Artykuł metodologiczny

Wykrywanie i izolacja Campylobacter spp. z surowego mięsa

3.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66462

⸱

23 lutego 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Characterization and Interventions for Foodborne Pathogens Research Unit, Eastern Regional Research Center, Agricultural Research Service (ARS), United States Department of Agriculture (USDA)

W tym artykule

Podsumowanie

Campylobacter jest główną przyczyną bakteryjnego zapalenia żołądka i jelit przenoszonego przez żywność na całym świecie. Pomimo tego, że zakłady wprowadzają środki mające na celu zmniejszenie rozpowszechnienia w swoich obiektach, skażone produkty konsekwentnie docierają do konsumentów. Technika opracowana w ciągu ostatnich dwunastu lat rozwiązuje problemy związane z ograniczeniami istniejących metod izolowania i wykrywania Campylobacter spp. z surowego mięsa.

Streszczenie

Ten artykuł przedstawia szybki, ale solidny protokół izolowania Campylobacter spp. z surowego mięsa, skupiając się szczególnie na Campylobacter jejuni i Campylobacter coli. Protokół opiera się na ustalonych metodach, zapewniając zgodność z dominującymi technikami stosowanymi przez organy regulacyjne, takie jak Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) i Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (USDA) w USA, a także Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna (ISO) w Europie. Centralnym elementem tego protokołu jest zebranie płukania, które jest zagęszczane i ponownie zawieszane w pożywce Bolton Broth zawierającej krew końską. Udowodniono, że pożywka ta ułatwia regenerację zestresowanych komórek Campylobacter i skraca wymagany czas wzbogacania o 50%. Wzbogacone próbki są następnie przenoszone na membrany nitrocelulozowe na płytkach brucelozy. Aby poprawić czułość i swoistość metody, oceniono membrany filtracyjne o wielkości porów 0,45 μm i 0,65 μm. Dane wykazały 29-krotny wzrost odzysku komórek przy użyciu filtra o wielkości porów 0,65 μm w porównaniu z filtrem o wielkości porów 0,45 μm bez wpływu na swoistość. Wysoce ruchliwe cechy Campylobacter pozwalają komórkom aktywnie przemieszczać się przez filtry membranowe w kierunku podłoża agarowego, co umożliwia skuteczną izolację czystych kolonii Campylobacter. Protokół obejmuje multipleksowy ilościowy test reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (mqPCR) w celu identyfikacji izolatów na poziomie gatunku. Ta technika molekularna oferuje niezawodny i skuteczny sposób identyfikacji gatunków. Badania przeprowadzone w ciągu ostatnich dwunastu lat z udziałem mięsa sprzedawanego w handlu detalicznym wykazały zdolność tej metody do poprawy odzysku Campylobacter z naturalnie zanieczyszczonych próbek mięsa w porównaniu z obecnymi metodami referencyjnymi. Co więcej, protokół ten charakteryzuje się skróconym czasem przygotowania i przetwarzania. W rezultacie stanowi obiecującą alternatywę dla skutecznego odzyskiwania Campylobacter z mięsa. Co więcej, procedurę tę można bezproblemowo zintegrować z metodami opartymi na DNA, ułatwiając szybkie badania przesiewowe próbek dodatnich wraz z kompleksową analizą sekwencjonowania całego genomu.

Wprowadzenie

Campylobacter spp. są główną przyczyną bakteryjnego zapalenia żołądka i jelit na całym świecie, z szacunkową liczbą 800 milionów przypadków rocznie1. Jako główna bakteria odzwierzęca, Campylobacter naturalnie kolonizuje przewód pokarmowy wielu różnych zwierząt, w tym dzikich ptaków, zwierząt gospodarskich i zwierząt domowych2. Podczas uboju lub przetwarzania żywności Campylobacter spp. często zanieczyszcza tusze lub produkty mięsne3. Kampylobakterioza jest zwykle związana ze spożyciem niedogotowanego drobiu lub zanieczyszczeniem krzyżowym innych produktów spożywczych przez surowe soki drobiowe2. Może powodować poważne powikłania, takie jak zespół Guillaina-Barrégo, reaktywne zapalenie stawów i posocznica u osób z obniżoną odpornością4. Wykrywanie i izolowanie Campylobacter ze źródeł żywności, zwłaszcza produktów drobiowych, ma zasadnicze znaczenie dla nadzoru nad zdrowiem publicznym, badania epidemii i oceny ryzyka.

Konwencjonalne metody oparte na kulturach to tradycyjne i standardowe metody wykrywania Campylobacter5,6. Istnieje jednak kilka ograniczeń, w tym długi czas inkubacji (48 godzin lub więcej), niska czułość (do 50%) i nie obejmują wszystkich szczepów (niektóre zestresowane komórki Campylobacter mogą nie rosnąć dobrze lub wcale w pożywce)7. Metody molekularne, takie jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), są szybsze i bardziej czułe niż metody oparte na hodowlach, ale nie dostarczają żywotnych izolatów do dalszej charakterystyki8,9.

Metody immunologiczne są alternatywnymi i uzupełniającymi metodami wykrywania Campylobacter. Są one szybkie, proste i wszechstronne, ale mają również kilka ograniczeń, w tym reaktywność krzyżową (niektóre przeciwciała mogą wiązać się z bakteriami innymi niż Campylobacter lub innymi substancjami, które mają podobne antygeny), niską swoistością (niektóre przeciwciała mogą nie wiązać się ze wszystkimi szczepami Campylobacter lub serotypami) oraz wymagania dotyczące przygotowania próbek (metody immunologiczne często wymagają wstępnej obróbki próbek w celu usunięcia substancji zakłócających w celu wzmocnienia wiązania przeciwciał)10.

W obrębie rodzaju Campylobacter, C. jejuni i C. coli powodują większość infekcji u ludzi Campylobacter (odpowiednio 81% i 8,4%)11. Obie są spiralnymi, mikroaerofilnymi i termofilnymi bakteriami zawierającymi wić jednobiegunową lub wić dwubiegunową. Rotacja wici na każdym biegunie jest uważana zarówno za główną siłę napędową jej charakterystycznej ruchliwości korkociągu, jak i za kluczową dla jej patogenezy, ponieważ umożliwia bakterii przepływanie przez lepką błonę śluzową przewodu pokarmowego gospodarza. Ruchliwość Campylobacter jest kontrolowana przez system chemosensoryczny, który pozwala komórkom przemieszczać się w kierunku sprzyjających środowisk12,13. Opierając się na morfologii komórek i cechach fizjologicznych Campylobacter, w kilku badaniach wykorzystano filtrację membranową do izolacji Campylobacter spp. z próbek kałowych i środowiskowych14,15,16.

