Artykuł metodologiczny

Analizy zakażeń komórek nabłonkowych preparatem Shigella

DOI:

10.3791/66426

⸱

9 lutego 2024

 ,  , 
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje testy infekcji do badania przestrzegania Shigella, inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej przy użyciu linii komórkowych nabłonka in vitro.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przystosowany do człowieka patogen bakteryjny jelitowy Shigella powoduje miliony infekcji każdego roku, powoduje długoterminowe efekty wzrostu wśród pacjentów pediatrycznych i jest główną przyczyną zgonów z powodu biegunki na całym świecie. Zakażenie wywołuje wodnistą lub krwawą biegunkę w wyniku przejścia patogenu przez przewód pokarmowy i zakażenia komórek nabłonka wyściełających okrężnicę. Przy oszałamiającym wzroście oporności na antybiotyki i obecnym braku zatwierdzonych szczepionek, ustandaryzowane protokoły badawcze mają kluczowe znaczenie dla badania tego groźnego patogenu. W tym miejscu przedstawiono metodologie badania molekularnej patogenezy Shigella przy użyciu analiz in vitro przylegania, inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej bakterii w komórkach nabłonka okrężnicy. Przed analizą infekcji fenotyp zjadliwości kolonii Shigella został zweryfikowany poprzez wychwyt czerwonego barwnika Kongo na płytkach agarowych. Uzupełnione pożywki laboratoryjne mogą być również brane pod uwagę podczas hodowli bakteryjnej w celu naśladowania warunków in vivo. Komórki bakteryjne są następnie wykorzystywane w znormalizowanym protokole do infekowania komórek nabłonka okrężnicy na płytkach do hodowli tkankowych przy ustalonej wielokrotności infekcji z adaptacjami do analizy każdego etapu infekcji. W celu przeprowadzenia testów adhezyjnych komórki Shigella są inkubowane ze zmniejszonymi poziomami pożywki, aby ułatwić kontakt bakterii z komórkami nabłonka. Zarówno w testach inwazji, jak i replikacji wewnątrzkomórkowej gentamycyna jest stosowana w różnych odstępach czasu w celu wyeliminowania bakterii zewnątrzkomórkowych i umożliwienia oceny inwazji i/lub ilościowego określenia szybkości replikacji wewnątrzkomórkowej. Wszystkie protokoły infekcji wyliczają bakterie przylegające, zaatakowane i/lub wewnątrzkomórkowe poprzez seryjne rozcieńczanie zakażonych lizatów komórek nabłonka i posiewanie jednostek tworzących kolonie bakteryjne w stosunku do mian infekcji na czerwonych płytkach agarowych Kongo. Łącznie protokoły te umożliwiają niezależną charakterystykę i porównania komórek nabłonkowych dla każdego etapu infekcji Shigella w celu pomyślnego zbadania tego patogenu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroby biegunkowe wywołane przez patogeny bakteryjne jelit stanowią znaczące globalne obciążenie zdrowotne. W 2016 roku choroby biegunkowe były odpowiedzialne za 1,3 miliona zgonów na całym świecie i były czwartą najczęstszą przyczyną zgonów dzieci poniżej piątego roku życia1,2. Gram-ujemny, jelitowy patogen bakteryjny Shigella jest czynnikiem wywołującym shigellozę, główną przyczynę zgonów z powodu biegunki na całym świecie3. Shigeloza powoduje co roku znaczną zachorowalność i śmiertelność u dzieci z krajów o niższych i średnich dochodach4,5, podczas gdy infekcje w krajach o wysokich dochodach są związane z epidemiami w ośrodkach opieki dziennej, przenoszonych przez żywność i wodę6,7,8,9. Nieskuteczne opracowanie szczepionki10 i rosnące wskaźniki oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR)11,12 skomplikowały zarządzanie epidemiami Shigella na dużą skalę. Ostatnie dane Centers for Disease Control and Prevention pokazują, że prawie 46% zakażeń Shigella w Stanach Zjednoczonych wykazywało oporność na leki w 2020 roku13,14, podczas gdy Światowa Organizacja Zdrowia uznała Shigella za priorytetowy patogen AMR, dla którego pilnie potrzebne są nowe terapie15.

Infekcje Shigella są łatwo przenoszone drogą fekalno-oralną po spożyciu skażonego jedzenia lub wody, lub poprzez bezpośredni kontakt z człowiekiem. Shigella wyewoluowała, aby stać się skutecznym, przystosowanym do człowieka patogenem, z zakaźną dawką 10-100 bakterii wystarczającą do wywołania choroby16. Podczas pasażu jelita cienkiego Shigella jest narażona na sygnały środowiskowe, takie jak podwyższona temperatura i żółć17. Wykrycie tych sygnałów indukuje zmiany transkrypcyjne w celu ekspresji czynników wirulencji, które zwiększają zdolność bakterii do infekowania ludzkiego jelita grubego17,18,19. Shigella nie atakuje nabłonka okrężnicy z powierzchni wierzchołkowej, ale raczej przechodzi przez warstwę nabłonka po wychwycie do wyspecjalizowanych komórek mikrofałdowych prezentujących antygen (komórki M) w nabłonku związanym z pęcherzykami włosowymi20,21,22. Po transcytozie komórki Shigella są fagocytozowane przez rezydujące makrofagi. Shigella szybko ucieka z fagosomu i wywołuje śmierć komórek makrofagów, co powoduje uwolnienie cytokin prozapalnych5,23,24. Shigella następnie atakuje komórki nabłonka okrężnicy od strony podstawno-bocznej, lizuje wakuolę makropinocytarną i ustanawia niszę replikacyjną w cytoplazmie5,25. Cytokiny prozapalne, zwłaszcza interleukina-8 (IL-8), rekrutują polimorfojądrzaste leukocyty neutrofilowe (PMN) do miejsca zakażenia, co osłabia ścisłe połączenia nabłonkowe i umożliwia infiltrację bakteryjną wyściółki nabłonka w celu zaostrzenia infekcji podstawno-bocznej5. PMN niszczą zainfekowaną wyściółkę nabłonka, aby powstrzymać infekcję, co skutkuje charakterystycznymi objawami czerwonki bakteryjnej (krwawej) 5. Chociaż mechanizmy inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej zostały dokładnie scharakteryzowane, nowe badania pokazują ważne nowe koncepcje infekcji Shigella, w tym regulację wirulencji podczas pasażu żołądkowo-jelitowego (GI)17, adherence19, lepszy dostęp podstawno-boczny dzięki przepuszczalności bariery26 oraz bezobjawowe nosicielstwo u niedożywionych dzieci27.

Zdolność Shigella spp. do wywoływania choroby biegunkowej jest ograniczona do ludzi i naczelnych (NHP)28. Modele infekcji jelitowych Shigella zostały opracowane dla danio pręgowanego29, mice30, świnki morskie31, rabbits21,32,33 i pigs34,35. Jednak żaden z tych systemów modelowych nie jest w stanie dokładnie odtworzyć cech choroby obserwowanych podczas infekcji u ludzi36. Chociaż modele NHP shigellozy zostały stworzone w celu badania patogenezy Shigella, te systemy modelowe są kosztowne do wdrożenia i wymagają sztucznie wysokich dawek zakaźnych, do dziewięciu rzędów wielkości wyższych niż dawka zakaźna u ludzi37,38,39,40,41,42. Tak więc niezwykła adaptacja Shigelli do infekcji ludzkich gospodarzy wymaga użycia kultur komórkowych pochodzących od ludzi w celu odtworzenia fizjologicznie istotnych modeli do dokładnego badania patogenezy Shigella.

Tutaj opisane są szczegółowe procedury mierzące tempo przylegania, inwazji i replikacji Shigella w komórkach nabłonka okrężnicy HT-29. Korzystając z tych ustandaryzowanych protokołów, można zbadać mechanizmy molekularne, za pomocą których geny wirulencji bakteryjnej i sygnały środowiskowe wpływają na każdy etap infekcji Shigella, aby lepiej zrozumieć dynamiczną zależność interakcji gospodarz-patogen.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie odczynników i materiałów

UWAGA: Wszystkie objętości są zgodne z testem z użyciem dwóch płytek 6-dołkowych.

  1. Pożywka TSB: Dodaj 0,5 l wody dejonizowanej (DI) do 15 g bulionu sojowego tryptycznego (TSB, patrz tabela materiałów) i autoklawu. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  2. Pożywka z solami żółciowymi (TSB + BS): Aby przygotować TSB zawierającą 0,4% (w/v) soli żółciowych, należy ponownie zawiesić 0,06 g soli żółciowych (BS, patrz tabela materiałów) w 15 ml autoklawowanego TSB. Filtr sterylizować za pomocą filtra PES 0,22 μm.
    UWAGA: Sole żółciowe składają się z mieszaniny 1:1 cholanu sodu i deoksycholanu sodu. Przygotuj świeże podłoże bezpośrednio przed użyciem.
  3. DMEM + 10% (v/v) FBS: Dodaj 5 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do 45 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. DMEM + gentamycyna: Do probówki o pojemności 50 ml dodaj 50 ml DMEM i 50 μl gentamycyny 50 mg/ml (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Przed każdym eksperymentem przygotuj świeżą porcję i ogrzej ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  5. PBS + 1% (v/v) Triton X-100: Dodać 150 μl Triton X-100 do 15 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    UWAGA: Przed każdym eksperymentem przygotuj świeżą porcję i ogrzej ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  6. Czerwone płytki wskaźnikowe TSB + Kongo: Do butelki o pojemności 1 l dodać 15 g TSB, 7,5 g wybranego agaru i 0,125 g czerwonego barwnika Kongo (patrz tabela materiałów). Dodaj 0,5 l wody DI i przelej do autoklawu. Wlać 10-20 ml pożywki do pojedynczych sterylnych szalek Petriego (100 mm x 15 mm) i pozostawić do zestalenia.
    UWAGA: Czerwień kongijska jest rakotwórcza i jest toksyną reprodukcyjną. Należy dopilnować, aby obchodzenie się z czerwienią kongijską odbywało się przy użyciu odpowiedniego wyposażenia ochrony osobistej. Dodatkowe informacje można znaleźć w karcie charakterystyki produktu.
    UWAGA: Około 20 talerzy jest wykonanych z 0,5 l czerwonego podłoża Kongo. Talerze można przygotować 2-3 dni wcześniej i pozostawić odwrócone w temperaturze pokojowej do czasu użycia. W przypadku długotrwałego przechowywania odwrócone płytki należy umieścić w plastikowych rękawach w temperaturze 4 °C na okres do 3 miesięcy.
  7. DMEM + 10% (v/v) FBS i 5% (v/v) dimetylosulfotlenek (DMSO): Dodaj 42,5 ml DMEM, 5 ml FBS i 2,5 ml DMSO do probówki o pojemności 50 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Przygotowanie bakterii

UWAGA: Wszystkie protokoły laboratoryjnej uprawy i przechowywania Shigella są zaadaptowane z Payne, S. M.43.

