Artykuł metodologiczny

Analizy zakażeń komórek nabłonkowych preparatem Shigella

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66426

⸱

9 lutego 2024

 ,  , 
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje testy infekcji do badania przestrzegania Shigella, inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej przy użyciu linii komórkowych nabłonka in vitro.

Streszczenie

Przystosowany do człowieka patogen bakteryjny jelitowy Shigella powoduje miliony infekcji każdego roku, powoduje długoterminowe efekty wzrostu wśród pacjentów pediatrycznych i jest główną przyczyną zgonów z powodu biegunki na całym świecie. Zakażenie wywołuje wodnistą lub krwawą biegunkę w wyniku przejścia patogenu przez przewód pokarmowy i zakażenia komórek nabłonka wyściełających okrężnicę. Przy oszałamiającym wzroście oporności na antybiotyki i obecnym braku zatwierdzonych szczepionek, ustandaryzowane protokoły badawcze mają kluczowe znaczenie dla badania tego groźnego patogenu. W tym miejscu przedstawiono metodologie badania molekularnej patogenezy Shigella przy użyciu analiz in vitro przylegania, inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej bakterii w komórkach nabłonka okrężnicy. Przed analizą infekcji fenotyp zjadliwości kolonii Shigella został zweryfikowany poprzez wychwyt czerwonego barwnika Kongo na płytkach agarowych. Uzupełnione pożywki laboratoryjne mogą być również brane pod uwagę podczas hodowli bakteryjnej w celu naśladowania warunków in vivo. Komórki bakteryjne są następnie wykorzystywane w znormalizowanym protokole do infekowania komórek nabłonka okrężnicy na płytkach do hodowli tkankowych przy ustalonej wielokrotności infekcji z adaptacjami do analizy każdego etapu infekcji. W celu przeprowadzenia testów adhezyjnych komórki Shigella są inkubowane ze zmniejszonymi poziomami pożywki, aby ułatwić kontakt bakterii z komórkami nabłonka. Zarówno w testach inwazji, jak i replikacji wewnątrzkomórkowej gentamycyna jest stosowana w różnych odstępach czasu w celu wyeliminowania bakterii zewnątrzkomórkowych i umożliwienia oceny inwazji i/lub ilościowego określenia szybkości replikacji wewnątrzkomórkowej. Wszystkie protokoły infekcji wyliczają bakterie przylegające, zaatakowane i/lub wewnątrzkomórkowe poprzez seryjne rozcieńczanie zakażonych lizatów komórek nabłonka i posiewanie jednostek tworzących kolonie bakteryjne w stosunku do mian infekcji na czerwonych płytkach agarowych Kongo. Łącznie protokoły te umożliwiają niezależną charakterystykę i porównania komórek nabłonkowych dla każdego etapu infekcji Shigella w celu pomyślnego zbadania tego patogenu.

Wprowadzenie

Choroby biegunkowe wywołane przez patogeny bakteryjne jelit stanowią znaczące globalne obciążenie zdrowotne. W 2016 roku choroby biegunkowe były odpowiedzialne za 1,3 miliona zgonów na całym świecie i były czwartą najczęstszą przyczyną zgonów dzieci poniżej piątego roku życia1,2. Gram-ujemny, jelitowy patogen bakteryjny Shigella jest czynnikiem wywołującym shigellozę, główną przyczynę zgonów z powodu biegunki na całym świecie3. Shigeloza powoduje co roku znaczną zachorowalność i śmiertelność u dzieci z krajów o niższych i średnich dochodach4,5, podczas gdy infekcje w krajach o wysokich dochodach są związane z epidemiami w ośrodkach opieki dziennej, przenoszonych przez żywność i wodę6,7,8,9. Nieskuteczne opracowanie szczepionki10 i rosnące wskaźniki oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR)11,12 skomplikowały zarządzanie epidemiami Shigella na dużą skalę. Ostatnie dane Centers for Disease Control and Prevention pokazują, że prawie 46% zakażeń Shigella w Stanach Zjednoczonych wykazywało oporność na leki w 2020 roku13,14, podczas gdy Światowa Organizacja Zdrowia uznała Shigella za priorytetowy patogen AMR, dla którego pilnie potrzebne są nowe terapie15.

Infekcje Shigella są łatwo przenoszone drogą fekalno-oralną po spożyciu skażonego jedzenia lub wody, lub poprzez bezpośredni kontakt z człowiekiem. Shigella wyewoluowała, aby stać się skutecznym, przystosowanym do człowieka patogenem, z zakaźną dawką 10-100 bakterii wystarczającą do wywołania choroby16. Podczas pasażu jelita cienkiego Shigella jest narażona na sygnały środowiskowe, takie jak podwyższona temperatura i żółć17. Wykrycie tych sygnałów indukuje zmiany transkrypcyjne w celu ekspresji czynników wirulencji, które zwiększają zdolność bakterii do infekowania ludzkiego jelita grubego17,18,19. Shigella nie atakuje nabłonka okrężnicy z powierzchni wierzchołkowej, ale raczej przechodzi przez warstwę nabłonka po wychwycie do wyspecjalizowanych komórek mikrofałdowych prezentujących antygen (komórki M) w nabłonku związanym z pęcherzykami włosowymi20,21,22. Po transcytozie komórki Shigella są fagocytozowane przez rezydujące makrofagi. Shigella szybko ucieka z fagosomu i wywołuje śmierć komórek makrofagów, co powoduje uwolnienie cytokin prozapalnych5,23,24. Shigella następnie atakuje komórki nabłonka okrężnicy od strony podstawno-bocznej, lizuje wakuolę makropinocytarną i ustanawia niszę replikacyjną w cytoplazmie5,25. Cytokiny prozapalne, zwłaszcza interleukina-8 (IL-8), rekrutują polimorfojądrzaste leukocyty neutrofilowe (PMN) do miejsca zakażenia, co osłabia ścisłe połączenia nabłonkowe i umożliwia infiltrację bakteryjną wyściółki nabłonka w celu zaostrzenia infekcji podstawno-bocznej5. PMN niszczą zainfekowaną wyściółkę nabłonka, aby powstrzymać infekcję, co skutkuje charakterystycznymi objawami czerwonki bakteryjnej (krwawej) 5. Chociaż mechanizmy inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej zostały dokładnie scharakteryzowane, nowe badania pokazują ważne nowe koncepcje infekcji Shigella, w tym regulację wirulencji podczas pasażu żołądkowo-jelitowego (GI)17, adherence19, lepszy dostęp podstawno-boczny dzięki przepuszczalności bariery26 oraz bezobjawowe nosicielstwo u niedożywionych dzieci27.

Zdolność Shigella spp. do wywoływania choroby biegunkowej jest ograniczona do ludzi i naczelnych (NHP)28. Modele infekcji jelitowych Shigella zostały opracowane dla danio pręgowanego29, mice30, świnki morskie31, rabbits21,32,33 i pigs34,35. Jednak żaden z tych systemów modelowych nie jest w stanie dokładnie odtworzyć cech choroby obserwowanych podczas infekcji u ludzi36. Chociaż modele NHP shigellozy zostały stworzone w celu badania patogenezy Shigella, te systemy modelowe są kosztowne do wdrożenia i wymagają sztucznie wysokich dawek zakaźnych, do dziewięciu rzędów wielkości wyższych niż dawka zakaźna u ludzi37,38,39,40,41,42. Tak więc niezwykła adaptacja Shigelli do infekcji ludzkich gospodarzy wymaga użycia kultur komórkowych pochodzących od ludzi w celu odtworzenia fizjologicznie istotnych modeli do dokładnego badania patogenezy Shigella.

Tutaj opisane są szczegółowe procedury mierzące tempo przylegania, inwazji i replikacji Shigella w komórkach nabłonka okrężnicy HT-29. Korzystając z tych ustandaryzowanych protokołów, można zbadać mechanizmy molekularne, za pomocą których geny wirulencji bakteryjnej i sygnały środowiskowe wpływają na każdy etap infekcji Shigella, aby lepiej zrozumieć dynamiczną zależność interakcji gospodarz-patogen.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników i materiałów

UWAGA: Wszystkie objętości są dostosowane do analizy z wykorzystaniem dwóch płytek 6-dołkowych.

  1. Pożywka TSB: Do 15 g pożywki Tryptic Soy Broth (TSB, patrz Tabela materiałów) dodać 0,5 L wody dejonizowanej (DI) i autoklawować. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  2. Pożywka z solami żółciowymi (TSB + BS): Aby przygotować TSB zawierający 0,4% (w/v) soli żółciowych, resuspendować 0,06 g soli żółciowych (BS, patrz Tabela materiałów) w 15 mL autoklawowanego TSB. Sterylizować poprzez filtrację przy użyciu filtra PES 0,22 µm.
    UWAGA: Sole żółciowe składają się z mieszaniny cholanu sodu i deoksycholanu sodu w stosunku 1:1. Świeże pożywki należy przygotowywać bezpośrednio przed użyciem.
  3. DMEM + 10% (v/v) FBS: Do 45 mL pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) dodać 5 mL płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. DMEM + gentamycyna: Do probówki 50 mL dodać 50 mL DMEM oraz 50 µL gentamycyny w stężeniu 50 mg/mL (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Przed każdym eksperymentem należy przygotować świeżą porcję i ogrzać ją w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
  5. PBS + 1% (v/v) Triton X-100: Do 15 mL soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) dodać 150 µL Triton X-100.
    UWAGA: Przed każdym eksperymentem należy przygotować świeżą porcję i ogrzać ją w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
  6. Płytki TSB z wskaźnikiem Congo red: Do butelki o pojemności 1 L dodać 15 g TSB, 7,5 g agaru selektywnego oraz 0,125 g barwnika Congo red (patrz Tabela materiałów). Dodać 0,5 L wody DI i autoklawować. Wlać 10-20 mL pożywki do poszczególnych sterylnych szalek Petriego (100 mm x 15 mm) i pozostawić do stężenia.
    OSTROŻNIE: Congo red jest substancją rakotwórczą i toksyczną dla rozrodu. Należy upewnić się, że praca z Congo red odbywa się przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej. Dodatkowe informacje znajdują się w karcie charakterystyki produktu.
    UWAGA: Z 0,5 L pożywki z Congo red przygotowuje się około 20 płytek. Płytki można przygotować z 2-3 dniowym wyprzedzeniem i przechowywać odwróconymi w temperaturze pokojowej do momentu użycia. W celu długoterminowego przechowywania odwrócone płytki należy umieścić w plastikowych etui w temperaturze 4 °C na okres do 3 miesięcy.
  7. DMEM + 10% (v/v) FBS i 5% (v/v) dimetylosulfotlenek (DMSO): Do probówki 50 mL dodać 42,5 mL DMEM, 5 mL FBS oraz 2,5 mL DMSO. Przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Przygotowanie bakterii

UWAGA: Wszystkie protokoły hodowli laboratoryjnej i przechowywania Shigella zostały zaadaptowane z pracy Payne, S. M.43.

