Trójwymiarowa tomografia całego narządu o wysokiej rozdzielczości zakażeń bakteryjnych

Podsumowanie

Tutaj opisujemy procedurę, która umożliwia wykrywanie bakterii chorobotwórczych w całym narządzie podczas infekcji i ilościowe określanie aktywności fluorescencyjnego reportera.

Streszczenie

Większość infekcji ma miejsce w trójwymiarowych tkankach gospodarza o skomplikowanej anatomii i lokalnie różniącej się fizjologii gospodarza. Umiejscowienie komórek patogennych w tym zróżnicowanym środowisku znacząco wpływa na ich poziom stresu, reakcje, los i przyczynia się do ogólnego postępu choroby i niepowodzenia leczenia. Jednak ze względu na trudności techniczne w lokalizowaniu komórek patogenu o rozmiarach μm w narządach gospodarza o rozmiarach cm, ten obszar badań był stosunkowo mało zbadany. Poniżej przedstawiamy metodę radzenia sobie z tym wyzwaniem. Stosujemy seryjną tomografię dwufotonową i analizę obrazu wspomaganą sztuczną inteligencją, aby zlokalizować pojedyncze komórki Salmonelli w całej śledzionie, płatach wątroby i całych węzłach chłonnych zakażonych myszy. Za pomocą reporterów fluorescencyjnych i podawania przeciwciał in vivo można określić szybkość replikacji pojedynczych komórek Salmonelli, ich miejscową interakcję ze specyficznymi komórkami odpornościowymi oraz odpowiedzi bakterii na antybiotyki. Metodologie te otwierają drogę do kompleksowego badania zakażeń, ich zapobiegania i leczenia w trójwymiarowym kontekście tkankowym.

Wprowadzenie

Infekcje występują w tkankach o skomplikowanej anatomii i fizjologii przedziałowej. Różnorodne mikrośrodowiska, które współistnieją w zakażonej tkance, mogą decydować o losach lokalnych podzbiorów patogenów i ich wpływie na ogólny wynik choroby^1,2,3. Jednak kompleksowe mapowanie 3D patogenów mikrobiologicznych w tkankach o rozmiarach cm pozostaje wyzwaniem⁴. Obrazowanie mózgu i innych narządów jest bardzo aktywną dziedziną badawczą z ciągle ulepszanymi strategiami eksperymentalnymi⁵, ale wielu metodom nadal brakuje rozdzielczości poniżej μm, która byłaby wymagana do pewnej identyfikacji patogenów bakteryjnych wielkości μm. Z kolei seryjna tomografia dwufotonowa (STP) ⁶ umożliwia zautomatyzowane, wielokolorowe, wolne od deformacji obrazowanie całych tkanek z rozdzielczością poniżej μm w płaszczyźnie, uzyskując pełne wolumetryczne zestawy danych. Metoda ta łączy wielokrotne fizyczne cięcie tkanki za pomocą wibratomu z przerywanym dwufotonowym obrazowaniem wyłaniających się powierzchni bloków za pomocą światła podczerwonego. Tomografia STP jest szeroko stosowana do mapowania cienkich aksonów w mózgu w celu ustalenia map połączeń^7,8,9,10.

Tomografia STP umożliwia również mapowanie 3D pojedynczych komórek patogenów mikrobiologicznych (Salmonella, Toxoplasma) w całych zakażonych tkankach^11,12 za pomocą tomografu. Generacja drugiej harmonicznej ujawnia osłonki kolagenowe wokół tętnic i w pasmach włóknistych, takich jak beleczki śledziony, zapewniając w ten sposób kontekst anatomiczny. Przeciwciała fluorescencyjne wstrzykiwane in vivo mogą być używane do barwienia komórek gospodarza w celu ujawnienia interakcji między poszczególnymi komórkami patogenu a infiltrującymi komórkami odpornościowymi, takimi jak neutrofile. W tym miejscu opisano proces obejmujący przetwarzanie tkanki, obrazowanie, zszywanie płytek obrazowania z korekcją oświetlenia, układanie obrazów w trzech wymiarach oraz segmentację za pomocą narzędzi uczenia maszynowego. Rurociąg ten pozwala na uzyskanie pozycji 3D poszczególnych patogenów, komórek i mikrokolonii w kontekście gospodarza. Liczenie liczby pojedynczych komórek w mikrokoloniach pozostaje trudne ze względu na ograniczenia rozdzielczości, ale takie liczby można oszacować na podstawie zintegrowanej jasności mikrokolonii. Rurociąg można łatwo dostosować do innych modeli infekcji, jeśli dostępne są rekombinowane patogeny wykazujące ekspresję GFP lub YFP.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez władze (licencja 2239, Kantonales Veterinäramt Basel) i są zgodne z lokalnymi wytycznymi (Tierschutz-Verordnung, Bazylea) oraz szwajcarskim prawem ochrony zwierząt (Tierschutz-Gesetz).