To badanie przedstawia szybki i solidny protokół izolacji, a następnie wykrywania C. jejuni i C. coli z surowego mięsa, który przezwycięża wady istniejących metod i oferuje kilka zalet. Wstępne kolonie można potwierdzić jako Campylobacter spp. za pomocą różnych metod, takich jak mikroskopia, testy biochemiczne (np. testy aktywności katalazy i oksydazy) lub metody molekularne6. Metoda identyfikuje izolaty na poziomie gatunku za pomocą multipleksowego testu PCR w czasie rzeczywistym (mqPCR), który jest ukierunkowany na geny unikalne dla C. jejuni i C. coli. Ta metoda jest stosunkowo niedroga, szybka i selektywna, dzięki czemu nadaje się do stosowania w różnych warunkach, w tym w zakładach przetwórstwa spożywczego, laboratoriach klinicznych i laboratoriach badawczych.

Protokół

Wszystkie prace związane z tym protokołem powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC), aby utrzymać warunki aseptyczne i zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia próbki lub narażenia operatora na patogeny mikrobiologiczne. Podczas przenoszenia próbek na zewnątrz BSC należy używać szczelnych pojemników, aby zapobiec rozlaniu w przypadku przypadkowego upuszczenia, zachowując integralność próbki. Zaleca się, aby przez cały czas trwania procedury stosowano składniki jednorazowego użytku, aby ograniczyć możliwość zanieczyszczenia krzyżowego. W przypadkach, gdy produkty jednorazowego użytku nie są możliwe, przed użyciem upewnij się, że cały sprzęt i materiały są sterylne. Właściwa gospodarka odpadami ma kluczowe znaczenie; Wszystkie zużyte elementy jednorazowego użytku należy wyrzucić jako odpady stanowiące zagrożenie biologiczne. Autoklaw materiałów przed wyrzuceniem, aby zapewnić odpowiednią sterylizację i uniknąć przechowywania potencjalnie niebezpiecznych materiałów. Przestrzeganie tych środków ostrożności nie tylko chroni integralność próbki, ale także minimalizuje ryzyko narażenia operatora na patogeny mikrobiologiczne. Rysunek 1 przedstawia przebieg procesu przygotowania próbki, selektywnego wzbogacania, izolacji opartej na filtrach i różnicowania mqPCR gatunków Campylobacter. Plik uzupełniający 1 przedstawia bardziej szczegółowy przepływ pracy i obrazy w całym procesie.

1. Przygotowanie próbek mięsa

  1. Pobieranie próbek mięsa
    1. Kupuj różne opakowania świeżego mięsa, w tym udka z kurczaka, skrzydełka, podudzia i wątróbki od lokalnych sprzedawców.
    2. Wszystkie próbki przenieść do magazynu w temperaturze 4 °C i przetworzyć w ciągu 24 godzin od otrzymania.
      UWAGA: Przechowywanie świeżych próbek w niższych temperaturach, takich jak poniżej zera, wpłynie na regenerację.
  2. Przetwarzanie próbek mięsa
    1. Postępuj zgodnie ze stosunkiem składników zalecanym w wytycznych dotyczących pobierania próbek FSIS6,17.
    2. Z każdego opakowania pokrój 450 g kawałków kurczaka i umieść je w woreczku stomacher (patrz Tabela Materiałów).
      UWAGA: Zaleca się stosowanie worków stomacherowych, ponieważ mają one wystarczającą wytrzymałość mechaniczną, aby zapewnić dalsze procesy i nie pękają ani nie przeciekają.
    3. Przygotuj buforowaną wodę peptonową (BPW).
      1. Rozpuścić 20 g proszku (patrz Tabela Materiałów) w 1 l oczyszczonej wody. Roztwór należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut. Rozcieńczyć roztwór w sterylnej wodzie do stężenia 0,1%.
    4. Dodaj 200 ml 0,1% BPW do torebki stomachera zawierającej kurczaka.
    5. Ręcznie masować/dotykać próbkę od zewnątrz worka stomachera przez 2 minuty.
    6. Zbierz cały płyn do płukania kurczaka z filtrowanej strony worka za pomocą zmotoryzowanego sterownika pipet (patrz tabela materiałów).
    7. Przelej płukanie kurczaka do sterylnych butelek wirówek. Wirować przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Ostrożnie zebrać supernatant za pomocą zmotoryzowanego kontrolera pipet z jednorazową plastikową pipetą serologiczną o pojemności 25 ml. Unikaj naruszania pelletu.
    9. W razie potrzeby powtórzyć proces, aby upewnić się, że cały supernatant został usunięty.
    10. Zebrać supernatant należy wyrzucić.

2. Selektywne wzbogacanie Campylobacter z surowego mięsa

  1. Przygotowanie bulionu Bolton z suplementami
    1. Rozpuścić 13,8 g proszku (patrz tabela materiałów) w 500 ml oczyszczonej wody. Sterylizować bulion w autoklawie przez 15 minut w temperaturze 121 °C.
    2. Dodaj 25 ml lakowanej krwi końskiej (patrz tabela materiałów) do wysterylizowanych 500 ml bulionu Bolton.
      UWAGA: Dodatek krwi konia działa jak środek gaszący tlen, pomagając w odzyskiwaniu uszkodzonych komórek Campylobacter z matrycy pokarmowej.
    3. Rozpuścić 1 fiolkę suplementu antybiotykowego (cefoperazon, cykloheksymid, trimetoprim i wankomycyna, patrz tabela materiałów) w 5 ml 50% etanolu.
    4. Dodaj odtworzony suplement antybiotykowy do bulionu Bolton.
  2. Procedura wzbogacania
    1. Zawiesić granulkę w 50 ml bulionu Bolton zawierającego lakowaną krew końską i antybiotyki.
    2. Umieść próbki (z poluzowanymi nakrętkami) w szczelnie zamkniętym pojemniku, w którym znajduje się mieszanina gazów o stężeniu 85% N2 , 10% CO2 i 5%O2 .
      1. Upewnij się, że nakrętka jest luźna, ale pojemnik jest szczelnie zamknięty, aby zapewnić mikroaerofilny i ciepłolubny wzrost Campylobacter.
        UWAGA: Zestawy gazowe, które utrzymują atmosferę na poziomie 85% N2, 10% CO2 i 5% O2 mogą być używane, gdy komory środowiskowe nie są dostępne.
      2. Próbki należy inkubować w temperaturze 42 °C przez 24 godziny.

