Artykuł metodologiczny

Zmodyfikowany mysi model powtarzającego się łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu z przerzedzonym okienkiem czaszki i płynną stymulacją

DOI:

10.3791/66440

⸱

19 kwietnia 2024

 ,  ,  ,  , 
1College of Physical Education and Health Sciences, Zhejiang Normal University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia zmodyfikowany mysi model powtarzalnego łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu (rmTBI) wywołanego metodą zamkniętego urazu głowy (CHI). Podejście to obejmuje cieńsze okienko czaszki i płynną stymulację w celu zmniejszenia stanu zapalnego często spowodowanego ekspozycją opon mózgowych, a także lepszą odtwarzalność i dokładność w modelowaniu rmTBI u gryzoni.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Łagodne urazowe uszkodzenie mózgu jest klinicznie wysoce heterogennym zaburzeniem neurologicznym. Wysoce powtarzalne modele zwierzęce urazowego uszkodzenia mózgu (TBI) z dobrze zdefiniowanymi patologiami są pilnie potrzebne do badania mechanizmów neuropatologii po łagodnym TBI i testowania środków terapeutycznych. Odtworzenie wszystkich następstw TBI w modelach zwierzęcych okazało się wyzwaniem. W związku z tym dostępność wielu modeli zwierzęcych TBI jest niezbędna, aby uwzględnić różnorodne aspekty i nasilenia obserwowane u pacjentów z TBI. CHI jest jedną z najczęstszych metod wytwarzania modeli rmTBI gryzoni. Metoda ta jest jednak podatna na wiele czynników, w tym zastosowaną metodę uderzeniową, grubość i kształt kości czaszki, bezdech zwierzęcy oraz rodzaj zastosowanego podparcia głowy i unieruchomienia. Celem tego protokołu jest zademonstrowanie kombinacji metod cienkiego okienka czaszki i płynnego uszkodzenia udarowego (FPI) w celu uzyskania precyzyjnego mysiego modelu rmTBI związanego z CHI. Głównym celem tego protokołu jest zminimalizowanie czynników, które mogą wpływać na dokładność i spójność modelowania CHI i FPI, w tym grubości, kształtu kości czaszki i podparcia głowy. Dzięki zastosowaniu metody przerzedzonego okna czaszki, potencjalny stan zapalny spowodowany kraniotomią i FPI jest zminimalizowany, co skutkuje ulepszonym modelem mysim, który replikuje cechy kliniczne obserwowane u pacjentów z łagodnym TBI. Wyniki analizy behawioralnej i histologicznej z użyciem barwienia hematoksyliną i eozyną (HE) sugerują, że rmTBI może prowadzić do skumulowanego urazu, który powoduje zmiany zarówno w zachowaniu, jak i ogólnej morfologii mózgu. Ogólnie rzecz biorąc, zmodyfikowany rmTBI związany z CHI stanowi użyteczne narzędzie dla naukowców do zbadania podstawowych mechanizmów, które przyczyniają się do ogniskowych i rozlanych zmian patofizjologicznych w rmTBI.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Łagodne TBI, w tym wstrząśnienie mózgu i podwstrząs mózgu, stanowią większość wszystkich przypadków TBI (>80% wszystkich TBI)1. Łagodne TBI często wynika z upadków, wypadków drogowych, aktów przemocy, sportów kontaktowych (np. piłki nożnej, boksu, hokeja) i walk wojskowych2,3. Łagodne TBI może prowadzić do zdarzeń neurobiologicznych, które wpływają na funkcje neurobehawioralne przez całe życie pacjenta i zwiększają ryzyko chorób neurodegeneracyjnych4,5,6. Modele zwierzęce zapewniają skuteczny i kontrolowany sposób badania łagodnego TBI, z nadzieją na dalszą poprawę diagnostyki i leczenia łagodnego TBI. Opracowano różne modele łagodnego TBI, takie jak kontrolowane uderzenie korowe (CCI), spadek masy ciała (WD), płynne uszkodzenie udarowe (FPI) i modele blast-TBI7,8. Żaden pojedynczy model eksperymentalny nie jest w stanie odwzorować całej złożoności patologii wywołanej przez TBI9,10. Heterogeniczność tych modeli jest korzystna dla zajęcia się różnorodnymi cechami związanymi z łagodnymi pacjentami z TBI i zbadania odpowiadających im mechanizmów komórkowych i molekularnych. Jednak każdy zwierzęcy model TBI ma swoje ograniczenia3, co ogranicza naszą obecną wiedzę na temat łagodnego TBI u zwierząt i ich znaczenia klinicznego.

Modele WD i CCI są wykorzystywane do replikowania stanów klinicznych, takich jak utrata tkanki mózgowej, ostry krwiak podtwardówkowy, uszkodzenie aksonów, wstrząśnienie mózgu, dysfunkcja bariery krew-mózg, a nawet śpiączka po TBI3,11,12. Model WD polega na wywołaniu uszkodzenia mózgu poprzez uderzenie w oponę twardą lub czaszkę swobodnie spadającymi ciężarkami. Uderzenie obciążonego przedmiotu w nienaruszoną czaszkę może replikować mieszane urazy ogniskowe/rozproszone; Jednak ta metoda wiąże się ze słabą dokładnością i powtarzalnością miejsca urazu, urazem odbicia i wyższą śmiertelnością z powodu złamań czaszki3,11,12. Model CCI polega na zastosowaniu metalu napędzanego powietrzem, który bezpośrednio uderza w odsłoniętą oponę twardą. W porównaniu z modelem WD, model CCI jest dokładniejszy i bardziej powtarzalny, ale nie powoduje uszkodzeń rozproszonych ze względu na małą średnicę końcówki uderzającej11. Podczas modelowania FPI tkanka mózgowa jest na krótko przemieszczana i deformowana przez uderzenie. FPI może wywoływać mieszane uszkodzenie ogniskowe / rozproszone i replikować krwotok śródczaszkowy, obrzęk mózgu i postępujące uszkodzenie istoty szarej po TBI. Jednak FPI ma wysoki wskaźnik śmiertelności z powodu uszkodzenia pnia mózgu i przedłużającego się bezdechu3,12. Kraniotomia stosowana w konwencjonalnych modelach WD, CCI i FPI może prowadzić do stłuczenia kory mózgowej, zmian krwotocznych, uszkodzenia bariery krew-mózg, infiltracji komórek odpornościowych, aktywacji komórek glejowych, wydłużenia czasu modelowania i możliwych śmiertelnych skutków3,12.