1. Przygotowanie i przechowywanie zainfekowanych tkanek

1. Użyj wybranego modelu infekcji. Tutaj myszy w wieku od 10 do 16 tygodni obu płci są zarażane ~ 1,000 jednostkami tworzącymi kolonie (CFU) przez wstrzyknięcie dożylne lub 5 x 10⁷ CFU przez podanie dożołądkowe za pomocą igły z okrągłą końcówką. Odpowiednie szczepy myszy to BALB/c i C57BL/6.
   UWAGA: To samo podejście można łatwo dostosować do innych gatunków żywicieli.
2. Upewnij się, że patogeny wykazują ekspresję białek fluorescencyjnych, aby umożliwić identyfikację w niebarwionej tkance. Patogeny wyrażające GFP.mut2¹³, YPet¹⁴, TIMER^bac15 lub mWasabi¹⁶ można wizualizować za pomocą wzbudzenia 940 nm¹⁷. Salmonella wyrażająca mCherry¹⁸ na poziomach łatwo wykrywalnych przez cytometrię przepływową¹⁹ można zobrazować przy użyciu wzbudzenia 800 nm, ale mają słabe proporcje sygnału do tła w zakażonej śledzionie i wątrobie, które wykazują znaczną autofluorescencję.
3. Upewnij się, że wszystkie białka fluorescencyjne zachowują >70% swojej intensywności fluorescencji po utrwaleniu paraformaldehydem o neutralnym pH w oparciu o kwantyfikację za pomocą cytometrii przepływowej. W tym przypadku stosuje się zakażoną tkankę myszy, a mianowicie śledzionę, wątrobę, węzły chłonne i plastry Peyera.
4. Barwienie markerów powierzchniowych komórek gospodarza in vivo, poprzez wstrzyknięcie przeciwciał znakowanych fikoerytryną (PE) 10 minut przed perfuzją. Aby zabarwić neutrofile, wstrzyknąć dożylnie 4 μg anty-Ly-6G-PE w 100 μl PBS. Aby zabarwić makrofagi strefy brzeżnej w śledzionie, wstrzyknąć 4 μg anty-CD169-PE w 100 μl PBS (patrz Tabela materiałów).
5. Napraw zainfekowane tkanki za pomocą standardowej perfuzji przezsercowej²⁰ za pomocą 15 ml lodowatego buforu fosforanowego 50 mM (PB; 10 mM NaH₂PO₄, 40 mMNa₂HPO₄, pH 7,4), a następnie 35 ml 4% paraformaldehydu (PFA; utrwalacz) w PB (Rysunek 1A).
   1. Krótko mówiąc, należy podać zakażonemu zwierzęciu głębokie znieczulenie poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie 100 mg/kg ketaminy i 16 mg/kg ksylazyny. Zapewnij odpowiednie znieczulenie, potwierdzając utratę odruchu szczypania palców u stóp.
   2. Zdezynfekuj futro za pomocą 70% etanolu, osusz je sterylnym ręcznikiem papierowym i chirurgicznie otwórz klatkę piersiową pęsetą i nożyczkami. Umieść sterylną igłę w lewej komorze serca, otwórz prawy przedsionek sterylnymi nożyczkami i przeprowadź pierwszy bufor, a następnie utrwalacz przez igłę, lewą komorę i cały układ naczyniowy za pomocą pompy. To szybko i jednolicie utrwala wszystkie tkanki i powoduje eutanazję.
6. Zebrać tkankę po perfuzji, inkubować ją w 20-krotnej objętości 4% zimnego paraformaldehydu w buforze PB i umieścić na wytrząsarce w temperaturze 4 °C przez noc (Ryc. 1B). Obrazowanie jest możliwe dla tkanek w zakresie wielkości od 0,05 do 2 cm³. W przypadku większych tkanek pokrój na odpowiednie kawałki.
7. Następnego dnia przemyj chusteczkę 3x po 10 minut buforem PB z wytrząsaniem przy 40 obr./min w temperaturze pokojowej w celu usunięcia PFA.
   UWAGA: Ze względu na toksyczność PFA, czynności te należy wykonać wewnątrz dygestorium. Odpady PFA należy utylizować zgodnie z wytycznymi instytucji.
8. Usunąć nadmiar buforu PB i dodać 20 razy większą objętość buforu do przechowywania krioprotektantu²¹ (876 mM sacharozy, 0,25 mM poliwinylopirolidonu, 40% (v/v) glikolu etylenowego, rozpuszczony w 50 mM buforze PB) do próbki, wytrząsając z prędkością 40 obr./min w 4 °C przez 6-8 godzin lub do momentu, gdy tkanki opadną na dno. Próbki należy inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 3 dni, aby zapewnić skuteczną redukcję autofluorescencji tkankowej¹¹. Próbki mogą być używane przez okres do 5 lat przy przechowywaniu w temperaturze -20 °C.
   UWAGA: Zapadanie się tkanki wskazuje na prawidłową penetrację buforu spichrzającego w głąb tkanki.