3. Izolacja i oczyszczanie C. jejuni i C. coli z surowego kurczaka

  1. Przygotowanie płytek agarowych Brucella
    1. Rozpuścić 28 g proszku z brucelozy (patrz tabela materiałów) w 1 l oczyszczonej wody. Rozpuść 15 g agaru w roztworze Brucelli.
    2. Sterylizować agar Brucella przez autoklawowanie przez 15 minut w temperaturze 121 °C. Schłodzić mieszaninę pożywki z agarem w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C.
    3. Wlej 20 ml agaru Brucella do każdej szalki Petriego o średnicy 100 mm.
  2. Metoda filtracji i hodowla kolonii
    1. Ocenić wpływ wilgoci na Campylobacter przechodzącą przez filtry, susząc płytki agarowe Brucella z otwartymi pokrywkami w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 0 godzin, 1 godzinę, 2 godziny i 3 godziny.
    2. Przygotować kontrolę bez filtra, bezpośrednio rozprowadzając 80 μl próbki na płytce agarowej Brucella.
  3. Umieść filtr z octanu celulozy (0.45 μm lub 0.65 wielkości porów, patrz Tabela materiałów) na środku płytki agarowej Brucella.
  4. Odpipetować 4 krople/filtr i 20 μl/kroplę wzbogaconej próbki na filtr.
    1. Umieść krople w pobliżu środka filtra, aby upewnić się, że ciecz, która dociera do płytki, przechodzi przez filtr, a nie wokół filtra.
    2. Umieść krople w taki sposób, aby nie rozprzestrzeniały się i nie gromadziły.
  5. Inkubuj krople w temperaturze pokojowej przez 15 minut i ostrożnie wyjmij filtry.
    UWAGA: Ten krok daje wystarczająco dużo czasu, aby komórki Campylobacter przeszły przez błonę i dotarły do podłoża agarowego bez nadmiernego suszenia.
  6. Inkubować płytki w temperaturze 42 °C przez około 24 godziny w warunkach mikrotlenowych opisanych wcześniej.
  7. Wybierz charakterystyczne kolonie Campylobacter o określonych cechach.
    UWAGA: Kolonie Campylobacter są zazwyczaj okrągłe z gładkimi krawędziami, błyszczące i półprzezroczyste żółtawe lub różowawe kolor6.
  8. Umieść kolonie na płytkach agarowych Brucella w celu oczyszczenia. Powtarzaj ten krok, aż uzyskasz płytki o pojedynczej jednolitej morfologii kolonii.
  9. Przygotuj próbki do długotrwałego przechowywania.
    1. Przygotuj bulion Bolton zgodnie z wcześniejszym opisem. Dodaj jedną kolonię z płytki o jednolitej morfologii kolonii.
    2. Rosnąć przez noc (24 h) w opisanych wcześniej warunkach mikroaerofilnych. Dodać 900 μl nocnej hodowli do 2 ml kriowialu zawierającego 100 μl DMSO.
    3. Szybko schłodzić w suchej kąpieli lodowo-etanolowej (ok. -72 °C) przez 10 minut. Przenieść do zamrażarki o temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.

4. Identyfikacja gatunków C. jejuni i C. coli

  1. Przeprowadź identyfikację na poziomie gatunku C. jejuni i C. coli za pomocą wcześniej opracowanego testu multiplex qPCR (mqPCR) 18,19.
    1. Wykonaj szybką lizę komórek i ekstrakcję genomowego DNA w formacie 96-dołkowej.
      UWAGA: Zdecydowanie zaleca się rozważenie użycia zestawów komercyjnych (patrz Tabela materiałów) w celu zapewnienia, że próbka jest wystarczająco wolna od znanych inhibitorów PCR.
      1. Oczyszczone kolonie Campylobacter rozpuścić w 100 μl roztworu ekstrakcyjnego.
      2. Próbki należy poddać lizie w temperaturze 99 °C przez 10 minut, a następnie schłodzić w temperaturze 20 °C przez 2 minuty w termocyklerze.
      3. Odwirować płytkę o masie 8 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć 2 μl podwielokrotności supernatantu do testu mqPCR.
      4. Przygotować mieszaninę reakcyjną o objętości 20 μl składającą się z 10 μl 2x Master Mix, 2,0 μl próbki DNA, 104 kopii matrycy wewnętrznej kontroli amplifikacji (IAC) i 200 nM każdego startera i sondy (patrz tabela materiałów).
        UWAGA: Startery i sondy hipO i cdtA są wyłącznymi genami docelowymi odpowiednio dla C. jejuni i C. coli. IAC składa się z 79-bp segmentu DNA ludzkiego adenowirusa i jest uwzględniony jako kontrola pozytywna w celu zapewnienia stałej aktywności polimerazy DNA we wszystkich próbkach.
    2. Załaduj wszystkie próbki w trzech egzemplarzach do 96-dołkowej płytki optycznej pokrytej folią optyczną i umieść je w systemie Real-Time PCR (patrz Tabela materiałów).
      1. Rozpocząć aktywację polimerazy DNA w temperaturze gorącego startu w temperaturze 95 °C przez 10 minut, a następnie przeprowadzić 40 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 15 s i wyżarzanie/przedłużanie w temperaturze 60 °C przez 1 minutę.

5. Wylicz zawiesiny komórek

  1. Wylicz zawiesiny komórek za pomocą procedury płytki kroplowej 6 x 620. Zapoznaj się z plikiem uzupełniającym 1, aby zapoznać się z obrazami przedstawiającymi metodę płytki kroplowej 6 x 6.
  2. Suszyć na powietrzu płytki agarowe Brucella ze zdjętą pokrywką w okapie z przepływem laminarnym przez 45 minut.
  3. Dodać 200 μl zawiesiny bakteryjnej do sześciu rzędów (A-F) w pierwszej kolumnie 96-dołkowej płytki.
  4. Rozprowadzić 180 μl pożywki Brucella w sześciu rzędach pozostałych kolumn (2-12).
  5. Przygotować dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia, używając transferów 20 μl.
    1. Na przykład przenieść 20 μl próbki z kolumny pierwszej do kolumny drugiej. Powtórzyć ten proces dla co najmniej 6 kolumn
      2. .
    2. Refluks wymieszać każdą zawiesinę dziesięć razy za pomocą pipety, zmieniając końcówki między każdym transferem.
  6. Za pomocą pipety wielokanałowej nanieś 7 μl kropli z sześciu rzędów kolumny na powierzchnię płytki agarowej Brucella.
  7. Powtórz tę czynność, aby utworzyć tablicę 6 x 6, upewniając się, że wiersze są technicznymi replikacjami między kolumnami.
  8. Suszyć płytki na powietrzu przez 5 minut, a następnie odwrócić płytkę. Inkubować płytki w temperaturze 42 °C przez 24 godziny.
  9. Policz liczbę kolonii w każdym reprezentatywnym rozcieńczeniu.

Wyniki

Wpływ wilgotności płytek z agarem Brucella na pasywną filtrację Campylobacter
Campylobacter posiada mały genom i brakuje mu kilku genów odpowiedzi na stres, które powszechnie występują u innych bakterii, takich jak E. coli O157:H7 i Salmonella. W związku z tym jest on bardziej wrażliwy na różne stresy środowiskowe i nie toleruje odwodnienia ani poziomu tlenu w otoczeniu. Z drugiej strony, zbyt wilgotne podłoże agarowe może doprowadzić do zalania filtra. Powoduje to nie tylko dyfuzję próbki poza obszar filtra, ale także wydłuża czas ekspozycji na tlen21.