Łagodne TBI charakteryzuje się wynikiem GCS (skala śpiączki Glasgow, GCS) w zakresie od 13 do 152. Łagodne TBI może być ogniskowe lub rozlane i jest związane zarówno z ostrymi urazami, takimi jak załamanie homeostazy komórkowej, ekscytotoksyczność, wyczerpanie glukozy, dysfunkcja mitochondriów, zaburzenia przepływu krwi i uszkodzenie aksonów, jak i urazy podostre, w tym uszkodzenie aksonów, zapalenie nerwów i glejoza2,3. Pomimo znacznego postępu w nakreśleniu skomplikowanej patofizjologii TBI, mechanizmy leżące u podstaw łagodnego TBI/rmTBI pozostają nieuchwytne i wymagają dalszych badań9. Biorąc pod uwagę, że CHI jest najpowszechniejszym typem TBI12, protokół ten prezentuje nowatorskie podejście do tworzenia bardziej precyzyjnie kontrolowanego mysiego modelu rmTBI przy użyciu zmodyfikowanego urządzenia FPI do wykonywania uderzenia w okno z przerzedzoną czaszką13. Unikając urazów wywołanych kraniotomią, zmiennej grubości czaszki i niedokładności spowodowanych kształtem oraz urazów związanych z odbiciem, podejście to ma na celu przezwyciężenie głównych wad związanych z modelami WD, CCI i FPI. Zastosowanie wpływu FPI na okienko z rozrzedzoną czaszką jest wygodne do oceny uszkodzenia naczyń mózgowych po rmTBI i pomaga zminimalizować wysokie wskaźniki śmiertelności w niektórych modelach, co skutkuje bliższym podobieństwem do cech klinicznych pacjentów z TBI.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury związane z tym protokołem zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (Zhejiang Normal University, Numer Zezwolenia, dw2019005) oraz zgodnie z ARRIVE i NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Specyfikacje techniczne można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Procedura postępowania ze zwierzętami

  1. Myszy trzymane w kontrolowanym środowisku o temperaturze 22-24 °C, wilgotności w zakresie 40%-60%, 12-godzinny cykl światło/ciemność i zapewniają ad libitum dostęp do wody i standardowej karmy dla myszy. Do celów tego eksperymentu wykorzystano 25 samców myszy ICR (25-30 g, 8 tygodni).
  2. Losowo przydziel myszy do grupy kontrolnej (n = 12) lub grupy rmTBI (n = 13). Aby zapobiec potencjalnej agresji ze strony myszy pozorowanych w stosunku do myszy, które przeszły rmTBI, należy je umieścić w oddzielnych klatkach.
  3. Daj myszom co najmniej 1 tydzień na aklimatyzację w środowisku klatki przed rozpoczęciem eksperymentu. Ten okres aklimatyzacji zapewnia, że myszy zapoznają się z otoczeniem i minimalizują potencjalny wpływ stresu lub lęku na reakcje fizjologiczne lub behawioralne podczas badania.

2. Przygotowanie urządzenia TBI

  1. Wytwarzanie modelu rmTBI na myszach za pomocą zmodyfikowanego urządzenia FPI (patrz Tabela materiałów; Rysunek 1A)13. Przed użyciem urządzenia FPI dokładnie sprawdź wszystkie połączenia pod kątem oznak wycieku lub pęknięć, zwracając szczególną uwagę na połączenia między cylindrem a rurką oraz między łącznikiem trójdrożnym a rurką. Aby dokładnie określić ciśnienie uderzenia, zainstalowano przetwornik ciśnienia do punktu uderzenia w urządzenie do uszkadzania płynów udarowych13.
  2. Przeprowadź dokładną kontrolę urządzenia FPI, aby upewnić się, że tłok porusza się płynnie wewnątrz cylindra i że uderzenia mogą być skutecznie przeprowadzane ( Rysunek 1B). Sprawdź, czy w systemie nie ma pęcherzyków powietrza. W przypadku wykrycia pęcherzyków powietrza należy ostrożnie dodać wodę destylowaną do systemu za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml i usunąć pęcherzyki powietrza, szybko przepychając pręt butli przez pobliskie złącze 3-drożne i/lub przez strzykawkę.
    UWAGA: System FPI składa się z wody destylowanej w butli i podłączonych przewodów. Bardzo ważne jest, aby skalibrować urządzenie przed rozpoczęciem pracy, aby zapewnić dokładność i wiarygodność wyników.

3. Przygotowanie cienkiej czaszki

UWAGA: Operacja na zwierzętach i przygotowanie cienkiej czaszki nie powinny być wykonywane w obecności innych myszy. Okienko z przerzedzoną czaszką jest przydatne do oceny uszkodzenia naczyń mózgowych po zabiegu FPI.

  1. Przestrzegaj wymagań centrum dla zwierząt, instruując operatora doświadczalnego, aby nosił sterylny fartuch i maskę podczas wszystkich procedur związanych ze zwierzętami.
  2. Przed rozpoczęciem eksperymentu zdezynfekuj blat stołu laboratoryjnego, urządzenie FPI, rurkę anestezjologiczną i przyległą przestrzeń przed rozpoczęciem eksperymentu za pomocą sprayu z 70% etanolem.
  3. Zważ myszy zarówno w grupie pozorowanej, jak i rmTBI przed operacją i porównaj ich wagę z wagą zarejestrowaną 1 tydzień przed eksperymentem. Wyklucz z badania każdą mysz wykazującą zły stan zdrowia, taki jak szorstkie futro, biegunka, utrata masy ciała lub letarg. Dodatkowo należy wykluczyć myszy ważące mniej niż 20 g, aby zapewnić im zdolność do tolerowania powtarzających się uderzeń. Środki te mają zasadnicze znaczenie dla utrzymania dobrostanu zwierząt i zapewnienia wiarygodnych wyników doświadczeń.
  4. Znieczulaj myszy 4%-5% izofluranem (w 100% tlenu przy natężeniu przepływu 1 l/min) przez 3-4 minuty w komorze indukcyjnej. Podaj smar okulistyczny (patrz Tabela materiałów) do oczu zwierzęcia, aby utrzymać nawilżenie przez cały czas trwania operacji. W celu złagodzenia bólu buprenorfinę należy podawać podskórnie (0,05 mg/kg) w środkowy punkt między uszami 20 minut przed znieczuleniem, a następnie co 6 godzin przez 24 godziny. Ponadto pod koniec znieczulenia każdemu zwierzęciu należy podać podskórnie pojedynczą dawkę 5 mg/kg karprofenu.
  5. Zdezynfekuj głowę po tym, jak mysz straciła odruch prostowania i wycofywania pedału. Przytnij futro na głowie myszy za pomocą nożyczek chirurgicznych i użyj golarki, aby usunąć pozostałe futro. Zdezynfekuj skórę głowy za pomocą trzech sekwencyjnych aplikacji 2% chlorheksydyny, przeplatanych peelingami z 75% etanolu.
  6. Umieść jednorazową sterylną podkładkę chirurgiczną pod zwierzęciem i jego otoczeniem, aby zapewnić odpowiednią higienę. Wykonaj 1,5 cm nacięcie za pomocą cienkich małych nożyczek chirurgicznych wzdłuż linii środkowej skóry głowy myszy, aby całkowicie odsłonić pole operacyjne (Rysunek 2A).
  7. Zabezpiecz mysz za pomocą nieterminalnych nauszników w konwencjonalnej ramie stereotaktycznej (patrz Tabela materiałów). Dostosuj pozycję głowicy myszy w ramce stereotaktycznej na płaskim poziomie lub pod lekkim kątem nachylenia zgodnie z określonym obszarem docelowym, który będzie badany. Oczyść sierść z obszaru operacyjnego, aby uniknąć późniejszego stanu zapalnego.
  8. Utrzymuj temperaturę ciała myszy na poziomie 37 °C za pomocą konwencjonalnej izotermicznej poduszki grzewczej (patrz Tabela materiałów).
  9. Podczas procesu instalacji piasty chirurgicznej i udarowej (żeńskiego Luer Lock) utrzymuj znieczulenie myszy (bez reakcji na uszczypnięcie palca lub ogona) za pomocą stożka nosowego, który zapewnia ciągłe stężenie izofluranu na poziomie 2%, regulowane przez skalibrowany waporyzator.
  10. Ostrożnie oczyść obszar operacyjny wokół okienka z przerzedzoną czaszką za pomocą sterylnego wacika nasączonego solą fizjologiczną.
  11. Stwórz okienko z przerzedzoną czaszką o średnicy około 2,5 mm i grubości 20 μm w prawej przedniej korze ruchowej za pomocą wiertła do mikrowiertła z płaską końcówką (patrz Tabela materiałów, Rysunek 2B) i ostrza mikrochirurgicznego. Zlokalizuj pole operacyjne na 1,5 mm przed bregmą i 1,3-2,0 mm bocznie do linii środkowej (Rysunek 2C).
    1. Aby zapobiec przebiciu się mikrowiertła do czaszki podczas tworzenia okienka z przerzedzoną czaszką, należy co jakiś czas zwilżać czaszkę solą fizjologiczną podczas szlifowania mikrowiertłem.
    2. Potwierdź grubość czaszki, delikatnie badając przerzedzoną czaszkę spłaszczoną końcówką cienkiej igły strzykawkowej i oceniając jej miękkość. Oszacuj wizualnie przejrzystość odsłoniętych mikronaczyń korowych, aby określić grubość czaszki.
    3. Aby sprawdzić grubość czaszki, nałóż sterylną sól fizjologiczną na rozrzedzony obszar i sprawdź wzrokowo za pomocą konwencjonalnego mikroskopu preparacyjnego (patrz Tabela materiałów). Ta technika może pomóc w zapewnieniu, że czaszka została odpowiednio przerzedzona.
      UWAGA: Smaruj oko myszy przez cały czas przygotowania rozrzedzonej czaszki i procedury modelowania rmTBI, aby zapobiec wysuszeniu. Ścieńczenie czaszki do mniej niż 15 μm niesie ze sobą ryzyko łagodnego urazu kory mózgowej, który może skutkować łagodnym zapaleniem kory mózgowej14.
  12. Przymocuj wyregulowany żeński zamek Luer Lock (średnica wewnętrzna 2,2 mm, utworzony z piasty igły 19G, jak pokazano na Rysunek 2D) do miejsca przerzedzonej czaszki. Zabezpiecz Luer Lock za pomocą kleju i cementu dentystycznego (Rysunek 2E).
    UWAGA: W przypadku używania kleju do mocowania żeńskiego zamka Luer do obszaru wokół okienka z rozrzedzoną czaszką, ważne jest, aby dokładnie osuszyć obszar czaszki i zapobiec przedostawaniu się kleju do samego okna. Klej w oknie może znacznie zmniejszyć siłę uderzenia FPI.

