-60% i temperaturze pokojowej (RT) 21 ± 1 °C.
- Zapewnij wodę i jedzenie ad libitum.
- Utrzymuj myszy w normalnym cyklu ciemności/światła o godzinie 12:12 (światła włączone o 08:00).
2. Chirurgia
- Na każdą mysz przygotuj jeden kawałek chromowej ligatury jelitowej (6-0) o długości około 6 cm i umieść ją w sterylnym roztworze soli fizjologicznej, aby uniknąć wysuszenia i stania się sztywnym i łamliwym.
- Znieczulić mysz ketaminą/ksylazyną (75/15 mg/kg, dootrzewnowo, objętość wstrzyknięcia 10 ml/kg). Sprawdź głębokość znieczulenia, ściskając skórę między palcami. Upewnij się, że mysz nie zgina nogi. W razie potrzeby poczekaj, aż zwierzę zostanie w pełni znieczulone i/lub podaj dodatkową ketaminę/ksylazynę.
UWAGA: Nie należy podawać uzupełniających leków przeciwbólowych, aby uniknąć wyprzedzających skutków przeciwbólowych, które mogą zakłócać rozwój bólu neuropatycznego nerwu trójdzielnego. - Delikatnie ogol włosy policzkowe między opuszką wąsów a okiem, aby wykonać nacięcie o średnicy około 4 mm tuż obok otworu podoczodołowego. Uważaj, aby nie uszkodzić wąsów, ponieważ może to wpłynąć na testy behawioralne.
- Zamocuj głowicę myszy w ramce stereotaktycznej lub w inny sposób unieruchomij głowę. Umieść mysz na podgrzewanej podkładce lub zadbaj o utrzymanie temperatury ciała w przeciwnym razie.
- Nałóż maść na oba oczy, aby uniknąć wysuszenia. Wyszoruj ogoloną okolicę głowy alkoholem, a następnie betadyną. Umieść serwetę chirurgiczną odsłaniającą ogoloną okolicę głowy.
- Użyj mikroskopu dla kroków od 2.7 do 2.14.
- Wykonaj nacięcie skóry o średnicy 4 mm prostopadłe do linii środkowej mniej więcej w połowie odległości między krawędzią opuszki wąsa a okiem, tuż rostralne do otworu podoczodołowego i wyśrodkowane wokół linii między środkiem oka a środkiem opuszki wąsa.
- Odsłoń IoN, tępo oddzielając powierzchowną tkankę łączną. Uważaj, aby zminimalizować uszkodzenia mięśni i unikać włókien nerwów ruchowych. Upewnij się, że pień IoN (o średnicy 1-1,5 mm) jest dostępny na głębokości około 3 mm między miejscem, w którym wychodzi z czaszki, a miejscem, w którym rozgałęzia się do poduszki wąsów (Rysunek 1).
- Wykonując ruch obrotowy, wsuń główkę haczykowatego środka do podwiązywania pod IoN, uważając, aby nie uszkodzić nerwu.
- Umieść chromową ligaturę jelitową przez otwór na końcówce pomocy do podwiązywania i wsuń pomocnicę podwiązującą tak, aby ligatura pozostała pod IoN, a oba końce ligatury były mniej więcej w równej odległości od IoN.
- Zawiąż "węzeł poślizgowy" z dwóch końców ligatury i wsuń węzeł w kierunku IoN. Upewnij się, że węzeł poślizgowy umożliwia płynne działanie, aby można było dokładnie kontrolować stopień zwężenia. Przesuń węzeł dalej i zwęź IoN. Zmniejsz średnicę nerwu o zauważalną wartość4. Umieść normalny węzeł na węźle szczelinowym, aby zapobiec jego ślizganiu się.
- Odetnij końce ligatury, pozostawiając około 1,5 mm wolnych końców, aby zapobiec rozplątaniu się węzła.
- Wykonaj pozorowaną operację, wykonując kroki 2.2-2.8.
