Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analizy zakażeń komórek nabłonkowych preparatem Shigella

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66426

⸱

9 lutego 2024

 ,  , 
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje testy infekcji do badania przestrzegania Shigella, inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej przy użyciu linii komórkowych nabłonka in vitro.

Streszczenie

Przystosowany do człowieka patogen bakteryjny jelitowy Shigella powoduje miliony infekcji każdego roku, powoduje długoterminowe efekty wzrostu wśród pacjentów pediatrycznych i jest główną przyczyną zgonów z powodu biegunki na całym świecie. Zakażenie wywołuje wodnistą lub krwawą biegunkę w wyniku przejścia patogenu przez przewód pokarmowy i zakażenia komórek nabłonka wyściełających okrężnicę. Przy oszałamiającym wzroście oporności na antybiotyki i obecnym braku zatwierdzonych szczepionek, ustandaryzowane protokoły badawcze mają kluczowe znaczenie dla badania tego groźnego patogenu. W tym miejscu przedstawiono metodologie badania molekularnej patogenezy Shigella przy użyciu analiz in vitro przylegania, inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej bakterii w komórkach nabłonka okrężnicy. Przed analizą infekcji fenotyp zjadliwości kolonii Shigella został zweryfikowany poprzez wychwyt czerwonego barwnika Kongo na płytkach agarowych. Uzupełnione pożywki laboratoryjne mogą być również brane pod uwagę podczas hodowli bakteryjnej w celu naśladowania warunków in vivo. Komórki bakteryjne są następnie wykorzystywane w znormalizowanym protokole do infekowania komórek nabłonka okrężnicy na płytkach do hodowli tkankowych przy ustalonej wielokrotności infekcji z adaptacjami do analizy każdego etapu infekcji. W celu przeprowadzenia testów adhezyjnych komórki Shigella są inkubowane ze zmniejszonymi poziomami pożywki, aby ułatwić kontakt bakterii z komórkami nabłonka. Zarówno w testach inwazji, jak i replikacji wewnątrzkomórkowej gentamycyna jest stosowana w różnych odstępach czasu w celu wyeliminowania bakterii zewnątrzkomórkowych i umożliwienia oceny inwazji i/lub ilościowego określenia szybkości replikacji wewnątrzkomórkowej. Wszystkie protokoły infekcji wyliczają bakterie przylegające, zaatakowane i/lub wewnątrzkomórkowe poprzez seryjne rozcieńczanie zakażonych lizatów komórek nabłonka i posiewanie jednostek tworzących kolonie bakteryjne w stosunku do mian infekcji na czerwonych płytkach agarowych Kongo. Łącznie protokoły te umożliwiają niezależną charakterystykę i porównania komórek nabłonkowych dla każdego etapu infekcji Shigella w celu pomyślnego zbadania tego patogenu.

Wprowadzenie

Choroby biegunkowe wywołane przez patogeny bakteryjne jelit stanowią znaczące globalne obciążenie zdrowotne. W 2016 roku choroby biegunkowe były odpowiedzialne za 1,3 miliona zgonów na całym świecie i były czwartą najczęstszą przyczyną zgonów dzieci poniżej piątego roku życia1,2. Gram-ujemny, jelitowy patogen bakteryjny Shigella jest czynnikiem wywołującym shigellozę, główną przyczynę zgonów z powodu biegunki na całym świecie3. Shigeloza powoduje co roku znaczną zachorowalność i śmiertelność u dzieci z krajów o niższych i średnich dochodach4,5, podczas gdy infekcje w krajach o wysokich dochodach są związane z epidemiami w ośrodkach opieki dziennej, przenoszonych przez żywność i wodę6,7,8,9. Nieskuteczne opracowanie szczepionki10 i rosnące wskaźniki oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR)11,12 skomplikowały zarządzanie epidemiami Shigella na dużą skalę. Ostatnie dane Centers for Disease Control and Prevention pokazują, że prawie 46% zakażeń Shigella w Stanach Zjednoczonych wykazywało oporność na leki w 2020 roku13,14, podczas gdy Światowa Organizacja Zdrowia uznała Shigella za priorytetowy patogen AMR, dla którego pilnie potrzebne są nowe terapie15.

Infekcje Shigella są łatwo przenoszone drogą fekalno-oralną po spożyciu skażonego jedzenia lub wody, lub poprzez bezpośredni kontakt z człowiekiem. Shigella wyewoluowała, aby stać się skutecznym, przystosowanym do człowieka patogenem, z zakaźną dawką 10-100 bakterii wystarczającą do wywołania choroby16. Podczas pasażu jelita cienkiego Shigella jest narażona na sygnały środowiskowe, takie jak podwyższona temperatura i żółć17. Wykrycie tych sygnałów indukuje zmiany transkrypcyjne w celu ekspresji czynników wirulencji, które zwiększają zdolność bakterii do infekowania ludzkiego jelita grubego17,18,19. Shigella nie atakuje nabłonka okrężnicy z powierzchni wierzchołkowej, ale raczej przechodzi przez warstwę nabłonka po wychwycie do wyspecjalizowanych komórek mikrofałdowych prezentujących antygen (komórki M) w nabłonku związanym z pęcherzykami włosowymi20,21,22. Po transcytozie komórki Shigella są fagocytozowane przez rezydujące makrofagi. Shigella szybko ucieka z fagosomu i wywołuje śmierć komórek makrofagów, co powoduje uwolnienie cytokin prozapalnych5,23,24. Shigella następnie atakuje komórki nabłonka okrężnicy od strony podstawno-bocznej, lizuje wakuolę makropinocytarną i ustanawia niszę replikacyjną w cytoplazmie5,25. Cytokiny prozapalne, zwłaszcza interleukina-8 (IL-8), rekrutują polimorfojądrzaste leukocyty neutrofilowe (PMN) do miejsca zakażenia, co osłabia ścisłe połączenia nabłonkowe i umożliwia infiltrację bakteryjną wyściółki nabłonka w celu zaostrzenia infekcji podstawno-bocznej5. PMN niszczą zainfekowaną wyściółkę nabłonka, aby powstrzymać infekcję, co skutkuje charakterystycznymi objawami czerwonki bakteryjnej (krwawej) 5. Chociaż mechanizmy inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej zostały dokładnie scharakteryzowane, nowe badania pokazują ważne nowe koncepcje infekcji Shigella, w tym regulację wirulencji podczas pasażu żołądkowo-jelitowego (GI)17, adherence19, lepszy dostęp podstawno-boczny dzięki przepuszczalności bariery26 oraz bezobjawowe nosicielstwo u niedożywionych dzieci27.

Zdolność Shigella spp. do wywoływania choroby biegunkowej jest ograniczona do ludzi i naczelnych (NHP)28. Modele infekcji jelitowych Shigella zostały opracowane dla danio pręgowanego29, mice30, świnki morskie31, rabbits21,32,33 i pigs34,35. Jednak żaden z tych systemów modelowych nie jest w stanie dokładnie odtworzyć cech choroby obserwowanych podczas infekcji u ludzi36. Chociaż modele NHP shigellozy zostały stworzone w celu badania patogenezy Shigella, te systemy modelowe są kosztowne do wdrożenia i wymagają sztucznie wysokich dawek zakaźnych, do dziewięciu rzędów wielkości wyższych niż dawka zakaźna u ludzi37,38,39,40,41,42. Tak więc niezwykła adaptacja Shigelli do infekcji ludzkich gospodarzy wymaga użycia kultur komórkowych pochodzących od ludzi w celu odtworzenia fizjologicznie istotnych modeli do dokładnego badania patogenezy Shigella.