2. Osadzanie próbki

1. Osadź tkankę w bloku agarozy, aby uzyskać gładkie cięcie za pomocą wibratomu. Wstępnie aktywuj agarozę chemicznie poprzez utlenianie z periodatem, a następnie zredukuj borowodorkiem, aby utworzyć usieciowanie z tkanką w celu poprawy stabilności podczas procesu cięcia. Wykonaj czynności opisane poniżej.
2. Przygotować 4% utlenionej agarozy, ważąc 2,25 g agarozy i dodać 0,21 g NaIO₄. Dodaj 100 ml PB do agarozy i NaIO₄. Mieszać w temperaturze pokojowej w dygestorium przez 2-3 godziny z ochroną przed światłem.
   UWAGA: Krok krytyczny: Nie przekraczaj czasu mieszania przez więcej niż 3 godziny, w przeciwnym razie agaroza słabo się ulegnie polimeryzacji.
3. Odzysk agarozy przez filtrację membranową w standardowym filtrze próżniowym z membraną 0,2 μm. Usunąć pozostały NaIO₄, przemłukując 3x 50 ml buforu PB. Zawiesić utlenioną agarozę w 50 ml buforu PB.
   UWAGA: Nie topić agarozy na tym etapie. Agaroza może być przechowywana w temperaturze 4 °C do 2-3 tygodni w osłonie przed światłem.
4. Przygotować roztwór borowodorku, dodając 19 g boraksu i 3 g kwasu borowego do 1 l wody. Mieszać aż do rozpuszczenia i dostosować pH do 9-9,5 za pomocą 1 M NaOH. Na płycie mieszającej w dygestorium podgrzać 100 ml buforu boranowego do temperatury 40 °C. Dodać 0,2 g NaBH₄ i mieszać przez 15-30 minut, chroniąc przed światłem.
   UWAGA: Roztwór borowodorku można przechowywać przez kilka tygodni w temperaturze pokojowej w ciemności. Etap krytyczny: Podczas dodawania NaBH₄ do bufora boranowego powstanie gaz, dlatego należy przeprowadzić ten krok wewnątrz dygestorium. Nie wykonuj tego kroku w szczelnie zamkniętym pojemniku, ponieważ może to doprowadzić do wybuchu.
5. Pobrać tkankę z zamrażarki po wystarczającej inkubacji dla zmniejszonej autofluorescencji (≥ 3 dni), usunąć nadmiar buforu do przechowywania krioprotektantu i umyć tkankę 3x przez 10 minut za pomocą buforu PB z wytrząsaniem przy 40 obr./min w temperaturze pokojowej (RT).
6. Rozpuść około 20 ml utlenionej zawiesiny agarozy (przygotowanej w kroku 1) w kuchence mikrofalowej (700 W przez ~30 s), pozwól jej ostygnąć na tyle, aby można było z nią poradzić (~45 °C) i wlej do plastikowej formy.
   UWAGA: Krok krytyczny: Nie dodawaj agarozy bezpośrednio po podgrzaniu jej w kuchence mikrofalowej na próbce, może to doprowadzić do zniszczenia tkanki.
7. Użyj pęsety, aby delikatnie podnieść tkankę i szybko włóż ją do dolnej środkowej części agarozy. Inkubować pleśń w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby umożliwić polimeryzację agarozy.
8. Po polimeryzacji agarozy otwórz plastikową foremkę skalpelem z jej czterech rogów i ostrożnie podnieś kostkę agarozy palcami w rękawiczkach.
9. Zanurzyć próbkę w roztworze borowodorku (przygotowanym w kroku 2) na 2-3 godziny w temperaturze 4 °C w celu zainicjowania sieciowania utlenionej agarozy i tkanki. Zapobiega to odklejaniu się tkanki podczas cięcia.
   UWAGA: Etap krytyczny: Próbkę zanurzoną w borowodorku należy inkubować w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.
10. Umyj kostkę agarozy buforem PB 2x przez 10 min. Obróć kostkę agarozy tak, aby chusteczka znalazła się na górnej stronie i przymocuj klocek do szkiełka magnetycznego (szkiełko mikroskopowe z dwoma magnesami przymocowanymi z tyłu) za pomocą kilku kropel kleju błyskawicznego. Klej potrzebuje 10-20 minut, aby zastygnąć, więc umieść papierową chusteczkę z kroplami buforu PB na wierzchu agarozy, upewniając się, że próbka pozostaje odpowiednio uwodniona przez cały czas (Rysunek 1C).