UWAGA: Shigella spp. są patogenami z grupy ryzyka 244. Wszystkie prace laboratoryjne należy przeprowadzać w środowisku BSL-2, stosując dodatkowe środki bezpieczeństwa w celu ograniczenia przypadkowej ekspozycji ze względu na niską dawkę zakaźną Shigella spp.

  1. Hodowla Shigella z mrożonych zapasów
    1. Przenieś niewielką ilość zamrożonej kultury z fiolki kriogenicznej na płytkę z agarem TSB + czerwień Kongo za pomocą sterylnego aplikatora.
    2. Wypal pętlę do posiewu i poczekaj, aż ostygnie. Wykonaj posiew inoculum zygzakowate w jednym kwadrancie płytki. Ponownie wypal pętlę, poczekaj, aż ostygnie, a następnie przenieś posiew z pierwszego kwadrantu do drugiego kwadrantu płytki. Powtórz tę czynność, aby zaszczepić inoculum w trzecim i czwartym kwadrancie płytki.
      UWAGA: Alternatywnie posiew inoculum można wykonać, używając nowego sterylnego aplikatora pomiędzy każdym kwadrantem.
    3. Odwróć płytkę i inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc.
      UWAGA: Inkubacja w temperaturach ≥37 °C jest niezbędna do ekspresji czynników wirulencji Shigella koniecznych do obserwacji fenotypu dodatniego z czerwienią Kongo (CR+)45. Kolonie awirulentne będą miały biały kolor i nie będą inwazyjne.
    4. Zabezpiecz płytkę folią parafinową i przechowuj w lodówce w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Kolonie bakteryjne pozostaną żywe na płytkach z agarem przez 1-2 tygodnie.
  2. Nocna hodowla Shigella w kulturze płynnej
    1. Odmierz 3 mL pożywki TSB do sterylnych probówek hodowlanych o pojemności 14 mL.
    2. Wyizoluj pojedynczą, dobrze odseparowaną czerwoną (CR+) kolonię za pomocą sterylnego aplikatora i resuspenduj w pożywce płynnej.
    3. Inkubuj kultury przez noc (16-18 h) w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 250 obrotów na minutę (rpm).

3. Przygotowanie eukariotycznych komórek HT-29

UWAGA: Wszystkie objętości są dostosowane do analizy z wykorzystaniem dwóch płytek 6-dołkowych. Linie komórkowe HT-29 zostały pozyskane z American Type Culture Collection (ATCC). Protokoły hodowli komórek HT-29 zostały opracowane na podstawie zaleceń ATCC46. Wszystkie pożywki należy uprzednio podgrzać w łaźni wodnej do 37 °C przed użyciem. Wszystkie procedury dotyczące hodowli HT-29 należy przeprowadzać w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Podczas mieszania lub pracy z komórkami HT-29 w pożywkach należy unikać tworzenia pęcherzyków powietrza, aby zapobiec gwałtownym zmianom pH.

  1. Rozmrażanie komórek HT-29 z zamrożonego banku
    1. Rozmroź fiolkę z komórkami HT-29 w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Upewnij się, że zakrętka znajduje się całkowicie ponad powierzchnią wody, aby uniknąć kontaminacji. Rozmrażanie powinno trwać krócej niż 2 min.
    2. Wyjmij fiolkę z wody natychmiast po całkowitym rozmrożeniu hodowli i zdezynfekuj ją 70% etanolem. Upewnij się, że wszystkie kolejne kroki są wykonywane z zachowaniem zasad aseptyki.
    3. Przenieś całą zawartość fiolki do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL zawierającej 9 mL DMEM + 10% FBS. Wirować przy 125 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    4. Odlej nadsącz do pojemnika na odpady i resuspenduj osad w 10 mL ogrzanego DMEM + 10% FBS. Przenieś resuspendowane komórki do butelki do hodowli tkankowej o powierzchni 75 cm2 (T75) zawierającej 10 mL ogrzanego DMEM + 10% FBS (objętość całkowita 20 mL).
    5. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 aż do osiągnięcia przez nie 90% konfluencji (około 6-7 dni).
      UWAGA: Konfluencję ocenia się na podstawie przybliżonej analizy wizualnej.
  2. Wysiewanie komórek HT-29
    1. Podgrzej 20 mL PBS oraz 50 mL DMEM + 10% FBS w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, a 3 mL 0,25% (w/v) Trypsyny-EDTA doprowadź do temperatury pokojowej.
    2. Gdy komórki HT-29 (z kroku 3.1) osiągną 90% konfluencji, odlej pożywkę z hodowli komórek HT-29 z butelki T75 do pojemnika na odpady. Wlej do butelki ~10 mL ogrzanego PBS i delikatnie zamieszaj w celu przemycia. Odlej PBS do pojemnika na odpady. Przemyj ponownie ogrzanym PBS i odlej.
    3. Dodaj 2-3 mL 0,25% (w/v) Trypsyny-EDTA i delikatnie wymieszaj na całej powierzchni. Inkubuj w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez 4 min.
    4. Wyjmij butelkę z inkubatora i delikatnie zamieszaj Trypsynę-EDTA, upewniając się wizualnie, że wszystkie komórki oddzieliły się od powierzchni.
    5. Natychmiast dodaj 6 mL ogrzanego DMEM + 10% FBS, aby dezaktywować trypsynę. Pipetuj w górę i w dół, aby dokładnie wymieszać.
    6. Przenieś całą zawartość do probówki wirówkowej 15 mL i wiruj przy 500 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    7. Delikatnie odlej nadsącz do pojemnika na odpady i resuspenduj osad w 6 mL ogrzanego DMEM + 10% FBS.
    8. Bezpośrednio po resuspensji przenieś 10 µL zawiesiny komórek HT-29 z części środkowej hodowli do probówki PCR 0,2 mL. Dodaj do probówki PCR 10 µL barwnika Trypan blue i wymieszaj.
    9. Dodaj 10 µL mieszaniny komórek HT-29 z Trypan blue na jednorazową szkiełko do licznika komórek Countess (patrz Tabela materiałów). Policz liczbę żywych komórek i oblicz żywotność komórek.
      UWAGA: Dokumentując liczbę komórek w próbce, odczytaj wartość z pola „live” (żywe), a nie całkowitą liczbę komórek. Alternatywnie, zliczanie komórek można przeprowadzić ręcznie za pomocą hemocytometru.
    10. Wysiej resuspendowane komórki HT-29 do nowej butelki T75 lub płytki 6-dołkowej.
      1. Dla butelki T75:
        1. Wymieszaj delikatnie pipetą, a następnie przenieś 2,5 x 106 komórek do nowej butelki T75 zgodnie z poniższym równaniem:
          Wzór na obliczenie stężenia komórek, \( \frac{2,5 \times 10^6 \text{ komórek}}{\text{stężenie żywych komórek (kom/mL)}} = \text{mL komórek} \).
        2. Dodaj ogrzaną pożywkę DMEM + 10% FBS do uzyskania objętości końcowej 20 mL (stężenie końcowe 1,25 x 105 komórek/mL).
        3. Rozprowadź komórki równomiernie w butelce, delikatnie kołysząc nią w przód i w tył.
        4. Inkubuj w 37 °C przy 5% CO2 do czasu, aż komórki osiągną 80% konfluencji.
          UWAGA: Dla optymalnego wzrostu wymieniaj pożywkę DMEM + 10% FBS w butelce T75 mniej więcej co 3 dni. Odlej pożywkę do pojemnika na odpady i dodaj do butelki 10 mL ogrzanego PBS. Delikatnie zamieszaj PBS i odlej go do pojemnika na odpady. Następnie dodaj do butelki 20 mL świeżego, ogrzanego DMEM + 10% FBS i umieść w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).
      2. Dla płytki 6-dołkowej:
        1. Wymieszaj delikatnie pipetą, a następnie przenieś 5,85 x 106 komórek do nowej probówki stożkowej 50 mL zgodnie z poniższym równaniem:
          Wzór na stężenie żywych komórek, równanie 5,85x10^6 komórek, stosowane w obliczeniach biologii komórki.
        2. Dodaj ogrzaną pożywkę DMEM + 10% FBS do uzyskania objętości końcowej 26 mL (stężenie końcowe 2,25 x 105 komórek/mL).
        3. Wymieszaj delikatnie pipetą, a następnie rozlej po 2 mL (4,5 x 105 komórek) do poszczególnych dołków płytek 6-dołkowych.
        4. Rozprowadź komórki równomiernie w dołku, delikatnie kołysząc płytką w górę/dół i lewo/prawo 2-3 razy.
        5. Inkubuj w 37 °C przy 5% CO2 do czasu, aż komórki osiągną konfluencję 80%-95% (około 3-4 dni).
          UWAGA: Do testów inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej zaleca się konfluencję 85%, natomiast do testów adhezji zaleca się konfluencję 90%-95%. Komórki powinny osiągnąć ok. 85% konfluencji po 48 h inkubacji przy stężeniu końcowym około 1 x 106 komórek/dołek. Może być wymagana korekta liczby wysiewanych komórek oraz czasu inkubacji.
  3. Przygotowanie zamrożonych zapasów HT-29
    1. Rozdziel po 1 mL pożywki DMEM + 10% FBS + 5% DMSO do pojedynczych fiolek kriogenicznych.
    2. Dodaj 1 x 106 komórek HT-29 z kroku 3.2.7 do każdej fiolki. Oblicz objętość komórek zgodnie z poniższym wzorem:
      Wzór na stężenie żywych komórek; równanie do obliczania mL komórek na podstawie stężenia komórek.
    3. Przechowuj komórki HT-29 długoterminowo w temperaturze poniżej -130 °C w zamrażarce do przechowywania w oparach ciekłego azotu.