UWAGA: Shigella spp. to patogeny grupy ryzyka 244. Wszystkie prace laboratoryjne należy wykonywać w środowisku BSL-2, przy jednoczesnym podjęciu dodatkowych środków bezpieczeństwa w celu ograniczenia przypadkowego narażenia z powodu niskiej dawki zakaźnej Shigella spp.

  1. Wzrost Shigelli z mrożonych zapasów
    1. Przenieś niewielką ilość zamrożonej kultury z fiolki kriogenicznej na płytkę z czerwonym agarem TSB + Kongo za pomocą sterylnego aplikatora.
    2. Wysterylizuj płomieniem pętlę zaszczepiającą i pozwól jej ostygnąć. Przesuwaj inokulum tam iz powrotem przez jedną ćwiartkę płytki. Podpal pętlę, pozwól jej ostygnąć, a następnie przeprowadź smugę od pierwszej ćwiartki do drugiej ćwiartki płytki. Powtórz tę czynność, aby wprowadzić inokulum do trzeciej i czwartej ćwiartki płytki.
      UWAGA: Alternatywnie, za pomocą świeżego sterylnego aplikatora należy rozprowadzić inokulum między każdą ćwiartką.
    3. Odwrócić płytkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
      UWAGA: Inkubacja w temperaturach ≥37 °C jest wymagana do ekspresji czynników wirulencji Shigella niezbędnych do obserwacji fenotypu kongo czerwono-dodatniego (CR+)45. Kolonie avirulent będą miały biały wygląd i nie będą inwazyjne.
    4. Uszczelnić płytkę folią parafinową i przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Kolonie bakteryjne pozostaną żywe na płytkach agarowych przez 1-2 tygodnie.
  2. Nocny wzrost Shigelli w płynnej kulturze
    1. Porcjować 3 ml pożywki TSB do sterylnych probówek hodowlanych o pojemności 14 ml.
    2. Za pomocą sterylnego aplikatora należy pobrać pojedynczą, dobrze wyizolowaną czerwoną (CR+) kolonię i ponownie zawiesić w płynnym podłożu.
    3. Inkubować kultury przez noc (16-18 godzin) w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obrotach na minutę (obr./min).

3. Przygotowanie komórek eukariotycznych HT-29

UWAGA: Wszystkie objętości są zgodne z testem przy użyciu dwóch płytek 6-dołkowych. Linie komórkowe HT-29 pozyskano z American Type Culture Collection (ATCC). Protokoły konserwacji HT-29 są zaadaptowane z zaleceń ATCC46. Przed użyciem wszystkie podłoża należy wstępnie podgrzać w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Wszystkie protokoły konserwacji HT-29 powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Powstrzymaj się od wytwarzania pęcherzyków podczas mieszania/pracy z komórkami HT-29 w pożywce, aby uniknąć dramatycznych zmian pH.

  1. Rozmrażanie ogniw HT-29 z zamrożonego materiału
    1. Rozmrozić fiolkę z komórkami HT-29 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Upewnij się, że nasadka pozostaje całkowicie nad wodą, aby uniknąć zanieczyszczenia. Rozmrażanie powinno zająć mniej niż 2 minuty.
    2. Wyjąć fiolkę z wody natychmiast po całkowitym rozmrożeniu kultury i odkazić 70% etanolem. Upewnij się, że wszystkie kroki od tego momentu są wykonywane przy użyciu technik aseptycznych.
    3. Dodać całą zawartość fiolki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 9 ml DMEM + 10% FBS. Wirować przy 125 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Zdekantować supernatant do pojemnika na odpady i ponownie zawiesić granulat w 10 ml ciepłego DMEM + 10% FBS. Przenieś zawieszone komórki do 75 cm2 kolby do hodowli tkankowej (T75) zawierającej 10 ml ciepłego DMEM + 10% FBS (całkowita objętość 20 ml).
    5. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 , aż komórki osiągną 90% zbiegu (około 6-7 dni).
      UWAGA: Konfluencja jest szacowana za pomocą przybliżenia wizualnego.
  2. Wysiew komórek HT-29
    1. Podgrzej 20 ml PBS i 50 ml DMEM + 10% FBS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i podgrzej 3 ml 0,25% (w/v) trypsyny-EDTA do temperatury pokojowej.
    2. Gdy komórki HT-29 (z kroku 3.1) osiągną 90% konfluencji, zdekantuj pożywkę do hodowli komórek HT-29 z kolby T75 do pojemnika na odpady. Wlej ~10 ml ciepłego PBS do kolby i delikatnie zamieszaj do umycia. Przelać PBS do pojemnika na odpady. Ponownie umyć ciepłym PBS i zdekantować.
    3. Dodaj 2-3 ml 0,25% (w/v) trypsyny-EDTA i delikatnie zamieszaj na całej powierzchni. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 4 minuty.
    4. Wyjąć kolbę z inkubatora i delikatnie zawirować trypsyną-EDTA, upewniając się wzrokowo, że wszystkie komórki odrywają się od powierzchni.
    5. Natychmiast dodaj 6 ml ciepłego DMEM + 10% FBS, aby dezaktywować trypsynę. Pipetuj w górę i w dół, aby dokładnie wymieszać.
    6. Przenieść całą zawartość do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Delikatnie zdekantować supernatant do pojemnika na odpady i ponownie zawiesić granulat w 6 ml ciepłego DMEM + 10% FBS.
    8. Natychmiast po ponownym zawieszeniu przenieść 10 μl zawieszonych komórek HT-29 ze środka hodowli do probówki PCR o pojemności 0,2 ml. Dodaj 10 μl niebieskiego barwnika trypanowego do probówki PCR i wymieszaj.
    9. Dodać 10 μl mieszanki ogniw HT-29 i błękitu trypanowego do jednorazowego szkiełka z komorą licznika komórek Countess (patrz tabela materiałów). Wylicz liczbę żywych komórek i oblicz żywotność komórek.
      UWAGA: Dokumentując liczbę komórek w próbce, odczytaj liczbę pod "żywą" liczbą komórek, a nie całkowitą liczbę komórek. Alternatywnie wyliczanie komórek można wykonać ręcznie za pomocą hemocytometru.
    10. Nasiona zawiesić komórki HT-29 w świeżej kolbie T75 lub płytce 6-dołkowej.
      1. Dla kolby T75:
        1. Delikatnie odpipetować, aby wymieszać, a następnie przenieść 2,5 x 106 komórek do świeżej kolby T75 zgodnie z poniższym równaniem:
          figure-protocol-1
        2. Dodaj ciepłe podłoże DMEM + 10% FBS do końcowej objętości 20 ml (końcowe stężenie 1,25 x 105 komórek/ml).
        3. Rozprowadź komórki równomiernie w kolbie, delikatnie kołysząc w przód iw tył.
        4. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 aż do momentu, gdy komórki osiągną 80% konfluencji.
          UWAGA: Aby uzyskać optymalny wzrost, wymieniaj pożywkę DMEM + 10% FBS w kolbie T75 co ~3 dni. Przelać pożywkę do pojemnika na odpady i dodać 10 ml ciepłego PBS do kolby. Delikatnie zakręć PBS i przelej go do pojemnika na odpady. Następnie dodać 20 ml świeżego, ciepłego DMEM + 10% FBS do kolby i wrócić do inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
      2. Dla płytki 6-dołkowej:
        1. Delikatnie odpipetować, aby wymieszać, a następnie przenieść 5,85 x 106 komórek do świeżej stożkowej probówki o pojemności 50 ml zgodnie z poniższym równaniem:
          figure-protocol-2
        2. Dodaj ciepłą pożywkę DMEM + 10% FBS do końcowej objętości 26 ml (końcowe stężenie 2,25 x 105 komórek/ml).
        3. Delikatnie pipetować, aby wymieszać, a następnie dozować 2 ml (4,5 x 105 komórek) do indywidualnych dołków z płytkami 6-dołkowymi.
        4. Rozprowadź komórki równomiernie w dołku, delikatnie kołysząc się w górę / w dół i w lewo / w prawo 2-3 razy.
        5. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 do momentu, gdy komórki osiągną zlewność 80%-95% (około 3-4 dni).
          UWAGA: 85% konfluencja jest zalecana w testach inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej, podczas gdy 90%-95% konfluencji jest zalecana w testach adherencji. Komórki powinny osiągnąć ~85% konfluencji po 48 godzinach inkubacji z końcowym stężeniem około 1 x 106 komórek/dołek. Mogą być wymagane dostosowania liczby wysiewanych komórek i długości inkubacji.
  3. Wytwarzanie mrożonych zapasów HT-29
    1. Porcję 1 ml DMEM + 10% FBS + 5% pożywki DMSO do indywidualnych fiolek kriogenicznych.
    2. Dodać 1 x 106 komórek HT-29 z kroku 3.2.7 do każdej fiolki. Oblicz objętość komórek zgodnie z poniższym wzorem:
      figure-protocol-3
    3. Przechowuj ogniwa HT-29 przez długi czas w temperaturze poniżej -130 °C w zamrażarce do przechowywania par ciekłego azotu.