Tutaj opisane są szczegółowe procedury mierzące tempo przylegania, inwazji i replikacji Shigella w komórkach nabłonka okrężnicy HT-29. Korzystając z tych ustandaryzowanych protokołów, można zbadać mechanizmy molekularne, za pomocą których geny wirulencji bakteryjnej i sygnały środowiskowe wpływają na każdy etap infekcji Shigella, aby lepiej zrozumieć dynamiczną zależność interakcji gospodarz-patogen.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników i materiałów

UWAGA: Wszystkie objętości są dostosowane do analizy z wykorzystaniem dwóch płytek 6-dołkowych.

  1. Pożywka TSB: Do 15 g pożywki Tryptic Soy Broth (TSB, patrz Tabela materiałów) dodać 0,5 L wody dejonizowanej (DI) i autoklawować. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  2. Pożywka z solami żółciowymi (TSB + BS): Aby przygotować TSB zawierający 0,4% (w/v) soli żółciowych, resuspendować 0,06 g soli żółciowych (BS, patrz Tabela materiałów) w 15 mL autoklawowanego TSB. Sterylizować poprzez filtrację przy użyciu filtra PES 0,22 µm.
    UWAGA: Sole żółciowe składają się z mieszaniny cholanu sodu i deoksycholanu sodu w stosunku 1:1. Świeże pożywki należy przygotowywać bezpośrednio przed użyciem.
  3. DMEM + 10% (v/v) FBS: Do 45 mL pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) dodać 5 mL płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. DMEM + gentamycyna: Do probówki 50 mL dodać 50 mL DMEM oraz 50 µL gentamycyny w stężeniu 50 mg/mL (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Przed każdym eksperymentem należy przygotować świeżą porcję i ogrzać ją w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
  5. PBS + 1% (v/v) Triton X-100: Do 15 mL soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) dodać 150 µL Triton X-100.
    UWAGA: Przed każdym eksperymentem należy przygotować świeżą porcję i ogrzać ją w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
  6. Płytki TSB z wskaźnikiem Congo red: Do butelki o pojemności 1 L dodać 15 g TSB, 7,5 g agaru selektywnego oraz 0,125 g barwnika Congo red (patrz Tabela materiałów). Dodać 0,5 L wody DI i autoklawować. Wlać 10-20 mL pożywki do poszczególnych sterylnych szalek Petriego (100 mm x 15 mm) i pozostawić do stężenia.
    OSTROŻNIE: Congo red jest substancją rakotwórczą i toksyczną dla rozrodu. Należy upewnić się, że praca z Congo red odbywa się przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej. Dodatkowe informacje znajdują się w karcie charakterystyki produktu.
    UWAGA: Z 0,5 L pożywki z Congo red przygotowuje się około 20 płytek. Płytki można przygotować z 2-3 dniowym wyprzedzeniem i przechowywać odwróconymi w temperaturze pokojowej do momentu użycia. W celu długoterminowego przechowywania odwrócone płytki należy umieścić w plastikowych etui w temperaturze 4 °C na okres do 3 miesięcy.
  7. DMEM + 10% (v/v) FBS i 5% (v/v) dimetylosulfotlenek (DMSO): Do probówki 50 mL dodać 42,5 mL DMEM, 5 mL FBS oraz 2,5 mL DMSO. Przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Przygotowanie bakterii

UWAGA: Wszystkie protokoły hodowli laboratoryjnej i przechowywania Shigella zostały zaadaptowane z pracy Payne, S. M.43.

UWAGA: Shigella spp. są patogenami z grupy ryzyka 244. Wszystkie prace laboratoryjne należy przeprowadzać w środowisku BSL-2, stosując dodatkowe środki bezpieczeństwa w celu ograniczenia przypadkowej ekspozycji ze względu na niską dawkę zakaźną Shigella spp.

  1. Hodowla Shigella z mrożonych zapasów
    1. Przenieś niewielką ilość zamrożonej kultury z fiolki kriogenicznej na płytkę z agarem TSB + czerwień Kongo za pomocą sterylnego aplikatora.
    2. Wypal pętlę do posiewu i poczekaj, aż ostygnie. Wykonaj posiew inoculum zygzakowate w jednym kwadrancie płytki. Ponownie wypal pętlę, poczekaj, aż ostygnie, a następnie przenieś posiew z pierwszego kwadrantu do drugiego kwadrantu płytki. Powtórz tę czynność, aby zaszczepić inoculum w trzecim i czwartym kwadrancie płytki.
      UWAGA: Alternatywnie posiew inoculum można wykonać, używając nowego sterylnego aplikatora pomiędzy każdym kwadrantem.
    3. Odwróć płytkę i inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc.
      UWAGA: Inkubacja w temperaturach ≥37 °C jest niezbędna do ekspresji czynników wirulencji Shigella koniecznych do obserwacji fenotypu dodatniego z czerwienią Kongo (CR+)45. Kolonie awirulentne będą miały biały kolor i nie będą inwazyjne.
    4. Zabezpiecz płytkę folią parafinową i przechowuj w lodówce w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Kolonie bakteryjne pozostaną żywe na płytkach z agarem przez 1-2 tygodnie.
  2. Nocna hodowla Shigella w kulturze płynnej
    1. Odmierz 3 mL pożywki TSB do sterylnych probówek hodowlanych o pojemności 14 mL.
    2. Wyizoluj pojedynczą, dobrze odseparowaną czerwoną (CR+) kolonię za pomocą sterylnego aplikatora i resuspenduj w pożywce płynnej.
    3. Inkubuj kultury przez noc (16-18 h) w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 250 obrotów na minutę (rpm).

3. Przygotowanie eukariotycznych komórek HT-29

UWAGA: Wszystkie objętości są dostosowane do analizy z wykorzystaniem dwóch płytek 6-dołkowych. Linie komórkowe HT-29 zostały pozyskane z American Type Culture Collection (ATCC). Protokoły hodowli komórek HT-29 zostały opracowane na podstawie zaleceń ATCC46. Wszystkie pożywki należy uprzednio podgrzać w łaźni wodnej do 37 °C przed użyciem. Wszystkie procedury dotyczące hodowli HT-29 należy przeprowadzać w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Podczas mieszania lub pracy z komórkami HT-29 w pożywkach należy unikać tworzenia pęcherzyków powietrza, aby zapobiec gwałtownym zmianom pH.