4. Test adhezji

UWAGA: Wszystkie objętości są dostosowane do analizy z wykorzystaniem dwóch płytek 6-dołkowych.

  1. Przeszczepienie na noc Shigella hodowle poprzez rozcieńczenie 1:50 w świeżej pożywce.
    1. Wymieszać w wirówce vortex, a następnie dodać 100 µL każdej kultury nocnej do 5 ml świeżej pożywki TSB lub TSB + BS w probówce o odpowiedniej pojemności.
      UWAGA: Ogranicz objętość hodowli do <20% objętości kolby lub probówki hodowlanej, aby zapewnić właściwe napowietrzanie.
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C z wstrząsaniem przy 250 obr./min, aż komórki osiągną gęstość optyczną (OD600) wynoszącej 0,7 (środkowa faza logarytmiczna Shigella wzrost); około 2–2,5 h.
      UWAGA: Podczas pasażowania odmierzyć 50 ml DMEM oraz odpowiednią objętość PBS do wszystkich etapów płukania i umieścić w 37 °C kąpiel wodna. Pozostaw pożywkę do osiągnięcia 37 °C przed użyciem.
  2. Przenieś 2 x 108 przeszczepione jednostki tworzące kolonie (CFU) Shigella do poszczególnych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml.
    UWAGA: 2 x 108 Liczba CFU odpowiada w przybliżeniu 1 ml komórek bakteryjnych przy wartości OD600 wynoszącej 0,7. Należy użyć OD600 odczyty pozwalające przybliżyć wartość CFU/ml zgodnie z kalibracją każdego poszczególnego spektrofotometru.
  3. Przemyć każdą Shigella przemyć próbkę 2x w PBS.
    1. Odwirować komórki w wirowarce z prędkością 17 000 x g przez 2 min w temperaturze pokojowej. Odessać nadsącz, następnie dodać 1 ml ciepłego PBS i dokładnie resuspender osad, delikatnie pipetując próbkę w górę i w dół do uzyskania całkowitej homogeniczności mieszaniny (8-10 razy).
    2. Powtórz krok 4.3.1 jeszcze raz.
    3. Odwirować komórki w celu uzyskania osadu przy 17 000 x g przez 2 min w temperaturze pokojowej, odessać nadsącz i zawiesić osad w 2 ml ciepłego DMEM.
      UWAGA: Końcowe stężenie resuspenderowanych bakterii wyniesie 1 x 108 JCF/ml
  4. Wymieszać w wortexie, a następnie dodać 1 ml (1 x 108 jednostek tworzących kolonie (CFU) w zawiesinie Shigella do każdej studni przygotowanych monowarstw nabłonka jelita grubego HT-29 na płytkach 6-dołkowych (z kroku 3.2.10.2).
    UWAGA: Infekcje przeprowadza się zazwyczaj przy wielokrotności infekcji (MOI; stosunek komórek bakteryjnych do nabłonkowych) wynoszącej 100. Aby przetestować różne wartości MOI, należy rozcieńczyć resuspensję Shigella w ciepłym DMEM do pożądanego stężenia, a następnie dodać 1 ml rozcieńczonych bakterii do monowarstw HT-29. Na przykład, aby przetestować MOI wynoszące 10, należy rozcieńczyć bakterie w stosunku 1:10 poprzez dodanie 150 µL 1 x 108 CFU/ml bakterii do 1,35 ml ciepłego DMEM, a następnie nanieść 1 ml (1 x 107 jednostki tworzące kolonie (CFU) do komórek HT-29.
  5. Inkubować płytki 6-dołkowe w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 3 h.
  6. Podczas inkubacji należy oznaczyć miano infekcji bakteryjnej.
    1. Przygotować 10-krotne rozcieńczenia seryjne zawiesiny Shigella komórki (z kroku 4.3.3) do PBS.
    2. Płytka 100 µL z 1 x 10-5 oraz 1 x 10-6 rozcieńczenia na płytki z pożywką TSB z kongo red i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Wysiewanie na podłoża 100 µL z 1 x 10-5 oraz 1 x 10-6 rozcieńczenia odpowiadają końcowemu współczynnikowi rozcieńczenia 1 x 10-6 oraz 1 x 10-7odpowiednio.
  7. Po inkubacji warstwy monowarstw należy przemyć 4-5 razy buforem PBS.
    1. Odssać medium z każdej studzienki.
      UWAGA: Podczas aspirowania pożywki z płytek 6-dołkowych należy prowadzić końcówkę aspiratora wzdłuż dna dołków, starając się unikać kontaktu z komórkami HT-29.
    2. Do każdego dołka należy dodać 1 ml ciepłego PBS i delikatnie wypłukać.
      UWAGA: Aby delikatnie przemyć monowarstwy w płytce 6-dołkowej przy użyciu PBS, należy przesuwać płytkę w górę i w dół oraz na boki po blacie laboratoryjnym. Mycie płytek ruchem okrężnym i/lub podnoszenie płytki z powierzchni blatu może spowodować mechaniczne oderwanie komórek od plastiku.
    3. Powtórzyć kroki 4.7.1 i 4.7.2 jeszcze 4 razy.
  8. Usunąć PBS poprzez aspirację, a następnie zlizować komórki HT-29, dodając do każdego dołka 1 mL PBS + 1% Triton X-100.
  9. Inkubować płytki 6-dołkowe w temperaturze 37 °C przez 5 min.
  10. Używając skrobaka do komórek lub zagiętego końcówki pipety, zeskrob lizeowane komórki z dna dołka i przenieś całą objętość 1 ml do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 ml.
  11. Wyznacz liczbę bakterii związanych z komórkami.
    1. Wymieszać każdą probówkę (z kroku 4.10) na wirówce typu vortex przez co najmniej 30 s, aby dodatkowo przemieścić Shigella z lizowanych komórek eukariotycznych.
    2. Przygotować 10-krotne rozcieńczenia seryjne lizatów w PBS.
    3. Płytka 100 µL z 1 x 10-2, 1 x 10-3oraz 1 x 10-4 roztwory w serii rozcieńczeń na płytki z pożywką TSB z czerwienią kongową i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Wysiewanie na płytki 100 µL z 1 x 10-2, 1 x 10-3, oraz 1 x 10-4 rozcieńczenia odpowiadają końcowemu czynnikowi rozcieńczenia 1 x 10-3, 1 x 10-4oraz 1 x 10-5odpowiednio.

5. Test inwazyjności

UWAGA: Wszystkie objętości są dostosowane do analizy z wykorzystaniem dwóch płytek 6-dołkowych.