4. Procedura modelowania rmTBI związana z CHI

  1. Wprowadź rmTBI za pomocą metody bocznego udaru płynu ze zmodyfikowanym urządzeniem FPI, jak opisano wcześniej13,15.
  2. Po zakończeniu procedur przerzedzonego okna czaszki i koncentratora uderzeniowego, przenieś mysz z aparatu stereotaktycznego na platformę impaktora.
  3. Biorąc pod uwagę potencjalny wpływ znieczulenia na czas odruchu prostowania zwierzęcia i nasilenie obrażeń po uderzeniu9,16, monitoruj głębokość znieczulenia, oceniając odruchy powiekowe i odruchy wycofania łapy (Rysunek 2F).
  4. Podłącz żeński zamek Luer Lock, który został przyklejony do okienka z cieńszą czaszką, do męskiego zamka Luer Lock na końcu rurki urządzenia FPI (Rysunek 2G).
    UWAGA: W modelowaniu rmTBI znieczulenie wywołane izofluranem u myszy było przedłużone z powodu wywołania bezdechu i utraty przytomności przez opukiwanie.
  5. Wprowadź dwa łagodne TBI (odstęp 48 godzin) ze zmodyfikowanym urządzeniem. Zastosuj pierwsze uderzenie FPI natychmiast po zakończeniu operacji okienka z cieńszą czaszką i zainstalowaniu Luer Lock. Wpływ FPI należy podawać tylko wtedy, gdy mysz za każdym razem wykazuje powrót odruchu wycofania do uszczypnięcia łapy (Rysunek 2H). Zastosowanie wpływu FPI u głęboko znieczulonych myszy może spowodować przedłużony bezdech i śmierć.
    1. Aby zastosować uderzenie FPI, podnieś wahadło do wyznaczonego stopnia wzdłuż kątomierza na urządzeniu i zwolnij wahadło za pomocą sterowania programowego13,15. Uderzenie powinno osiągnąć intensywność uderzenia 2,0 ± 0,1 atm, zgodnie z ustalonymi protokołami stosowanymi w badaniach na gryzoniach10,17,18. Należy wykluczyć zwierzęta z dalszych badań, jeśli uderzenie nie zostało zarejestrowane między 1,9-2,1 atm lub jeśli pęknięcie czaszki wystąpiło podczas FPI.
    2. W przypadku myszy pozorowanych przymocuj je do aparatu, ale nie wywieraj wpływu.
  6. Po uderzeniu natychmiast odłącz złącze Luer Lock i przenieś myszy do izotermicznej poduszki grzewczej w celu odzyskania sprawności. Gdy mysz odzyska czujność i przytomność, przywróć ją do klatki domowej bez zdejmowania żeńskiego zamka Luer. Drugie uderzenie FPI należy podać w ten sam sposób 48 godzin później.
  7. Po wykonaniu rmTBI ostrożnie usuń żeński zamek Luer i cement dentystyczny. Zszyj skórę głowy za pomocą kleju tkankowego i użyj płaskich kleszczyków do uszczypnięcia skóry głowy, aby ułatwić proces adhezji (patrz Tabela materiałów; Rysunek 2I).
  8. Aby zapobiec stanom zapalnym, infekcjom oraz złagodzić ból i dyskomfort pooperacyjny, należy nałożyć na ranę mieszaninę erytromycyny i maści diklofenakowej sodu w stosunku 1:1 (patrz tabela materiałów). Przenieś myszy do izotermicznej poduszki grzewczej w celu odzyskania sprawności.
  9. Zapisać czas trwania odruchu prostującego, który rozpoczyna się w momencie wyjęcia myszy z aparatu stereotaktycznego i umieszczenia jej bocznie na platformie impaktora dla FPI i trwa do momentu, gdy mysz będzie w stanie samodzielnie stać prosto.
  10. Gdy mysz odzyska czujność i przytomność, przywróć ją do klatki domowej. Myszy są zazwyczaj w pełni przytomne i są w stanie chodzić w ciągu 1,5 godziny po urazie.
  11. W ciągu kilku dni po modelowaniu TBI obserwuj myszy pod kątem różnych objawów, w tym wzorców oddychania, obecności śluzu wokół nosa i ust oraz zaczerwienienia, obrzęku, wysięku lub ponownego otwarcia obszaru rany. Należy wykluczyć zwierzęta z badania z co najmniej jednym z powyższych nieprawidłowych objawów.
    UWAGA: Wstępna mikroiniekcja AAV-GCaMP6s pozwala na obserwację leżącej u podstaw homeostazy i pobudliwości neuronów Ca2 + w uszkodzonej korze przez okienko przerzedzonej czaszki za pomocą dwufotonowej laserowej mikroskopii skaningowej 15.

5. Test labiryntu wodnego Morrisa (MWM)

UWAGA: MWM (patrz Tabela Materiałów) jest powszechnie uznaną metodą oceny uczenia się przestrzennego i deficytów pamięci u myszy po TBI.