4. Test zgodności

UWAGA: Wszystkie objętości są zgodne z testem z użyciem dwóch płytek 6-dołkowych.

  1. Subkultura przez noc Kultury Shigella przez rozcieńczenie 1:50 na świeże podłoża.
    1. Odwiruj, a następnie dodaj 100 μl każdej nocnej kultury do 5 ml świeżego TSB lub TSB + BS w probówce hodowlanej o odpowiedniej wielkości.
      UWAGA: Ogranicz objętość kultury do <20% objętości kolby hodowlanej lub probówki, aby zapewnić prawidłowe napowietrzenie.
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem z prędkością 250 obr./min, aż komórki osiągną gęstość optyczną (OD600) 0,7 (środkowa faza logarytmiczna wzrostu Shigella); około 2-2,5 h.
      UWAGA: Podczas subhodowli należy podać 50 ml DMEM i wystarczającą objętość PBS na wszystkie etapy mycia i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Przed użyciem odczekać, aż nośnik osiągnie temperaturę 37 °C.
  2. Przenieś 2 x 108 jednostek tworzących kolonie (CFU) z subkulturą Shigella do pojedynczych probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml.
    UWAGA: 2 x 108 CFU odpowiada około 1 ml komórek bakteryjnych przy OD600 0,7. Użyj odczytów OD600, aby w przybliżeniu określić jtk/ml zgodnie z kalibracją każdego spektrofotometru.
  3. Umyj każdą próbkę Shigella 2x PBS.
    1. Komórki osadu przez odwirowanie przy 17 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant, a następnie dodać 1 ml ciepłego PBS i dobrze zawiesić osad, delikatnie pipetując próbkę w górę i w dół, aż mieszanina będzie w pełni jednorodna (8-10x).
    2. Powtórz krok 4.3.1 1x więcej czasu.
    3. Komórki osadu przez odwirowanie przy 17 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, odessać supernatant i ponownie zawiesić granulki w 2 ml ciepłego DMEM.
      UWAGA: Końcowe stężenie zawieszonych bakterii wyniesie 1 x 108 jtk/ml.
  4. Odwirować, a następnie dodać 1 ml (1 x 108 jtk) zawieszonej Shigelli do każdego dołka przygotowanych monowarstw nabłonka okrężnicy HT-29 na płytkach 6-dołkowych (od kroku 3.2.10.2).
    UWAGA: Infekcje są zwykle wykonywane przy wielokrotności infekcji (MOI; stosunek komórek bakteryjnych do nabłonkowych) wynoszącej 100. Aby przetestować różne MOI, rozcieńczyć zawieszoną Shigella w ciepłym DMEM do pożądanego stężenia, a następnie dodać 1 ml rozcieńczonych bakterii do monowarstw HT-29. Na przykład, aby przetestować MOI 10, rozcieńczyć bakterie w stosunku 1:10, dodając 150 μl bakterii 1 x 108 CFU/ml do 1,35 ml ciepłego DMEM, a następnie nałóż 1 ml (1 x 107 CFU) na komórki HT-29.
  5. Inkubować płytki 6-dołkowe w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 3 godziny.
  6. Podczas inkubacji określić miano infekcji bakteryjnej.
    1. Przygotować 10-krotne seryjne rozcieńczenia zawieszonych komórek Shigella (z kroku 4.3.3) do PBS.
    2. Umieścić 100 μl rozcieńczeń 1 x 10-5 i 1 x 10-6 na czerwonych płytkach TSB + Kongo i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Posiewanie 100 μl z rozcieńczeń 1 x 10-5 i 1 x 10-6 odpowiada końcowemu współczynnikowi rozcieńczenia wynoszącemu odpowiednio 1 x 10-6 i 1 x 10-7.
  7. Po inkubacji przemyć monowarstwy 4-5x PBS.
    1. Odessać pożywkę z każdej studzienki.
      UWAGA: Podczas zasysania pożywki z płytek 6-dołkowych należy poprowadzić końcówkę aspiratora wzdłuż dolnej strony studzienek, starając się unikać kontaktu z komórkami HT-29.
    2. Dodaj 1 ml ciepłego PBS do każdej studzienki i delikatnie umyj.
      UWAGA: Aby delikatnie umyć 6-dołkowe monowarstwy PBS, przesuwaj płytkę w górę iw dół oraz z boku na bok na blacie. Mycie talerzy ruchem okrężnym i/lub zdejmowanie płytki z powierzchni blatu może spowodować mechaniczne usunięcie komórek z tworzywa sztucznego.
    3. Powtórz kroki 4.7.1 i 4.7.2 dodatkowe 4 razy.
  8. Usuń PBS przez aspirację i lizę komórek HT-29, dodając 1 ml PBS + 1% Triton X-100 do każdego dołka.
  9. Inkubować płytki 6-dołkowe w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  10. Użyj skrobaka do komórek lub wygiętej końcówki pipety, aby zeskrobać zlizowane komórki z dna studzienki i przenieś cały 1 ml do świeżej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml.
  11. Określ liczbę bakterii związanych z komórkami.
    1. Wirować każdą probówkę (od kroku 4.10) przez co najmniej 30 sekund, aby jeszcze bardziej wyprzeć Shigella z lizowanych komórek eukariotycznych.
    2. Przygotować 10-krotne seryjne rozcieńczenia lizatów do PBS.
    3. Umieścić 100 μl rozcieńczeń 1 x 10-2, 1 x 10-3 i 1 x 10-4 na czerwonych płytkach TSB + Kongo i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Posiewanie 100 μl z rozcieńczeń 1 x 10-2, 1 x 10-3 i 1 x 10-4 odpowiada końcowemu współczynnikowi rozcieńczenia wynoszącemu odpowiednio 1 x 10-3, 1 x 10-4 i 1 x 10-5.

5. Test inwazji

UWAGA: Wszystkie objętości są zgodne z testem z użyciem dwóch płytek 6-dołkowych.

  1. Subkultura przez noc Kultury Shigella przez rozcieńczenie 1:50 na świeże podłoża.
    1. Odwiruj, a następnie dodaj 100 μl każdej nocnej kultury do 5 ml świeżego TSB lub TSB + BS w probówce hodowlanej o odpowiedniej wielkości.
      UWAGA: Ogranicz objętość kultury do <20% objętości kolby hodowlanej lub probówki, aby zapewnić prawidłowe napowietrzenie.
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem z prędkością 250 obr./min, aż komórki osiągną OD600 równą 0,7 (środkowa faza logarytmiczna wzrostu Shigella); około 2-2,5 godz.
      UWAGA: Podczas subhodowli należy podać 50 ml DMEM + 50 mg/ml gentamycyny i wystarczającą objętość PBS na wszystkie etapy płukania i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Przed użyciem odczekać, aż nośnik osiągnie temperaturę 37 °C.
  2. Przenieś 2 x 10 8 CFU z subkulturą Shigella do indywidualnych probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml.
    UWAGA: 2 x 108 CFU odpowiada około 1 ml komórek bakteryjnych przy OD600 0,7. Użyj odczytów OD600, aby w przybliżeniu określić jtk/ml zgodnie z kalibracją każdego spektrofotometru.
  3. Próbki Shigella umyć 1x PBS.
    1. Komórki osadu przez odwirowanie przy 17 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant, a następnie dodać 1 ml ciepłego PBS i dobrze zawiesić osad, delikatnie pipetując próbkę w górę i w dół, aż mieszanina będzie w pełni jednorodna (8-10x).
    2. Powtórz krok 5.3.1. 1x dodatkowy czas.
    3. Komórki osadu przez odwirowanie przy 17 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, odessać supernatant i ponownie zawiesić granulki w 2 ml ciepłego DMEM.
      UWAGA: Końcowe stężenie zawieszonych bakterii wyniesie 1 x 108 jtk/ml.
  4. Odwirować, a następnie dodać 1 ml (1 x 108 jtk) zawieszonej Shigelli plus 1 ml DMEM do każdego dołka przygotowanych monowarstw nabłonka okrężnicy HT-29 na płytkach 6-dołkowych (od kroku 3.2.10.2).
    UWAGA: Infekcje są zwykle wykonywane przy wielokrotności infekcji (MOI; stosunek komórek bakteryjnych do nabłonkowych) wynoszącej 100. Aby przetestować różne MOI, rozcieńczyć zawieszoną Shigella w DMEM do pożądanego stężenia, a następnie dodać 1 ml rozcieńczonych bakterii do monowarstw HT-29. Na przykład, aby przetestować MOI 10, rozcieńczyć bakterie w stosunku 1:10, dodając 150 μl bakterii 1 x 108 CFU/ml do 1,35 ml DMEM, a następnie dodaj 1 ml (1 x 107 CFUs) do komórek HT-29.
  5. Aby ułatwić kontakt bakterii z komórkami HT-29, należy odwirować 6-dołkowe płytki o stężeniu 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej lub 37 °C, jeśli można dostosować ustawienie temperatury.
    UWAGA: Wirowanie sprzyja kontaktowi bakterii z komórkami HT-29, co omija potrzebę stosowania czynników adhezyjnych i pozwala bakteriom szybko zaatakować komórki.
  6. Inkubować płytki 6-dołkowe w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 45 minut.
  7. Podczas inkubacji określić miano infekcji bakteryjnej.
    1. Przygotować 10-krotne seryjne rozcieńczenia zawieszonych komórek Shigella (z kroku 5.3.3) do PBS.
    2. Umieścić 100 μl rozcieńczeń 1 x 10-5 i 1 x 10-6 na czerwonych płytkach TSB + Kongo i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Posiewanie 100 μl z rozcieńczeń 1 x 10-5 i 1 x 10-6 odpowiada końcowemu współczynnikowi rozcieńczenia wynoszącemu odpowiednio 1 x 10-6 i 1 x 10-7.
  8. Dokładnie umyj zainfekowane komórki HT-29 3x 1 ml PBS.
    1. Odessać pożywkę z każdej studzienki.
      UWAGA: Podczas zasysania pożywki z płytek 6-dołkowych należy poprowadzić końcówkę aspiratora wzdłuż dolnej strony studzienek, starając się unikać kontaktu z komórkami HT-29.
    2. Dodaj 1 ml ciepłego PBS do każdej studzienki i delikatnie umyj.
      UWAGA: Aby delikatnie umyć 6-dołkowe monowarstwy PBS, przesuwaj płytkę w górę iw dół oraz z boku na bok na blacie. Mycie talerzy ruchem okrężnym i/lub zdejmowanie płytki z powierzchni blatu może spowodować mechaniczne usunięcie komórek z tworzywa sztucznego.
    3. Powtórz kroki 5.8.1 i 5.8.2 dodatkowe 2 razy.
  9. Usunąć PBS przez aspirację, a następnie dodać 2 ml ciepłego DMEM uzupełnionego 50 μg/ml gentamycyny do każdej studzienki i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  10. Dokładnie umyj zainfekowane komórki HT-29 3x 1 ml PBS.
    1. Powtórzyć krok prania 5.8.
  11. Usunąć PBS przez aspirację, a następnie dodać 2 ml ciepłego DMEM uzupełnionego 50 μg/ml gentamycyny do każdej studzienki i inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  12. Dokładnie umyj zainfekowane komórki HT-29 3x 1 ml PBS.
    1. Powtórzyć krok prania 5.8.
  13. Usuń PBS przez aspirację i lizę komórek HT-29, dodając 1 ml PBS + 1% Triton X-100 do każdego dołka.
  14. Inkubować płytki 6-dołkowe w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  15. Użyj skrobaka do komórek lub wygiętej końcówki pipety, aby zeskrobać zlizowane komórki z dna studzienki i przenieś cały 1 ml do świeżej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml.
  16. Określ liczbę bakterii wewnątrzkomórkowych.
    1. Wirować każdą probówkę (od kroku 5.15) przez co najmniej 30 sekund, aby jeszcze bardziej wyprzeć Shigella z lizowanych komórek eukariotycznych.
    2. Przygotować 10-krotne seryjne rozcieńczenia lizatów do PBS.
    3. Umieścić 100 μl rozcieńczeń 1 x 10-2 i 1 x 10-3 na czerwonych płytkach TSB + Kongo i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Posiewanie 100 μl z rozcieńczeń 1 x 10-2 i 1 x 10-3 odpowiada końcowemu współczynnikowi rozcieńczenia wynoszącemu odpowiednio 1 x 10-3 i 1 x 10-4.