  1. Przeszczepienie w celu nocnej inkubacji Shigella hodowle poprzez rozcieńczenie 1:50 w świeżej pożywce.
    1. Wymieszać w wirówce Vortex, a następnie dodać 100 µL każdej hodowli nocnej do 5 ml świeżej pożywki TSB lub TSB + BS w probówce o odpowiedniej pojemności.
      UWAGA: Ogranicz objętość hodowli do <20% objętości kolby lub probówki hodowlanej, aby zapewnić właściwe napowietrzanie.
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C przy wstrząsaniu z prędkością 250 obr./min aż do momentu, gdy komórki osiągną gęstość optyczną (OD)600 wynoszącej 0,7 (środkowa faza logarytmiczna) Shigella wzrost); około 2–2,5 h.
      UWAGA: Podczas pasażowania odmież 50 ml DMEM + 50 mg/ml gentamycyny oraz odpowiednią objętość PBS do wszystkich etapów płukania i umieść je w 37 °C łaźnia wodna. Pozostawić pożywkę do osiągnięcia 37 °C przed użyciem.
  2. Przenieś 2 x 108 przesiane CFU Shigella do poszczególnych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml.
    UWAGA: 2 x 108 CFU odpowiada około 1 ml komórek bakteryjnych przy danej wartości OD600 do 0,7. Należy użyć OD600 odczyty do przybliżonego wyznaczenia CFU/ml zgodnie z kalibracją każdego poszczególnego spektrofotometru.
  3. Przemyć Shigella próbki 1x w PBS.
    1. Odwirować komórki w celu uzyskania osadu przy 17 000 x g przez 2 min w temperaturze pokojowej. Odessać nadsącz, następnie dodać 1 ml ciepłego PBS i dokładnie resuspender osad, delikatnie pipetując próbkę w górę i w dół do pełnego ujednorodnienia mieszaniny (8–10 razy).
    2. Powtórz krok 5.3.1 jeszcze jeden raz.
    3. Odwiruj komórki w celu otrzymania osadu przy prędkości 17 000 x g przez 2 min w temperaturze pokojowej, odessać nadsącz i zawiesić osad w 2 ml podgrzanego DMEM.
      UWAGA: Końcowe stężenie resuspendowanych bakterii wyniesie 1 x 108 CFU/ml
  4. Wymieszać w wortexie, a następnie dodać 1 ml (1 x 108 jednostek tworzących kolonie (CFU) z resuspenderowanych Shigella dodaj 1 mL pożywki DMEM do każdej studni przygotowanych monowarstw nabłonka jelita grubego HT-29 w płytkach 6-dołkowych (z kroku 3.2.10.2).
    UWAGA: Zakażenia przeprowadza się zazwyczaj przy wielokrotności zakażenia (MOI; stosunek bakterii do komórek nabłonkowych) wynoszącej 100. Aby przetestować różne wartości MOI, należy rozcieńczyć zawiesinę Shigella w DMEM do pożądanego stężenia, a następnie dodać 1 ml rozcieńczonych bakterii do monowarstw komórek HT-29. Na przykład, aby przetestować MOI wynoszące 10, należy rozcieńczyć bakterie w stosunku 1:10 poprzez dodanie 150 µL 1 x 108 CFU/ml bakterii do 1,35 ml DMEM, a następnie dodać 1 ml (1 x 107 CFU) do komórek HT-29.
  5. Aby wspomóc kontakt bakterii z komórkami HT-29, wiruj płytki 6-dołkowe z prędkością 2000 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej lub 37 °C czy ustawienie temperatury można dostosować.
    UWAGA: Wirowanie sprzyja kontaktowi bakterii z komórkami HT-29, co eliminuje konieczność wykorzystania czynników adhezyjnych i umożliwia bakteriom szybką inwazję do wnętrza komórek.
  6. Inkubować płytki 6-dołkowe w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 45 min.
  7. W trakcie inkubacji należy oznaczyć miano infekcji bakteryjnej.
    1. Przygotować 10-krotne rozcieńczenia seryjne zresuspendowanego Shigella komórki (z kroku 5.3.3) do PBS.
    2. Płytka 100 µL z 1 x 10-5 oraz 1 x 10-6 rozcieńczenia na płytki z pożywką TSB z czerwienią kongową i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Wysiew na płytki 100 µL z 1 x 10-5 oraz 1 x 10-6 rozcieńczenia odpowiadają końcowemu współczynnikowi rozcieńczenia 1 x 10-6 oraz 1 x 10-7odpowiednio.
  8. Zainfekowane komórki HT-29 należy dokładnie przemyć trzykrotnie 1 ml PBS.
    1. Odssać pożywkę z każdego dołka.
      UWAGA: Podczas aspiracji pożywki z płytek 6-dołkowych należy prowadzić końcówkę aspiratora wzdłuż dna dołków, starając się uniknąć kontaktu z komórkami HT-29.
    2. Do każdego dołka należy dodać 1 ml ciepłego PBS i delikatnie wypłukać.
      UWAGA: Aby delikatnie przemyć monowarstwy w płytce 6-dołkowej za pomocą PBS, należy przesuwać płytkę w górę i w dół oraz na boki po blacie laboratoryjnym. Mycie płytek ruchem okrężnym i/lub podnoszenie płytki z powierzchni blatu może spowodować mechaniczne oderwanie komórek od tworzywa.
    3. Powtórzyć kroki 5.8.1 i 5.8.2 jeszcze 2 razy.
  9. Usunąć PBS poprzez aspirację, a następnie dodać 2 ml ocieplonego DMEM uzupełnionego o 50 µg/mL gentamycynę do każdej studzienki i inkubować przez 30 min w temperaturze 37 °C z dodatkiem 5% CO2.
  10. Zainfekowane komórki HT-29 należy dokładnie przemyć trzykrotnie 1 ml PBS.
    1. Powtórz etap płukania 5.8.
  11. Usunąć PBS poprzez aspirację, a następnie dodać 2 ml ogrzanego DMEM uzupełnionego o 50 µg/mL gentamycynę do każdego dołka i inkubować przez 60 min w temperaturze 37 °C z 5% CO2.
  12. Zainfekowane komórki HT-29 dokładnie przemyć 3 razy 1 ml PBS.
    1. Powtórz etap płukania 5.8.
  13. Usunąć PBS poprzez aspirację i zlizować komórki HT-29, dodając 1 ml PBS + 1% Triton X-100 do każdego dołka.
  14. Inkubować płytki 6-dołkowe w temperaturze 37 °C przez 5 min.
  15. Używając skrobaka do komórek lub zagiętego końcówki pipety, zeskrob lizeowane komórki z dna dołka i przenieś całą objętość 1 ml do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 ml.
  16. Oznacz liczbę bakterii wewnątrzkomórkowych.
    1. Wymieszać każdą probówkę (z kroku 5.15) na wirówce typu vortex przez co najmniej 30 s, aby dodatkowo przemieścić Shigella z lizowanych komórek eukariotycznych.
    2. Przygotować 10-krotne rozcieńczenia seryjne lizatów w PBS.
    3. Płytka 100 µL z 1 x 10-2 oraz 1 x 10-3 rozcieńczenia na płytki z pożywką TSB z czerwienią kongową i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Wysiewanie na płytki 100 µL z 1 x 10-2 oraz 1 x 10-3 rozwodnienia odpowiadają końcowemu współczynnikowi rozcieńczenia 1 x 10-3 oraz 1 x 10-4odpowiednio.

6. Analiza replikacji wewnątrzkomórkowej

UWAGA: Wszystkie objętości są dostosowane do analizy z wykorzystaniem dwóch płytek 6-dołkowych.

  1. Przeszczepienie do hodowli nocnej Shigella hodowle poprzez rozcieńczenie 1:50 w świeżej pożywce.
    1. Wymieszać w wstrząsarku wirówkowym, a następnie dodać 100 µL każdej hodowli nocnej do 5 ml świeżej pożywki TSB lub TSB + BS w probówce o odpowiedniej wielkości.
      UWAGA: Ogranicz objętość hodowli do <20% objętości kolby lub probówki hodowlanej, aby zapewnić odpowiednie napowietrzenie.
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min aż do osiągnięcia przez komórki wartości OD600 wynoszącej 0,7 (środkowa faza logarytmiczna) Shigella wzrostu); około 2-2,5 h.
      UWAGA: Podczas pasażowania odmierzyć 50 ml DMEM + 50 mg/ml gentamycyny oraz odpowiednią objętość PBS do wszystkich etapów płukania i umieścić w 37 °C kąpiel wodna. Pozostawić pożywkę do osiągnięcia 37 °C przed użyciem.
  2. Przenieś 2 x 108 przeprowadzono subkulturę CFU Shigella do poszczególnych probówek do mikrowirówki o pojemności 2 ml.
    UWAGA: 2 x 108 CFU odpowiadają około 1 ml komórek bakteryjnych przy OD600 wynoszącej 0,7. Należy użyć OD600 odczyty służące do przybliżenia wartości CFU/ml zgodnie z kalibracją każdego poszczególnego spektrofotometru.
  3. Przemyć Shigella próbki 1x w PBS.
    1. Odwirować komórki w celu uzyskania osadu przy 17 000 x g przez 2 min w temperaturze pokojowej. Odessać nadsącz, następnie dodać 1 ml ciepłego PBS i dokładnie resuspender osad, delikatnie pipetując próbkę w górę i w dół do momentu uzyskania pełnej homogeniczności mieszaniny (8–10 razy).
    2. Powtórz krok 6.3.1 jeszcze raz.
    3. Odwirować komórki w celu uzyskania osadu przy 17 000 x g przez 2 min w temperaturze pokojowej, odessać nadsącz i zawiesić osad w 2 mL ciepłego DMEM.
      UWAGA: Końcowe stężenie resuspensowanych bakterii wyniesie 1 x 108 JCF/ml
  4. Wymieszać w wstrząsarzu typu vortex, a następnie dodać 1 ml (1 x 108 jednostek tworzących kolonie (CFU) z resuspensowanego Shigella dodać 1 ml DMEM do każdej studni z przygotowanymi monowarstwami nabłonka jelita grubego HT-29 w płytkach 6-dołkowych (z kroku 3.2.10.2).
    UWAGA: Infekcje przeprowadza się zazwyczaj przy wielokrotności infekcji (MOI; stosunek bakterii do komórek nabłonkowych) wynoszącej 100. Aby przetestować różne wartości MOI, należy rozcieńczyć zawiesinę Shigella w DMEM do pożądanego stężenia, a następnie dodaj 1 ml rozcieńczonych bakterii do monowarstw HT-29. Na przykład, aby przetestować MOI wynoszące 10, rozcieńcz bakterie w stosunku 1:10 poprzez dodanie 150 µL z 1 x 108 CFU/ml bakterii do 1,35 ml DMEM, a następnie nanieść 1 ml (1 x 107 jednostek tworzących kolonie (CFU) do komórek HT-29.
  5. Aby zwiększyć kontakt bakterii z komórkami HT-29, wiruj płytki 6-dołkowe przy 2000 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej lub 37 °C czy ustawienie temperatury można dostosować.
    UWAGA: Wirowanie sprzyja kontaktowi bakterii z komórkami HT-29, co eliminuje potrzebę udziału czynników adhezyjnych i pozwala bakteriom na szybką inwazję do wnętrza komórek.
  6. Inkubować płytki 6-dołkowe w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 45 min.
  7. W trakcie inkubacji należy oznaczyć miano infekcji bakteryjnej.
    1. Przygotować 10-krotne rozcieńczenia seryjne zawiesiny Shigella komórki (z kroku 6.3.3) do PBS.
    2. Płytka 100 µL z 1 x 10-5 oraz 1 x 10-6 rozcieńczenia na płytki z pożywką TSB z czerwienią kongową i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Wysiewanie na płytki 100 µL z 1 x 10-5 oraz 1 x 10-6 rozcieńczenia odpowiadają końcowemu współczynnikowi rozcieńczenia 1 x 10-6 oraz 1 x 10-7odpowiednio.
  8. Zakażone komórki HT-29 należy dokładnie przemyć trzykrotnie 1 ml PBS.
    1. Odssać medium z każdego dołka.
      UWAGA: Podczas aspiracji pożywki z płytek 6-dołkowych prowadź końcówkę aspiratora wzdłuż dna dołków, starając się uniknąć kontaktu z komórkami HT-29.
    2. Do każdego dołka należy dodać 1 ml ciepłego buforu PBS i delikatnie wypłukać.
      UWAGA: Aby delikatnie przemyć monowarstwy w płytce 6-dołkowej za pomocą PBS, należy przesuwać płytkę w górę i w dół oraz na boki po blacie laboratoryjnym. Mycie płytek ruchem okrężnym i/lub odrywanie płytki od powierzchni blatu może spowodować mechaniczne usunięcie komórek z plastiku.
    3. Powtórz kroki 6.8.1 i 6.8.2 jeszcze 2 razy.
  9. Usunąć PBS poprzez aspirację, a następnie dodać 2 ml ogrzanego DMEM uzupełnionego o 50 µg/mL gentamycynę do każdej studzienki i inkubować przez 30 min w temperaturze 37 °C z 5% CO2.
  10. Zainfekowane komórki HT-29 należy dokładnie przemyć trzykrotnie 1 ml PBS.
    1. Powtórz etap płukania 6.8.
  11. Usunąć PBS poprzez aspirację, a następnie dodać 2 ml podgrzanego DMEM z 50 µg/mL gentamycynę do każdego dołka płytek 6-dołkowych i inkubować w 37 °C z 5% CO2 przez pożądany czas, aby umożliwić replikację wewnątrzkomórkową (do 24 h).
  12. Komórki należy dokładnie przemyć dwukrotnie 1 ml PBS.
    1. Powtórz etap płukania 6.8.
  13. Usunąć PBS poprzez aspirację, a następnie zlizować komórki HT-29, dodając do każdego dołka 1 ml PBS + 1% Triton X-100.
  14. Inkubować płytki 6-dołkowe w temperaturze 37 °C przez 5 min.
  15. Za pomocą skrobaka do komórek lub zagiętej końcówki pipety zeskrob z dna dołka zlizowane komórki i przenieś całą objętość 1 ml do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml.
  16. Oznacz liczbę bakterii wewnątrzkomórkowych.
    1. Wymieszać każdą probówkę (z kroku 6.15) na wirówce typu vortex przez co najmniej 30 s, aby dodatkowo przemieścić Shigella z lizowanych komórek eukariotycznych.
    2. Przygotować 10-krotne rozcieńczenia seryjne lizatów w PBS.
    3. Płytka 100 µL z 1 x 10-2, 1 x 10-3, oraz 1 x 10-4 rozcieńczenia na płytki z pożywką TSB z czerwienią Kongo i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Wysiewanie na płytki 100 µL z 1 x 10-2, 1 x 10-3, oraz 1 x 10-4 rozcieńczenia odpowiadają końcowemu współczynnikowi rozcieńczenia 1 x 10-3, 1 x 10-4oraz 1 x 10-5odpowiednio.