  1. Przeprowadź test MWM zaczynając od 7 dni po urazie (DPI). Okrągły basen MWM miał średnicę 120 cm i wysokość 50 cm, a temperatura wody utrzymywała się na poziomie 25 °C. Okrągły basen należy podzielić na cztery ćwiartki, przy czym platforma ewakuacyjna, okrągła platforma o średnicy 6 cm i wysokości 30 cm, zanurzona 1 cm pod powierzchnią wody w północno-wschodniej ćwiartce.
  2. Umieść kamerę bezpośrednio nad okrągłym basenem, aby zarejestrować trajektorię ruchu myszy. Oznacz myszy czarną taśmą na ich grzbietach, aby ułatwić rozpoznawanie przez oprogramowanie do akwizycji obrazu i rejestrowanie danych, w tym opóźnienia, odległości pływania i trajektorii ruchu.
  3. Umieść myszy w wodzie, zwrócone twarzą do wewnętrznej ściany każdego z czterech kwadrantów, jeden raz dla każdej ćwiartki. Gdy myszy znajdą platformę, pozwól im odpocząć na niej przez 10 sekund. Jeśli mysz nie znajdzie platformy w ciągu 60 sekund, poproś operatora, aby poprowadził mysz do platformy, pozwól jej odpocząć na platformie przez 10 sekund, a następnie wróć do klatki domowej w celu odpoczynku.
  4. Powtórz dla każdej myszy próbę akwizycji 4 razy dziennie. Po próbach akwizycji, na 12 DPI, przeprowadź 60-sekundowy eksperyment z sondą przestrzenną i zapisz, ile razy myszy przekroczyły pierwotny obszar platformy oraz czas przebywania myszy w kwadrancie, w którym znajdowała się platforma.
  5. Po każdej próbie szybko osusz myszy ręcznikiem lub umieść je pod lampą rozgrzewającą, aby utrzymać temperaturę ciała i zapobiec hipotermii podczas próby akwizycji 60 s od DPI 7 do DPI 11.
  6. Po zakończeniu procedur eksperymentalnych opisanych powyżej, znieczulij myszy pentobarbitalem (45 mg/kg, i.p.) w temperaturze 13 DPI. Perfuzję izotoniczną soli fizjologicznej przezsercowo, a następnie perfuzję z 4% paraformaldehydem w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (pH 7,2). Pobranie mózgów do konwencjonalnego barwienia HE w celu oceny dużych zmian morfologii kory mózgowej i hipokampa. Szczegółowy opis protokołu barwienia HE można znaleźć we wcześniejszych publikacjach13,15.
  7. Po zakończeniu wszystkich eksperymentów należy poddać mysz eutanazji przez wstrzyknięcie przedawkowania pentobarbitalu (≥100 mg / kg, i.p.), jeśli nie są potrzebne próbki myszy. Przed pobraniem tkanek lub usunięciem tuszy należy obserwować mysz do momentu, gdy nie nastąpi bicie serca przez co najmniej 60 sekund.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisany w tym badaniu przedstawia metodę indukowania rmTBI przez okienko z rozrzedzoną czaszką, która oferuje rozwiązanie problemu uszkodzenia mózgu spowodowanego przygotowaniem do kraniotomii podczas konwencjonalnego modelowania TBI z użyciem perkusji. Wykorzystując tę zmodyfikowaną procedurę udaru płynu ze zmodyfikowanym urządzeniem, osiągnięto lepszą precyzję i powtarzalność uderzenia FPI13. Zmodyfikowany impaktor jest na tyle wszechstronny, że może być stosowany zarówno do modelowania CHI, jak i FPI, z kraniotomią czaszki lub bez. Ponadto stopień urazu jest modulowany poprzez dostosowanie parametrów urazu, takich jak kąt opadania wahadła uderzeniowego, lub poprzez dodanie dodatkowych podkładek z pianki etylenowo-winylowej o różnych komórkach o różnych twardościach do płyty końcowej słupa tłoka.

Zmodyfikowany model rmTBI zapewnia znaczące korzyści, takie jak wytwarzanie patologii ogniskowej i rozproszonej bez odsłaniania opony twardej, co minimalizuje stan zapalny spowodowany ekspozycją opon mózgowych i/lub bezpośrednim FPI na miąższ. Co więcej, model ten zmniejsza różnice w grubości i kształcie kości czaszki, aby zapewnić wiarygodne wyniki urazów. W związku z tym zmodyfikowany model rmTBI jest skuteczny i niezawodny w symulacji klinicznie istotnych deficytów neuropatologicznych i behawioralnych związanych z objawami powstrząsowymi (PCS) w różnych stopniach urazu. W szczególności model ten jest przydatny do badania mechanizmów patologicznych TBI, które opierają się na dokładności i odtwarzalności zwierzęcych modeli TBI, zwłaszcza do badania łagodnych mechanizmów związanych z TBI.

Czołowa boczna gałąź środkowej tętnicy mózgowej myszy i żyły ogonowej nosa19, znajdująca się pod przerzedzoną czaszką, pozwalała na wyraźną wizualizację pod kamerą. Po dwóch uderzeniach rmTBI, każdy pod ciśnieniem około 2,0 atm, wszystkie myszy wykazywały krwiaki podtwardówkowe przy 0 DPI. Chociaż integralność ścieńczonej czaszki nie wydawała się być zagrożona; jednak zaobserwowano zmniejszenie liczby mikronaczyń wraz ze zmianami w morfologii mikrokrążeń (Ryc. 2H), jak wcześniej informowano15. Po 2 DPI krwiaki w dużej mierze ustąpiły. Śmiertelność wynika przede wszystkim z uderzenia, gdy mysz jest pod głębokim znieczuleniem, co może znacznie przedłużyć bezdech. Regularna ocena głębokości znieczulenia przed uderzeniem przez odruchy odruchu powiekowego i odruchu wycofania łapy może znacznie zmniejszyć śmiertelność. Dodatkowe czynniki, które mogą wpływać na śmiertelność po płynnej opuszczce, to szczep myszy, twardość czaszki, płeć i wiek. W poprzednim badaniu wykorzystującym ten sam protokół rmTBI, jedna mysz C57BL/6J zmarła15. W tym protokole tylko samce myszy ICR zostały wykorzystane do wprowadzenia wszystkich procedur.

Zarówno badania na ludziach, jak i na zwierzętach wykazały, że nawet powtarzające się uderzenia głową w podłoże wstrząsowe mogą powodować rozległe mikrostrukturalne uszkodzenia istoty białej20,21,22, które są związane z gorszą wydajnością poznawczą21,22. Przy 7-12 DPI rmTBI może powodować upośledzenie uczenia się przestrzennego i pamięci, które badano przy użyciu paradygmatu MWM. Rysunek 4 ilustruje wyniki uzyskane z tej oceny.

Analiza ostatniej próby akwizycji w MWM wykazała znaczny wzrost (p< 0,05) opóźnienia myszy z rmTBI do dotarcia do zanurzonej platformy, w porównaniu do grupy kontrolnej. W badaniu sondowym analiza procentu czasu spędzonego w oryginalnym kwadrancie platformy wykazała znaczące zmniejszenie (p<0,01) w grupie rmTBI w porównaniu z grupą kontrolną, co wskazuje na spadek zdolności uczenia się odniesień przestrzennych i pamięci u myszy z rmTBI.

Opisana tutaj metoda została wykorzystana we wcześniejszej publikacji15 przy użyciu myszy C57BL/6J. Oprócz MWM przeprowadzono trzy dodatkowe analizy opisane poniżej.