6. Test replikacji wewnątrzkomórkowej

UWAGA: Wszystkie objętości są zgodne z testem z użyciem dwóch płytek 6-dołkowych.

  1. Subkultura przez noc Kultury Shigella przez rozcieńczenie 1:50 na świeże podłoża.
    1. Odwiruj, a następnie dodaj 100 μl każdej nocnej kultury do 5 ml świeżego TSB lub TSB + BS w probówce hodowlanej o odpowiedniej wielkości.
      UWAGA: Ogranicz objętość kultury do <20% objętości kolby hodowlanej lub probówki, aby zapewnić prawidłowe napowietrzenie.
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem z prędkością 250 obr./min, aż komórki osiągną OD600 równą 0,7 (środkowa faza logarytmiczna wzrostu Shigella); około 2-2,5 godz.
      UWAGA: Podczas subhodowli należy podać 50 ml DMEM + 50 mg/ml gentamycyny i wystarczającą objętość PBS na wszystkie etapy płukania i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Przed użyciem odczekać, aż nośnik osiągnie temperaturę 37 °C.
  2. Przenieś 2 x 10 8 CFU z subkulturą Shigella do indywidualnych probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml.
    UWAGA: 2 x 108 CFU odpowiada około 1 ml komórek bakteryjnych przy OD600 0,7. Użyj odczytów OD600, aby w przybliżeniu określić jtk/ml zgodnie z kalibracją każdego spektrofotometru.
  3. Próbki Shigella umyć 1x PBS.
    1. Komórki osadu przez odwirowanie przy 17 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant, a następnie dodać 1 ml ciepłego PBS i dobrze zawiesić osad, delikatnie pipetując próbkę w górę i w dół, aż mieszanina będzie w pełni jednorodna (8-10x).
    2. Powtórz krok 6.3.1. 1x więcej czasu.
    3. Komórki osadu przez odwirowanie przy 17 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, odessać supernatant i ponownie zawiesić granulki w 2 ml ciepłego DMEM.
      UWAGA: Końcowe stężenie zawieszonych bakterii wyniesie 1 x 108 jtk/ml.
  4. Odwirować, a następnie dodać 1 ml (1 x 108 jtk) zawieszonej Shigelli plus 1 ml DMEM do każdej studzienki przygotowanych monowarstw nabłonka okrężnicy HT-29 na płytkach 6-dołkowych (od kroku 3.2.10.2).
    UWAGA: Infekcje są zwykle wykonywane przy wielokrotności infekcji (MOI; stosunek komórek bakteryjnych do nabłonkowych) wynoszącej 100. Aby przetestować różne MOI, rozcieńczyć zawieszoną Shigella w DMEM do pożądanego stężenia, a następnie dodać 1 ml rozcieńczonych bakterii do monowarstw HT-29. Na przykład, aby przetestować MOI 10, rozcieńczyć bakterie 1:10, dodając 150 μl bakterii 1 x 108 CFU/ml do 1,35 ml DMEM, a następnie nałóż 1 ml (1 x 107 CFUs) na komórki HT-29.
  5. Aby ułatwić kontakt bakterii z komórkami HT-29, należy odwirować 6-dołkowe płytki o stężeniu 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej lub 37 °C, jeśli można dostosować ustawienie temperatury.
    UWAGA: Wirowanie sprzyja kontaktowi bakterii z komórkami HT-29, co omija potrzebę stosowania czynników adhezyjnych i pozwala bakteriom szybko zaatakować komórki.
  6. Inkubować płytki 6-dołkowe w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 45 minut.
  7. Podczas inkubacji określić miano infekcji bakteryjnej.
    1. Przygotować 10-krotne seryjne rozcieńczenia zawieszonych komórek Shigella (z kroku 6.3.3) do PBS.
    2. Umieścić 100 μl rozcieńczeń 1 x 10-5 i 1 x 10-6 na czerwonych płytkach TSB + Kongo i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Posiewanie 100 μl z rozcieńczeń 1 x 10-5 i 1 x 10-6 odpowiada końcowemu współczynnikowi rozcieńczenia wynoszącemu odpowiednio 1 x 10-6 i 1 x 10-7.
  8. Dokładnie umyj zainfekowane komórki HT-29 3x 1 ml PBS.
    1. Odessać pożywkę z każdej studzienki.
      UWAGA: Podczas zasysania pożywki z płytek 6-dołkowych należy poprowadzić końcówkę aspiratora wzdłuż dolnej strony studzienek, starając się unikać kontaktu z komórkami HT-29.
    2. Dodaj 1 ml ciepłego PBS do każdej studzienki i delikatnie umyj.
      UWAGA: Aby delikatnie umyć 6-dołkowe monowarstwy PBS, przesuwaj płytkę w górę iw dół oraz z boku na bok na blacie. Mycie talerzy ruchem okrężnym i/lub zdejmowanie płytki z powierzchni blatu może spowodować mechaniczne usunięcie komórek z tworzywa sztucznego.
    3. Powtórz kroki 6.8.1 i 6.8.2 jeszcze 2 razy.
  9. Usunąć PBS przez aspirację, a następnie dodać 2 ml ciepłego DMEM uzupełnionego 50 μg/ml gentamycyny do każdej studzienki i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  10. Dokładnie umyj zainfekowane komórki HT-29 3x 1 ml PBS.
    1. Powtórz krok prania 6.8.
  11. Usunąć PBS przez aspirację, a następnie dodać 2 ml ciepłego DMEM z 50 μg/ml gentamycyny do każdej studzienki z 6-dołkowych płytek i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez żądany czas, aby umożliwić replikację wewnątrzkomórkową (do 24 godzin).
  12. Dokładnie umyj komórki 2x 1 ml PBS.
    1. Powtórz krok prania 6.8.
  13. Usuń PBS przez aspirację i lizę komórek HT-29, dodając 1 ml PBS + 1% Triton X-100 do każdego dołka.
  14. Inkubować płytki 6-dołkowe w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  15. Użyj skrobaka do komórek lub wygiętej końcówki pipety, aby zeskrobać zlizowane komórki z dna studzienki i przenieś cały 1 ml do świeżej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml.
  16. Określ liczbę bakterii wewnątrzkomórkowych.
    1. Wirować każdą probówkę (od kroku 6.15) przez co najmniej 30 sekund, aby jeszcze bardziej wyprzeć Shigella z lizowanych komórek eukariotycznych.
    2. Przygotować 10-krotne seryjne rozcieńczenia lizatów do PBS.
    3. Umieścić 100 μl rozcieńczeń 1 x 10-2, 1 x 10-3 i 1 x 10-4 na płytkach TSB + Congo Red i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Posiewanie 100 μl z rozcieńczeń 1 x 10-2, 1 x 10-3 i 1 x 10-4 odpowiada końcowemu współczynnikowi rozcieńczenia wynoszącemu odpowiednio 1 x 10-3, 1 x 10-4 i 1 x 10-5.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprowadzono testy adherencji, inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej, porównując S. flexneri 2457T typu dzikiego (WT) z S. flexneri ΔVF (ΔVF), mutantem, o którym przypuszczalnie negatywnie reguluje zjadliwość Shigella. Ponieważ Shigella używa soli żółciowych jako sygnału do regulacji zjadliwości17,18,47, eksperymenty przeprowadzono po subkulturze bakteryjnej w pożywce TSB, a także TSB uzupełnionym 0,4% (w/v) soli żółciowych18. Narażenie na sole żółciowe na etapie subhodowli działa jak obróbka wstępna w celu odtworzenia pasażu jelita cienkiego przed infekcją okrężnicy17,18,47. Rysunek 1 analizuje wpływ mutacji ΔVF na zdolność S. flexneri do przylegania do komórek nabłonka okrężnicy HT-29. Procentowa adherencja jest wykreślana na osi y i reprezentuje stosunek bakterii odzyskanych po lizie HT-29 standaryzowany do liczby bakterii wejściowych. Zgodnie z oczekiwaniami, zarówno szczepy S. flexneri WT, jak i ΔVF miały znaczny wzrost przestrzegania zaleceń dotyczących zaleceń dotyczących subkultury z suplementacją solami żółciowymi w porównaniu z TSB bez suplementacji solami żółciowymi18. Nie stwierdzono jednak różnicy w przyleganiu do komórek HT-29 między zmutowanymi szczepami WT i ΔVF w każdym stanie subkultury. Dane te wskazują, że mutacja ΔVF nie ma wpływu na zdolność S. flexneri do przylegania do komórek nabłonka HT-29 z solami żółciowymi lub bez wstępnego traktowania.