  1. Rozmrażanie komórek HT-29 z zamrożonego banku
    1. Rozmroź fiolkę z komórkami HT-29 w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Upewnij się, że zakrętka znajduje się całkowicie ponad powierzchnią wody, aby uniknąć kontaminacji. Rozmrażanie powinno trwać krócej niż 2 min.
    2. Wyjmij fiolkę z wody natychmiast po całkowitym rozmrożeniu hodowli i zdezynfekuj ją 70% etanolem. Upewnij się, że wszystkie kolejne kroki są wykonywane z zachowaniem zasad aseptyki.
    3. Przenieś całą zawartość fiolki do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL zawierającej 9 mL DMEM + 10% FBS. Wirować przy 125 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    4. Odlej nadsącz do pojemnika na odpady i resuspenduj osad w 10 mL ogrzanego DMEM + 10% FBS. Przenieś resuspendowane komórki do butelki do hodowli tkankowej o powierzchni 75 cm2 (T75) zawierającej 10 mL ogrzanego DMEM + 10% FBS (objętość całkowita 20 mL).
    5. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 aż do osiągnięcia przez nie 90% konfluencji (około 6-7 dni).
      UWAGA: Konfluencję ocenia się na podstawie przybliżonej analizy wizualnej.
  2. Wysiewanie komórek HT-29
    1. Podgrzej 20 mL PBS oraz 50 mL DMEM + 10% FBS w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, a 3 mL 0,25% (w/v) Trypsyny-EDTA doprowadź do temperatury pokojowej.
    2. Gdy komórki HT-29 (z kroku 3.1) osiągną 90% konfluencji, odlej pożywkę z hodowli komórek HT-29 z butelki T75 do pojemnika na odpady. Wlej do butelki ~10 mL ogrzanego PBS i delikatnie zamieszaj w celu przemycia. Odlej PBS do pojemnika na odpady. Przemyj ponownie ogrzanym PBS i odlej.
    3. Dodaj 2-3 mL 0,25% (w/v) Trypsyny-EDTA i delikatnie wymieszaj na całej powierzchni. Inkubuj w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez 4 min.
    4. Wyjmij butelkę z inkubatora i delikatnie zamieszaj Trypsynę-EDTA, upewniając się wizualnie, że wszystkie komórki oddzieliły się od powierzchni.
    5. Natychmiast dodaj 6 mL ogrzanego DMEM + 10% FBS, aby dezaktywować trypsynę. Pipetuj w górę i w dół, aby dokładnie wymieszać.
    6. Przenieś całą zawartość do probówki wirówkowej 15 mL i wiruj przy 500 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    7. Delikatnie odlej nadsącz do pojemnika na odpady i resuspenduj osad w 6 mL ogrzanego DMEM + 10% FBS.
    8. Bezpośrednio po resuspensji przenieś 10 µL zawiesiny komórek HT-29 z części środkowej hodowli do probówki PCR 0,2 mL. Dodaj do probówki PCR 10 µL barwnika Trypan blue i wymieszaj.
    9. Dodaj 10 µL mieszaniny komórek HT-29 z Trypan blue na jednorazową szkiełko do licznika komórek Countess (patrz Tabela materiałów). Policz liczbę żywych komórek i oblicz żywotność komórek.
      UWAGA: Dokumentując liczbę komórek w próbce, odczytaj wartość z pola „live” (żywe), a nie całkowitą liczbę komórek. Alternatywnie, zliczanie komórek można przeprowadzić ręcznie za pomocą hemocytometru.
    10. Wysiej resuspendowane komórki HT-29 do nowej butelki T75 lub płytki 6-dołkowej.
      1. Dla butelki T75:
        1. Wymieszaj delikatnie pipetą, a następnie przenieś 2,5 x 106 komórek do nowej butelki T75 zgodnie z poniższym równaniem:
          Wzór na obliczenie stężenia komórek, \( \frac{2,5 \times 10^6 \text{ komórek}}{\text{stężenie żywych komórek (kom/mL)}} = \text{mL komórek} \).
        2. Dodaj ogrzaną pożywkę DMEM + 10% FBS do uzyskania objętości końcowej 20 mL (stężenie końcowe 1,25 x 105 komórek/mL).
        3. Rozprowadź komórki równomiernie w butelce, delikatnie kołysząc nią w przód i w tył.
        4. Inkubuj w 37 °C przy 5% CO2 do czasu, aż komórki osiągną 80% konfluencji.
          UWAGA: Dla optymalnego wzrostu wymieniaj pożywkę DMEM + 10% FBS w butelce T75 mniej więcej co 3 dni. Odlej pożywkę do pojemnika na odpady i dodaj do butelki 10 mL ogrzanego PBS. Delikatnie zamieszaj PBS i odlej go do pojemnika na odpady. Następnie dodaj do butelki 20 mL świeżego, ogrzanego DMEM + 10% FBS i umieść w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).
      2. Dla płytki 6-dołkowej:
        1. Wymieszaj delikatnie pipetą, a następnie przenieś 5,85 x 106 komórek do nowej probówki stożkowej 50 mL zgodnie z poniższym równaniem:
          Wzór na stężenie żywych komórek, równanie 5,85x10^6 komórek, stosowane w obliczeniach biologii komórki.
        2. Dodaj ogrzaną pożywkę DMEM + 10% FBS do uzyskania objętości końcowej 26 mL (stężenie końcowe 2,25 x 105 komórek/mL).
        3. Wymieszaj delikatnie pipetą, a następnie rozlej po 2 mL (4,5 x 105 komórek) do poszczególnych dołków płytek 6-dołkowych.
        4. Rozprowadź komórki równomiernie w dołku, delikatnie kołysząc płytką w górę/dół i lewo/prawo 2-3 razy.
        5. Inkubuj w 37 °C przy 5% CO2 do czasu, aż komórki osiągną konfluencję 80%-95% (około 3-4 dni).
          UWAGA: Do testów inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej zaleca się konfluencję 85%, natomiast do testów adhezji zaleca się konfluencję 90%-95%. Komórki powinny osiągnąć ok. 85% konfluencji po 48 h inkubacji przy stężeniu końcowym około 1 x 106 komórek/dołek. Może być wymagana korekta liczby wysiewanych komórek oraz czasu inkubacji.
  3. Przygotowanie zamrożonych zapasów HT-29
    1. Rozdziel po 1 mL pożywki DMEM + 10% FBS + 5% DMSO do pojedynczych fiolek kriogenicznych.
    2. Dodaj 1 x 106 komórek HT-29 z kroku 3.2.7 do każdej fiolki. Oblicz objętość komórek zgodnie z poniższym wzorem:
      Wzór na stężenie żywych komórek; równanie do obliczania mL komórek na podstawie stężenia komórek.
    3. Przechowuj komórki HT-29 długoterminowo w temperaturze poniżej -130 °C w zamrażarce do przechowywania w oparach ciekłego azotu.

4. Test adhezji

UWAGA: Wszystkie objętości są dostosowane do analizy z wykorzystaniem dwóch płytek 6-dołkowych.