OFT został wykorzystany do oceny zdolności lokomocyjnej i eksploracyjnej poprzez pomiar średniej prędkości jazdy, całkowitego przebytego dystansu i procentu przebytego dystansu w strefach środkowych. Przeprowadź test w otwartym polu (OFT) przy 6 DPI, aby ocenić lokomocję, eksplorację i lęk u myszy. Urządzenie testowe o wymiarach 40 x 40 x 40 cm, które zostało podzielone na 16 stref (każda o wymiarach 18 x 18 cm). Mysz została umieszczona na środku urządzenia i pozwolono na swobodną eksplorację przez 5 minut. Dokonano rejestracji przebytego dystansu w 4 środkowych strefach, całkowitego przebytego dystansu, średniej prędkości ruchu oraz czasu spędzonego w strefach przygranicznych. Poziom lęku oceniano na podstawie procentu odległości przebytej w strefach centralnych oraz czasu spędzonego przez gryzonie w strefach przygranicznych podczas 5-minutowego okresu obserwacji. Przy 6 DPI, rmTBI może nie mieć znaczącego wpływu na ogólne zdolności lokomomotoryczne myszy, może wywoływać znaczny niepokój i zmieniać zachowania eksploracyjne, jak pokazano w Rysunek 415. Co więcej, zmodyfikowany model rmTBI indukuje rozlane uszkodzenia aksonów, które można ocenić za pomocą dodatkowych testów behawioralnych, takich jak test zdolności poznawczych opisany w tym protokole.

Wykazano, że

RmTBI upośledza pamięć przestrzenną roboczą i referencyjną u myszy, jak pokazano w Rysunek 515. Te funkcje poznawcze oceniano za pomocą testu Y-labirynt. Test przeprowadzono przy 8 DPI w celu zmierzenia deficytów krótkotrwałej pamięci roboczej u myszy. Do spontanicznego zachowania naprzemiennego użyto akrylowego urządzenia Y-labirynt (20 cm wysokości, 50 cm długości i 10 cm szerokości na dole). Po umieszczeniu myszy na środku urządzenia i pozostawieniu jej na eksplorację przez 8 minut, nagrano wpisy ramienia. Spontaniczne zachowanie naprzemienne definiuje się jako kolejne wchodzenie myszy w trzy ramiona w zestawach trypletowych. Oblicz współczynnik spontanicznej przemiany (%) jako (kolejne serie tripletów / całkowita liczba wejść ramion minus 2) x 100. Aby uzyskać pamięć odniesienia przestrzennego, podczas 8-minutowego treningu losowo zamknij jedno ramię urządzenia Y-maze. Po 1 godzinie od początkowej ekspozycji mysz jest ponownie wprowadzana do labiryntu z otwartymi wszystkimi trzema ramionami i pozwala jej na swobodną eksplorację przez 3 minuty. Rejestrowany jest czas spędzony na badaniu nowego ramienia w porównaniu z pozostałymi dwoma ramionami. Oblicz wskaźnik preferencji jako czas spędzony w nowym ramieniu w porównaniu z czasem spędzonym we wszystkich trzech ramionach.

Ponadto, sugerujemy ocenę poważnych zmian strukturalnych w mózgu za pomocą prostego barwienia HE (Rysunek 6)15 po zakończeniu wszystkich testów behawioralnych. Stosować obszar korowy przecięty koronalnie od 1 mm do przodu przez miejsce zmiany do tylnego brzegu zmiany oraz obszar hipokampa przecięty koronalnie w typowej strefie w kształcie półksiężyca (Bregma: -1,7 do -2,2 mm). Liczenie neuronów na każdym slajdzie z sześciu losowych pól przy użyciu siatki okularowej (powiększenie 400x) i uśrednianie liczby neuronów zapewniło gęstość liczbową na pole widzenia (gęstość liczb). Stwierdzono, że obszary mózgu dotknięte rmTBI wykazują różny stopień uszkodzeń neuronów15. W szczególności kora ruchowa wykazywała silniejszy i bardziej zróżnicowany zakres takich urazów niż hipokamp. Barwienie HE wykazało znaczne przesunięcie w kierunku morfologii piknotycznej z normalnych neuronów (Ryc. 6A,B,E,F). Ponadto zaobserwowano, że macierz zewnątrzkomórkowa ulega poluzowaniu specyficznie w obszarze zmiany (Rysunek 6F). Oprócz obserwowanych obszarów rozluźnionych przez macierz, myszy rmTBI wykazały również znaczny wzrost barwienia hiperchromowego, widzianego jako ciemniejszy czerwony kolor, w znacznej liczbie neuronów subziarnistych w zakręcie zębatym oraz niektórych neuronach korowych i CA1. Co ciekawe, te wzorce barwienia nie wykazywały żadnych towarzyszących oznak skurczu cytoplazmatycznego lub jądra piknotycznego (Ryc. 6C,D,G,H,K)15. Wspomniane powyżej metody barwienia behawioralnego (z wyjątkiem testu WMM) i HE zostały szczegółowo opisane w niedawnej publikacji, w której wprowadzono zmodyfikowany model rmTBI15.