3. Przygotowanie mikrotomu i przygotowanie sceny

1. Umieść szkiełko magnetyczne na metalu pośrodku pudełka na próbki tomografu.
2. Napełnij pudełko buforem PB i ostrożnie umieść je na stoliku i dokręć po lewej stronie, aby zabezpieczyć pojemnik na próbki na stoliku tomografu.
   UWAGA: Nie dokręcaj zbyt mocno, ponieważ spowoduje to uszkodzenie plastikowego pudełka.
3. Umieść ostrze na mikrotomie i ostrożnie przesuń pozycję próbki w pobliżu i pod mikrotomem. Górna powierzchnia agarozy powinna znajdować się na tym samym poziomie co ostrze mikrotomu.
   UWAGA: Ustawienie go zbyt nisko spowoduje stratę czasu na cięcie, podczas gdy ustawienie go zbyt wysoko usunie duży kawałek bloku przy pierwszym cięciu.
4. Przesuń stolik, aby ustawić sześcian agarozy na środku obiektywu i klikaj kilkakrotnie przycisk Plasterek w oprogramowaniu tomografu, aż uzyskasz nienaruszony plaster całej kostki agarozy.

4. Przydzielanie powierzchni i pozyskiwanie obrazów 2D

1. Wyśrodkuj soczewkę obiektywu na próbce tkanki w kierunkach x i y.
2. Otwórz oprogramowanie lasera i włącz laser w oprogramowaniu. Po usłyszeniu tykającego dźwięku włącz przełącznik lasera i ustaw długość fali na 800 nm.
   UWAGA: Źródło lasera musi być rozgrzane przez co najmniej 30 minut, a najlepiej 1 godzinę, przed obrazowaniem.
3. Zamknij drzwi szafy mikroskopu, wyłącz wszystkie źródła światła w pomieszczeniu, włącz PMT i ustaw napięcie na 750 V.
   UWAGA: Krok krytyczny: PMT są bardzo wrażliwe na światło, trzymaj je z daleka, chyba że drzwi szafy są zamknięte, a wszystkie źródła światła w pomieszczeniu są wyłączone.
4. Dostosuj ustawienia protokołu w oprogramowaniu tomografu zgodnie z opisem i ustaw migawkę mikroskopu na automatyczną, a napięcie na 20 i 3 odpowiednio dla V1 i V2.
5. Kliknij przycisk 2D w oprogramowaniu tomografu, aby uchwycić zdjęcie próbki.
6. Gdy pojawi się obraz z widoczną autofluorescencją, wyreguluj z-piezoelektryczny, aby ustawić płaszczyznę ogniskową na powierzchni sześcianu agarozy. Pierwszy skan będzie znajdował się 20 μm pod powierzchnią, aby uzyskać stabilny obraz próbki.
   1. Jeśli tło autofluorescencji nie jest widoczne, zwiększaj kontrast, aż pojawi się sygnał. Może się zdarzyć, że nie ma widocznego sygnału (np. z powodu agarozy na wierzchu tkanki). W takim przypadku wyreguluj oś z za pomocą urządzenia z-piezoelektrycznego, aż dotrze do powierzchni agarozy. Ręczny ruch obiektywu może być konieczny, jeśli żądana pozycja znajduje się poza zasięgiem urządzenia z-piezoelektrycznego.
7. Wytnij wiele plasterków o wielkości 50 μm po znalezieniu powierzchni próbki i uzyskaj obrazy 2D po każdym cięciu, aby upewnić się, że płaszczyzna ogniskowej jest prawidłowo ustawiona na powierzchni bloku.