  1. Przeszczepienie na noc Shigella hodowle poprzez rozcieńczenie 1:50 w świeżej pożywce.
    1. Wymieszać w wirówce vortex, a następnie dodać 100 µL każdej kultury nocnej do 5 ml świeżej pożywki TSB lub TSB + BS w probówce o odpowiedniej pojemności.
      UWAGA: Ogranicz objętość hodowli do <20% objętości kolby lub probówki hodowlanej, aby zapewnić właściwe napowietrzanie.
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C z wstrząsaniem przy 250 obr./min, aż komórki osiągną gęstość optyczną (OD600) wynoszącej 0,7 (środkowa faza logarytmiczna Shigella wzrost); około 2–2,5 h.
      UWAGA: Podczas pasażowania odmierzyć 50 ml DMEM oraz odpowiednią objętość PBS do wszystkich etapów płukania i umieścić w 37 °C kąpiel wodna. Pozostaw pożywkę do osiągnięcia 37 °C przed użyciem.
  2. Przenieś 2 x 108 przeszczepione jednostki tworzące kolonie (CFU) Shigella do poszczególnych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml.
    UWAGA: 2 x 108 Liczba CFU odpowiada w przybliżeniu 1 ml komórek bakteryjnych przy wartości OD600 wynoszącej 0,7. Należy użyć OD600 odczyty pozwalające przybliżyć wartość CFU/ml zgodnie z kalibracją każdego poszczególnego spektrofotometru.
  3. Przemyć każdą Shigella przemyć próbkę 2x w PBS.
    1. Odwirować komórki w wirowarce z prędkością 17 000 x g przez 2 min w temperaturze pokojowej. Odessać nadsącz, następnie dodać 1 ml ciepłego PBS i dokładnie resuspender osad, delikatnie pipetując próbkę w górę i w dół do uzyskania całkowitej homogeniczności mieszaniny (8-10 razy).
    2. Powtórz krok 4.3.1 jeszcze raz.
    3. Odwirować komórki w celu uzyskania osadu przy 17 000 x g przez 2 min w temperaturze pokojowej, odessać nadsącz i zawiesić osad w 2 ml ciepłego DMEM.
      UWAGA: Końcowe stężenie resuspenderowanych bakterii wyniesie 1 x 108 JCF/ml
  4. Wymieszać w wortexie, a następnie dodać 1 ml (1 x 108 jednostek tworzących kolonie (CFU) w zawiesinie Shigella do każdej studni przygotowanych monowarstw nabłonka jelita grubego HT-29 na płytkach 6-dołkowych (z kroku 3.2.10.2).
    UWAGA: Infekcje przeprowadza się zazwyczaj przy wielokrotności infekcji (MOI; stosunek komórek bakteryjnych do nabłonkowych) wynoszącej 100. Aby przetestować różne wartości MOI, należy rozcieńczyć resuspensję Shigella w ciepłym DMEM do pożądanego stężenia, a następnie dodać 1 ml rozcieńczonych bakterii do monowarstw HT-29. Na przykład, aby przetestować MOI wynoszące 10, należy rozcieńczyć bakterie w stosunku 1:10 poprzez dodanie 150 µL 1 x 108 CFU/ml bakterii do 1,35 ml ciepłego DMEM, a następnie nanieść 1 ml (1 x 107 jednostki tworzące kolonie (CFU) do komórek HT-29.
  5. Inkubować płytki 6-dołkowe w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 3 h.
  6. Podczas inkubacji należy oznaczyć miano infekcji bakteryjnej.
    1. Przygotować 10-krotne rozcieńczenia seryjne zawiesiny Shigella komórki (z kroku 4.3.3) do PBS.
    2. Płytka 100 µL z 1 x 10-5 oraz 1 x 10-6 rozcieńczenia na płytki z pożywką TSB z kongo red i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Wysiewanie na podłoża 100 µL z 1 x 10-5 oraz 1 x 10-6 rozcieńczenia odpowiadają końcowemu współczynnikowi rozcieńczenia 1 x 10-6 oraz 1 x 10-7odpowiednio.
  7. Po inkubacji warstwy monowarstw należy przemyć 4-5 razy buforem PBS.
    1. Odssać medium z każdej studzienki.
      UWAGA: Podczas aspirowania pożywki z płytek 6-dołkowych należy prowadzić końcówkę aspiratora wzdłuż dna dołków, starając się unikać kontaktu z komórkami HT-29.
    2. Do każdego dołka należy dodać 1 ml ciepłego PBS i delikatnie wypłukać.
      UWAGA: Aby delikatnie przemyć monowarstwy w płytce 6-dołkowej przy użyciu PBS, należy przesuwać płytkę w górę i w dół oraz na boki po blacie laboratoryjnym. Mycie płytek ruchem okrężnym i/lub podnoszenie płytki z powierzchni blatu może spowodować mechaniczne oderwanie komórek od plastiku.
    3. Powtórzyć kroki 4.7.1 i 4.7.2 jeszcze 4 razy.
  8. Usunąć PBS poprzez aspirację, a następnie zlizować komórki HT-29, dodając do każdego dołka 1 mL PBS + 1% Triton X-100.
  9. Inkubować płytki 6-dołkowe w temperaturze 37 °C przez 5 min.
  10. Używając skrobaka do komórek lub zagiętego końcówki pipety, zeskrob lizeowane komórki z dna dołka i przenieś całą objętość 1 ml do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 ml.
  11. Wyznacz liczbę bakterii związanych z komórkami.
    1. Wymieszać każdą probówkę (z kroku 4.10) na wirówce typu vortex przez co najmniej 30 s, aby dodatkowo przemieścić Shigella z lizowanych komórek eukariotycznych.
    2. Przygotować 10-krotne rozcieńczenia seryjne lizatów w PBS.
    3. Płytka 100 µL z 1 x 10-2, 1 x 10-3oraz 1 x 10-4 roztwory w serii rozcieńczeń na płytki z pożywką TSB z czerwienią kongową i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Wysiewanie na płytki 100 µL z 1 x 10-2, 1 x 10-3, oraz 1 x 10-4 rozcieńczenia odpowiadają końcowemu czynnikowi rozcieńczenia 1 x 10-3, 1 x 10-4oraz 1 x 10-5odpowiednio.

5. Test inwazyjności

UWAGA: Wszystkie objętości są dostosowane do analizy z wykorzystaniem dwóch płytek 6-dołkowych.