Aby określić odpowiednie warunki dla izolacji Campylobacter metodą filtracyjną, płytki z agarem Brucella suszono z otwartymi pokrywkami przez 0 h, 1 h, 2 h i 3 h w komorze bezpieczeństwa biologicznego, a następnie oceniano wydajność przenikania komórek Campylobacter przez filtr o rozmiarze porów 0,65 µm. Cztery aliquoty po 20 µL kultur C. jejuni S27 o stężeniach 1,53 x 104 i 1,53 x 105 CFU/mL naniesiono pipetą na każdą membranę filtracyjną umieszczoną na płytce Brucella. Po 15 min penetracji filtry usunięto, a płytki inkubowano przez noc w celu wzrostu komórek.

Komórki z 5 powtórzonych szalek następnie policzono i odnotowano w Tabuili 1. Wyniki wykazały, że szalki agarowe suszone przez 2 h i 3 h dawały podobne rezultaty, z niemal taką samą liczbą komórek odzyskanych w drodze filtracji pasywnej. Zauważalnie, szalki suszone w tych warunkach przez 0 h i 1 h nie pozwoliły komórkom na pełne przejście przez membranę w zastosowanym 15-minutowym przedziale czasowym.

Porównanie membran filtracyjnych o różnych wielkościach porów do izolacji Campylobacter z wątrób drobiowych
Biorąc pod uwagę rozmiary komórek Campylobacter (0,5-5 µm długości i 0,2-0,9 µm szerokości) oraz szeroki zakres rozmiarów cząstek żywności, przetestowano filtry z octanu celulozy o wielkościach porów 0,45 µm i 0,65 µm pod kątem wydajności przenikania Campylobacter przy 15-minutowym czasie inkubacji. Do eksperymentu wykorzystano próbki żywności składające się z 450 g wątrób drobiowych, wzbogaconych o 153 CFU C. jejuni, a następnie inkubowanych przez noc w celu namnożenia. Jako kontrolę bez filtra równolegle przeprowadzono bezpośrednie wysiewanie próbki z namnażania. Wyniki (Rysunek 2) z 5 powtórnych płyt konsekwentnie wykazały, że filtr o wielkości porów 0,65 µm pozwolił na przeniknięcie większej liczby komórek niż filtry o wielkości porów 0,45 µm, co zaowocowało około 29-krotnym wzrostem liczby uzyskanych komórek. Filtr o wielkości porów 0,45 µm zatrzymał zbyt wiele komórek na górnej stronie membrany, co skutkowało znacznie niższą odzyskowalnością Campylobacter z żywności w porównaniu do filtra o wielkości porów 0,65 µm. Zgodnie z oczekiwaniami, na płytach kontrolnych bez filtra wyrósł gęsty nalot różnych organizmów tła.

Zastosowanie filtracji pasywnej w izolacji Campylobacter z kurczaka z handlu detalicznego
Ze względu na nietypową ruchliwość komórek Campylobacter, do izolacji C. jejuni i C. coli z produktów mięsnych z handlu detalicznego, które są zazwyczaj zanieczyszczone licznymi organizmami tła, wybrano technikę filtracji pasywnej. W latach 2014-2023 z różnych lokalnych supermarketów zebrano łącznie 79 opakowań surowego mięsa, w tym różne części mięsa z kurczaka, wątróbki drobiowe, wołowe i cielęce. Z każdego opakowania pobrano próbkę o masie 450 g w celu izolacji Campylobacter spp. Dzięki połączeniu selektywnego namnażania Campylobacter w pożywce Bolton Broth z dodatkiem krwi oraz filtracji pasywnej komórek przez filtr z octanu celulozy o rozmiarze porów 0.65 µm bezpośrednio na płytkę z agarem Brucella, pomyślnie wyizolowano 49 szczepów Campylobacter z 79 próbek mięsa (Tabela 2). Rysunek 3 przedstawia wynik izolacji nowego szczepu Campylobacter z wątróbek drobiowych. Metoda ta wielokrotnie okazała się czuła, specyficzna i kosztowo efektywna.

Identyfikacja i różnicowanie izolatów C. jejuni oraz C. coli
W celu weryfikacji rodzaju i różnicowania gatunków izolatów Campylobacter uzyskanych z surowego mięsa zastosowano test multiplex qPCR amplifikujący specyficzne geny docelowe (hipO i cdtA) dla C. jejuni i C. coli oraz wewnętrzną kontrolę amplifikacji (IAC). IAC została uwzględniona jako wskaźnik wyników fałszywie ujemnych podczas jednoczesnej amplifikacji wielu genów. Test przeprowadzono w formacie 96-dołkowym z szybką lizą komórek i ekstrakcją DNA przy użyciu dostępnego komercyjnie odczynnika (patrz Tabela materiałów). Tabela 2 podsumowuje wyniki identyfikacji gatunkowej szczepów C. jejuni i C. coli. Jako dodatkową weryfikację wyniki sekwencjonowania całego genomu potwierdziły gatunki wszystkich izolatów (dane nie przedstawiono).

Metoda izolacji Campylobacter; proces hodowli w warunkach mikroaerobowych; multiplex qPCR do identyfikacji gatunkowej; schemat eksperymentu.
Rysunek 1: Schemat postępowania w celu izolacji i identyfikacji gatunków Campylobacter z mięsa detalicznego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Porównanie wzrostu kolonii; wykres słupkowy; wpływ wielkości filtra na liczbę kolonii; analiza mikrobiologiczna.
Rycina 2: Wpływ wielkości filtra na odzysk Campylobacter. Wyniki wskazują, że filtr 0.65 µm pozwala na odzysk średnio 900 ± 138 kolonii, podczas gdy filtr 0.45 µm odzyskuje 31 ± 7 kolonii. Wyniki uzyskano dla N = 20 (5 płytek z 4 kroplami/płytka), a test t-Studenta wskazuje, że średnie różnią się statystycznie (p < 0.0001). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Eksperyment wzrostu mikrobów na płytkach agarowych, schemat testu dyfuzji antybiotyków, strefa zahamowania wzrostu.
Rysunek 3: Izolacja Campylobacter poprzez filtrację pasywną wzbogaconych próbek z drobiu. (A) Przedstawia cztery krople wzbogaconej próbki o objętości 20 µL naniesione na membranę filtracyjną z nitrocelulozy. Obraz został zarejestrowany podczas 15 min filtracji pasywnej. (B) Przedstawia płytkę po usunięciu filtra nitrocelulozowego. Cztery plamy wskazują miejsca, w których wzbogacona próbka przeniknęła przez membranę. (C) Przedstawia płytkę po 24 h inkubacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 1: Wpływ czasu suszenia płytek z agarem Brucella na filtrację pasywną C. jejuni. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Szczepy C. jejuni i C. coli wyizolowane z surowego mięsa. W okresie od 2008 do 2023 roku z 79 opakowań mięsa obejmujących 24 unikalne produkty detaliczne wyizolowano 36 szczepów C. jejuni i 13 szczepów C. coli. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 1: Zdjęcia z przebiegu procesów izolacji i liczenia. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Znaczenie protokołu
C. jejuni i C. coli były dwoma głównymi gatunkami Campylobacter, które okazały się powszechne w wątrobach drobiu22 i zwierząt23,24. W tym badaniu próbki mięsa części kurczaka (nogi, skrzydełka i uda), wątróbek drobiowych i wątróbek wołowych zostały losowo pobrane w różnych okresach czasu, z różnych sklepów detalicznych i producentów w celu izolacji Campylobacter spp. Spośród 49 wszystkich wyizolowanych szczepów Campylobacter, 36 zidentyfikowano jako C. jejuni, a 13 jako C. coli, przy czym nie znaleziono żadnego innego gatunku Campylobacter, co jest zgodne z innymi doniesieniami25.