5. Znajdowanie krawędzi próbek i ustawianie lasera na punkt początkowy

1. Opierając się na współrzędnych xy obszaru skanowania laserowego (4 współrzędne narożne), ogranicz obszar obrazowania do tkanki z minimalnym obrazowaniem otaczającego bloku agarozy.
2. Wyłącz PMT, ustaw długość fali lasera na 800 nm, przełącz migawkę lasera na otwarcie. Położenie światła laserowego wpadającego do bloku agarozy jest widoczne jako czerwona plama rozproszonego światła (Rysunek 2A,B).
   Krytyczny krok: Zachowaj szczególną ostrożność w przypadku lasera klasy 4. Może szybko uszkodzić ludzkie tkanki i oczy. Personel potrzebuje specjalnego przeszkolenia, aby bezpiecznie obsługiwać taki instrument.
3. Użyj plamki lasera podczas przesuwania stolika, aby znaleźć współrzędne krawędzi tkanki za pomocą sekwencji do tyłu, w prawo, z przodu i w lewo.
4. Dokładnie sprawdź współrzędne i umieść plamkę lasera w prawym przednim rogu, który jest domyślnym punktem wyjścia do obrazowania tkanki.
5. Przekonwertuj współrzędne z okna konsoli na rozpoznawalne maszynowo rozmiary bloków, które są definiowane przez kroki xy. Wprowadź te pomiary krokowe do protokołu oprogramowania. Zamknij drzwi szafki.

6. 3D skanowanie / dzielenie na sekcje

1. Zmień długość fali na 940 nm, aby wzbudzić GFP, mWasabi lub YPet i PE.
   UWAGA: Laser jest niewidoczny dla ludzkiego oka na tej długości fali. Aby poprawić transmisję sygnału do tła dla GFP, mWasabi i zielonego składnika emitującego TIMER^bac, przed PMT 2 należy umieścić filtr wąskoprzepustowy 510/20 nm. Zmniejsza to interferencję przez zielono-żółtą autofluorescencję tkanek.
2. Przełącz migawkę mikroskopu w tryb automatyczny, a ustawienia napięcia migawki na 20 dla V1 i 1.71 dla V2.
3. Dostosuj następujące trzy parametry w oprogramowaniu: Grubość przekroju - w większości przypadków ustawiona na 50 μm. W przypadku wątroby należy ustawić na 30 μm ze względu na ograniczoną głębokość obrazowania. Liczba przekrojów fizycznych - określa całkowitą głębokość tkanki, która zostanie zobrazowana, odpowiednio ustawioną. Liczba płaszczyzn do przechwycenia dla każdej sekcji -to określi rozdzielczość z. Do większości celów używaj 5 płaszczyzn (co daje rozdzielczość pionową 10 μm). Do wątroby użyj 3 lub mniej płaszczyzn.
4. Ustaw wzmocnienie lasera. Musi to zostać empirycznie przetestowane dla różnych tkanek i głębokości skanowania.
5. Zdefiniuj ścieżkę i nazwę folderu, w którym mają być przechowywane pozyskane obrazy, a następnie podaj odpowiednie informacje dla metapliku obrazowania.
6. Dokładnie sprawdź wszystkie wprowadzone wartości.
7. Kliknij ustawienie mozaiki 3D, aby rozpocząć proces skanowania ( Rysunek 1D).
8. Po zakończeniu obrazowania ostrożnie pobrać skrawki tkanek ze zbiornika na wodę i przechowywać je w buforze do przechowywania w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia (Rysunek 1E; Rysunek 2C,D).