  1. Przeszczepienie w celu nocnej inkubacji Shigella hodowle poprzez rozcieńczenie 1:50 w świeżej pożywce.
    1. Wymieszać w wirówce Vortex, a następnie dodać 100 µL każdej hodowli nocnej do 5 ml świeżej pożywki TSB lub TSB + BS w probówce o odpowiedniej pojemności.
      UWAGA: Ogranicz objętość hodowli do <20% objętości kolby lub probówki hodowlanej, aby zapewnić właściwe napowietrzanie.
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C przy wstrząsaniu z prędkością 250 obr./min aż do momentu, gdy komórki osiągną gęstość optyczną (OD)600 wynoszącej 0,7 (środkowa faza logarytmiczna) Shigella wzrost); około 2–2,5 h.
      UWAGA: Podczas pasażowania odmież 50 ml DMEM + 50 mg/ml gentamycyny oraz odpowiednią objętość PBS do wszystkich etapów płukania i umieść je w 37 °C łaźnia wodna. Pozostawić pożywkę do osiągnięcia 37 °C przed użyciem.
  2. Przenieś 2 x 108 przesiane CFU Shigella do poszczególnych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml.
    UWAGA: 2 x 108 CFU odpowiada około 1 ml komórek bakteryjnych przy danej wartości OD600 do 0,7. Należy użyć OD600 odczyty do przybliżonego wyznaczenia CFU/ml zgodnie z kalibracją każdego poszczególnego spektrofotometru.
  3. Przemyć Shigella próbki 1x w PBS.
    1. Odwirować komórki w celu uzyskania osadu przy 17 000 x g przez 2 min w temperaturze pokojowej. Odessać nadsącz, następnie dodać 1 ml ciepłego PBS i dokładnie resuspender osad, delikatnie pipetując próbkę w górę i w dół do pełnego ujednorodnienia mieszaniny (8–10 razy).
    2. Powtórz krok 5.3.1 jeszcze jeden raz.
    3. Odwiruj komórki w celu otrzymania osadu przy prędkości 17 000 x g przez 2 min w temperaturze pokojowej, odessać nadsącz i zawiesić osad w 2 ml podgrzanego DMEM.
      UWAGA: Końcowe stężenie resuspendowanych bakterii wyniesie 1 x 108 CFU/ml
  4. Wymieszać w wortexie, a następnie dodać 1 ml (1 x 108 jednostek tworzących kolonie (CFU) z resuspenderowanych Shigella dodaj 1 mL pożywki DMEM do każdej studni przygotowanych monowarstw nabłonka jelita grubego HT-29 w płytkach 6-dołkowych (z kroku 3.2.10.2).
    UWAGA: Zakażenia przeprowadza się zazwyczaj przy wielokrotności zakażenia (MOI; stosunek bakterii do komórek nabłonkowych) wynoszącej 100. Aby przetestować różne wartości MOI, należy rozcieńczyć zawiesinę Shigella w DMEM do pożądanego stężenia, a następnie dodać 1 ml rozcieńczonych bakterii do monowarstw komórek HT-29. Na przykład, aby przetestować MOI wynoszące 10, należy rozcieńczyć bakterie w stosunku 1:10 poprzez dodanie 150 µL 1 x 108 CFU/ml bakterii do 1,35 ml DMEM, a następnie dodać 1 ml (1 x 107 CFU) do komórek HT-29.
  5. Aby wspomóc kontakt bakterii z komórkami HT-29, wiruj płytki 6-dołkowe z prędkością 2000 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej lub 37 °C czy ustawienie temperatury można dostosować.
    UWAGA: Wirowanie sprzyja kontaktowi bakterii z komórkami HT-29, co eliminuje konieczność wykorzystania czynników adhezyjnych i umożliwia bakteriom szybką inwazję do wnętrza komórek.
  6. Inkubować płytki 6-dołkowe w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 45 min.
  7. W trakcie inkubacji należy oznaczyć miano infekcji bakteryjnej.
    1. Przygotować 10-krotne rozcieńczenia seryjne zresuspendowanego Shigella komórki (z kroku 5.3.3) do PBS.
    2. Płytka 100 µL z 1 x 10-5 oraz 1 x 10-6 rozcieńczenia na płytki z pożywką TSB z czerwienią kongową i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Wysiew na płytki 100 µL z 1 x 10-5 oraz 1 x 10-6 rozcieńczenia odpowiadają końcowemu współczynnikowi rozcieńczenia 1 x 10-6 oraz 1 x 10-7odpowiednio.
  8. Zainfekowane komórki HT-29 należy dokładnie przemyć trzykrotnie 1 ml PBS.
    1. Odssać pożywkę z każdego dołka.
      UWAGA: Podczas aspiracji pożywki z płytek 6-dołkowych należy prowadzić końcówkę aspiratora wzdłuż dna dołków, starając się uniknąć kontaktu z komórkami HT-29.
    2. Do każdego dołka należy dodać 1 ml ciepłego PBS i delikatnie wypłukać.
      UWAGA: Aby delikatnie przemyć monowarstwy w płytce 6-dołkowej za pomocą PBS, należy przesuwać płytkę w górę i w dół oraz na boki po blacie laboratoryjnym. Mycie płytek ruchem okrężnym i/lub podnoszenie płytki z powierzchni blatu może spowodować mechaniczne oderwanie komórek od tworzywa.
    3. Powtórzyć kroki 5.8.1 i 5.8.2 jeszcze 2 razy.
  9. Usunąć PBS poprzez aspirację, a następnie dodać 2 ml ocieplonego DMEM uzupełnionego o 50 µg/mL gentamycynę do każdej studzienki i inkubować przez 30 min w temperaturze 37 °C z dodatkiem 5% CO2.
  10. Zainfekowane komórki HT-29 należy dokładnie przemyć trzykrotnie 1 ml PBS.
    1. Powtórz etap płukania 5.8.
  11. Usunąć PBS poprzez aspirację, a następnie dodać 2 ml ogrzanego DMEM uzupełnionego o 50 µg/mL gentamycynę do każdego dołka i inkubować przez 60 min w temperaturze 37 °C z 5% CO2.
  12. Zainfekowane komórki HT-29 dokładnie przemyć 3 razy 1 ml PBS.
    1. Powtórz etap płukania 5.8.
  13. Usunąć PBS poprzez aspirację i zlizować komórki HT-29, dodając 1 ml PBS + 1% Triton X-100 do każdego dołka.
  14. Inkubować płytki 6-dołkowe w temperaturze 37 °C przez 5 min.
  15. Używając skrobaka do komórek lub zagiętego końcówki pipety, zeskrob lizeowane komórki z dna dołka i przenieś całą objętość 1 ml do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 ml.
  16. Oznacz liczbę bakterii wewnątrzkomórkowych.
    1. Wymieszać każdą probówkę (z kroku 5.15) na wirówce typu vortex przez co najmniej 30 s, aby dodatkowo przemieścić Shigella z lizowanych komórek eukariotycznych.
    2. Przygotować 10-krotne rozcieńczenia seryjne lizatów w PBS.
    3. Płytka 100 µL z 1 x 10-2 oraz 1 x 10-3 rozcieńczenia na płytki z pożywką TSB z czerwienią kongową i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Wysiewanie na płytki 100 µL z 1 x 10-2 oraz 1 x 10-3 rozwodnienia odpowiadają końcowemu współczynnikowi rozcieńczenia 1 x 10-3 oraz 1 x 10-4odpowiednio.

6. Analiza replikacji wewnątrzkomórkowej

UWAGA: Wszystkie objętości są dostosowane do analizy z wykorzystaniem dwóch płytek 6-dołkowych.