Test opiera się na morfologii komórek w kształcie spirali i charakterystycznej ruchliwości przypominającej korkociąg Campylobacter spp. Do oddzielenia Campylobacter od mieszaniny organizmów tła zastosowano prostą, ale skuteczną, pasywną technikę filtracji 26,27, która wykorzystywała morfologię komórek w kształcie spirali (długie, smukłe, 0,2-0,9 na 0,5-5 μm) i silną ruchliwość korkociągu. Wysoka ruchliwość Campylobacter pozwoliła komórkom przejść przez filtry membranowe i przemieścić się w kierunku sprzyjających warunków występujących w pożywce agarowej, podczas gdy inne mikroorganizmy tła z produktów mięsnych nie były w stanie przez nie przejść. Ta metoda jest stosunkowo niedroga, szybka i selektywna, dzięki czemu nadaje się do stosowania w różnych warunkach, w tym w zakładach przetwórstwa spożywczego, laboratoriach klinicznych i laboratoriach badawczych.

Często cytowany pionierski artykuł stwierdza, że filtr 0,45 μm działał tak dobrze, że 0,65 μm nie było oceniane28. Wyniki niniejszego badania wskazują, że filtr o wielkości porów 0,65 μm działał znacznie lepiej niż filtr o wielkości porów 0,45 μm, co spowodowało 29-krotny wzrost liczby komórek odzyskanych po wzbogaceniu. Jest to ważne, ponieważ wybrane filtry nie wykazują zmniejszonej selektywności, jak wcześniej zgłaszano29. Ponadto, jak wiadomo, filtrowanie znacznie zmniejszy ilość odzyskiwanego Campylobacter w porównaniu z bezpośrednim posiewem30, dlatego zwiększenie wielkości porów poprawia regenerację mikroorganizmu, co jest zgodne z wcześniej zgłoszonymi odkryciami21. Jest to istotne, ponieważ wszystkie komórki, które przeszły przez filtry, utworzyły jednolite kolonie Campylobacter , co wskazuje, że oba filtry były wystarczające w zapobieganiu przedostawaniu się innych mikroflory i cząstek żywności. Dodatkowo, schemat blokowy FSIS7 zwraca uwagę na możliwość wydłużenia produkcji wyników dzięki ponownemu rozwarstwianiu izolatów na płytkach Campy-Cefex zawierających antybiotyki. W przeciwieństwie do tego, protokół opisany w tym manuskrypcie, który łączy w sobie stosowanie filtracji i selektywnego wzbogacania cefoperazonem, cykloheksymidem, trimetoprimem i wankomycyną, nie wymagał ponownego smugowania.

Obecnie stosowana metoda jest zgodna z obecnymi programami kontroli wyrywkowej i weryfikacji FSIS17. Ponieważ poziom zanieczyszczenia Campylobacter może być niski (153 jtk/450 g kurczaka), płukanie jest odwirowywane w celu czterokrotnego zagęszczenia próbki, co zwiększa czułość testu. Po 4-krotnym zagęszczeniu płukania, próbki są wzbogacane przez 48 godzin i poddawane badaniom przesiewowym za pomocą systemu detekcji molekularnej (MDS) w celu odtworzenia metody stosowanej przez laboratoria FSIS (dane nie pokazane). Warto zauważyć, że opisana metoda nie zdołała jeszcze zidentyfikować dodatnich szczepów w ciągu 24 godzin, które zostały wykryte przez system detekcji molekularnej przy użyciu 48 godzin wzbogacania (dane nie pokazane). Wreszcie, dodatkową zaletą tego protokołu jest to, że może on dostarczyć informacji związanych z gatunkami bakterii i zidentyfikować, czy Campylobacter to C.coli, C. jejuni czy C. lari, podczas gdy MDS przyjęty w MLG 41.07 może zapewnić tylko binarną odpowiedź pozytywną/negatywną dla Campylobacter.

Kroki krytyczne
Protokół izolacji i identyfikacji Campylobacter wymaga precyzji podczas wirowania, filtracji i analizy molekularnej. Dokładne rozcieńczenia, odpowiednie warunki inkubacji i skrupulatne przestrzeganie warunków testu qPCR mają kluczowe znaczenie dla wiarygodnej identyfikacji gatunków.

Jako bakteria mikroaerofilna Campylobacter jest bardzo delikatna i wrażliwa na różne stresy środowiskowe i wymaga wyjątkowo wybrednych warunków do wzrostu 31,32,33. W próbkach żywności zwykle poddawanych długim okresom transportu i przechowywania, wiele komórek Campylobacter jest być może w stanie uśpienia lub subletalnego/śmiertelnego uszkodzenia34,35. Dlatego ważne jest, aby odzyskać zestresowane komórki z ich matryc pokarmowych i wyhodować je do wyższego stężenia. W pierwszym etapie zabiegu zastosowaliśmy bulion Bolton Bulion uzupełniony krwią końskiej laki i antybiotykami w celu selektywnego wzbogacenia Campylobacter z pożywienia. Dodatkowa krew służyła jako środek gaszący tlen w celu przezwyciężenia niekorzystnych skutków wolnych rodników tlenowych36. Antybiotyki stosowano w celu zahamowania wzrostu mikroflory tła37.

Aby zminimalizować czas ekspozycji Campylobacter na tlen atmosferyczny w otoczeniu, wybrano 15-minutowy okres inkubacji, aby umożliwić komórkom przejście przez filtr. Również wilgotność płytki agarowej Brucella pod filtrem odgrywała ważną rolę w szybkości przejścia. W szczególności wyniki testów płytek agarowych suszonych przez 0 godzin, 1 godzinę, 2 godziny i 3 godziny sugerowały, że wysoka zawartość wilgoci w filtrze uniemożliwia przejście komórek. Równie ważne jest precyzyjne rozmieszczenie filtrów i kropli na płytkach i filtrach, co wpływa na powodzenie izolacji komórek.