7. Przetwarzanie obrazów i analiza danych

1. Pobierz skrypty MATLAB na komputer z systemem Linux z https://github.com/BumannLab/Li_BumannLab_2020. Skopiuj skrypty do folderu, np. /home/user/Program/.
   UWAGA: Aby skrypt był w pełni funkcjonalny, na komputerach z systemem Linux musi być zainstalowany dodatek Computer Vision Toolbox dla MATLAB i Fiji (lub ImageJ).
2. Zszyj obrazy kafelków zgodnie z poniższym opisem.
   1. Przesyłanie danych z serwera tomografu do komputera z systemem Linux.
   2. Otwórz skrypt MATLAB StepOneStitchingAndArchive.m i znajdź folder źródłowy zawierający nieprzetworzone dane. Zdefiniuj foldery źródłowe i docelowe w skrypcie.
   3. Przejdź do zakładki Edytor i kliknij przycisk Uruchom. Informacje o postępie są wyświetlane w oknie poleceń. Przetwarzanie obejmuje odczyt informacji z pliku Mosaic, wygenerowanie indeksu kafelków przed zszyciem obrazu, korekcję oświetlenia tła za pomocą Cidre²² (Rysunek 3), a także korekcję oświetlenia między warstwami optycznymi uzyskanymi na różnych głębokościach. Znajdź zszyte obrazy w podfolderze o nazwie stitchedImages_100 w folderze źródłowym. Skompresuj surowe dane do długoterminowego przechowywania za pomocą polecenia tar i zapisz jako pojedynczy plik z rozszerzeniem nazwy pliku tar.bz2 (Rysunek 1F).
3. Wykonuj trenowanie i segmentację modelu za pomocą maszyny wektorów nośnych. Aby wytrenować maszynę wektorów nośnych i przeprowadzić segmentację, wykonaj poniższe czynności.
   UWAGA: Zszyte obrazy dla każdego z trzech kanałów fluorescencyjnych są przechowywane w 3 podfolderach (o nazwach 1, 2 i 3, odpowiadających fluorescencji czerwonej, pomarańczowej i zielonej) stitchedImages_100. Każdy podfolder zawiera wszystkie zszyte obrazy z tego samego kanału.
   1. Wyświetl podgląd zszytych obrazów. Otwórz jeden obraz o tej samej nazwie pliku z każdego podfolderu za pomocą Fiji (lub ImageJ). Scal trzy kanały w jeden kolorowy obraz. Dostosuj jasność każdego kanału, aż pojawią się wyraźne sygnały z bakterii i autofluorescencji tkanek. Zanotuj dostosowany maksymalny poziom intensywności każdego kanału w następnym kroku.
   2. Otwórz skrypt MATLAB StepTwoSegmentationAndAnalysis.m i przejdź do źródła. Zdefiniuj folder źródłowy i nazwy obrazów do trenowania. Na przykład,
      sourceD = '/' ;
      red_name = [sourceD '1/section_020_01.tif']; green_name = [sourceD '2/section_020_01.tif'];
      blue_name = [sourceD '3/section_020_01.tif'];
   3. Przejdź do zakładki Edytor i kliknij Uruchom.
   4. Pojawi się okno dialogowe z prośbą o podanie progów kolorów, wypełnij je na podstawie wcześniejszego ręcznego sprawdzenia Fidżi (krok 7.3.1).
   5. Wybierz regiony tła i obszary zainteresowania (np. bakterie) zgodnie z oknami dialogowymi. Zostaną wyświetlone wykresy pokazujące, jak dobrze model został wytrenowany i pytające, czy należy dodać więcej regionów. Dodaj więcej obszarów zainteresowania i tła, aż bakterie będą mogły być wyraźnie podzielone na segmenty (Rysunek 4A,B).
   6. Nazwij i zapisz model. Skrypt automatycznie załaduje obrazy i zastosuje filtr mediany (promień 2 piksele).
   7. Proces segmentacji jest uruchamiany automatycznie, a informacje o postępie są wyświetlane w oknie polecenia. Obserwuj postęp segmentacji. Jeśli segmentacja nie działa dobrze z modelem na innych zszytych obrazach, powtórz trenowanie modelu, aby uwzględnić więcej regionów tła i bakterii.