Wyniki

Testy adhezji, inwazji oraz replikacji wewnątrzkomórkowej przeprowadzono w celu porównania szczepu dzikiego (WT) S. flexneri 2457T ze szczepem S. flexneri ΔVF (ΔVF), mutantem, który według hipotezy negatywnie reguluje wirulencję Shigella . Ponieważ Shigella wykorzystuje sole żółciowe jako sygnał do regulacji wirulencji17,18,47, eksperymenty przeprowadzono po subkulturze bakterii w pożywce TSB, a także w TSB uzupełnionej o 0,4% (w/v) soli żółciowych18. Ekspozycja na sole żółciowe podczas etapu subkultury służy jako wstępna obróbka w celu odwzorowania przejścia przez jelito cienkie przed infekcją jelita grubego17,18,47. Rysunek 1 analizuje wpływ mutacji ΔVF na zdolność S. flexneri do adhezji do komórek nabłonka jelita grubego HT-29. Procent adhezji naniesiono na oś y; reprezentuje on stosunek odzyskanych bakterii po lizie komórek HT-29 do liczby bakterii wprowadzonych do układu. Zgodnie z oczekiwaniami, oba szczepy, S. flexneri WT oraz ΔVF , wykazały znaczący wzrost adhezji po subkulturze z dodatkiem soli żółciowych w porównaniu do pożywki TSB bez dodatku soli żółciowych18. Jednakże, w obrębie każdego z warunków subkultury nie stwierdzono różnic w adhezji do komórek HT-29 między szczepem WT a mutantem ΔVF . Dane te wskazują, że mutacja ΔVF nie wpływa na zdolność S. flexneri do adhezji do komórek nabłonka HT-29, niezależnie od zastosowania wstępnej obróbki solami żółciowymi.

Na Rysunku 2 przeanalizowano wpływ mutacji ΔVF na zdolność S. flexneri do inwazji (Rysunek 2A) i replikacji (Rysunek 2B) wewnątrz komórek nabłonkowych jelita grubego HT-29, z uprzednią obróbką solami żółciowymi lub bez niej. Procent odzysku przedstawiono na osi y; reprezentuje on stosunek odzyskanych komórek bakteryjnych po lizie komórek HT-29 w odniesieniu do liczby wprowadzonych bakterii. Na Rysunku 2A odnotowano oczekiwany istotny wzrost zdolności szczepu WT S. flexneri 2457T do inwazji w komórki HT-29 po uprzedniej ekspozycji na sole żółciowe48, podczas gdy mutant S. flexneri ΔVF wykazał mniejszy wzrost inwazji po uprzedniej ekspozycji na sole żółciowe w porównaniu ze szczepem WT. Mutant ΔVF wykazywał zwiększony stopień inwazji komórek HT-29 w porównaniu do szczepu WT podhodowanego w TSB, ale wykazywał stopień inwazji podobny do WT w przypadku podhodowania w TSB uzupełnionym o sole żółciowe (Rysunek 2A). Wyniki te sugerują, że mutacja ΔVF zwiększa zdolność S. flexneri do inwazji komórek HT-29, co osłabia efekt uprzedniej ekspozycji na sole żółciowe, mimo że zdolność inwazyjna mutanta ΔVF uległa dalszemu zwiększeniu po podhodowaniu w solach żółciowych.

Ogólnie rzecz biorąc, po inkubacji nocnej odzyskano 10-krotnie więcej bakterii (Rycyna 2B) w porównaniu do inkubacji trwającej 90 min (Rycyna 2A), co wykazuje różnice odpowiednio w monitorowaniu wzrostu wewnątrzkomórkowego oraz inwazji. Gdy zakażone komórki HT-29 inkubowano przez 18 h, aby umożliwić wewnątrzkomórkową replikację bakterii (Rycyna 2B), wpływ wstępnej obróbki solami żółciowymi zmalał zarówno dla szczepu WT, jak i ΔVF. Jednakże zmniejszony efekt wstępnej obróbki solami żółciowymi podczas replikacji wewnątrzkomórkowej był bardziej wyraźny w przypadku mutanta ΔVF. Ponieważ wzrost replikacji wewnątrzkomórkowej obu szczepów po uprzedniej ekspozycji na sole żółciowe był mniejszy niż wzrost tempa inwazji w tych samych warunkach, stawiamy hipotezę, że sole żółciowe mają większy wpływ na wczesne etapy patogenezy S. flexneri. Mutant ΔVF wykazał zwiększony procent odzysku po nocnej replikacji w komórkach HT-29 w porównaniu do WT (Rycyna 2B) po obu warunkach subkultury. Jednakże procent odzysku mutanta ΔVF był podobny niezależnie od wstępnej ekspozycji na sole żółciowe. Trendy tych danych sugerują, że mutant ΔVF replikuje się w komórkach HT-29 wydajniej niż WT oraz że wstępna ekspozycja na sole żółciowe nie wpływa na zdolność mutanta ΔVF do replikacji wewnątrzkomórkowej, w przeciwieństwie do tego, co zaobserwowano dla WT (Rycyna 2B). Ponieważ różnica między szczepem mutantem a WT w warunkach wstępnej ekspozycji na sole żółciowe nie została zaobserwowana podczas 90-minutowego testu inwazji, hipotetyzujemy, że produkt kodowany przez usunięty gen VF może również regulować replikację S. flexneri w komórkach HT-29. Łącznie obie analizy wykazują, że mutant ΔVF jest bardziej wirulentny w stosunku do WT, co sugeruje, że produkt genu VF jest negatywnym regulatorem wirulencji S. flexneri.

Wykres słupkowy adhezji szczepów bakteryjnych; TSB vs TSB+BS; istotność statystyczna zaznaczona gwiazdkami.
Rysunek 1Wcześniejsza ekspozycja na sole żółciowe indukuje adhezję S. flexneri do komórek HT-29. S. flexneri 2457T WT oraz ΔVF komórki mutantów poddawano pasażowaniu w pożywce TSB lub TSB uzupełnionej o 0,4% (w/v) soli żółciowych (TSB+BS). Następnie bakterie naniesiono na komórki HT-29 z wielokrotnością infekcji (MOI) wynoszącą 100 i inkubowano przez 3 h w celu zbadania adhezji. Po inkubacji zainfekowane komórki HT-29 przemyto i poddano lizie, a następnie seryjne rozcieńczenia odzyskanych bakterii wysiano na płytki w celu oznaczenia liczby jednostek tworzących kolonie na ml (CFU/ml). Liczbę bakterii adherentnych przedstawiono w stosunku do miana bakterii wyjściowych, aby określić procent adhezji. Dane są reprezentatywne dla jednej powtórki biologicznej z trzema powtórkami technicznymi (pojedyncze kropki). Słupki błędów wskazują błąd standardowy średniej (SEM). Istotność statystyczną określono za pomocą testu t Studenta (*p < 0.05; ***p < 0.001). Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Wykres słupkowy; porównanie procentowej odzyskiwalności po zastosowaniu różnych warunków hodowli (TSB vs TSB+BS) dla poszczególnych szczepów.
Rycina 2Wcześniejsza ekspozycja na sole żółciowe zwiększyła WT S. flexneri inwazja i replikacja wewnątrzkomórkowa. S. flexneri 2457T WT oraz ΔVF komórki mutantów pod hodowano w pożywce TSB lub TSB uzupełnionej o sole żółciowe (TSB+BS). Następnie bakterie naniesiono na komórki HT-29 przy MOI wynoszącym 100, odwirowano je na komórki i inkubowano w 37 °C z 5% CO2 przez 45 min. Komórki przemyto PBS, a bakterie pozakomórkowe zlizowano poprzez dodanie gentamycyny do DMEM, aby odzyskać wyłącznie bakterie wewnątrzkomórkowe. Po 90 min (A, inwazji bakteryjnej) lub 18 h (B, inkubacje związane z replikacją wewnątrzkomórkową) zakażone komórki HT-29 przemyto i poddano lizie, a następnie wykonano rozcieńczenia seryjne odzyskanych bakterii i wysiano je na płytki w celu określenia liczby jednostek tworzących kolonie na ml (CFU/ml). Liczbę bakterii wewnątrzkomórkowych przedstawiono w stosunku do początkowych mian bakterii w celu ustalenia procentu odzysku. Dane są reprezentatywne dla jednej repliki biologicznej, z trzema replikami technicznymi dla każdej z nich (poszczególne kropki). Słupki błędu oznaczają SEM. Istotność statystyczną określono za pomocą testu t Studenta (*p < 0,05). Należy zwrócić uwagę na różnice w skalach osi y pomiędzy panelami (A) i (B). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Protokół ten opisuje zestaw trzech standaryzowanych testów do badania przylegania, inwazji i wewnątrzkomórkowej replikacji komórek nabłonka jelitowego. Chociaż metody te są jedynie zmodyfikowanymi wersjami klasycznych testów gentamycyny stosowanych do badania inwazji i wewnątrzkomórkowej replikacji różnych patogenów bakteryjnych w komórkach gospodarza 49,50,51, podczas badania Shigella należy zastosować specjalne względy.