Potencjalne pułapki i ograniczenia
Przedstawiając ustrukturyzowane podejście do izolowania i identyfikacji gatunków Campylobacter z surowych próbek kurczaków, na uwagę zasługuje kilka ograniczeń tego protokołu. Zanieczyszczenia zewnętrzne, niedostatecznie wysuszone płytki, zatkanie filtrów utrudniających ruch mikroorganizmów, uwięzienie mikroorganizmów w granulce, niepełne uszczelnienie komory atmosferycznej i krople rozprzestrzeniające się poza granice filtra to tylko niektóre z głównych pułapek.

Nieodpowiednie oddzielenie mikroorganizmów od powierzchni żywności lub ich zamknięcie w większej ilości próbki może utrudnić ich izolację przy użyciu tej metody. Ponadto poleganie na ruchliwości drobnoustrojów podczas przechodzenia przez filtry pasywne stanowi znaczące ograniczenie; Możliwe, że membrany filtracyjne zachowały niektóre mniej ruchliwe szczepy Campylobacter , ponieważ wykazano, że filtry mogą zmniejszać skuteczność wychwytywania patogenów mikrobiologicznych w żywności38. Dalsze ograniczenia obejmują wsadowy charakter procesów wirowania i filtracji, podatność na zapychanie filtra oraz nieefektywność dyspergowania powstałych granulek, co będzie miało wpływ na dokładność ładunków mikrobiologicznych. Ograniczenia te łącznie podkreślają potrzebę ostrożności i dodatkowych metodologii w celu zapewnienia kompleksowej analizy, zwłaszcza w przypadku różnych typów próbek lub poszukiwania możliwości wysokiej przepustowości.

Sugestie dotyczące rozwiązywania problemów
Aby zapobiec potencjalnym problemom, najpierw upewnij się, że wszystkie materiały są zgodne z niezbędnymi normami jakości i nie straciły ważności. Rozwiąż problemy z zatkanymi filtrami, potencjalnie stosując dodatkową filtrację w celu usunięcia wszelkich dużych zanieczyszczeń, które mogą ograniczać przejście Campylobacter przez membranę nitrocelulozową. W przypadku zaobserwowania zanieczyszczenia należy sprawdzić, czy krople nie zostały umieszczone zbyt blisko krawędzi filtra i czy ciecz nie mogła dotrzeć do agaru, przechodząc wokół filtra, a nie przez pory. Jeśli wzrost po wzbogaceniu jest niewystarczający, sprawdź, czy uszczelki pojemników atmosferycznych są szczelne i nie przeciekają.

Potencjalne udoskonalenie i rozbudowa
Badanie alternatywnych materiałów filtracyjnych może usprawnić przenikanie mikroorganizmów i umożliwić rozszerzenie tego protokołu do stosowania w izolowaniu innych ruchliwych mikroorganizmów z niejednorodnych mieszanin, takich jak żywność. Wskazane jest zidentyfikowanie kontroli w celu zachowania mniej ruchliwych wariantów Campylobacter bez negatywnego wpływu na swoistość. Ponadto, chociaż wykazano, że multipleksowany test qPCR zastosowany w tym badaniu ma zdolność do wykrywania C.lari18 innych gatunków Campylobacter , które są przedmiotem zainteresowania, można włączyć do tego testu.

Podsumowując, poprzez ocenę różnych parametrów i ustawień, ustalono odpowiednie warunki do izolacji opartej na filtrach i identyfikacji C. jejuni i C. coli z pożywienia na poziomie gatunkowym. Wykazano, że metoda jest czuła, specyficzna, solidna i opłacalna. Stosując go do prawdziwych próbek żywności, protokół był w stanie wyizolować 36 szczepów C. jejuni i 13 C. coli z 79 opakowań mięsa.

Protokół jest zgodny z dyrektywą FSIS 10,250.117, która określa procedurę pobierania próbek z surowych części kurczaka, oraz MLG 41.076 dotyczącą izolacji i identyfikacji Campylobacter. Dane sugerują, że 4-krotne zagęszczenie próbki i wzbogacenie jej przez 24 godziny, w połączeniu z filtracją i posiewem, daje izolowane, potwierdzone kolonie w ciągu 48 godzin, a nie 96 godzin. Protokół jest zgodny z metodami opartymi na DNA, takimi jak sekwencjonowanie genomu, w celu zapewnienia kompleksowej charakterystyki szczepów Campylobacter , w tym ich profili oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, przewidywań wirulencji i powiązań filogenetycznych. Protokół stanowi obiecującą alternatywę dla skutecznego odzyskiwania i izolowania Campylobacter spp. z surowego drobiu, co może ułatwić badania epidemiologiczne i interwencje w zakresie zdrowia publicznego.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy deklarują, że nie ma konfliktu interesów.