  1. Przeszczepienie do hodowli nocnej Shigella hodowle poprzez rozcieńczenie 1:50 w świeżej pożywce.
    1. Wymieszać w wstrząsarku wirówkowym, a następnie dodać 100 µL każdej hodowli nocnej do 5 ml świeżej pożywki TSB lub TSB + BS w probówce o odpowiedniej wielkości.
      UWAGA: Ogranicz objętość hodowli do <20% objętości kolby lub probówki hodowlanej, aby zapewnić odpowiednie napowietrzenie.
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min aż do osiągnięcia przez komórki wartości OD600 wynoszącej 0,7 (środkowa faza logarytmiczna) Shigella wzrostu); około 2-2,5 h.
      UWAGA: Podczas pasażowania odmierzyć 50 ml DMEM + 50 mg/ml gentamycyny oraz odpowiednią objętość PBS do wszystkich etapów płukania i umieścić w 37 °C kąpiel wodna. Pozostawić pożywkę do osiągnięcia 37 °C przed użyciem.
  2. Przenieś 2 x 108 przeprowadzono subkulturę CFU Shigella do poszczególnych probówek do mikrowirówki o pojemności 2 ml.
    UWAGA: 2 x 108 CFU odpowiadają około 1 ml komórek bakteryjnych przy OD600 wynoszącej 0,7. Należy użyć OD600 odczyty służące do przybliżenia wartości CFU/ml zgodnie z kalibracją każdego poszczególnego spektrofotometru.
  3. Przemyć Shigella próbki 1x w PBS.
    1. Odwirować komórki w celu uzyskania osadu przy 17 000 x g przez 2 min w temperaturze pokojowej. Odessać nadsącz, następnie dodać 1 ml ciepłego PBS i dokładnie resuspender osad, delikatnie pipetując próbkę w górę i w dół do momentu uzyskania pełnej homogeniczności mieszaniny (8–10 razy).
    2. Powtórz krok 6.3.1 jeszcze raz.
    3. Odwirować komórki w celu uzyskania osadu przy 17 000 x g przez 2 min w temperaturze pokojowej, odessać nadsącz i zawiesić osad w 2 mL ciepłego DMEM.
      UWAGA: Końcowe stężenie resuspensowanych bakterii wyniesie 1 x 108 JCF/ml
  4. Wymieszać w wstrząsarzu typu vortex, a następnie dodać 1 ml (1 x 108 jednostek tworzących kolonie (CFU) z resuspensowanego Shigella dodać 1 ml DMEM do każdej studni z przygotowanymi monowarstwami nabłonka jelita grubego HT-29 w płytkach 6-dołkowych (z kroku 3.2.10.2).
    UWAGA: Infekcje przeprowadza się zazwyczaj przy wielokrotności infekcji (MOI; stosunek bakterii do komórek nabłonkowych) wynoszącej 100. Aby przetestować różne wartości MOI, należy rozcieńczyć zawiesinę Shigella w DMEM do pożądanego stężenia, a następnie dodaj 1 ml rozcieńczonych bakterii do monowarstw HT-29. Na przykład, aby przetestować MOI wynoszące 10, rozcieńcz bakterie w stosunku 1:10 poprzez dodanie 150 µL z 1 x 108 CFU/ml bakterii do 1,35 ml DMEM, a następnie nanieść 1 ml (1 x 107 jednostek tworzących kolonie (CFU) do komórek HT-29.
  5. Aby zwiększyć kontakt bakterii z komórkami HT-29, wiruj płytki 6-dołkowe przy 2000 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej lub 37 °C czy ustawienie temperatury można dostosować.
    UWAGA: Wirowanie sprzyja kontaktowi bakterii z komórkami HT-29, co eliminuje potrzebę udziału czynników adhezyjnych i pozwala bakteriom na szybką inwazję do wnętrza komórek.
  6. Inkubować płytki 6-dołkowe w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 45 min.
  7. W trakcie inkubacji należy oznaczyć miano infekcji bakteryjnej.
    1. Przygotować 10-krotne rozcieńczenia seryjne zawiesiny Shigella komórki (z kroku 6.3.3) do PBS.
    2. Płytka 100 µL z 1 x 10-5 oraz 1 x 10-6 rozcieńczenia na płytki z pożywką TSB z czerwienią kongową i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Wysiewanie na płytki 100 µL z 1 x 10-5 oraz 1 x 10-6 rozcieńczenia odpowiadają końcowemu współczynnikowi rozcieńczenia 1 x 10-6 oraz 1 x 10-7odpowiednio.
  8. Zakażone komórki HT-29 należy dokładnie przemyć trzykrotnie 1 ml PBS.
    1. Odssać medium z każdego dołka.
      UWAGA: Podczas aspiracji pożywki z płytek 6-dołkowych prowadź końcówkę aspiratora wzdłuż dna dołków, starając się uniknąć kontaktu z komórkami HT-29.
    2. Do każdego dołka należy dodać 1 ml ciepłego buforu PBS i delikatnie wypłukać.
      UWAGA: Aby delikatnie przemyć monowarstwy w płytce 6-dołkowej za pomocą PBS, należy przesuwać płytkę w górę i w dół oraz na boki po blacie laboratoryjnym. Mycie płytek ruchem okrężnym i/lub odrywanie płytki od powierzchni blatu może spowodować mechaniczne usunięcie komórek z plastiku.
    3. Powtórz kroki 6.8.1 i 6.8.2 jeszcze 2 razy.
  9. Usunąć PBS poprzez aspirację, a następnie dodać 2 ml ogrzanego DMEM uzupełnionego o 50 µg/mL gentamycynę do każdej studzienki i inkubować przez 30 min w temperaturze 37 °C z 5% CO2.
  10. Zainfekowane komórki HT-29 należy dokładnie przemyć trzykrotnie 1 ml PBS.
    1. Powtórz etap płukania 6.8.
  11. Usunąć PBS poprzez aspirację, a następnie dodać 2 ml podgrzanego DMEM z 50 µg/mL gentamycynę do każdego dołka płytek 6-dołkowych i inkubować w 37 °C z 5% CO2 przez pożądany czas, aby umożliwić replikację wewnątrzkomórkową (do 24 h).
  12. Komórki należy dokładnie przemyć dwukrotnie 1 ml PBS.
    1. Powtórz etap płukania 6.8.
  13. Usunąć PBS poprzez aspirację, a następnie zlizować komórki HT-29, dodając do każdego dołka 1 ml PBS + 1% Triton X-100.
  14. Inkubować płytki 6-dołkowe w temperaturze 37 °C przez 5 min.
  15. Za pomocą skrobaka do komórek lub zagiętej końcówki pipety zeskrob z dna dołka zlizowane komórki i przenieś całą objętość 1 ml do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml.
  16. Oznacz liczbę bakterii wewnątrzkomórkowych.
    1. Wymieszać każdą probówkę (z kroku 6.15) na wirówce typu vortex przez co najmniej 30 s, aby dodatkowo przemieścić Shigella z lizowanych komórek eukariotycznych.
    2. Przygotować 10-krotne rozcieńczenia seryjne lizatów w PBS.
    3. Płytka 100 µL z 1 x 10-2, 1 x 10-3, oraz 1 x 10-4 rozcieńczenia na płytki z pożywką TSB z czerwienią Kongo i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Wysiewanie na płytki 100 µL z 1 x 10-2, 1 x 10-3, oraz 1 x 10-4 rozcieńczenia odpowiadają końcowemu współczynnikowi rozcieńczenia 1 x 10-3, 1 x 10-4oraz 1 x 10-5odpowiednio.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Testy adhezji, inwazji oraz replikacji wewnątrzkomórkowej przeprowadzono w celu porównania szczepu dzikiego (WT) S. flexneri 2457T ze szczepem S. flexneri ΔVF (ΔVF), mutantem, który według hipotezy negatywnie reguluje wirulencję Shigella . Ponieważ Shigella wykorzystuje sole żółciowe jako sygnał do regulacji wirulencji17,18,47, eksperymenty przeprowadzono po subkulturze bakterii w po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje zestaw trzech standaryzowanych testów do badania przylegania, inwazji i wewnątrzkomórkowej replikacji komórek nabłonka jelitowego. Chociaż metody te są jedynie zmodyfikowanymi wersjami klasycznych testów gentamycyny stosowanych do badania inwazji i wewnątrzkomórkowej replikacji różnych patogenów bakteryjnych w komórkach gospodarza 49,50,51, podczas badania Shigella należy zastosować specjal...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Wsparcie dla autorów obejmuje Departament Pediatrii Massachusetts General Hospital, nagrodę Komitetu Wykonawczego ds. Tymczasowego Wsparcia Badań (ISF) 2022A009041, grant Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych R21AI146405, oraz grant National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Nutrition Obesity Research Center at Harvard (NORCH) 2P30DK040561-26. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &m; m Filtr PESMillipore-SigmaSCGP00525Sterylny, polieterosulfonowy filtr do sterylizacji pożywek do 50 ml
Probówki hodowlane 14 mlCorning352059Probówki polipropylenowe 17 mm x 100 mm z nakrętką
Probówki stożkowe 50 mlCorning43082950 ml przezroczyste polipropylenowe stożkowe probówki wirówkowe z szczelną nasadką
6-dołkowe płytki do hodowli tkankowychCorning3516Płytki są poddawane obróbce w celu optymalnego przylegania komórek
Sole żółcioweSigma-AldrichB8756Stosunek 1:1 cholanu do deoksycholanu
Czerwony barwnik KongoSigma-AldrichC6277Anionowy barwnik diazowy na bazie benzydyny, czystość >85%
Szkiełko komory do liczenia komórek CountessInvitrogenC10283Do stosowania z automatycznym licznikiem komórek Countess
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD8418A wysoce polarny odczynnik organiczny
Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM)Gibco10569-010DMEM jest uzupełnione o wysoką zawartość glukozy, pirogronian sodu, GlutaMAX i fenol Czerwona
płodowa surowica bydlęca (FBS)Sigma-AldrichF4135Inaktywowana termicznie, sterylna
gentamycynaSigma-AldrichG3632Stężenie zapasowe wynosi 50 mg / ml
Linia komórkowa HT-29ATCCHTB-38Linia komórkowa gruczolakoraka; jelita grubego w pochodzenie
Folia parafinowaBemisPM999Laboratoryjna folia uszczelniająca
szalki PetriegoThermo Fisher ScientificFB0875713100 mm x 15 mm Szalki Petriego do mediów stałych
Sola buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher Scientific100100491x stężenie; pH 7,4
Wybierz agarInvitrogen30391023Mieszanina polisacharydów ekstrahowana ze ścian komórkowych czerwonych wodorostów w celu wytworzenia pożywki do powlekania bakteryjnego
Kolby T75Corning430641UKolby do hodowli tkankowych
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Powszechny niejonowy środek powierzchniowo czynny i emulgator 
Barwienie błękitem trypanowymInvitrogenT10282Barwnik do wykrywania martwych komórek hodowli tkankowych; tylko żywe komórki mogą wykluczyć barwnik
Trypsyna-EDTAGibco25200-056Odczynnik do dysocjacji komórek do utrzymania i pasażowania linii komórkowych
Tryptyczny bulion sojowy (TSB)Sigma-AldrichT8907Pożywka do wzrostu bakterii