- Zamknij nacięcie skóry za pomocą syntetycznych wchłanialnych szwów (6-0) i pozwól zwierzęciu dojść do siebie na podgrzewanej podkładce lub pod lampą grzewczą na podczerwień.
3. Testy behawioralne
- Przyzwyczaj mysz do warunków panujących w pomieszczeniach przez co najmniej 8 dni przed badaniami przedoperacyjnymi.
- Przed badaniem przedoperacyjnym przyzwyczaj mysz do procedury testowej co najmniej raz dziennie przez 3 dni.
- Przeprowadź testy w normalnych warunkach oświetleniowych. W razie potrzeby zapewnij hałas w tle, aby zminimalizować zakłócenia spowodowane hałasami z zewnątrz.
- Obserwacja zachowań związanych z pielęgnacją twarzy
- Przenoś pojedynczą mysz z obudowy do pomieszczenia testowego w zakrytej plastikowej klatce bez żadnego materiału ściółkowego. Unikaj stymulacji zewnętrznej podczas transportu zwierząt.
- Umieść mysz w zakrytej, przezroczystej plastikowej klatce bez ściółki (dł. x szer. x wys.: 12 cm x 12 cm x 17 cm) przed kamerą wideo. Umieść lustro, aby view twarz zwierzęcia, gdy jest ono odwrócone plecami w stronę kamery.
- Nagrywaj zachowanie myszy przez 10 minut. Podczas nagrywania upewnij się, że eksperymentator nie jest obecny w pomieszczeniu.
- Po nagraniu kolejnego zwierzęcia wyczyść klatkę obserwacyjną.
- Niech obserwator, który jest ślepy na warunki eksperymentalne myszy, przeanalizuje zarejestrowane zachowanie.
- Zwróć uwagę na każdy epizod pielęgnacji twarzy podczas analizy 10-minutowego nagrania. Pielęgnacja twarzy to wzorce ruchowe, w których zwierzę styka się przednimi łapami z obszarami twarzy.
- Rozróżnij izolowane zachowania związane z pielęgnacją twarzy i zachowaniami związanymi z pielęgnacją twarzy podczas pielęgnacji ciała9. Jeśli sekwencja nie jest poprzedzona lub nie następuje po niej pielęgnacja ciała, epizod jest oznaczony jako izolowana pielęgnacja twarzy. Pielęgnacja ciała jest definiowana jako wzorce ruchów, które sprawiają, że łapy, język lub siekacze stykają się z obszarem ciała innym niż twarz lub przednie łapy. Jeśli pielęgnacja ciała jest obecna przed lub po sekwencji pielęgnacji twarzy, epizod jest oznaczony jako pielęgnacja twarzy podczas pielęgnacji ciała.
- Określ liczbę epizodów pielęgnacji twarzy, stosując kryterium odcięcia 4 s. Okres między czynnościami pielęgnacyjnymi krótszy niż 4 sekundy definiuje się jako przerwę w obrębie jednego epizodu. Okres dłuższy niż 4 sekundy definiuje się jako całkowite przerwanie czynności pielęgnacyjnych między dwoma epizodami.
- Testy stymulacji mechanicznej
- Myszy należy przenosić w grupach do 6 zwierząt z pomieszczenia do pomieszczenia testowego w zadaszonej klatce z ściółką. Ponownie należy uważać, aby unikać stymulacji zewnętrznej.
- Umieść myszy pojedynczo na stole.
- Umieść ogon myszy w miękkim silikonowym zacisku i przymocuj zacisk magnetycznie do metalowej płytki na stole. Silikonowy materiał zapobiega wyślizgiwaniu się ogona z zacisku, jednocześnie minimalizując nacisk na ogon.
- Umieść trójścienny plastikowy uchwyt (65 mm x 25 mm x 23 mm) nad zwierzęciem tak, aby z pojemnika wystawała tylko głowa myszy. Rozmiar uchwytu pozwala na ruchy głowy i przedniej łapy, ale zapobiega obracaniu się zwierzęcia w jego wnętrzu. Na koniec umieść ciężarek na wierzchu uchwytu, aby utrzymać uchwyt na miejscu (Rysunek 2).