Podziękowania

Badania te były wspierane przez Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych, Służbę Badań Rolniczych (USDA-ARS), Narodowy Program 108, numery Systemu Informacji o Aktualnych Badaniach 8072-42000-093 i 8072-42000-094-000-D. Wzmianka o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych w tym artykule ma na celu wyłącznie dostarczenie konkretnych informacji i nie oznacza rekomendacji ani poparcia ze strony Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych. USDA jest dostawcą równych szans i pracodawcą.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agar - Środek krzepnący (Difco)Becton, Dickinson and Company (BD)281230
Waga analitycznaMettler ToledoJL602-G/LSprzęt 
Waga analitycznaMettler ToledoAB54-SSprzęt 
Antybiotyki suplementy cefoperazon, cykloheksymid, trimetoprim, wankomycynaOxoid Ltd.
SR0183E Pakiet do kontroli atmosfery Pak  (Campy, 85% N2, 10% CO2 i 5% O2)Becton, Dickinson and Company (BD)260680
Statek do kontroli atmosfery,  System pojemników GasPak EZ CampyPak Autoklaw Becton, Dickinson and Company (BD)260678
- Amsco Lab250, laboratoryjny sterylizator parowySteris plcLV-250Sprzęt 
Szafa bezpieczeństwa biologicznego, typ A2, oczyszczacz Logic+Labconco Corporation302411101Equipment 
Rosół z Boltona Oxoid Sp. z o.o.CM0983
Rosół z bruceli (Difco)Becton, Dickinson and Company (BD)211088
Buforowana woda peptonowaBio-Rad Laboratories Inc.
3564684 Wirówka Mikrowirówka 5424Eppendorf5424Wirówka sprzętowa
, Avanti J-25Beckman Coulter, Inc. Sprzęt
Udka, skrzydełka, podudzia, wątrobyLokalni sprzedawcy detaliczni
Ekstrakcja DNA - Odczynnik do przygotowania próbek PreMan Ultra Thermo Fisher Scientific Inc. 
Sonda FAM do hipO (Sequence 5'-TTGCAACCTCACTAGCAAAATCC
ACAGCT-3')		Zintegrowany filtr technologii DNA
- 0,45 i mikro; M Sterylny filtr z octanu celulozy DAWP04700Merck-Millipore LTD
- 0,65 &mikro; M Sterylny filtr z octanu celulozy Merck-Millipore LTDHAWG04700
starter do przodu dla cdtA (Sekwencja 5'-TGTCAAACAAAAAACACCAAGCT
T-3' ')		Zintegrowany starter do przodu DNA Technologies
dla hipO (Sekwencja 5'-TCCAAAATCCTCACTTGCCATT-3')Zintegrowany starter do przodu DNA Technologies
dla IAC (Sekwencja 5'-GGCGCCCTAACACATCT-3')Zintegrowane DNA Technologie
Sonda HEX do cdtA (Sekwencja 5'-AAAATTTCCCGCCATACCACTTG
TCCC-3')Zintegrowany		DNA Technologies
- Wytrząsarka z chłodzeniem Inova 4230Brunswick Scientific4230Sprzęt 
Pętla inokulacyjna - Pętla Combi  10&mikro; L oraz 1&mikro; L Fisher Scientific International, Inc22-363-602
Fragment DNA do wewnętrznej kontroli amplifikacji (IAC) (sekwencja 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTAT
GTGGTGGCATTGTCTTCTCCC
GTTGTAACTATCCACTGAGATG
TGTTAGGCGCGCC-3')		Zintegrowane technologie
Krew końska Remel Inc.R54072
Pipeta ręczna Pipet-Lite LTS Pipeta L-1000XLS+Mettler Toledo17014382Sprzęt
Pipeta ręczna Pipet-Lite LTS Pipeta L-100XLS+Mettler Toledo17014384Sprzęt
Pipeta ręczna Pipet-Lite LTS Pipeta L-10XLS+Mettler Toledo17014388Sprzęt
Pipeta ręczna Pipet-Lite LTS Pipeta L-200XLS+Mettler Toledo17014391Equipment
Pipeta ręczna Pipet-Lite LTS Pipeta L-20XLS+Mettler Toledo17014392Sprzęt
Pipeta ręczna Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+Mettler Toledo17013805Equipment
Pipeta ręczna Pipet-Lite Multi Pipette L8-20XLS+Mettler Toledo17013803Equipment
Butelka do przechowywania nośników -PYREX 1 L Kwadratowa Szklana  Butelka z nakrętką GL45Corning Inc.1396-1L
Butelka do przechowywania mediów -PYREX 2 L Okrągła butelka z szerokimi ustami, z zakrętką GLS80Corning Inc.1397-2LSprzęt Płytka
do mikromiareczkowania, płytka 96-dołkowa, płaskie dno, polistyren, 0,34 cm2, sterylny, 108/csZ707902MilliporeSigma
- Vortex Genie 2Scientific Industries Inc.SI-0236Sprzęt
Zmotoryzowany sterownik pipet, PIPETBOY2INTEGRA Biosciences Corp.Sprzęt PCR
Mastermix 2 razy; Ekspresja genu TaqMan Thermo Fisher Scientific Inc. 
Rotator szalki Petriego -  BioWORLD Gramofon do inokulacjiFisher Scientific International, Inc3489E20Sprzęt
Szalki Petriego z przezroczystą pokrywką (100 mm x 15 mm)Fisher Scientific International, IncFB0875713
Końcówki do pipet GP LTS 1000µ L S 768A/8Mettler Toledo 
30389273 Końcówki do pipet GP LTS 20µ L 960A/1030389270Mettler Toledo
GP LTS 200µ L F 960A/1030389276Mettler Toledo
sterylny zbiornik 25 ml używany z pipetami wielokanałowymiThermo Fisher Scientific Inc. 8093-11
System PCR w czasie rzeczywistym - 7500 System PCR w czasie rzeczywistym (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia)Sprzętowy
odwrotny starter do cdtA (Sekwencja 5'-CCTTTGACGGCATTATCTCCTT-3')Zintegrowany
do hipO (Sekwencja 5'-TGCACCAGTGACTATGAATAACG
A-3')		Zintegrowany starter odwrotny DNA Technologies
do IAC (Sekwencja 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA
-3')		Zintegrowane technologie DNA Pipety
serologiczne, pipety serologiczne Nunc (10 ml)Thermo Fisher Scientific Inc. 170356N
Pipety serologiczne, Pipety serologiczne Nunc (2 ml)Thermo Fisher Scientific Inc. 170372N
Pipety serologiczne, Pipety serologiczne Nunc (25 ml)Thermo Fisher Scientific Inc. 170357N
Pipety serologiczne, Pipety serologiczne Nunc (50 ml)Thermo Fisher Scientific Inc. 170376N
Rozsiewacz - Rozsiewacze komórkowe w kształcie litery L FisherbrandFisher Scientific International, Inc14-665-230
Torba stomacher, Nasco Whirl-Pak Write-On Homogenizator Blender Worki filtracyjneThermo Fisher Scientific Inc. 01-812
Sonda TAMRA do IAC (Sekwencja 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGCC
ACCA-3')		DNA Technologies
(system GeneAmp PCR 9700)SprzętBiosystems
- Elga Veolia Purelab Flex Sprzęt Elga LabWaterPF2XXXXM1-US
4318930Filtr inkubator New DNA Mieszalnik 4369542 Końcówki do pipet Zbiornik na odczynniki , odwrócony starter DNA Technologies Zintegrowany termocykler do filtracji wody w