Shigella to fakultatywne beztlenowce, które rosną optymalnie w temperaturze 37 °C w bogatym podłożu z napowietrzeniem43. Podczas wykonywania tych testów w celu zbadania wpływu różnych sygnałów środowiskowych lub metabolitów na infekcje Shigella, zaleca się hodowlę Shigella w bogatych pożywkach przez noc, a następnie subkulturę w zdefiniowanych lub uzupełnionych pożywkach do połowy fazy logarytmicznej przed infekcją. Maksymalna ekspresja genu wirulencji zachodzi w logarytmicznej fazie wzrostu52,53. Tak więc, subkulturacja kultur Shigella przez noc i umożliwienie wzrostu bakterii do fazy wykładniczej (OD600 ~ 0,7) są niezbędnymi krokami do prawidłowej oceny zjadliwości Shigella. Co więcej, ekspresja genów wirulencji jest zależna od temperatury. Aby zapewnić swoistość ekspresji tylko podczas infekcji gospodarza, geny wirulencji są indukowane w temperaturach fizjologicznych gospodarza (37 °C) i ściśle tłumione w niższych temperaturach (np. 30 °C)54. Aby zapewnić ekspresję genów wirulencji, hodowla bakterii i infekcje muszą być przeprowadzane w temperaturze 37 °C, z należytą ostrożnością, aby temperatura nie spadła poniżej 37 °C. Duży, 220-kilozasadowy plazmid wirulencji, który koduje maszynerię molekularną wymaganą do inwazji i infekcji komórek nabłonkowych, jest niezbędnym wyznacznikiem wirulencji dla wszystkich Shigella spp5. Powtarzające się pasażowanie i przedłużony wzrost w temperaturze 37 °C sprzyjają niestabilności plazmidu wirulencji, co skutkuje utratą plazmidu i sprawia, że komórki Shigella stają się awirulentem55. Aby zapewnić utrzymanie plazmidu wirulencji i ekspresję kluczowych genów wirulencji, zaleca się ponowne przerzucanie bakterii bezpośrednio z zapasów zamrażarki co dwa tygodnie na świeże czerwone płytki wskaźnikowe TSB + Kongo. Czerwony agar Kongo może być używany do rozróżniania kolonii zjadliwych typu dzikiego (czerwony, CR+) i kolonii awirulentowych (białych, CR-), które utraciły zjadliwy plazmid45. Jeśli niestabilność plazmidu wirulencji jest wielokrotnie obserwowana, nocne kultury Shigella można inkubować w temperaturze 30 °C, aby zapobiec utracie plazmidu wirulencji, a następnie subkulturować w temperaturze 37 °C w celu promowania ekspresji genów wirulencji43. Wreszcie, jeśli przeprowadzane są analizy z mutantami i/lub komplementarnymi szczepami, w których markery antybiotykowe są obecne w tych szczepach bakteryjnych, zaleca się stosowanie odpowiedniej selekcji antybiotyków podczas etapów nocnego i podhodowli bakterii.

Zastosowanie monowarstw nabłonka HT-29 ma wiele zalet w badaniu molekularnych mechanizmów patogenezy Shigella in vitro. Ponieważ Shigella jest patogenem przystosowanym do potrzeb człowieka, małe modele zwierzęce nie odzwierciedlają dokładnie charakterystycznej patogenezy shigellozy obserwowanej u ludzi36. W związku z tym zastosowanie znormalizowanych protokołów infekcji linii komórkowych pochodzenia ludzkiego umożliwia ilościowe badanie poszczególnych etapów patogenezy bakteryjnej w celu scharakteryzowania wzajemnych oddziaływań molekularnych między tym patogenem a jego rodzimym gospodarzem. Historycznie rzecz biorąc, komórki HeLa były głównie wykorzystywane do badania interakcji gospodarz-patogen in vitro 25,56,57. Jednak komórki HeLa są unieśmiertelnioną linią komórkową raka szyjki macicy, która jest nienatywnymi komórkami gospodarza dla jelitowych patogenów bakteryjnych. W związku z tym badania in vitro patogenezy jelit przesunęły się na wykorzystanie linii komórkowych gruczolakoraka jelita grubego (np. HT-29, Caco-2 i T84), które wierniej odwzorowują morfologię nabłonka jelitowego i mogą być hodowane na transwellach jako monowarstwy nabłonkowe ze zróżnicowanymi powierzchniami wierzchołkowymi i podstawno-bocznymi 58,59,60. Chociaż każda linia komórkowa ma swoje indywidualne mocne i słabe strony, komórki HT-29 są wykorzystywane w opisanych tutaj testach ze względu na podobieństwa fenotypowe do enterocytów jelitowych i silną ekspresję receptorów powierzchniowych komórek i cytokin prozapalnych 58,59,61. Jednak każdy z tych omawianych modeli to linie komórkowe pochodzące z raka z nieprawidłowymi fenotypami metabolicznymi i wzrostowymi, które nie reprezentują dokładnie naturalnego stanu fizjologicznego nabłonka okrężnicy in vivo58. Ostatnie postępy w technikach hodowli tkanek ludzkich umożliwiły hodowlę ludzkich jelitowych komórek macierzystych, uzyskanych z biopsji tkanek, w organoidy lub pojedyncze dwuwymiarowe monowarstwy komórkowe, które podsumowują różne typy komórek obecnych w ludzkim przewodzie pokarmowym (GI) 62,63,64. Organoidy jelitowe można różnicować, obejmując enterocyty, komórki kubkowe wytwarzające śluz, komórki M i inne typy komórek specyficzne dla tkanki. Ostatnie badania potwierdziły użycie tych modeli organoidowych do badania patogenów jelitowych, w tym różnych patowarów Shigella spp., Salmonella enterica i Escherichia coli 62,63,64. Chociaż organoidy są dokładniejszymi modelami ludzkiego nabłonka przewodu pokarmowego i mogą być nawet hodowane w różnych warunkach odżywczych, aby reprezentować populację światową65, ich względna złożoność wymaga znacznego szkolenia i wiedzy technicznej, co skutkuje wyższymi kosztami i dłuższym czasem hodowli w porównaniu z tradycyjnymi liniami komórek nowotworowych58.

Protokół ten opisuje metody średnioprzepustowe, w których dwie 6-dołkowe płytki są używane do łącznie 12 monowarstw dostępnych do testowania. Jednak eksperymenty można łatwo skalować, aby zwiększyć liczbę zasiewanych monowarstw w celu dostosowania do dodatkowych powtórzeń technicznych lub testowania dodatkowych mutantów Shigella i sygnałów środowiskowych. Płytki do hodowli tkankowych z większą liczbą dołków (np. płytki 12-dołkowe lub 24-dołkowe) mogą być również używane z odpowiednimi dostosowaniami w celu uwzględnienia studzienek o mniejszych średnicach. W warunkach wzrostu HT-29 opisanych w kroku 3.2, miana HT-29 są wystarczające do wysiewu około sześciu 6-dołkowych płytek po hodowli z jednej kolby T75, z wystarczającą ilością pozostałych komórek, aby utrzymać hodowlę komórkową HT-29. Co więcej, wysiewanie monowarstw HT-29 i przygotowanie etapów inokulacji bakterii jest identyczne w testach adherencji bakteryjnej, inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej. W ten sposób testy testujące te same szczepy Shigella lub warunki subhodowli mogą być łatwo przeprowadzane równolegle, aby jednocześnie badać rolę każdego warunku eksperymentalnego w różnych etapach infekcji Shigella .

Miana odzysku dla bakterii adherentnych (krok 4), zaatakowanych (krok 5) i wewnątrzkomórkowych (krok 6) są określane przez posiew seryjnych rozcieńczeń zakażonych komórek HT-29 po lizie, co umożliwia ilościową ocenę skuteczności każdego etapu infekcji Shigella. Etapy wirowania w testach inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej, oparte na klasycznych testach 49,50,51, promują kontakt bakterii z komórkami gospodarza w celu natychmiastowej inwazji i zwiększają wskaźniki inwazji. W ten sposób wirowanie "pomija" etap przylegania, który później okazał się ważnym aspektem infekcji Shigella 17,18,19,66. Należy zauważyć, że etapu wirowania nie można wykonać ze spolaryzowanymi komórkami nabłonkowymi wysianymi na transwellach. Jednak w przypadku testu przylegania przyleganie nie jest wymuszane przez wirowanie, a gentamycyna nie jest dodawana do zakażonych komórek HT-29 przed lizą, co pozwala na zliczenie przylegających komórek bakteryjnych. Objętość pożywki do hodowli tkankowej jest zmniejszona do 1 ml (w przeciwieństwie do 2 ml w testach inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej), aby umożliwić bardziej efektywny kontakt bakterii z komórkami HT-29. Ponadto, w zależności od stopnia przylegania, podczas 3-godzinnej inkubacji może dojść do pewnej inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej, ale ilość ta jest zwykle znikoma (np. Tylko 0,05% odzyskanej populacji bakterii po lizie komórek gospodarza). Niemniej jednak, aby prawidłowo uwzględnić bakterie adherentne i wewnątrzkomórkowe podczas 3-godzinnej inkubacji, zaleca się przeprowadzenie równoległych testów, w których, oprócz podanego protokołu, druga płytka jest inkubowana z 50 μg/ml gentamycyny w 2 ml DMEM na studzienkę przez łącznie 45 minut (15 minut inkubacji, mycie, świeży DMEM + gentamycyna przez 30 minut) w celu dokładnej lizy bakterii zewnątrzkomórkowych. Po lizie komórek HT-29, jak zaznaczono w protokole, bakterie wewnątrzkomórkowe można policzyć, jak wspomniano powyżej, i będą reprezentować liczbę bakterii, które zostały zaatakowane. Wartość tę można następnie odjąć od bakterii wyliczonych na płytce bez traktowania gentamycyną, aby odpowiednio określić bakterie przylegające i zaatakowane. Można również przeprowadzić analizy równoległe, aby uzyskać lepszy wgląd w wewnątrzkomórkową replikację Shigella wewnątrz komórek HT-29 po inwazji, np. wykorzystując wiele punktów czasowych do wykonania wewnątrzkomórkowych krzywych wzrostu. Wreszcie, wraz z liczeniem bakterii wewnątrzkomórkowych po 18-godzinnej inkubacji gentamycyny, można zebrać supernatanty hodowlane i przeanalizować je pod kątem wydzielania cytokin przez zakażone komórki HT-29. Na przykład IL-8 jest chemokiną wydzielaną przez komórki nabłonkowe, która w dużej mierze działa w celu rekrutacji PMN do miejsca infekcji. Ilość IL-8 wydzielanej do pożywki hodowlanej zakażonych komórek HT-29 można analizować za pomocą testu IL-8 ELISA67.