- Użyj stopniowanej serii czterech włosów von Freya. Siła potrzebna do zgięcia włosów wynosi 0,02 g, 0,16 g, 0,4 g i 1,0 g.
- Przyzwyczaj myszy do krępowania i sięgania przez 10 minut. Co 30 s wykonuj ruch sięgający na zwierzę.
- Kiedy zwierzę jest w stanie zrelaksowanym, powoli nakładaj najjaśniejsze włosy von Freya na terytorium IoN w pobliżu środka wibrysów, aż włosy von Freya się ugną. Upewnij się, że stymulacja trwa nie dłużej niż 1 s.
- Oceń reakcję zwierzęcia na stymulację, aby dopasować się do jednej z poniższych kategorii reakcji.
- Przyznaj wynik 0, gdy nie ma odpowiedzi.
- Daj wynik 1 za wykrywanie, tj. mysz odwraca głowę w kierunku obiektu stymulującego, a następnie bada obiekt bodźca.
- Przyznaj wynik 2 za reakcję odstawienia, tj. mysz delikatnie odwraca głowę lub szybko ciągnie ją do tyłu, gdy stosowana jest stymulacja; czasami dochodzi do pojedynczego przetarcia twarzy ipsilateralnie do stymulowanego obszaru.
- Daj wynik 3 za atakowanie, tj. mysz atakuje obiekt bodźca, wykonując ruchy gryzienia i/lub chwytania.
- Przyznaj wynik 4 za asymetryczną pielęgnację twarzy, tj. mysz wykazuje nieprzerwaną serię co najmniej trzech ruchów mycia twarzy skierowanych w stronę stymulowanego obszaru twarzy.
- Dla każdej myszy nałóż włosy von Freya w rosnącej kolejności intensywności i losowo stymuluj stronę ipsilateralną i przeciwległą. Zastosuj każdą intensywność bodźca jeden raz z każdej strony.
- Oblicz średni wynik na podstawie odpowiedzi na cztery włosy von Freya w każdym zwierzęciu. Oblicz oddzielne wyniki dla strony ipsilateralnej i kontralateralnej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Myszy DIoN-CCI wykazują silny pooperacyjny wzrost czasu poświęcanego na izolowane pielęgnowanie pyska oraz liczby epizodów izolowanego pielęgnowania pyska (Rysunek 3). Najsilniejszy wzrost występuje w pierwszym tygodniu po operacji, a następnie maleje w kolejnych tygodniach, jednak pozostaje istotnie zwiększony przez co najmniej 6 tygodni. Pielęgnowanie pyska podczas pielęgnowania ciała pozostaje w niewielkim stopniu niezmienione.
Myszy z modelem DIoN-CCI są niema...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
U szczurów wcześniej argumentowano, że preferowane jest wewnątrzoczodołowe podejście do IoN, biorąc pod uwagę znaczenie nienaruszonej drobnej muskulatury kontrolującej złożone wzorce trzepania w dyskryminacji wibrysowo-dotykowej i względną odległość nacięcia linii środkowej do skórnego terytorium nerwu podoczodołowego10. Inni twierdzą, że podejście dystalne poprzez nacięcie w owłosionej skórze ogonowej do opuszki wibrysalnej ma szereg korzyści13,14
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy nie mają żadnych podziękowań.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Chromowy katgut (6-0) | Dynek | CG602D | ligatury |
| Aplikator bawełniany | Apteka | ||
| Cyfrowa kamera wideo | Sony | HDR-CX330E | |
| Kleszcze Dumont #5 | Narzędzia do nauki | precyzyjnej 11251-10 | |
| Kleszcze Dumont - Mikro-końcówki (#5/45) | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| Duratears | Alcon | 0037-820 | maść okulistyczna |
| Haczykowaty środek do podwiązywania | Fine Science Tools | 18062-12 | |
| Ketalar | Pfizer | ketamina (50 mg / ml) | |
| Mikroskop operacyjny | Kaps | SOM 62 | |
| Precyzyjny wacik bawełniany | Qosina | 10225 | |
| Precyzyjny trymer | Philips | HP6392/00 | |
| Rompun | Bayer | ksylazyna (2 %) | |
| Nożyczki - końcówki | Fine Science Tools | 14574-09 | |
| Zestaw do estezjometru Semmes-Weinstein Von Frey | Stoelting | 58011 | |
| Vicryl Rapide | Ethicon | MPVR489H | szwy |
Bibliografia
- Costigan, M., Scholz, J., Woolf, C. J. Neuropathic pain: a maladaptive response of the nervous system to damage. Annu Rev Neurosci. 32, 1-32 (2009).