   8. Aby zobaczyć wyniki segmentacji, sprawdź plik o nazwie Allpositions_filter3D.txt. Plik ten zawiera współrzędne środka ciężkości dla każdej bakterii lub mikrokolonii bakteryjnej oraz odpowiadającą jej zintegrowaną intensywność fluorescencji (Rysunek 1G).
4. Usuń dodatkowe artefakty za pomocą konwolucyjnej sieci neuronowej zgodnie z poniższym opisem.
   UWAGA: W przypadku niektórych bakterii prosta segmentacja za pomocą maszyny wektorów nośnych nadal zawiera pewne artefakty obrazowania. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku bakterii wykazujących ekspresję YPet. Segmentacja oparta na sieciach neuronowych może skutecznie usunąć te artefakty (Rysunek 4C). Aby skrypt był w pełni funkcjonalny, na komputerach z systemem Windows musi być zainstalowany dodatek Computer Vision Toolbox dla programów MATLAB i Fiji (lub ImageJ). Aby uzyskać informacje na temat podstawowej sieci neuronowej, zobacz: https://ch.mathworks.com/help/deeplearning/ug/create-simple-deep-learning-network-for-classification.html
   1. Przygotuj obrazy. Konwertuj pliki tif na pliki jpg z różnymi regulacjami jasności za pomocą Fidżi. Zidentyfikuj za pomocą ręcznej selekcji co najmniej 600 bakterii i 600 artefaktów oraz bezpiecznie przycięte obrazy tych obiektów w odpowiednich folderach.
   2. Otwórz skrypt MATLAB CNNtestV4.m i przejdź do plików źródłowych zawierających obrazy obiektów z kroku 7.4.1.
   3. Zdefiniuj folder obrazów do trenowania. Na przykład,
      digitDatasetPath = fullfile ('D:\20200602_CNN','fortrainingPixel12Folder2');
      Zdefiniuj liczbę obrazów do trenowania, np. numTrainFiles = 600.
   4. Przejdź do zakładki Edytor i kliknij Uruchom. Po wytrenowaniu plik modelu CNN jest zapisywany jako gregnet1.mat w folderze źródłowym.
   5. Zdefiniuj folder z obrazami testowymi. Na przykład,
      digitDatasetPathTest = fullfile('D:\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp').
      Wyniki są zapisywane w pliku YourFile.txt który zawiera informacje o nazwie obrazu i klasyfikacji jako bakteria lub artefakt.
   6. Zdefiniuj folder z obrazami testowymi. Na przykład,
      digitDatasetPathTest = fullfile('D:\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp').
      Wyniki zostaną zapisane w pliku YourFile.txt, który zawiera informacje o nazwie obrazu i klasyfikacji jako bakteria lub artefakt.
5. Oszacuj wielkość mikrokolonii na podstawie intensywności fluorescencji pojedynczych bakterii, jak opisano poniżej.
   UWAGA: Rozdzielczość przestrzenna tomografu jest niewystarczająca do rozdzielenia pojedynczych komórek bakteryjnych w gęsto upakowanych mikrokoloniach. Jednak liczbę bakterii w każdej mikrokolonii można oszacować na podstawie całkowitej fluorescencji mikrokolonii w stosunku do fluorescencji pojedynczych bakterii. Ta dokładność oszacowania zależy od jednorodności intensywności fluorescencji w całej populacji bakterii.
   1. Potwierdź tożsamość zdarzeń GFP-dodatnich w tomografii STP, barwiąc składniki bakteryjne, takie jak lipopolisacharyd, za pomocą immunohistochemii pobranych skrawków z tomografu (Rysunek 1H; Rysunek 5).