Sole żółciowe okazały się ważnym sygnałem wirulencji dla Shigella podczas tranzytu przez ludzki układ pokarmowy i mogą być stosowane do uzupełniania pożywek rozwojowych bakterii w tych protokołach w celu odtworzenia typowych warunków przewodu pokarmowego. Naturalnie sole żółciowe są wprowadzane do dwunastnicy lub górnej części jelita cienkiego, aby wspomóc trawienie; A w końcowym jelicie krętym lub na końcu jelita cienkiego 95% soli żółciowych jest usuwanych i zawracanych z powrotem do krążenia w celu ostatecznego depozytu w woreczku żółciowym68. Sole żółciowe mają zwykle stężenie od 0,2% do 2,0% (w/v) w jelicie cienkim i są naturalnie bakteriobójcze. Jednak Shigella, podobnie jak większość bakterii jelitowych, jest odporna na sole żółciowe i wykorzystuje sygnały do wzmocnienia infekcji47. Kilka badań udokumentowało, w jaki sposób ekspozycja na sole żółciowe, czasami w połączeniu z innymi sygnałami jelita cienkiego, takimi jak glukoza, wpływa na przeżycie Shigella i regulację zjadliwości przed zakażeniem. Wykazano, że Shigella jest odporna na sole żółciowe, zmienia ekspresję genów oraz tworzy i rozprasza biofilm w warunkach, które odtwarzają pasaż jelita cienkiego17,69. Badania wykazały, że zmiany te skutkują hiperwirulentnym fenotypem, w którym przyleganie i inwazja są indukowane po późniejszym zakażeniu okrężnicy przez Shigella 17,18,19,48,66. Tak więc warunki opisane powyżej dokumentują, w jaki sposób subkulturować Shigella w solach żółciowych, aby naśladować pasaż jelita cienkiego przed wykonaniem testów adherencji, inwazji lub replikacji wewnątrzkomórkowej. Podany preparat TSB zawiera dodatek glukozy w stosunku do typowego bulionu Luria (LB)17. Tak więc, jeśli stosuje się LB, ważne jest, aby uzupełnić pożywkę glukozą (0,5%-2,0% [w/v]), aby odpowiednio uwzględnić sygnały glukozy w jelicie cienkim17. Ponadto, jak wspomniano powyżej, wszystkie subkultury Shigella są myte w celu usunięcia soli żółciowych i naśladowania przejścia do okrężnicy w celu analizy infekcji.

Tradycyjnie, jak podkreślono w powyższych wynikach (Ryc. 1 i Ryc. 2), testy infekcji są cenne dla określenia roli określonego genu w zakażeniu Shigella . Fenotyp różnych mutantów może jednak nie być w pełni doceniony bez odpowiedniej suplementacji pożywek bakteryjnych. Jak wykazały wcześniejsze badania, sole żółciowe znacząco zmieniają ekspresję genu S. flexneri , w tym geny odpowiedzialne za centralny metabolizm, czynniki transkrypcyjne, transportery cukru, oporność na leki i geny wirulencji kodowane na chromosomie lub plazmidziewirulencji 17. Geny te dają wgląd w to, w jaki sposób Shigella wykorzystuje sole żółciowe jako sygnał do zmiany ekspresji genów i przygotowania się do ewentualnej infekcji okrężnicy, a zatem kolejne analizy mutacji muszą być wykonywane w odpowiednich uzupełnionych pożywkach bakteryjnych przed zbadaniem wpływu na zjadliwość w testach adherencji, inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej. Jak widać powyżej na rycinie 1 i rycinie 2, mutacja ΔVF nie wpłynęła na przyleganie, ale wpłynęła na inwazję i replikację wewnątrzkomórkową. Ponieważ mutacja wzmocniła inwazję i replikację wewnątrzkomórkową, obecnie trwają eksperymenty mające na celu określenie, w jaki sposób produkt genu reguluje infekcję. Analizy mutantów służą jako przykład tego, w jaki sposób można badać nowe informacje na temat patogenezy Shigella , zwłaszcza w warunkach, które lepiej odwzorowują ludzki przewód pokarmowy. Zaleca się odpowiednie analizy komplementacji w celu walidacji fenotypów różnych mutantów.

W połączeniu, procedury te opisują eksperymenty ilościowe, które dostarczą ważnych informacji na temat mechanizmów molekularnych przylegania, inwazji i replikacji Shigella do komórek nabłonka okrężnicy HT-29 poprzez najlepsze naśladowanie naturalnego środowiska ludzkiego przewodu pokarmowego podczas infekcji. Przyszłe badania mogą poszerzyć zakres badań nad mutantami i warunkami eksperymentalnymi, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób Shigella przygotowuje się do zakażenia ludzkiego gospodarza i skutecznie go zakaża. Pomimo dziesięcioleci badań, wciąż jest o wiele więcej do odkrycia na temat infekcji Shigella.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Wsparcie dla autorów obejmuje Departament Pediatrii Massachusetts General Hospital, nagrodę Komitetu Wykonawczego ds. Tymczasowego Wsparcia Badań (ISF) 2022A009041, grant Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych R21AI146405, oraz grant National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Nutrition Obesity Research Center at Harvard (NORCH) 2P30DK040561-26. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &m; m Filtr PESMillipore-SigmaSCGP00525Sterylny, polieterosulfonowy filtr do sterylizacji pożywek do 50 ml
Probówki hodowlane 14 mlCorning352059Probówki polipropylenowe 17 mm x 100 mm z nakrętką
Probówki stożkowe 50 mlCorning43082950 ml przezroczyste polipropylenowe stożkowe probówki wirówkowe z szczelną nasadką
6-dołkowe płytki do hodowli tkankowychCorning3516Płytki są poddawane obróbce w celu optymalnego przylegania komórek
Sole żółcioweSigma-AldrichB8756Stosunek 1:1 cholanu do deoksycholanu
Czerwony barwnik KongoSigma-AldrichC6277Anionowy barwnik diazowy na bazie benzydyny, czystość >85%
Szkiełko komory do liczenia komórek CountessInvitrogenC10283Do stosowania z automatycznym licznikiem komórek Countess
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD8418A wysoce polarny odczynnik organiczny
Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM)Gibco10569-010DMEM jest uzupełnione o wysoką zawartość glukozy, pirogronian sodu, GlutaMAX i fenol Czerwona
płodowa surowica bydlęca (FBS)Sigma-AldrichF4135Inaktywowana termicznie, sterylna
gentamycynaSigma-AldrichG3632Stężenie zapasowe wynosi 50 mg / ml
Linia komórkowa HT-29ATCCHTB-38Linia komórkowa gruczolakoraka; jelita grubego w pochodzenie
Folia parafinowaBemisPM999Laboratoryjna folia uszczelniająca
szalki PetriegoThermo Fisher ScientificFB0875713100 mm x 15 mm Szalki Petriego do mediów stałych
Sola buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher Scientific100100491x stężenie; pH 7,4
Wybierz agarInvitrogen30391023Mieszanina polisacharydów ekstrahowana ze ścian komórkowych czerwonych wodorostów w celu wytworzenia pożywki do powlekania bakteryjnego
Kolby T75Corning430641UKolby do hodowli tkankowych
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Powszechny niejonowy środek powierzchniowo czynny i emulgator 
Barwienie błękitem trypanowymInvitrogenT10282Barwnik do wykrywania martwych komórek hodowli tkankowych; tylko żywe komórki mogą wykluczyć barwnik
Trypsyna-EDTAGibco25200-056Odczynnik do dysocjacji komórek do utrzymania i pasażowania linii komórkowych
Tryptyczny bulion sojowy (TSB)Sigma-AldrichT8907Pożywka do wzrostu bakterii