Bibliografia

  1. Karambizi, N. U., McMahan, C. S., Blue, C. N., Temesvari, L. A. Global estimated Disability-Adjusted Life-Years (DALYs) of diarrheal diseases: A systematic analysis of data from 28 years of the global burden of disease study. PloS one. 16 (10), e0259077(2021).
  2. WHO. WHO methods and data sources for country-level causes of death 2000-2016. World Health Organization. , Geneva. (2018).
  3. Kotloff, K. L. Shigella infection in children and adults: a formidable foe. Lancet Glob Health. 5 (12), e1166-e1167 (2017).
  4. Kotloff, K. L., et al. Burden and aetiology of diarrhoeal disease in infants and young children in developing countries (the Global Enteric Multicenter Study, GEMS): A prospective, case-control study. Lancet. 382 (9888), 209-222 (2013).
  5. Schroeder, G. N., Hilbi, H. Molecular pathogenesis of Shigella spp.: Controlling host cell signaling, invasion, and death by type III secretion. Clin Microbiol Rev. 21 (1), 134-156 (2008).
  6. Arvelo, W., et al. Transmission risk factors and treatment of pediatric shigellosis during a large daycare center-associated outbreak of multidrug resistant shigella sonnei: Implications for the management of shigellosis outbreaks among children. Pediatr Infect Dis J. 28 (11), 976-980 (2009).
  7. Kozyreva, V. K., et al. Recent outbreaks of Shigellosis in California caused by two distinct populations of Shigella sonnei with either increased virulence or fluoroquinolone resistance. mSphere. 1 (6), 1-18 (2016).
  8. Bowen, A., et al. Importation and domestic transmission of Shigella sonnei resistant to ciprofloxacin - United States, May 2014-February 2015. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 64 (12), 318-320 (2015).
  9. Tansarli, G. S., et al. Genomic reconstruction and directed interventions in a multidrug-resistant Shigellosis outbreak in Seattle, WA, USA: a genomic surveillance study. Lancet. 3099 (22), 1-11 (2023).
  10. Barry, E. M., et al. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
  11. Increase in Extensively Drug-Resistant Shigellosis in the United States. CDC Health Alert Network. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://emergency.cdc.gov/han/2023/han00486.asp?ACSTrackingID=USCDC_511-DM100260&ACSTrackingLabel=HAN%20486%20-%20General%20Public&deliveryName=USCDC_511-DM100260 (2023).
  12. Shiferaw, B., et al. Antimicrobial susceptibility patterns of Shigella isolates in Foodborne Diseases Active Surveillance Network (FoodNet) sites, 2000-2010. Clin Infect Dis. 54, S458-S463 (2012).
  13. Centers for Disease Control and Prevention. COVID-19: U.S. Impact on Antimicrobial Resistance, Special Report 2022. Atlanta, GA: U.S. Department of Health and Human Services. CDC. , (2022).
  14. Centers for Disease Control and Prevention. Antibiotic resistance threats in the United States, 2019. CDC. 10 (1), Atlanta, Georgia. (2019).
  15. WHO. Prioritization of pathogens to guide discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. WHO. , Geneva. (2017).
  16. DuPont, H. L., Levine, M. M., Hornick, R. B., Formal, S. B. Inoculum size in shigellosis and implications for expected mode of transmission. J Infect Dis. 159 (6), 1126-1128 (1989).
  17. Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), 1-18 (2017).
  18. Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
  19. Chanin, R. B., et al. Shigella flexneri adherence factor expression in in vivo-like conditions. mSphere. 4 (6), e00751(2019).
  20. Baranov, V., Hammarström, S. Carcinoembryonic antigen (CEA) and CEA-related cell adhesion molecule 1 (CEACAM1), apically expressed on human colonic M cells, are potential receptors for microbial adhesion. Histochem Cell Biol. 121 (2), 83-89 (2004).
  21. Wassef, J. S., Keren, D. F., Mailloux, J. L. Role of M cells in initial antigen uptake and in ulcer formation in the rabbit intestinal loop model of shigellosis. Infect Immun. 57 (3), 858-863 (1989).
  22. Sansonetti, P. J., Arondel, J., Cantey, J. R., Prévost, M. C., Huerre, M. Infection of rabbit Peyer's patches by Shigella flexneri: Effect of adhesive or invasive bacterial phenotypes on follicle-associated epithelium. Infect Immun. 64 (7), 2752-2764 (1996).
  23. Sansonetti, P. J., et al. Caspase-1 activation of IL-1beta and IL-18 are essential for Shigella flexneri-induced inflammation. Immunity. 12 (5), 581-590 (2000).
  24. Zychlinsky, A., Fitting, C., Cavaillon, J. M., Sansonetti, P. J. Interleukin 1 is released by murine macrophages during apoptosis induced by Shigella flexneri. J Clin Invest. 94 (3), 1328-1332 (1994).
  25. Sansonetti, P. J., Ryter, A., Clerc, P., Maurelli, A. T., Mounier, J. Multiplication of Shigella flexneri within HeLa cells: lysis of the phagocytic vacuole and plasmid-mediated contact hemolysis. Infect Immun. 51 (2), 461-469 (1986).
  26. Maldonado-Contreras, A., et al. Shigella depends on SepA to destabilize the intestinal epithelial integrity via cofilin activation. Gut Microbes. 8 (6), 544-560 (2017).
  27. Collard, J. -M., et al. High prevalence of small intestine bacteria overgrowth and asymptomatic carriage of enteric pathogens in stunted children in Antananarivo, Madagascar. PLoS Negl Trop Dis. 16 (5), e0009849(2022).
  28. Mattock, E., Blocker, A. J. How do the virulence factors of shigella work together to cause disease. Front Cell Infect Microbiol. 7, 1-24 (2017).
  29. Mostowy, S., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy. PLoS Pathog. 9 (9), e1003588(2013).
  30. Martinez-Becerra, F. J., et al. Parenteral immunization with IpaB/IpaD protects mice against lethal pulmonary infection by Shigella. Vaccine. 31 (24), 2667-2672 (2013).
  31. Shim, D. -H., et al. New animal model of shigellosis in the Guinea pig: its usefulness for protective efficacy studies. J Immunol. 178 (4), Baltimore, Md. 2476-2482 (2007).
  32. Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465 (7296), 355-358 (2010).