figure-results-1
Rysunek 1: Zmodyfikowane urządzenie FPI i zrzut ekranu oprogramowania. (A) Zmodyfikowane urządzenie FPI. (B) Zrzut ekranu przedstawia przebieg ciśnienia FPI oraz automatyczny pomiar i eksport parametrów ciśnienia uderzenia w czasie rzeczywistym, takich jak czas narastania, czas opadania i czas trwania połowy szerokości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Zmodyfikowany mysi model rmTBI u myszy ICR. (A) Wykonuje się nacięcie w linii środkowej, aby odsłonić obszar chirurgiczny. (B) Na korze ruchowej wyprodukowano okienko z cieńszą czaszką. Przejrzystość odsłoniętych mikronaczyń korowych służy do określenia grubości czaszki. (C) Grubość czaszki można również sprawdzić poprzez delikatne sondowanie cienkiej czaszki spłaszczoną końcówką cienkiej igły strzykawkowej i ocenę jej miękkości. (D) Samica Luer Lock była przyklejona do okna z cieńszą czaszką. (E) Dołączony żeński zamek Luer Lock został zabezpieczony poprzez nałożenie cementu dentystycznego. (F) Głębokość znieczulenia monitorowano, sprawdzając odruchy odruchu powiekowego i odruchu wycofania łapy. (G) Uderzenie FPI zostało dostarczone po powrocie odruchu wycofania do uszczypnięcia łapy. (H) Obraz po rmTBI okienka rozrzedzonej czaszki przy 0 DPI. (I) Skóra głowy została zszyta klejem tkankowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Wpływ rmTBI na uczenie się i pamięć odniesień przestrzennych u myszy ICR. (A) Ślad nawigacyjny myszy podczas ostatniej próby akwizycji zarejestrowany na 11 DPI, (B) trasa sondy przestrzennej w próbie sondy zarejestrowana na 12 DPI, oraz (C) czas ucieczki, jaki zajęło myszom zlokalizowanie platformy podczas ostatniej próby akwizycji. Wyniki ujawniły, że grupa rmTBI potrzebowała znacznie więcej czasu, aby dotrzeć do ukrytej platformy niż grupa kontrolna (p<0,05). (D) Procent czasu spędzonego przez myszy w pierwotnym kwadrancie platformy w stosunku do całkowitego czasu nawigacji podczas próby sondy był znacznie niższy w grupie rmTBI niż w grupie kontrolnej (p<0,01). n=8. *p<0,05, **p<0,01 w porównaniu z kontrolą za pomocą niesparowanego testu t. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Wpływ rmTBI na lokomocję, eksplorację i lęk u myszy C57BL/6J. (A) Reprezentatywne ślady kontroli i ruchu myszy rmTBI podczas 5 min OFT. (B-E) Zsumowane dane pokazują odpowiednio przebytą odległość w strefach środkowych, całkowitą przebytą odległość, średnią prędkość podróży i czas spędzony w strefach peryferyjnych. Kontrola, n=13; rmTBI, n =12. p<. 01 w porównaniu z kontrolą za pomocą niesparowanego testu t. Ten rysunek został zmodyfikowany z15. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Wpływ rmTBI na przestrzenną pamięć roboczą i referencyjną u myszy C57BL/6J. (A, B) Reprezentatywne ślady kontroli i ruchu myszy rmTBI podczas pracy przestrzennej i oceny pamięci referencyjnej w labiryncie Y. Test spontanicznej przemiany labiryntu Y jest powszechnie stosowaną metodą oceny pamięci krótkotrwałej w modelach gryzoni15. (C) Podsumowanie spontanicznych wskaźników naprzemienności myszy kontrolnych i rmTBI podczas przestrzennej oceny pracy. Gryzonie zwykle wolą odkrywać nową odnogę labiryntu niż wracać do tej, którą już zbadały. Indeks preferencji jest obliczany na podstawie czasu spędzonego przez gryzonie w nowym ramieniu w porównaniu z czasem spędzonym we wszystkich trzech ramionach, a następnie wskaźnik ten jest analizowany. (D) Podsumowanie wskaźnika preferencji myszy kontrolnych i rmTBI podczas przestrzennej oceny roboczej. Kontrola, n=13; rmTBI, n=12. p<. 01 w porównaniu z kontrolą za pomocą niesparowanego testu t. Ten rysunek został zmodyfikowany z15. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Porównanie barwienia HE uszkodzonej kory ruchowej ipsilateralnie i podregionu zakrętu zębatego hipokampa między grupą kontrolną a rmTBI u myszy C57BL/6J. (A, B) Normalna kora ruchowa; i (C, D) obszar hipokampa myszy kontrolnych w różnych powiększeniach. (E, F) Uszkodzona kora ruchowa i (G, H) obszary hipokampa myszy rmTBI. Neurony hiperchromiczne w korze i CA1 mogły być nieznacznie dotknięte przygotowaniem chirurgicznym lub utrzymującym się rmTBI; jednak neurony hipochromiczne (prawdopodobnie średnio uszkodzone) i piknotyczne (neurony apoptotyczne) zaobserwowano w korze ruchowej myszy rmTBI w porównaniu z normalnymi neuronami u myszy kontrolnych. Te cechy apoptozy neuronalnej obejmowały cytoplazmatyczne neurony i kurczenie się jądra, któremu towarzyszyła pozorna wakuolizacja. Warto zauważyć, że biała linia demarkacyjna w (E) reprezentuje granicę między uszkodzeniem a otaczającą tkanką. Dodatkowo, neurony hiperchromiczne w podregionie DG (H) prawdopodobnie odnosiły się do nowo wygenerowanych niedojrzałych i dojrzałych neuronów ziarnistych. Poniższe wykresy słupkowe pokazują rozkład normalnych i dotkniętych rmTBI neuronów w (I) korze ruchowej i podregionach hipokampa (J) CA1 i (K) DG. Kontrola, n=13; rmTBI, n=12, ***p<. 001 w porównaniu z kontrolą za pomocą niesparowanego testu t. Ten rysunek został zmodyfikowany z15. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TBI odnosi się do dwóch podstawowych typów, zamkniętego i penetrującego, przy czym ten ostatni charakteryzuje się rozerwaniem czaszki i opony twardej. Dane kliniczne sugerują, że CHI są bardziej rozpowszechnione niż urazy penetrujące 1,2. Po pojedynczym łagodnym TBI większość pacjentów doświadcza objawów PCS, które zwykle ustępują w krótkim czasie, i istnieją kontrowersje dotyczące odsetka pacjentów, u których PCS rozwija się w długoterminowe następstwa23,24. W związku z tym naukowcy skupili się na powtarzalnych modelachCHI, aby lepiej zrozumieć skumulowane skutki wielokrotnych wstrząsów mózgu, które często występują podczas upadków, wypadków drogowych i sportów kontaktowych. Te powtarzające się oddziaływania mogą prowadzić do poważniejszych i długotrwałych skutków26,27. Korzystając z powtarzalnych modeli CHI, naukowcy mogą zbadać potencjalne addytywne lub synergiczne skutki wielokrotnych wstrząsów mózgu i lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw PCS. Takie modele mogą ułatwić opracowanie ukierunkowanych interwencji terapeutycznych w celu złagodzenia długoterminowych konsekwencji powtarzających się uderzeń głową.

Chociaż niektóre modele CHI próbują symulować zarówno ogniskowe pojedyncze, jak i rmTBI, uwzględniając zarówno siły liniowe, jak i obrotowe, modele te mogą powodować urazy z odbicia i niedokładności w ciężkości obrażeń ze względu na takie czynniki, jak pęknięcie czaszki, morfologia i grubość czaszki, rozszerzony bezdech zwierzęcy10 oraz zmienność mechanicznych parametrów wejściowych, szczególnie gdy włączony jest ruch głowy rotacyjnej9. Metody uderzenia i spadku masy sterowane tłokiem są powszechnie stosowane do indukcji rmTBI w modelach zwierzęcych CHI25. Uderzenie sterowane tłokiem pozwala na precyzyjne i regulowane ustawienie parametrów uderzenia za pomocą elektromagnetycznych lub pneumatycznych urządzeń udarowych, umożliwiając w ten sposób wysoką powtarzalność uderzenia. Jednak użycie uderzenia kontrolowanego tłokiem, czy to na odsłoniętą korę, jak w CCI, czy na zamkniętą czaszkę, nadal wymaga rygorystycznego unieruchomienia głowy zwierzęcia w stereotaktycznym kadrze podczas uderzenia. I odwrotnie, metody obniżania masy ciała wymagają prostych i opłacalnych materiałów, które są łatwe do ustawienia, ale kompromisem jest dość duża zmienność ciężkości urazu25.

Model FPI zazwyczaj wywołuje mieszane urazy ogniskowe i rozlane, co pozwala na wytworzenie TBI o różnym nasileniu. Pomimo swoich zalet, model FPI ma również potencjalne ograniczenia. Podobnie jak model CCI, FPI nadal wymaga kraniotomii, zabiegu chirurgicznego, który może wywołać stan zapalny w tkance mózgowej17. Co więcej, nawet łagodny FPI często przenika do opony twardej na różnych głębokościach, co może powodować zakłócenia w interpretacji danych. W związku z tym modele CCI i FPI mają ograniczenia w replikowaniu cech klinicznych obserwowanych u pacjentów z łagodnym TBI9. W związku z tym przedstawiamy protokół, który łączy w sobie metodę przerzedzonego okna czaszki i FPI, które można wykorzystać do stworzenia bardziej precyzyjnego mysiego modelu rmTBI związanego z CHI. Celem tego protokołu jest dokładne odzwierciedlenie cech klinicznych pacjentów z łagodnym TBI. Wysoce powtarzalny model byłby nieocenionym narzędziem do badania mechanizmów leżących u podstaw patofizjologii łagodnego TBI i oceny potencjalnych interwencji terapeutycznych.