W Rysunek 2, przeanalizowano wpływ mutacji ΔVF na zdolność S. flexneri do inwazji (Rysunek 2A) i replikacji (Rysunek 2B) wewnątrz komórek nabłonka okrężnicy HT-29 z solami żółciowymi lub bez wstępnego traktowania. Procent odzysku jest wykreślony na osi y i reprezentuje stosunek odzyskanych komórek bakteryjnych po lizie komórek HT-29 standaryzowany na liczbę bakterii wejściowych. W Rysunek 2A, spodziewano się znacznego wzrostu zdolności WT S. flexneri 2457T do inwazji komórek HT-29 po wstępnej ekspozycji na sole żółciowe48, podczas gdy mutant S. flexneri ΔVF wykazywał mniejszy wzrost inwazji po wstępnej ekspozycji na sole żółciowe w porównaniu ze szczepem WT. ΔVF mutant miał zwiększone wskaźniki inwazji komórek HT-29 w porównaniu z WT subhodowanym w TSB, ale miał podobne wskaźniki inwazji jak WT, gdy był hodowany w TSB uzupełnionym solami żółciowymi (Figura 2A). Wyniki te sugerują, że mutacja ΔVF zwiększa zdolność S. flexneri do inwazji komórek HT-29, co zmniejsza wpływ soli żółciowych przed ekspozycją, mimo że zdolność inwazji mutanta ΔVF wzrosła dalej po subkulturze soli żółciowych.

Ogólnie rzecz biorąc, 10-krotnie więcej bakterii zostało odzyskanych po nocnej inkubacji (Rysunek 2B) w porównaniu do 90-minutowej inkubacji (Rysunek 2A), co pokazuje różnice w monitorowaniu wzrostu wewnątrzkomórkowego i inwazji, odpowiednio. Gdy zakażone komórki HT-29 inkubowano przez 18 godzin, aby umożliwić wewnątrzkomórkową replikację bakterii (Figura 2B), wpływ wstępnego leczenia solami żółciowymi zmniejszył się zarówno dla szczepów WT, jak i ΔVF. Jednak zmniejszony wpływ wstępnego traktowania solami żółciowymi podczas replikacji wewnątrzkomórkowej był bardziej dramatyczny w przypadku mutanta ΔVF. Ponieważ wzrost wewnątrzkomórkowej replikacji obu szczepów po wstępnej ekspozycji na sole żółciowe był mniejszy niż wzrost szybkości inwazji w tych samych warunkach, stawiamy hipotezę, że sole żółciowe mają większy wpływ na wczesne etapy patogenezy S. flexneri. Mutant ΔVF wykazał wzrost procentowego odzysku po nocnej replikacji wewnątrz komórek HT-29 w porównaniu z WT (Figura 2B) po obu warunkach subkultury. Jednak procentowy odzysk mutanta ΔVF był podobny niezależnie od soli żółciowych przed ekspozycją. Te trendy danych sugerują, że mutant ΔVF replikuje się bardziej efektywnie w komórkach HT-29 w porównaniu z WT i że sole żółciowe przed ekspozycją nie wpływają na zdolność mutanta ΔVF do replikacji wewnątrzkomórkowej, jak zaobserwowano dla WT (Figura 2B). Ponieważ nie zaobserwowano różnicy między zmutowanymi a WT szczepami w warunkach soli żółciowych przed ekspozycją podczas 90-minutowego testu inwazji, stawiamy hipotezę, że produkt kodowany przez usunięty gen VF może również regulować replikację S. flexneri wewnątrz komórek HT-29. Łącznie, obie analizy pokazują, że mutant ΔVF jest bardziej zjadliwy w stosunku do WT, co sugeruje, że produkt genu VF jest negatywnym regulatorem zjadliwości S. flexneri.

figure-results-1
Rysunek 1: Wstępne przyleganie S. flexneri do komórek HT-29 wywołane przez sole żółciowe. Zmutowane komórki S. flexneri 2457T WT i ΔVF hodowano w pożywce TSB lub TSB uzupełnionej 0,4% (w/v) soli żółciowych (TSB+BS). Bakterie następnie naniesiono na komórki HT-29 przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 100 i inkubowano przez 3 godziny w celu zbadania przylegania. Po inkubacji zakażone komórki HT-29 przemyto i poddano lizie, a seryjne rozcieńczenia odzyskanych bakterii posiano w celu wyliczenia jednostek tworzących kolonie na ml (CFU/ml). Liczba bakterii adherentnych jest wykreślana w stosunku do miana bakterii wejściowych w celu ustalenia procentowej adherencji. Dane są reprezentatywne dla jednej kontrpróby biologicznej z trzema kontrpróbami technicznymi (pojedynczymi kropkami). Słupki błędów wskazują błąd standardowy średniej (SEM). Istotność statystyczną określono za pomocą testu t-Studenta (*p < 0,05; ***p < 0,001). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Sól żółciowa przed ekspozycją zwiększyła inwazję WT S. flexneri i replikację wewnątrzkomórkową. Zmutowane komórki S. flexneri 2457T WT i ΔVF hodowano w pożywce TSB lub TSB uzupełnionej solami żółciowymi (TSB+BS). Bakterie następnie naniesiono na komórki HT-29 przy MOI 100, odwirowano na komórkach i inkubowano w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 45 minut. Komórki przemyto PBS, a bakterie zewnątrzkomórkowe poddano lizie przez dodanie gentamycyny do DMEM w celu odzyskania wyłącznie bakterii wewnątrzkomórkowych. Po 90 minutach (A, inwazja bakteryjna) lub 18 godzinach (B, replikacja wewnątrzkomórkowa) inkubacji, zakażone komórki HT-29 przemyto i poddano lizie, a seryjne rozcieńczenia odzyskanych bakterii posiewano w celu wyliczenia jednostek tworzących kolonie na ml (CFU / ml). Liczbę bakterii wewnątrzkomórkowych wykreśla się w stosunku do wejściowych mian bakterii w celu ustalenia procentu odzysku. Dane są reprezentatywne dla jednej kontrpróby biologicznej, z których każda składa się z trzech kontrprób technicznych (pojedynczych kropek). Słupki błędów wskazują SEM. Istotność statystyczną określono za pomocą testu t-Studenta (*p < 0,05). Proszę zwrócić uwagę na różnice w skalach osi y między panelami (A) i (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje zestaw trzech standaryzowanych testów do badania przylegania, inwazji i wewnątrzkomórkowej replikacji komórek nabłonka jelitowego. Chociaż metody te są jedynie zmodyfikowanymi wersjami klasycznych testów gentamycyny stosowanych do badania inwazji i wewnątrzkomórkowej replikacji różnych patogenów bakteryjnych w komórkach gospodarza 49,50,51, podczas badania Shigella należy zastosować specjalne względy.