  33. West, N. P., et al. Optimization of virulence functions through glucosylation of Shigella LPS. Science. 307 (5713), 1313-1317 (2005).
  34. Maurelli, A. T., et al. Shigella infection as observed in the experimentally inoculated domestic pig, Sus scrofa domestica. Microbial Pathog. 25 (4), 189-196 (1998).
  35. Jeong, K. -I., Zhang, Q., Nunnari, J., Tzipori, S. A piglet model of acute gastroenteritis induced by Shigella dysenteriae Type 1. J Infect Dis. 201 (6), 903-911 (2010).
  36. Kim, Y. -J., Yeo, S. -G., Park, J. -H., Ko, H. -J. Shigella vaccine development: prospective animal models and current status. Curr Pharm Biotechnol. 14 (10), 903-912 (2013).
  37. Kent, T. H., Formal, S. B., LaBrec, E. H., Sprinz, H., Maenza, R. M. Gastric shigellosis in rhesus monkeys. Am J Pathol. 51 (2), 259-267 (1967).
  38. Shipley, S. T., et al. A challenge model for Shigella dysenteriae 1 in cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis). Comp Med. 60 (1), 54-61 (2010).
  39. Higgins, R., Sauvageau, R., Bonin, P. Shigella flexneri Type 2 Infection in captive nonhuman primates. Can Vet J. 26 (12), 402-403 (1985).
  40. Oaks, E. V., Hale, T. L., Formal, S. B. Serum immune response to Shigella protein antigens in rhesus monkeys and humans infected with Shigella spp. Infect Immun. 53 (1), 57-63 (1986).
  41. Formal, S. B., et al. Protection of monkeys against experimental shigellosis with a living attenuated oral polyvalent dysentery vaccine. J Bacteriol. 92 (1), 17-22 (1966).
  42. Levine, M. M., Kotloff, K. L., Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Clinical trials of Shigella vaccines: two steps forward and one step back on a long, hard road. Nat Rev Microbiol. 5 (7), 540-553 (2007).
  43. Payne, S. M. Laboratory cultivation and storage of Shigella. Curr Protoc Microbiol. 55 (1), 93(2019).
  44. NIH Guidelines. NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules. NIH Guidelines. 2, 142(2019).
  45. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
  46. HT-29 cell line product sheet. ATCC. , Available from: https://www.atcc.org/products/htb-38 1-6 (2023).
  47. Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), 819-836 (2016).
  48. Stensrud, K. F., et al. Deoxycholate interacts with IpaD of Shigella flexneri in inducing the recruitment of IpaB to the type III secretion apparatus needle tip. J Biol Chem. 283 (27), 18646-18654 (2008).
  49. Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. J Clin Invest. 52 (7), 1673-1679 (1973).
  50. Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymo. 236 (1979), 405-420 (1994).
  51. Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62 (8), 3463-3471 (1994).
  52. Dorman, C. J., McKenna, S., Beloin, C. Regulation of virulence gene expression in Shigella flexneri, a facultative intracellular pathogen. Int J Med Microbiol. 291 (2), 89-96 (2001).
  53. Porter, M. E., Dorman, C. J. Positive regulation of Shigella flexneri virulence genes by integration host factor. J Bacteriol. 179 (21), 6537-6550 (1997).
  54. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Temperature-dependent expression of virulence genes in Shigella species. Infect Immun. 43 (1), 195-201 (1984).
  55. Schuch, R., Maurelli, A. T. Virulence plasmid instability in Shigella flexneri 2a is induced by virulence gene expression. Infect Immun. 65 (9), 3686-3692 (1997).
  56. Formal, S. B., Hale, T. L., Sansonetti, P. J. Invasive enteric pathogens. Rev Infect Dis. 5, S702-S707 (1983).
  57. Pál, T., Hale, T. L. Plasmid-associated adherence of Shigella flexneri in a HeLa cell model. Infect Immun. 57 (8), 2580-2582 (1989).
  58. Noben, M., et al. Human intestinal epithelium in a dish: Current models for research into gastrointestinal pathophysiology. United European Gastroenterol J. 5 (8), 1073-1081 (2017).
  59. Liévin-Le Moal, V., Servin, A. L. Pathogenesis of human enterovirulent bacteria: lessons from cultured, fully differentiated human colon cancer cell lines. Microbiol Mol Biol Rev R. 77 (3), 380-439 (2013).
  60. Mitchell, D. M., Ball, J. M. Characterization of a spontaneously polarizing HT-29 cell line, HT-29/cl.f8. In Vitro Cell Dev Biol - Anim. 40 (10), 297-302 (2004).
  61. Gagnon, M., Zihler Berner, A., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion. J Microbiol Methods. 94 (3), 274-279 (2013).
  62. Koestler, B. J., et al. Human intestinal enteroids as a model system of Shigella pathogenesis. Infect Immun. 87 (4), 00733(2019).
  63. Ranganathan, S., et al. Evaluating Shigella flexneri pathogenesis in the human enteroid model. Infect Immun. 87 (4), (2019).
  64. Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiol Spectr. 9 (1), 1-17 (2021).
  65. Perlman, M., Senger, S., Verma, S., Carey, J., Faherty, C. S. A foundational approach to culture and analyze malnourished organoids. Gut Microbes. 15 (2), 2248713(2023).
  66. Pope, L. M., Reed, K. E., Payne, S. M. Increased protein secretion and adherence to HeLa cells by Shigella spp. following growth in the presence of bile salts. Infect Immun. 63 (9), 3642-3648 (1995).
  67. Faherty, C. S., et al. The synthesis of OspD3 (ShET2) in Shigella flexneri is independent of OspC1. Gut Microbes. 7 (6), 486-502 (2016).
  68. Ridlon, J. M., Kang, D. -J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
  69. Köseoğlu, V. K., Hall, C. P., Rodríguez-López, E. M., Agaisse, H. The Autotransporter IcsA promotes Shigella flexneri biofilm formation in the presence of bile salts. Infect Immun. 87 (7), 1-14 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zakażenie Shigellaadhezja bakteryjnareplikacja wewnątrzkomórkowatest inwazjikomórki nabłonka jelita grubegoochrona gentamycynąagar z czerwienią Kongarozcieńczenia seryjnehodowla tkankowa
Analizy zakażeń komórek nabłonkowych preparatem Shigella
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.