Wyniki naszych badań nad rmTBI są zgodne z wcześniejszymi publikacjami, w których wykorzystano okienka z cieńszą czaszką do łagodnych badań TBI28,29. Na przykład Ren i wsp. stworzyli cieńsze okienko czaszki o grubości około 30 μm w lewej korze asocjacyjnej ciemieniowej, wywołując łagodne TBI poprzez delikatne naciskanie okienka za pomocą końca o średnicy 1 mm z chirurgicznego narzędzia stereotaktycznego29. Ich badanie wykazało znaczne rozszerzenie śmierci komórki i ekspresji reaktywnych form oksydacyjnych (ROS) w uszkodzonej korzemózgowej 29. Aby zbadać rmTBI, Nguyen i in. zastosowali trzy CCI ze zmodyfikowaną końcówką impaktora (okrągła silikonowa końcówka o średnicy 3 mm i grubości 1,5 mm) na okienku myszy z cieńszą czaszką (o grubości 20-40 μm) w korze asocjacyjnej ciemieniowej28. Aby chronić i utrzymać przezroczystość obszaru przerzedzonej czaszki do długotrwałego obrazowania, pokryli okienko przerzedzonej czaszki cienką warstwą kleju cyjanoakrylowego. Trzy CCI wykonywano raz w tygodniu przez 3 tygodnie, przy parametrach uderzenia 4 m/s prędkości i 2 mm głębokości. W wyniku trzech CCI myszy wykazywały wyraźną astroglejozę i aktywację mikrogleju28. Biorąc pod uwagę, że zastosowanie okienka z rozrzedzoną czaszką jako modelu łagodnego TBI/rmTBI jest stosunkowo nowe, konieczne są dalsze badania w celu zbadania związku między ciężkością/progresją urazu a różnymi technikami oddziaływania. Na przykład w poprzednim badaniu byliśmy w stanie zaobserwować oczywiste zmiany w morfologii komórek po dwóch FPI, które zostały podane w odstępie 2 dni15. Tymczasem, w innych badaniach, pojedynczy delikatny ucisk na rozrzedzone okno czaszki wywołał łagodne TBI z widoczną śmiercią komórki i reaktywną ekspresją gatunków oksydacyjnych29, a trzy tygodniowe CCI spowodowały silną astroglejozę i aktywację mikrogleju28.

Należy ostrożnie postępować w kilku krokach w celu stworzenia spójnego modelu urazu przy użyciu opisanej metody. Podczas operacji z przerzedzonym oknem czaszki, w oparciu o różne obszary docelowe (np. skupiliśmy się na korze ruchowej), głowa myszy powinna być zamocowana w ramce stereotaktycznej na poziomie poziomym lub pod niewielkim kątem bocznym w kierunku przeciwnej strony okna cienkiej czaszki w tym protokole. To specyficzne ułożenie może ułatwić stworzenie okienka z przerzedzoną czaszką w obszarze odpowiadającym korze ruchowej. Dokładne umieszczenie wkładek usznych jest jednym z najtrudniejszych aspektów tej procedury, a opanowanie jej może zająć czas i praktykę. Przed przystąpieniem do operacji rozrzedzonego okienka czaszki lub wywołania CHI należy upewnić się, że czaszka jest wypoziomowana. Jeśli czaszka nie jest prawidłowo ustawiona, głowę należy odpowiednio wyregulować. Ze względu na nierówny kształt i grubość kości czaszki, wzrost czaszki jest zmienny nawet w obrębie określonej kości30, bardzo ważne jest, aby dostosować ustawienie głowy przed podjęciem procedury rozrzedzonego okienka czaszki lub CHI. Niezastosowanie się do tego zwiększa ryzyko złamań czaszki, co może znacząco wpłynąć na dokładność i niezawodność CHI. Aby uzyskać bardziej wyczerpujące wskazówki dotyczące procedury okienka z przerzedzoną czaszką, zapoznaj się z protokołem opisanym przez Guang i wsp.14.

Wybór obszaru modelowania TBI różni się w zależności od obszaru badań, na których się skupiają. Biorąc pod uwagę znaczną zmienność w rzeczywistej lokalizacji urazu w CHI, pomimo większości badań podających, że miejsce uderzenia znajduje się centralnie między bregmą a lambdą, zaleca się zmianę miejsca uderzenia w przyszłych badaniach eksperymentalnych, jak zauważono w przeglądzie modeli zwierzęcych CHI25. Aby zweryfikować zmodyfikowany model uszkodzenia cienkiej czaszki CHI, zalecamy rozpoczęcie od kory ruchowej, jak opisano w niniejszym protokole. rmTBI może powodować ogniskowe uszkodzenia kory ruchowej, które można łatwo ocenić za pomocą metod oceny lokomotorycznej, takich jak OFT w tym protokole. Nacięcie wykonane podczas tej procedury wymaga czasu na zagojenie, a to może potencjalnie wywołać obwodową odpowiedź immunologiczną, ostatecznie wprowadzając zmienność do eksperymentu. Aby zminimalizować ryzyko wystąpienia stanu zapalnego, infekcji oraz bólu i dyskomfortu pooperacyjnego, zalecamy nałożenie na ranę maści miejscowej zawierającej kombinację erytromycyny i diklofenaku sodu. Wykazano, że takie podejście jest skuteczne w zmniejszaniu stanu zapalnego i bólu związanego z zabiegami chirurgicznymi u zwierząt.

Protokół płynnej stymulacji opartej na rozrzedzonej czaszce jest obiecującą metodą modelowania rmTBI u gryzoni, ponieważ zmniejsza stan zapalny często spowodowany wystawieniem opon mózgowych na FPI. Technika ta, zastosowana w okienku z przerzedzoną czaszką, może skutecznie generować klinicznie istotne PCS w różnym stopniu, stanowiąc potencjalną alternatywę dla naukowców badających rmTBI. Ponadto okienko z cieńszą czaszką ułatwia obserwację homeostazyCa2+ i nadpobudliwości neuronów w korze mózgowej in vivo15. Zastosowanie tej techniki może poprawić nasze zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw progresji PCS w krótkim/umiarkowanym/długim okresie, zwiększając w ten sposób zdolność przewidywania jej rozwoju i opracowywania skuteczniejszych metod leczenia.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Fundację Kluczowego Rozwoju Społecznego Gminy Jinhua (nr 2020-3-071), Program Szkolenia Studentów Innowacji i Przedsiębiorczości Zhejiang College (No: S202310345087, S202310345088) oraz Projekt Planu Działań Innowacyjnych w Dziedzinie Nauki i Technologii Studentów Zhejiang Provincial College (2023R404044). Autorzy dziękują Pani Emmie Ouyang (studentce pierwszego roku Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa, Bachelor of Science, Baltimore, USA) za redakcję językową artykułu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
75% etanol Shandong XieKang Technologia Medyczna Co., Ltd. 
Chlorowodorek buprenorfinyTianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., LtdH12020272Solution, Analgesic
CarprofenShanghai Guchen Biotechnology Co., Ltd53716-49-7Proszek, Przeciwbólowy
diglukonian chlorheksydynyShanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.18472-51-019%-21% roztwór wodny, Przeciwbakteryjny
zestaw cementu dentystycznego i rozpuszczalnikaShanghai New Century Dental Materials Co., Ltd.20220405, 3#Proszek odtworzony w dopasowanym rozpuszczalniku
Mikroskop preparacyjnyShenzhen RWD Life Science Inc.77019
Maść erytromycyny Wuhan Mayinglong Grupa Farmaceutyczna Co., Ltd.220412Antybiotykowe
światłowodowe źródło zimnego światłaShenzhen RWD Life Science Inc.F-150C
Wiertło mikrowiertło z płaską końcówką Shenzhen RWD Life Science Inc.HM310082 mm, stalowe
oprogramowanie urządzenia FPIJiaxing Bocom Biotech Inc.Biocom Animal Brain Impactor V1.0
ICRmyszy Jinhua Laboratory Animal Center   Stock#202309125 samców myszy, 25-30g, 8 tygodni
IsofluraneShandong Ante Animal Husbandry Technology Co., Ltd. 
Izotermiczna poduszka grzewcza Wenzhou Repshop Pet Products Co., Ltd. 
Luer Loc hupWykonane na zamówienie przy użyciu ręcznej wiertarki do czaszki 19G z piastą igłową
MicroShenzhen RWD Life Science Inc.78001Max: 38 000 obr./min
Zmodyfikowane urządzenie FPIJiaxing Bocom Biotech Inc.
Labirynt wodny Morris,Shenzhen, RWD, Life Science, Inc.63031Ocena zdolności myszy w zakresie uczenia się przestrzennego i zapamiętywania
Otwarte poleShenzhen RWD Life Science, Inc.63008Oceń lokalizację myszy i lęk
Smar okulistyczny Suzhou Tianlong Pharmaceutical Co., Ltd. 
Maść diklofenakowa sodu Wuhan Mayinglong Grupa Farmaceutyczna Co., Ltd.221207niesteroidowy lek przeciwzapalny
System znieczulenia małych zwierząt-Enhanced Shenzhen RWD Life Science Inc.R530IP
Inteligentny system śledzenia wideoPanlab Harvard Apparatus Inc., MA, USAV3.0Śledzenie i analiza zwierząt
Ramka stereotaktyczna Shenzhen RWD Life Science Inc.68043
Klej tkankowy Vetbond3M, St Paul, MN, USA202402AXZszyj ranę zwierzęcia
Labirynt YShenzhen RWD Life Science Inc.63005Ocena przestrzennej pamięci roboczej myszy
2205022023090501, , SC230724B