Shigella to fakultatywne beztlenowce, które rosną optymalnie w temperaturze 37 °C w bogatym podłożu z napowietrzeniem43. Podczas wykonywania tych testów w celu zbadania wpływu różnych sygnałów środowiskowych lub metabolitów na infekcje Shigella, zaleca się hodowlę Shigella w bogatych pożywkach przez noc, a następnie subkulturę w zdefiniowanych lub uzupełnionych pożywkach do połowy fazy logarytmicznej przed infekcją. Maksymalna ekspresja genu wirulencji zachodzi w logarytmicznej fazie wzrostu52,53. Tak więc, subkulturacja kultur Shigella przez noc i umożliwienie wzrostu bakterii do fazy wykładniczej (OD600 ~ 0,7) są niezbędnymi krokami do prawidłowej oceny zjadliwości Shigella. Co więcej, ekspresja genów wirulencji jest zależna od temperatury. Aby zapewnić swoistość ekspresji tylko podczas infekcji gospodarza, geny wirulencji są indukowane w temperaturach fizjologicznych gospodarza (37 °C) i ściśle tłumione w niższych temperaturach (np. 30 °C)54. Aby zapewnić ekspresję genów wirulencji, hodowla bakterii i infekcje muszą być przeprowadzane w temperaturze 37 °C, z należytą ostrożnością, aby temperatura nie spadła poniżej 37 °C. Duży, 220-kilozasadowy plazmid wirulencji, który koduje maszynerię molekularną wymaganą do inwazji i infekcji komórek nabłonkowych, jest niezbędnym wyznacznikiem wirulencji dla wszystkich Shigella spp5. Powtarzające się pasażowanie i przedłużony wzrost w temperaturze 37 °C sprzyjają niestabilności plazmidu wirulencji, co skutkuje utratą plazmidu i sprawia, że komórki Shigella stają się awirulentem55. Aby zapewnić utrzymanie plazmidu wirulencji i ekspresję kluczowych genów wirulencji, zaleca się ponowne przerzucanie bakterii bezpośrednio z zapasów zamrażarki co dwa tygodnie na świeże czerwone płytki wskaźnikowe TSB + Kongo. Czerwony agar Kongo może być używany do rozróżniania kolonii zjadliwych typu dzikiego (czerwony, CR+) i kolonii awirulentowych (białych, CR-), które utraciły zjadliwy plazmid45. Jeśli niestabilność plazmidu wirulencji jest wielokrotnie obserwowana, nocne kultury Shigella można inkubować w temperaturze 30 °C, aby zapobiec utracie plazmidu wirulencji, a następnie subkulturować w temperaturze 37 °C w celu promowania ekspresji genów wirulencji43. Wreszcie, jeśli przeprowadzane są analizy z mutantami i/lub komplementarnymi szczepami, w których markery antybiotykowe są obecne w tych szczepach bakteryjnych, zaleca się stosowanie odpowiedniej selekcji antybiotyków podczas etapów nocnego i podhodowli bakterii.

Zastosowanie monowarstw nabłonka HT-29 ma wiele zalet w badaniu molekularnych mechanizmów patogenezy Shigella in vitro. Ponieważ Shigella jest patogenem przystosowanym do potrzeb człowieka, małe modele zwierzęce nie odzwierciedlają dokładnie charakterystycznej patogenezy shigellozy obserwowanej u ludzi36. W związku z tym zastosowanie znormalizowanych protokołów infekcji linii komórkowych pochodzenia ludzkiego umożliwia ilościowe badanie poszczególnych etapów patogenezy bakteryjnej w celu scharakteryzowania wzajemnych oddziaływań molekularnych między tym patogenem a jego rodzimym gospodarzem. Historycznie rzecz biorąc, komórki HeLa były głównie wykorzystywane do badania interakcji gospodarz-patogen in vitro 25,56,57. Jednak komórki HeLa są unieśmiertelnioną linią komórkową raka szyjki macicy, która jest nienatywnymi komórkami gospodarza dla jelitowych patogenów bakteryjnych. W związku z tym badania in vitro patogenezy jelit przesunęły się na wykorzystanie linii komórkowych gruczolakoraka jelita grubego (np. HT-29, Caco-2 i T84), które wierniej odwzorowują morfologię nabłonka jelitowego i mogą być hodowane na transwellach jako monowarstwy nabłonkowe ze zróżnicowanymi powierzchniami wierzchołkowymi i podstawno-bocznymi 58,59,60. Chociaż każda linia komórkowa ma swoje indywidualne mocne i słabe strony, komórki HT-29 są wykorzystywane w opisanych tutaj testach ze względu na podobieństwa fenotypowe do enterocytów jelitowych i silną ekspresję receptorów powierzchniowych komórek i cytokin prozapalnych 58,59,61. Jednak każdy z tych omawianych modeli to linie komórkowe pochodzące z raka z nieprawidłowymi fenotypami metabolicznymi i wzrostowymi, które nie reprezentują dokładnie naturalnego stanu fizjologicznego nabłonka okrężnicy in vivo58. Ostatnie postępy w technikach hodowli tkanek ludzkich umożliwiły hodowlę ludzkich jelitowych komórek macierzystych, uzyskanych z biopsji tkanek, w organoidy lub pojedyncze dwuwymiarowe monowarstwy komórkowe, które podsumowują różne typy komórek obecnych w ludzkim przewodzie pokarmowym (GI) 62,63,64. Organoidy jelitowe można różnicować, obejmując enterocyty, komórki kubkowe wytwarzające śluz, komórki M i inne typy komórek specyficzne dla tkanki. Ostatnie badania potwierdziły użycie tych modeli organoidowych do badania patogenów jelitowych, w tym różnych patowarów Shigella spp., Salmonella enterica i Escherichia coli 62,63,64. Chociaż organoidy są dokładniejszymi modelami ludzkiego nabłonka przewodu pokarmowego i mogą być nawet hodowane w różnych warunkach odżywczych, aby reprezentować populację światową65, ich względna złożoność wymaga znacznego szkolenia i wiedzy technicznej, co skutkuje wyższymi kosztami i dłuższym czasem hodowli w porównaniu z tradycyjnymi liniami komórek nowotworowych58.

Protokół ten opisuje metody średnioprzepustowe, w których dwie 6-dołkowe płytki są używane do łącznie 12 monowarstw dostępnych do testowania. Jednak eksperymenty można łatwo skalować, aby zwiększyć liczbę zasiewanych monowarstw w celu dostosowania do dodatkowych powtórzeń technicznych lub testowania dodatkowych mutantów Shigella i sygnałów środowiskowych. Płytki do hodowli tkankowych z większą liczbą dołków (np. płytki 12-dołkowe lub 24-dołkowe) mogą być również używane z odpowiednimi dostosowaniami w celu uwzględnienia studzienek o mniejszych średnicach. W warunkach wzrostu HT-29 opisanych w kroku 3.2, miana HT-29 są wystarczające do wysiewu około sześciu 6-dołkowych płytek po hodowli z jednej kolby T75, z wystarczającą ilością pozostałych komórek, aby utrzymać hodowlę komórkową HT-29. Co więcej, wysiewanie monowarstw HT-29 i przygotowanie etapów inokulacji bakterii jest identyczne w testach adherencji bakteryjnej, inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej. W ten sposób testy testujące te same szczepy Shigella lub warunki subhodowli mogą być łatwo przeprowadzane równolegle, aby jednocześnie badać rolę każdego warunku eksperymentalnego w różnych etapach infekcji Shigella .

Miana odzysku dla bakterii adherentnych (krok 4), zaatakowanych (krok 5) i wewnątrzkomórkowych (krok 6) są określane przez posiew seryjnych rozcieńczeń zakażonych komórek HT-29 po lizie, co umożliwia ilościową ocenę skuteczności każdego etapu infekcji Shigella. Etapy wirowania w testach inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej, oparte na klasycznych testach 49,50,51, promują kontakt bakterii z komórkami gospodarza w celu natychmiastowej inwazji i zwiększają wskaźniki inwazji. W ten sposób wirowanie "pomija" etap przylegania, który później okazał się ważnym aspektem infekcji Shigella 17,18,19,66. Należy zauważyć, że etapu wirowania nie można wykonać ze spolaryzowanymi komórkami nabłonkowymi wysianymi na transwellach. Jednak w przypadku testu przylegania przyleganie nie jest wymuszane przez wirowanie, a gentamycyna nie jest dodawana do zakażonych komórek HT-29 przed lizą, co pozwala na zliczenie przylegających komórek bakteryjnych. Objętość pożywki do hodowli tkankowej jest zmniejszona do 1 ml (w przeciwieństwie do 2 ml w testach inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej), aby umożliwić bardziej efektywny kontakt bakterii z komórkami HT-29. Ponadto, w zależności od stopnia przylegania, podczas 3-godzinnej inkubacji może dojść do pewnej inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej, ale ilość ta jest zwykle znikoma (np. Tylko 0,05% odzyskanej populacji bakterii po lizie komórek gospodarza). Niemniej jednak, aby prawidłowo uwzględnić bakterie adherentne i wewnątrzkomórkowe podczas 3-godzinnej inkubacji, zaleca się przeprowadzenie równoległych testów, w których, oprócz podanego protokołu, druga płytka jest inkubowana z 50 μg/ml gentamycyny w 2 ml DMEM na studzienkę przez łącznie 45 minut (15 minut inkubacji, mycie, świeży DMEM + gentamycyna przez 30 minut) w celu dokładnej lizy bakterii zewnątrzkomórkowych. Po lizie komórek HT-29, jak zaznaczono w protokole, bakterie wewnątrzkomórkowe można policzyć, jak wspomniano powyżej, i będą reprezentować liczbę bakterii, które zostały zaatakowane. Wartość tę można następnie odjąć od bakterii wyliczonych na płytce bez traktowania gentamycyną, aby odpowiednio określić bakterie przylegające i zaatakowane. Można również przeprowadzić analizy równoległe, aby uzyskać lepszy wgląd w wewnątrzkomórkową replikację Shigella wewnątrz komórek HT-29 po inwazji, np. wykorzystując wiele punktów czasowych do wykonania wewnątrzkomórkowych krzywych wzrostu. Wreszcie, wraz z liczeniem bakterii wewnątrzkomórkowych po 18-godzinnej inkubacji gentamycyny, można zebrać supernatanty hodowlane i przeanalizować je pod kątem wydzielania cytokin przez zakażone komórki HT-29. Na przykład IL-8 jest chemokiną wydzielaną przez komórki nabłonkowe, która w dużej mierze działa w celu rekrutacji PMN do miejsca infekcji. Ilość IL-8 wydzielanej do pożywki hodowlanej zakażonych komórek HT-29 można analizować za pomocą testu IL-8 ELISA67.