Bibliografia

  1. Rushton, S. P., et al. Climate, human or environment: Individual-based modelling of Campylobacter seasonality and strategies to reduce disease burden. J Transl Med. 17 (1), 34(2019).
  2. Facciolà, A., et al. Campylobacter: From microbiology to prevention. J Prev Med Hyg. 58 (2), E79-E92 (2017).
  3. Perez-Arnedo, I., Gonzalez-Fandos, E. Prevalence of Campylobacter spp. In poultry in three spanish farms, a slaughterhouse and a further processing plant. Foods. 8 (3), 111(2019).
  4. Nachamkin, I., Allos, B. M., Ho, T. Campylobacter species and guillain-barré syndrome. Clin Microbiol Rev. 11 (3), 555-567 (1998).
  5. Department of Food Administration. Bacteriological analytical manual. Department of Food Administration. , (1992).
  6. USDA Office of Public Health Science. Isolating and identifying Campylobacter jejuni/coli/lari from poultry rinsate, sponge and raw product samples. Microbiology Laboratory Guidebook. , (2022).
  7. Singh, H., Rathore, R. S., Singh, S., Cheema, P. S. Comparative analysis of cultural isolation and PCR based assay for detection of Campylobacter jejuni in food and faecal samples. Braz J Microbiol. 42 (1), 181-186 (2011).
  8. Kralik, P., Ricchi, M. A basic guide to real time pcr in microbial diagnostics: Definitions, parameters, and everything. Front Microbiol. 8, (2017).
  9. Linton, D., Lawson, A. J., Owen, R. J., Stanley, J. PCR detection, identification to species level, and fingerprinting of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli direct from diarrheic samples. J Clin Microbiol. 35 (10), 2568-2572 (1997).
  10. Kabiraz, M. P., Majumdar, P. R., Mahmud, M. M. C., Bhowmik, S., Ali, A. Conventional and advanced detection techniques of foodborne pathogens: A comprehensive review. Heliyon. 9 (4), e15482(2023).
  11. Kaakoush, N. O., Castaño-Rodríguez, N., Mitchell, H. M., Man, S. M. Global epidemiology of Campylobacter infection. Clin Microbiol Rev. 28 (3), 687-720 (2015).
  12. Gilbreath, J. J., Cody, W. L., Merrell, D. S., Hendrixson, D. R. Change is good: Variations in common biological mechanisms in the epsilonproteobacterial genera Campylobacter and Helicobacter. Microbiol Mol Biol Rev. 75 (1), 84-132 (2011).
  13. Lertsethtakarn, P., Ottemann, K. M., Hendrixson, D. R. Motility and chemotaxis in campylobacter and helicobacter. Annu Rev Microbiol. 65, 389-410 (2011).
  14. Jokinen, C. C., et al. An enhanced technique combining pre-enrichment and passive filtration increases the isolation efficiency of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli from water and animal fecal samples. J Microbiol Methods. 91 (3), 506-513 (2012).
  15. Engberg, J., On, S. L., Harrington, C. S., Gerner-Smidt, P. Prevalence of Campylobacter, Arcobacter, Helicobacter, and Sutterella spp. In human fecal samples as estimated by a reevaluation of isolation methods for Campylobacters. J Clin Microbiol. 38 (1), 286-291 (2000).
  16. Lastovica, A. J., Le Roux, E. Efficient isolation of campylobacteria from stools. J Clin Microbiol. 38 (7), 2798-2799 (2000).
  17. USDA. Salmonella and Campylobacter verification program for raw poultry products. FSIS Directive 10250.1. 10000 Series: Laboratory Services. USDA. , (2021).
  18. He, Y., et al. Simultaneous detection and differentiation of Campylobacter jejuni, c. Coli, and c. Lari in chickens using a multiplex real-time PCR assay. Food Anal Methods. 3, 321-329 (2010).
  19. Suo, B., He, Y., Tu, S. -I., Shi, X. A multiplex real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of salmonella spp., escherichia coli o157, and listeria monocytogenes in meat products. Foodborne Pathog Dis. 7 (6), 619-628 (2010).
  20. Chen, C. Y., Nace, G. W., Irwin, P. L. A 6 x 6 drop plate method for simultaneous colony counting and MPN enumeration of Campylobacter jejuni, listeria monocytogenes, and escherichia coli. J Microbiol Methods. 55 (2), 475-479 (2003).
  21. Speegle, L., Miller, M. E., Backert, S., Oyarzabal, O. A. Use of cellulose filters to isolate Campylobacter spp. From naturally contaminated retail broiler meat. J Food Prot. 72 (12), 2592-2596 (2009).
  22. Guirin, G. F., Brusa, V., Adriani, C. D., Leotta, G. A. Prevalence of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli from broilers at conventional and kosher abattoirs and retail stores. Rev Argent Microbiol. 52 (3), 217-220 (2020).
  23. Noormohamed, A., Fakhr, M. K. A higher prevalence rate of Campylobacter in retail beef livers compared to other beef and pork meat cuts. Int J Environ Res Public Health. 10 (5), 2058-2068 (2013).
  24. Walker, L. J., et al. Prevalence of Campylobacter coli and Campylobacter jejuni in retail chicken, beef, lamb, and pork products in three Australian states. J Food Prot. 82 (12), 2126-2134 (2019).
  25. Zhao, C., et al. Prevalence of Campylobacter spp., Escherichia coli, and Salmonella serovars in retail chicken, turkey, pork, and beef from the greater Washington, D.C., area. Appl Environ Microbiol. 67 (12), 5431-5436 (2001).
  26. Honsheng, H., Manuel Mariano, G. Campylobacter. Guillermo, T. -I., Saeed, E. -A. , IntechOpen. Rijeka. (2022).
  27. He, Y., et al. Rapid identification and classification of Campylobacter spp. using laser optical scattering technology. Food Microbiol. 47, 28-35 (2015).
  28. Steele, T. W., Mcdermott, S. N. The use of membrane filters applied directly to the surface of agar plates for the isolation of Campylobacter jejuni from feces. Pathology. 16 (3), 263-265 (1984).
  29. Bourke, B., Chan, V. L., Sherman, P. Campylobacter upsaliensis: Waiting in the wings. Clin Microbiol Rev. 11 (3), 440-449 (1998).
  30. Berrang, M. E., Meinersmann, R. J., Cox, N. A. Passage of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli subtypes through 0.45- and 0.65-micrometer-pore-size nitrocellulose filters. J Food Prot. 80 (12), 2029-2032 (2017).
  31. Hill, G. N., et al. Optimizing enrichment of Campylobacter on poultry. J App Poult Res. 26 (3), 307-315 (2017).
  32. Kim, J. C., Oh, E., Kim, J., Jeon, B. Regulation of oxidative stress resistance in Campylobacter jejuni, a microaerophilic foodborne pathogen. Front Microbiol. 6, 751(2015).
  33. Nennig, M., et al. Metaphenotypes associated with recurrent genomic lineages of Campylobacter jejuni responsible for human infections in luxembourg. Front Microbiol. 13, (2022).
  34. Moore, J. E. Bacterial dormancy in Campylobacter: Abstract theory or cause for concern. Int J Food Sci Technol. 36 (6), 593-600 (2001).
  35. Saha, S., Saha, S., Sanyal, S. Recovery of injured Campylobacter jejuni cells after animal passage. Appl Environ Microbiol. 57 (11), 3388-3389 (1991).
  36. Baylis, C. L., Macphee, S., Martin, K. W., Humphrey, T. J., Betts, R. P. Comparison of three enrichment media for the isolation of Campylobacter spp. From foods. J Appl Microbiol. 89 (5), 884-891 (2000).
  37. Line, J. E. Development of a selective differential agar for isolation and enumeration of Campylobacter spp. J Food Prot. 64 (11), 1711-1715 (2001).
  38. Armstrong, C. M., et al. Impacts of clarification techniques on sample constituents and pathogen retention. Foods. 8 (12), 636(2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja Campylobacterbadanie surowego mi sadetekcja Campylobacternamna anie w bulionie Boltonamultipleksowy PCR w czasie rzeczywistympor wnanie membran filtracyjnychagar Brucellaoczyszczanie koloniiekstrakcja DNAodzyskiwanie patogen w przenoszonych przez ywno
Wykrywanie i izolacja Campylobacter spp. z surowego mięsa
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.