Bibliografia

  1. Karambizi, N. U., McMahan, C. S., Blue, C. N., Temesvari, L. A. Global estimated Disability-Adjusted Life-Years (DALYs) of diarrheal diseases: A systematic analysis of data from 28 years of the global burden of disease study. PloS one. 16 (10), e0259077(2021).
  2. WHO. WHO methods and data sources for country-level causes of death 2000-2016. World Health Organization. , Geneva. (2018).
  3. Kotloff, K. L. Shigella infection in children and adults: a formidable foe. Lancet Glob Health. 5 (12), e1166-e1167 (2017).
  4. Kotloff, K. L., et al. Burden and aetiology of diarrhoeal disease in infants and young children in developing countries (the Global Enteric Multicenter Study, GEMS): A prospective, case-control study. Lancet. 382 (9888), 209-222 (2013).
  5. Schroeder, G. N., Hilbi, H. Molecular pathogenesis of Shigella spp.: Controlling host cell signaling, invasion, and death by type III secretion. Clin Microbiol Rev. 21 (1), 134-156 (2008).
  6. Arvelo, W., et al. Transmission risk factors and treatment of pediatric shigellosis during a large daycare center-associated outbreak of multidrug resistant shigella sonnei: Implications for the management of shigellosis outbreaks among children. Pediatr Infect Dis J. 28 (11), 976-980 (2009).
  7. Kozyreva, V. K., et al. Recent outbreaks of Shigellosis in California caused by two distinct populations of Shigella sonnei with either increased virulence or fluoroquinolone resistance. mSphere. 1 (6), 1-18 (2016).
  8. Bowen, A., et al. Importation and domestic transmission of Shigella sonnei resistant to ciprofloxacin - United States, May 2014-February 2015. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 64 (12), 318-320 (2015).
  9. Tansarli, G. S., et al. Genomic reconstruction and directed interventions in a multidrug-resistant Shigellosis outbreak in Seattle, WA, USA: a genomic surveillance study. Lancet. 3099 (22), 1-11 (2023).
  10. Barry, E. M., et al. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
  11. Increase in Extensively Drug-Resistant Shigellosis in the United States. CDC Health Alert Network. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://emergency.cdc.gov/han/2023/han00486.asp?ACSTrackingID=USCDC_511-DM100260&ACSTrackingLabel=HAN%20486%20-%20General%20Public&deliveryName=USCDC_511-DM100260 (2023).
  12. Shiferaw, B., et al. Antimicrobial susceptibility patterns of Shigella isolates in Foodborne Diseases Active Surveillance Network (FoodNet) sites, 2000-2010. Clin Infect Dis. 54, S458-S463 (2012).
  13. Centers for Disease Control and Prevention. COVID-19: U.S. Impact on Antimicrobial Resistance, Special Report 2022. Atlanta, GA: U.S. Department of Health and Human Services. CDC. , (2022).
  14. Centers for Disease Control and Prevention. Antibiotic resistance threats in the United States, 2019. CDC. 10 (1), Atlanta, Georgia. (2019).
  15. WHO. Prioritization of pathogens to guide discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. WHO. , Geneva. (2017).
  16. DuPont, H. L., Levine, M. M., Hornick, R. B., Formal, S. B. Inoculum size in shigellosis and implications for expected mode of transmission. J Infect Dis. 159 (6), 1126-1128 (1989).
  17. Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), 1-18 (2017).
  18. Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
  19. Chanin, R. B., et al. Shigella flexneri adherence factor expression in in vivo-like conditions. mSphere. 4 (6), e00751(2019).
  20. Baranov, V., Hammarström, S. Carcinoembryonic antigen (CEA) and CEA-related cell adhesion molecule 1 (CEACAM1), apically expressed on human colonic M cells, are potential receptors for microbial adhesion. Histochem Cell Biol. 121 (2), 83-89 (2004).
  21. Wassef, J. S., Keren, D. F., Mailloux, J. L. Role of M cells in initial antigen uptake and in ulcer formation in the rabbit intestinal loop model of shigellosis. Infect Immun. 57 (3), 858-863 (1989).
  22. Sansonetti, P. J., Arondel, J., Cantey, J. R., Prévost, M. C., Huerre, M. Infection of rabbit Peyer's patches by Shigella flexneri: Effect of adhesive or invasive bacterial phenotypes on follicle-associated epithelium. Infect Immun. 64 (7), 2752-2764 (1996).
  23. Sansonetti, P. J., et al. Caspase-1 activation of IL-1beta and IL-18 are essential for Shigella flexneri-induced inflammation. Immunity. 12 (5), 581-590 (2000).
  24. Zychlinsky, A., Fitting, C., Cavaillon, J. M., Sansonetti, P. J. Interleukin 1 is released by murine macrophages during apoptosis induced by Shigella flexneri. J Clin Invest. 94 (3), 1328-1332 (1994).
  25. Sansonetti, P. J., Ryter, A., Clerc, P., Maurelli, A. T., Mounier, J. Multiplication of Shigella flexneri within HeLa cells: lysis of the phagocytic vacuole and plasmid-mediated contact hemolysis. Infect Immun. 51 (2), 461-469 (1986).
  26. Maldonado-Contreras, A., et al. Shigella depends on SepA to destabilize the intestinal epithelial integrity via cofilin activation. Gut Microbes. 8 (6), 544-560 (2017).
  27. Collard, J. -M., et al. High prevalence of small intestine bacteria overgrowth and asymptomatic carriage of enteric pathogens in stunted children in Antananarivo, Madagascar. PLoS Negl Trop Dis. 16 (5), e0009849(2022).
  28. Mattock, E., Blocker, A. J. How do the virulence factors of shigella work together to cause disease. Front Cell Infect Microbiol. 7, 1-24 (2017).
  29. Mostowy, S., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy. PLoS Pathog. 9 (9), e1003588(2013).
  30. Martinez-Becerra, F. J., et al. Parenteral immunization with IpaB/IpaD protects mice against lethal pulmonary infection by Shigella. Vaccine. 31 (24), 2667-2672 (2013).
  31. Shim, D. -H., et al. New animal model of shigellosis in the Guinea pig: its usefulness for protective efficacy studies. J Immunol. 178 (4), Baltimore, Md. 2476-2482 (2007).
  32. Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465 (7296), 355-358 (2010).
  33. West, N. P., et al. Optimization of virulence functions through glucosylation of Shigella LPS. Science. 307 (5713), 1313-1317 (2005).
  34. Maurelli, A. T., et al. Shigella infection as observed in the experimentally inoculated domestic pig, Sus scrofa domestica. Microbial Pathog. 25 (4), 189-196 (1998).
  35. Jeong, K. -I., Zhang, Q., Nunnari, J., Tzipori, S. A piglet model of acute gastroenteritis induced by Shigella dysenteriae Type 1. J Infect Dis. 201 (6), 903-911 (2010).
  36. Kim, Y. -J., Yeo, S. -G., Park, J. -H., Ko, H. -J. Shigella vaccine development: prospective animal models and current status. Curr Pharm Biotechnol. 14 (10), 903-912 (2013).
  37. Kent, T. H., Formal, S. B., LaBrec, E. H., Sprinz, H., Maenza, R. M. Gastric shigellosis in rhesus monkeys. Am J Pathol. 51 (2), 259-267 (1967).
  38. Shipley, S. T., et al. A challenge model for Shigella dysenteriae 1 in cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis). Comp Med. 60 (1), 54-61 (2010).
  39. Higgins, R., Sauvageau, R., Bonin, P. Shigella flexneri Type 2 Infection in captive nonhuman primates. Can Vet J. 26 (12), 402-403 (1985).
  40. Oaks, E. V., Hale, T. L., Formal, S. B. Serum immune response to Shigella protein antigens in rhesus monkeys and humans infected with Shigella spp. Infect Immun. 53 (1), 57-63 (1986).
  41. Formal, S. B., et al. Protection of monkeys against experimental shigellosis with a living attenuated oral polyvalent dysentery vaccine. J Bacteriol. 92 (1), 17-22 (1966).
  42. Levine, M. M., Kotloff, K. L., Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Clinical trials of Shigella vaccines: two steps forward and one step back on a long, hard road. Nat Rev Microbiol. 5 (7), 540-553 (2007).
  43. Payne, S. M. Laboratory cultivation and storage of Shigella. Curr Protoc Microbiol. 55 (1), 93(2019).
  44. NIH Guidelines. NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules. NIH Guidelines. 2, 142(2019).
  45. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
  46. HT-29 cell line product sheet. ATCC. , Available from: https://www.atcc.org/products/htb-38 1-6 (2023).
  47. Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), 819-836 (2016).
  48. Stensrud, K. F., et al. Deoxycholate interacts with IpaD of Shigella flexneri in inducing the recruitment of IpaB to the type III secretion apparatus needle tip. J Biol Chem. 283 (27), 18646-18654 (2008).
  49. Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. J Clin Invest. 52 (7), 1673-1679 (1973).
  50. Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymo. 236 (1979), 405-420 (1994).
  51. Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62 (8), 3463-3471 (1994).
  52. Dorman, C. J., McKenna, S., Beloin, C. Regulation of virulence gene expression in Shigella flexneri, a facultative intracellular pathogen. Int J Med Microbiol. 291 (2), 89-96 (2001).
  53. Porter, M. E., Dorman, C. J. Positive regulation of Shigella flexneri virulence genes by integration host factor. J Bacteriol. 179 (21), 6537-6550 (1997).
  54. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Temperature-dependent expression of virulence genes in Shigella species. Infect Immun. 43 (1), 195-201 (1984).
  55. Schuch, R., Maurelli, A. T. Virulence plasmid instability in Shigella flexneri 2a is induced by virulence gene expression. Infect Immun. 65 (9), 3686-3692 (1997).
  56. Formal, S. B., Hale, T. L., Sansonetti, P. J. Invasive enteric pathogens. Rev Infect Dis. 5, S702-S707 (1983).
  57. Pál, T., Hale, T. L. Plasmid-associated adherence of Shigella flexneri in a HeLa cell model. Infect Immun. 57 (8), 2580-2582 (1989).
  58. Noben, M., et al. Human intestinal epithelium in a dish: Current models for research into gastrointestinal pathophysiology. United European Gastroenterol J. 5 (8), 1073-1081 (2017).
  59. Liévin-Le Moal, V., Servin, A. L. Pathogenesis of human enterovirulent bacteria: lessons from cultured, fully differentiated human colon cancer cell lines. Microbiol Mol Biol Rev R. 77 (3), 380-439 (2013).
  60. Mitchell, D. M., Ball, J. M. Characterization of a spontaneously polarizing HT-29 cell line, HT-29/cl.f8. In Vitro Cell Dev Biol - Anim. 40 (10), 297-302 (2004).
  61. Gagnon, M., Zihler Berner, A., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion. J Microbiol Methods. 94 (3), 274-279 (2013).
  62. Koestler, B. J., et al. Human intestinal enteroids as a model system of Shigella pathogenesis. Infect Immun. 87 (4), 00733(2019).
  63. Ranganathan, S., et al. Evaluating Shigella flexneri pathogenesis in the human enteroid model. Infect Immun. 87 (4), (2019).
  64. Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiol Spectr. 9 (1), 1-17 (2021).
  65. Perlman, M., Senger, S., Verma, S., Carey, J., Faherty, C. S. A foundational approach to culture and analyze malnourished organoids. Gut Microbes. 15 (2), 2248713(2023).
  66. Pope, L. M., Reed, K. E., Payne, S. M. Increased protein secretion and adherence to HeLa cells by Shigella spp. following growth in the presence of bile salts. Infect Immun. 63 (9), 3642-3648 (1995).
  67. Faherty, C. S., et al. The synthesis of OspD3 (ShET2) in Shigella flexneri is independent of OspC1. Gut Microbes. 7 (6), 486-502 (2016).
  68. Ridlon, J. M., Kang, D. -J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
  69. Köseoğlu, V. K., Hall, C. P., Rodríguez-López, E. M., Agaisse, H. The Autotransporter IcsA promotes Shigella flexneri biofilm formation in the presence of bile salts. Infect Immun. 87 (7), 1-14 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zaka enie Shigellaadhezja bakteryjnareplikacja wewn trzkom rkowatest inwazjikom rki nab onka jelita grubegoochrona gentamycynagar z czerwieni Kongarozcie czenia seryjnehodowla tkankowa
Analizy zakażeń komórek nabłonkowych preparatem Shigella
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.