- Torrance, N., Smith, B. H., Bennett, M. I., Lee, A. J. The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey. J Pain. 7, 281-289 (2006).
- Jensen, T. S., Gottrup, H., Sindrup, S. H., Bach, F. W. The clinical picture of neuropathic pain. Eur J Pharmacol. 429 (1-3), 1-11 (2001).
- Bennett, G. J., Xie, Y. K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33 (1), 87-107 (1988).
- Backonja, M. M., Stacey, B. Neuropathic pain symptoms relative to overall pain rating. J Pain. 5, 491-497 (2004).
- Basbaum, A. I., et al. Measurrement and New Technologies. Emerging Strategies for the Treatment of Neuropathic Pain. Campbell, J. N. , IASP Press. Seattle, WA. (2006).
- Mogil, J. S., Crager, S. E. What should we be measuring in behavioral studies of chronic pain in animals. Pain. 112, 12-15 (2004).
- Vierck, C. J., et al. Animal Studies of Pain: Lessons for Drug Development. Emerging Strategies for the Treatment of Neuropathic Pain. Campbell, J. N. , IASP Press. Seattle, WA. (2006).
- Deseure, K., Adriaensen, H. Nonevoked facial pain in rats following infraorbital nerve injury a parametric analysis. Physiol Behav. 81 (4), 595-604 (2004).
- Deseure, K., Hans, G. H. Chronic constriction injury of the rat's infraorbital nerve (IoN-CCI) to study trigeminal neuropathic pain. J Vis Exp. (103), e53167(2015).
- Mogil, J. S. Animal models of pain: progress and challenges. Nat Rev Neurosci. 10 (4), 283-294 (2009).
- Wilson, S. G., Mogil, J. S. Measuring pain in the (knockout) mouse: big challenges in a small mammal. Behav Brain Res. 125 (1-2), 65-73 (2001).
- Ding, W., et al. An improved rodent model of trigeminal neuropathic pain by unilateral chronic constriction injury of distal infraorbital nerve. J Pain. 18 (8), 899-907 (2017).
- Hardt, S., Fischer, C., Vogel, A., Wilken-Schmitz, A., Tegeder, I. Distal infraorbital nerve injury: a model for persistent facial pain in mice. Pain. 160 (6), 1431-1447 (2019).
- Krzyzanowska, A., Avendaño, C. Behavioral testing in rodent models of orofacial neuropathic and inflammatory pain. Brain Behav. 2 (5), 678-697 (2012).
- Martin, Y. B., Malmierca, E., Avendaño, C., Nuñez, A. Neuronal disinhibition in the trigeminal nucleus caudalis in a model of chronic neuropathic pain. Eur J Neurosci. 32 (3), 399-408 (2010).
- Deseure, K., Hans, G. Behavioral study of non evoked orofacial pain following different types of infraorbital nerve injury in rats. Physiol Behav. 138, 292-296 (2015).
- Vuralli, D., Wattiez, A. S., Russo, A. F., Bolay, H. Behavioral and cognitive animal models in headache research. J Headache Pain. 20 (1), 11(2019).
- Krzyzanowska, A., et al. Assessing nociceptive sensitivity in mouse models of inflammatory and neuropathic trigeminal pain. J Neurosci Methods. 201 (1), 46-54 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