Sole żółciowe okazały się ważnym sygnałem wirulencji dla Shigella podczas tranzytu przez ludzki układ pokarmowy i mogą być stosowane do uzupełniania pożywek rozwojowych bakterii w tych protokołach w celu odtworzenia typowych warunków przewodu pokarmowego. Naturalnie sole żółciowe są wprowadzane do dwunastnicy lub górnej części jelita cienkiego, aby wspomóc trawienie; A w końcowym jelicie krętym lub na końcu jelita cienkiego 95% soli żółciowych jest usuwanych i zawracanych z powrotem do krążenia w celu ostatecznego depozytu w woreczku żółciowym68. Sole żółciowe mają zwykle stężenie od 0,2% do 2,0% (w/v) w jelicie cienkim i są naturalnie bakteriobójcze. Jednak Shigella, podobnie jak większość bakterii jelitowych, jest odporna na sole żółciowe i wykorzystuje sygnały do wzmocnienia infekcji47. Kilka badań udokumentowało, w jaki sposób ekspozycja na sole żółciowe, czasami w połączeniu z innymi sygnałami jelita cienkiego, takimi jak glukoza, wpływa na przeżycie Shigella i regulację zjadliwości przed zakażeniem. Wykazano, że Shigella jest odporna na sole żółciowe, zmienia ekspresję genów oraz tworzy i rozprasza biofilm w warunkach, które odtwarzają pasaż jelita cienkiego17,69. Badania wykazały, że zmiany te skutkują hiperwirulentnym fenotypem, w którym przyleganie i inwazja są indukowane po późniejszym zakażeniu okrężnicy przez Shigella 17,18,19,48,66. Tak więc warunki opisane powyżej dokumentują, w jaki sposób subkulturować Shigella w solach żółciowych, aby naśladować pasaż jelita cienkiego przed wykonaniem testów adherencji, inwazji lub replikacji wewnątrzkomórkowej. Podany preparat TSB zawiera dodatek glukozy w stosunku do typowego bulionu Luria (LB)17. Tak więc, jeśli stosuje się LB, ważne jest, aby uzupełnić pożywkę glukozą (0,5%-2,0% [w/v]), aby odpowiednio uwzględnić sygnały glukozy w jelicie cienkim17. Ponadto, jak wspomniano powyżej, wszystkie subkultury Shigella są myte w celu usunięcia soli żółciowych i naśladowania przejścia do okrężnicy w celu analizy infekcji.

Tradycyjnie, jak podkreślono w powyższych wynikach (Ryc. 1 i Ryc. 2), testy infekcji są cenne dla określenia roli określonego genu w zakażeniu Shigella . Fenotyp różnych mutantów może jednak nie być w pełni doceniony bez odpowiedniej suplementacji pożywek bakteryjnych. Jak wykazały wcześniejsze badania, sole żółciowe znacząco zmieniają ekspresję genu S. flexneri , w tym geny odpowiedzialne za centralny metabolizm, czynniki transkrypcyjne, transportery cukru, oporność na leki i geny wirulencji kodowane na chromosomie lub plazmidziewirulencji 17. Geny te dają wgląd w to, w jaki sposób Shigella wykorzystuje sole żółciowe jako sygnał do zmiany ekspresji genów i przygotowania się do ewentualnej infekcji okrężnicy, a zatem kolejne analizy mutacji muszą być wykonywane w odpowiednich uzupełnionych pożywkach bakteryjnych przed zbadaniem wpływu na zjadliwość w testach adherencji, inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej. Jak widać powyżej na rycinie 1 i rycinie 2, mutacja ΔVF nie wpłynęła na przyleganie, ale wpłynęła na inwazję i replikację wewnątrzkomórkową. Ponieważ mutacja wzmocniła inwazję i replikację wewnątrzkomórkową, obecnie trwają eksperymenty mające na celu określenie, w jaki sposób produkt genu reguluje infekcję. Analizy mutantów służą jako przykład tego, w jaki sposób można badać nowe informacje na temat patogenezy Shigella , zwłaszcza w warunkach, które lepiej odwzorowują ludzki przewód pokarmowy. Zaleca się odpowiednie analizy komplementacji w celu walidacji fenotypów różnych mutantów.

W połączeniu, procedury te opisują eksperymenty ilościowe, które dostarczą ważnych informacji na temat mechanizmów molekularnych przylegania, inwazji i replikacji Shigella do komórek nabłonka okrężnicy HT-29 poprzez najlepsze naśladowanie naturalnego środowiska ludzkiego przewodu pokarmowego podczas infekcji. Przyszłe badania mogą poszerzyć zakres badań nad mutantami i warunkami eksperymentalnymi, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób Shigella przygotowuje się do zakażenia ludzkiego gospodarza i skutecznie go zakaża. Pomimo dziesięcioleci badań, wciąż jest o wiele więcej do odkrycia na temat infekcji Shigella.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wsparcie dla autorów obejmuje Departament Pediatrii Massachusetts General Hospital, nagrodę Komitetu Wykonawczego ds. Tymczasowego Wsparcia Badań (ISF) 2022A009041, grant Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych R21AI146405, oraz grant National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Nutrition Obesity Research Center at Harvard (NORCH) 2P30DK040561-26. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &m; m Filtr PESMillipore-SigmaSCGP00525Sterylny, polieterosulfonowy filtr do sterylizacji pożywek do 50 ml
Probówki hodowlane 14 mlCorning352059Probówki polipropylenowe 17 mm x 100 mm z nakrętką
Probówki stożkowe 50 mlCorning43082950 ml przezroczyste polipropylenowe stożkowe probówki wirówkowe z szczelną nasadką
6-dołkowe płytki do hodowli tkankowychCorning3516Płytki są poddawane obróbce w celu optymalnego przylegania komórek
Sole żółcioweSigma-AldrichB8756Stosunek 1:1 cholanu do deoksycholanu
Czerwony barwnik KongoSigma-AldrichC6277Anionowy barwnik diazowy na bazie benzydyny, czystość >85%
Szkiełko komory do liczenia komórek CountessInvitrogenC10283Do stosowania z automatycznym licznikiem komórek Countess
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD8418A wysoce polarny odczynnik organiczny
Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM)Gibco10569-010DMEM jest uzupełnione o wysoką zawartość glukozy, pirogronian sodu, GlutaMAX i fenol Czerwona
płodowa surowica bydlęca (FBS)Sigma-AldrichF4135Inaktywowana termicznie, sterylna
gentamycynaSigma-AldrichG3632Stężenie zapasowe wynosi 50 mg / ml
Linia komórkowa HT-29ATCCHTB-38Linia komórkowa gruczolakoraka; jelita grubego w pochodzenie
Folia parafinowaBemisPM999Laboratoryjna folia uszczelniająca
szalki PetriegoThermo Fisher ScientificFB0875713100 mm x 15 mm Szalki Petriego do mediów stałych
Sola buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher Scientific100100491x stężenie; pH 7,4
Wybierz agarInvitrogen30391023Mieszanina polisacharydów ekstrahowana ze ścian komórkowych czerwonych wodorostów w celu wytworzenia pożywki do powlekania bakteryjnego
Kolby T75Corning430641UKolby do hodowli tkankowych
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Powszechny niejonowy środek powierzchniowo czynny i emulgator 
Barwienie błękitem trypanowymInvitrogenT10282Barwnik do wykrywania martwych komórek hodowli tkankowych; tylko żywe komórki mogą wykluczyć barwnik
Trypsyna-EDTAGibco25200-056Odczynnik do dysocjacji komórek do utrzymania i pasażowania linii komórkowych
Tryptyczny bulion sojowy (TSB)Sigma-AldrichT8907Pożywka do wzrostu bakterii