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jiang, J. Y., et al. Traumatic brain injury in china. Lancet Neurol. 18 (3), 286-295 (2019).
  2. Naumenko, Y., Yuryshinetz, I., Zabenko, Y., Pivneva, T. Mild traumatic brain injury as a pathological process. Heliyon. 9 (7), e18342(2023).
  3. Zhao, Q., Zhang, J., Li, H., Li, H., Xie, F. Models of traumatic brain injury-highlights and drawbacks. Front Neurol. 14, 1151660(2023).
  4. Grant, D. A., et al. Repeat mild traumatic brain injury in adolescent rats increases subsequent β-amyloid pathogenesis. J Neurotrauma. 35 (1), 94-104 (2018).
  5. Clark, A. L., et al. Repetitive mtbi is associated with age-related reductions in cerebral blood flow but not cortical thickness. J Cereb Blood Flow Metab. 41 (2), 431-444 (2021).
  6. Mcallister, T., Mccrea, M. Long-term cognitive and neuropsychiatric consequences of repetitive concussion and head-impact exposure. J Athl Train. 52 (3), 309-317 (2017).
  7. Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nat Rev Neurosci. 14 (2), 128-142 (2013).
  8. Pham, L., et al. proteomic alterations following repeated mild traumatic brain injury: Novel insights using a clinically relevant rat model. Neurobiol Dis. 148, 105151(2021).
  9. Fehily, B., Fitzgerald, M. Repeated mild traumatic brain injury: Potential mechanisms of damage. Cell Transplant. 26 (7), 1131-1155 (2017).
  10. Ma, X., Aravind, A., Pfister, B. J., Chandra, N., Haorah, J. Animal models of traumatic brain injury and assessment of injury severity. Mol Neurobiol. 56 (8), 5332-5345 (2019).
  11. Freeman-Jones, E., Miller, W. H., Work, L. M., Fullerton, J. L. Polypathologies and animal models of traumatic brain injury. Brain Sci. 13 (12), 1709(2023).
  12. Petersen, A., Soderstrom, M., Saha, B., Sharma, P. Animal models of traumatic brain injury: A review of pathophysiology to biomarkers and treatments. Exp Brain Res. 239 (10), 2939-2950 (2021).
  13. Ouyang, W., et al. Modified device for fluid percussion injury in rodents. J Neurosci Res. 96 (8), 1412-1429 (2018).
  14. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protoc. 5 (2), 201-208 (2010).
  15. Liu, Y., Fan, Z., Wang, J., Dong, X., Ouyang, W. Modified mouse model of repeated mild traumatic brain injury through a thinned-skull window and fluid percussion. J Neurosci Res. 101 (10), 1633-1650 (2023).
  16. Bolton-Hall, A. N., Hubbard, W. B., Saatman, K. E. Experimental designs for repeated mild traumatic brain injury: Challenges and considerations. J Neurotrauma. 36 (8), 1203-1221 (2019).
  17. Aleem, M., Goswami, N., Kumar, M., Manda, K. Low-pressure fluid percussion minimally adds to the sham craniectomy-induced neurobehavioral changes: Implication for experimental traumatic brain injury model. Exp Neurol. 329, 113290(2020).
  18. Katz, P. S., Molina, P. E. A lateral fluid percussion injury model for studying traumatic brain injury in rats. Methods Mol Biol. 1717, 27-36 (2018).
  19. Xiong, B., et al. Precise cerebral vascular atlas in stereotaxic coordinates of whole mouse brain. Front Neuroanat. 11, 128(2017).
  20. Hoogenboom, W. S., et al. Evolving brain and behaviour changes in rats following repetitive subconcussive head impacts. Brain Commun. 5 (6), 316(2023).
  21. Lipton, M. L., et al. Soccer heading is associated with white matter microstructural and cognitive abnormalities. Radiology. 268 (3), 850-857 (2013).
  22. Rubin, T. G., et al. Mri-defined white matter microstructural alteration associated with soccer heading is more extensive in women than men. Radiology. 289 (2), 478-486 (2018).
  23. Mcinnes, K., Friesen, C. L., Mackenzie, D. E., Westwood, D. A., Boe, S. G. Mild traumatic brain injury (mtbi) and chronic cognitive impairment: A scoping review. PLoS One. 12 (4), e0174847(2017).
  24. Marschner, L., et al. Single mild traumatic brain injury results in transiently impaired spatial long-term memory and altered search strategies. Behav Brain Res. 365, 222-230 (2019).
  25. Hoogenboom, W. S., Branch, C. A., Lipton, M. L. Animal models of closed-skull, repetitive mild traumatic brain injury. Pharmacol Ther. 198, 109-122 (2019).
  26. Cunningham, J., Broglio, S. P., O'grady, M., Wilson, F. History of sport-related concussion and long-term clinical cognitive health outcomes in retired athletes: A systematic review. J Athl Train. 55 (2), 132-158 (2020).
  27. Fidan, E., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in the developing brain: Effects on long-term functional outcome and neuropathology. J Neurotrauma. 33 (7), 641-651 (2016).
  28. Nguyen, T., et al. Repeated closed-head mild traumatic brain injury-induced inflammation is associated with nociceptive sensitization. J Neuroinflammation. 20 (1), 196(2023).
  29. Ren, H., et al. Enriched endogenous omega-3 fatty acids in mice ameliorate parenchymal cell death after traumatic brain injury. Mol Neurobiol. 54 (5), 3317-3326 (2017).
  30. Lillie, E. M., Urban, J. E., Lynch, S. K., Weaver, A. A., Stitzel, J. D. Evaluation of skull cortical thickness changes with age and sex from computed tomography scans. J Bone Miner Res. 31 (2), 299-307 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Modified Mouse Model of Repetitive Mild Traumatic Brain Injury Incorporating Thinned-Skull Window and Fluid Percussion
Posted by JoVE Editors on 6/04/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66440

Tagi

Powtarzaj ce si urazy m zgumysi model TBIuraz przez uderzenie cieczzamkni ty uraz czaszkimechanizmy neuropatologiczneanaliza behawioralnaanaliza histologicznabarwienie hematoksylin i eozyn

Powiązane artykuły