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Karambizi, N. U., McMahan, C. S., Blue, C. N., Temesvari, L. A. Global estimated Disability-Adjusted Life-Years (DALYs) of diarrheal diseases: A systematic analysis of data from 28 years of the global burden of disease study. PloS one. 16 (10), e0259077(2021).
  2. WHO. WHO methods and data sources for country-level causes of death 2000-2016. World Health Organization. , Geneva. (2018).
  3. Kotloff, K. L. Shigella infection in children and adults: a formidable foe. Lancet Glob Health. 5 (12), e1166-e1167 (2017).
  4. Kotloff, K. L., et al. Burden and aetiology of diarrhoeal disease in infants and young children in developing countries (the Global Enteric Multicenter Study, GEMS): A prospective, case-control study. Lancet. 382 (9888), 209-222 (2013).
  5. Schroeder, G. N., Hilbi, H. Molecular pathogenesis of Shigella spp.: Controlling host cell signaling, invasion, and death by type III secretion. Clin Microbiol Rev. 21 (1), 134-156 (2008).
  6. Arvelo, W., et al. Transmission risk factors and treatment of pediatric shigellosis during a large daycare center-associated outbreak of multidrug resistant shigella sonnei: Implications for the management of shigellosis outbreaks among children. Pediatr Infect Dis J. 28 (11), 976-980 (2009).
  7. Kozyreva, V. K., et al. Recent outbreaks of Shigellosis in California caused by two distinct populations of Shigella sonnei with either increased virulence or fluoroquinolone resistance. mSphere. 1 (6), 1-18 (2016).
  8. Bowen, A., et al. Importation and domestic transmission of Shigella sonnei resistant to ciprofloxacin - United States, May 2014-February 2015. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 64 (12), 318-320 (2015).
  9. Tansarli, G. S., et al. Genomic reconstruction and directed interventions in a multidrug-resistant Shigellosis outbreak in Seattle, WA, USA: a genomic surveillance study. Lancet. 3099 (22), 1-11 (2023).
  10. Barry, E. M., et al. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
  11. Increase in Extensively Drug-Resistant Shigellosis in the United States. CDC Health Alert Network. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://emergency.cdc.gov/han/2023/han00486.asp?ACSTrackingID=USCDC_511-DM100260&ACSTrackingLabel=HAN%20486%20-%20General%20Public&deliveryName=USCDC_511-DM100260 (2023).
  12. Shiferaw, B., et al. Antimicrobial susceptibility patterns of Shigella isolates in Foodborne Diseases Active Surveillance Network (FoodNet) sites, 2000-2010. Clin Infect Dis. 54, S458-S463 (2012).
  13. Centers for Disease Control and Prevention. COVID-19: U.S. Impact on Antimicrobial Resistance, Special Report 2022. Atlanta, GA: U.S. Department of Health and Human Services. CDC. , (2022).
  14. Centers for Disease Control and Prevention. Antibiotic resistance threats in the United States, 2019. CDC. 10 (1), Atlanta, Georgia. (2019).
  15. WHO. Prioritization of pathogens to guide discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. WHO. , Geneva. (2017).
  16. DuPont, H. L., Levine, M. M., Hornick, R. B., Formal, S. B. Inoculum size in shigellosis and implications for expected mode of transmission. J Infect Dis. 159 (6), 1126-1128 (1989).
  17. Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), 1-18 (2017).
  18. Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
  19. Chanin, R. B., et al. Shigella flexneri adherence factor expression in in vivo-like conditions. mSphere. 4 (6), e00751(2019).
  20. Baranov, V., Hammarström, S. Carcinoembryonic antigen (CEA) and CEA-related cell adhesion molecule 1 (CEACAM1), apically expressed on human colonic M cells, are potential receptors for microbial adhesion. Histochem Cell Biol. 121 (2), 83-89 (2004).
  21. Wassef, J. S., Keren, D. F., Mailloux, J. L. Role of M cells in initial antigen uptake and in ulcer formation in the rabbit intestinal loop model of shigellosis. Infect Immun. 57 (3), 858-863 (1989).
  22. Sansonetti, P. J., Arondel, J., Cantey, J. R., Prévost, M. C., Huerre, M. Infection of rabbit Peyer's patches by Shigella flexneri: Effect of adhesive or invasive bacterial phenotypes on follicle-associated epithelium. Infect Immun. 64 (7), 2752-2764 (1996).
  23. Sansonetti, P. J., et al. Caspase-1 activation of IL-1beta and IL-18 are essential for Shigella flexneri-induced inflammation. Immunity. 12 (5), 581-590 (2000).
  24. Zychlinsky, A., Fitting, C., Cavaillon, J. M., Sansonetti, P. J. Interleukin 1 is released by murine macrophages during apoptosis induced by Shigella flexneri. J Clin Invest. 94 (3), 1328-1332 (1994).
  25. Sansonetti, P. J., Ryter, A., Clerc, P., Maurelli, A. T., Mounier, J. Multiplication of Shigella flexneri within HeLa cells: lysis of the phagocytic vacuole and plasmid-mediated contact hemolysis. Infect Immun. 51 (2), 461-469 (1986).
  26. Maldonado-Contreras, A., et al. Shigella depends on SepA to destabilize the intestinal epithelial integrity via cofilin activation. Gut Microbes. 8 (6), 544-560 (2017).
  27. Collard, J. -M., et al. High prevalence of small intestine bacteria overgrowth and asymptomatic carriage of enteric pathogens in stunted children in Antananarivo, Madagascar. PLoS Negl Trop Dis. 16 (5), e0009849(2022).
  28. Mattock, E., Blocker, A. J. How do the virulence factors of shigella work together to cause disease. Front Cell Infect Microbiol. 7, 1-24 (2017).
  29. Mostowy, S., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy. PLoS Pathog. 9 (9), e1003588(2013).
  30. Martinez-Becerra, F. J., et al. Parenteral immunization with IpaB/IpaD protects mice against lethal pulmonary infection by Shigella. Vaccine. 31 (24), 2667-2672 (2013).
  31. Shim, D. -H., et al. New animal model of shigellosis in the Guinea pig: its usefulness for protective efficacy studies. J Immunol. 178 (4), Baltimore, Md. 2476-2482 (2007).
  32. Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465 (7296), 355-358 (2010).
  33. West, N. P., et al. Optimization of virulence functions through glucosylation of Shigella LPS. Science. 307 (5713), 1313-1317 (2005).
  34. Maurelli, A. T., et al. Shigella infection as observed in the experimentally inoculated domestic pig, Sus scrofa domestica. Microbial Pathog. 25 (4), 189-196 (1998).
  35. Jeong, K. -I., Zhang, Q., Nunnari, J., Tzipori, S. A piglet model of acute gastroenteritis induced by Shigella dysenteriae Type 1. J Infect Dis. 201 (6), 903-911 (2010).
  36. Kim, Y. -J., Yeo, S. -G., Park, J. -H., Ko, H. -J. Shigella vaccine development: prospective animal models and current status. Curr Pharm Biotechnol. 14 (10), 903-912 (2013).
  37. Kent, T. H., Formal, S. B., LaBrec, E. H., Sprinz, H., Maenza, R. M. Gastric shigellosis in rhesus monkeys. Am J Pathol. 51 (2), 259-267 (1967).
  38. Shipley, S. T., et al. A challenge model for Shigella dysenteriae 1 in cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis). Comp Med. 60 (1), 54-61 (2010).
  39. Higgins, R., Sauvageau, R., Bonin, P. Shigella flexneri Type 2 Infection in captive nonhuman primates. Can Vet J. 26 (12), 402-403 (1985).
  40. Oaks, E. V., Hale, T. L., Formal, S. B. Serum immune response to Shigella protein antigens in rhesus monkeys and humans infected with Shigella spp. Infect Immun. 53 (1), 57-63 (1986).
  41. Formal, S. B., et al. Protection of monkeys against experimental shigellosis with a living attenuated oral polyvalent dysentery vaccine. J Bacteriol. 92 (1), 17-22 (1966).
  42. Levine, M. M., Kotloff, K. L., Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Clinical trials of Shigella vaccines: two steps forward and one step back on a long, hard road. Nat Rev Microbiol. 5 (7), 540-553 (2007).
  43. Payne, S. M. Laboratory cultivation and storage of Shigella. Curr Protoc Microbiol. 55 (1), 93(2019).
  44. NIH Guidelines. NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules. NIH Guidelines. 2, 142(2019).
  45. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
  46. HT-29 cell line product sheet. ATCC. , Available from: https://www.atcc.org/products/htb-38 1-6 (2023).
  47. Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), 819-836 (2016).
  48. Stensrud, K. F., et al. Deoxycholate interacts with IpaD of Shigella flexneri in inducing the recruitment of IpaB to the type III secretion apparatus needle tip. J Biol Chem. 283 (27), 18646-18654 (2008).
  49. Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. J Clin Invest. 52 (7), 1673-1679 (1973).
  50. Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymo. 236 (1979), 405-420 (1994).
  51. Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62 (8), 3463-3471 (1994).
  52. Dorman, C. J., McKenna, S., Beloin, C. Regulation of virulence gene expression in Shigella flexneri, a facultative intracellular pathogen. Int J Med Microbiol. 291 (2), 89-96 (2001).
  53. Porter, M. E., Dorman, C. J. Positive regulation of Shigella flexneri virulence genes by integration host factor. J Bacteriol. 179 (21), 6537-6550 (1997).
  54. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Temperature-dependent expression of virulence genes in Shigella species. Infect Immun. 43 (1), 195-201 (1984).
  55. Schuch, R., Maurelli, A. T. Virulence plasmid instability in Shigella flexneri 2a is induced by virulence gene expression. Infect Immun. 65 (9), 3686-3692 (1997).
  56. Formal, S. B., Hale, T. L., Sansonetti, P. J. Invasive enteric pathogens. Rev Infect Dis. 5, S702-S707 (1983).
  57. Pál, T., Hale, T. L. Plasmid-associated adherence of Shigella flexneri in a HeLa cell model. Infect Immun. 57 (8), 2580-2582 (1989).
  58. Noben, M., et al. Human intestinal epithelium in a dish: Current models for research into gastrointestinal pathophysiology. United European Gastroenterol J. 5 (8), 1073-1081 (2017).
  59. Liévin-Le Moal, V., Servin, A. L. Pathogenesis of human enterovirulent bacteria: lessons from cultured, fully differentiated human colon cancer cell lines. Microbiol Mol Biol Rev R. 77 (3), 380-439 (2013).
  60. Mitchell, D. M., Ball, J. M. Characterization of a spontaneously polarizing HT-29 cell line, HT-29/cl.f8. In Vitro Cell Dev Biol - Anim. 40 (10), 297-302 (2004).
  61. Gagnon, M., Zihler Berner, A., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion. J Microbiol Methods. 94 (3), 274-279 (2013).
  62. Koestler, B. J., et al. Human intestinal enteroids as a model system of Shigella pathogenesis. Infect Immun. 87 (4), 00733(2019).
  63. Ranganathan, S., et al. Evaluating Shigella flexneri pathogenesis in the human enteroid model. Infect Immun. 87 (4), (2019).
  64. Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiol Spectr. 9 (1), 1-17 (2021).
  65. Perlman, M., Senger, S., Verma, S., Carey, J., Faherty, C. S. A foundational approach to culture and analyze malnourished organoids. Gut Microbes. 15 (2), 2248713(2023).
  66. Pope, L. M., Reed, K. E., Payne, S. M. Increased protein secretion and adherence to HeLa cells by Shigella spp. following growth in the presence of bile salts. Infect Immun. 63 (9), 3642-3648 (1995).
  67. Faherty, C. S., et al. The synthesis of OspD3 (ShET2) in Shigella flexneri is independent of OspC1. Gut Microbes. 7 (6), 486-502 (2016).
  68. Ridlon, J. M., Kang, D. -J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
  69. Köseoğlu, V. K., Hall, C. P., Rodríguez-López, E. M., Agaisse, H. The Autotransporter IcsA promotes Shigella flexneri biofilm formation in the presence of bile salts. Infect Immun. 87 (7), 1-14 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zaka enie Shigellaadhezja bakteryjnareplikacja wewn trzkom rkowatest inwazjikom rki nab onka jelita grubegoochrona gentamycynagar z czerwieni Kongarozcie czenia seryjnehodowla tkankowa

Powiązane artykuły