   2. Zidentyfikuj co najmniej 30 pojedynczych bakterii i pobierz ich intensywność fluorescencji z odpowiednich wyników segmentacji. Wykorzystaj wartość mediany intensywności jako odniesienie dla pojedynczej bakterii. Oblicz liczbę bakterii w każdej mikrokolonii, dzieląc całkowitą intensywność fluorescencji mikrokolonii przez wartość odniesienia dla pojedynczej bakterii (Rysunek 1I).
6. Wykonaj rekonstrukcję 3D za pomocą oprogramowania do wizualizacji, jak opisano poniżej.
   1. Przygotowanie obrazu
      1. Wykonaj obrazy niebieskiego kanału, które zawierają sygnały drugiej harmonicznej kolagenu, zapewniając użyteczne odniesienie anatomiczne, w tym torebki tkankowe, tętnice i beleczki. Użyj obrazów podzielonych na segmenty dla bakterii jako 2. kanału.
      2. Zmniejsz obrazy z 1. kanału 10-krotnie zarówno w osi x, jak i y, a zmniejszone obrazy zapisz w nowym folderze. Utwórz 3 repliki pomniejszonych obrazów w tym samym folderze. Nazwa nowych powtórzeń powinna zachować tę samą sekwencję. Na przykład: section_001_01.tif, replikuj liczbę 1 o nazwie section_001_01-copy.tif, section_001_01-copy-copy.tif. Zastosuj te kroki również do obrazów z^{2 kanału}. Zmniejszenie rozmiaru zapewnia łatwiejsze w zarządzaniu rozmiary plików. Potrójne obrazy wygładzą oś z.
      3. Scal obrazy z każdego kanału, aby utworzyć stosy obrazów z Fidżi. Kliknij pozycję Obraz > Stosy > Narzędzia > Sortowanie stosów > Sortuj według etykiet.
      4. Wykonaj filtrowanie 3D. Kliknij pozycję Process > Filters (Przetwarzaj filtry > Filtr 3D i ustaw rozmiar filtra Z na 6. Zapisz stosy obrazów.
   2. Wykonaj wizualizację 3D zgodnie z poniższym opisem.
      1. Otwórz pakiet oprogramowania do wizualizacji w widoku Arena (ustawienie domyślne). Użyj ikony folderu obserwowanego, aby dodać foldery do widoku Areny. Kliknij dwukrotnie, aby otworzyć plik *.ims lub *.tif (przygotowany w 7.6.1).
      2. Korzystając z opcji Edycja>Właściwości obrazu, dostosuj reprezentacje kolorów (LUT) różnych kanałów w oknie Dopasowanie wyświetlania.
      3. Kliknij Zaawansowane, aby ręcznie ustawić wartości min/max i wartość korekcji gamma.
         Kliknij Nazwy kanałów, aby zmienić nazwy i LUT.
      4. Po dostosowaniu wyglądu obrazu wyeksportuj bieżący widok za pomocą narzędzia Migawka.
      5. Użyj ikony Animacja, aby przedstawić dane 3D jako film. Użyj wskaźnika nawigacyjnego, aby znaleźć perspektywę/widok i powiększenie, a następnie użyj + Dodaj, aby dodać klatki kluczowe. Przejdź do innej pozycji i dodaj następną klatkę kluczową. Naciśnij czerwony przycisk nagrywania, aby zbudować film. Zapisz go w żądanym folderze docelowym i typie pliku (Rysunek 1J).

Wyniki

Opisana procedura umożliwia wykrywanie pojedynczych komórek Salmonelli w całych narządach myszy, takich jak śledziona, wątroba, krezkowe węzły chłonne i łaty Peyera¹¹ (Rysunek 5 i Rysunek 6). Wykrywa również pasożyty Toxoplasma gondii w mózgu myszy¹². Niektóre zakażone tkanki, w tym wątroba, łaty Peyera i śledziona, wydzielają znaczną autofluorescencję w zakresie zielono-żółtym. Autofluorescencja jest dodatkowo wzmocniona przez utrwalenie paraformaldehydem, który jest niezbędny do zachowania struktury tkanki. Wykrywanie zielonej fluorescencji z GFP, mWasabi i zielonego składnika^{TIMER bac} na tym tle autofluorescencji jest ulepszone przez umieszczenie filtra wąskoprzepustowego 510/20 nm (transmitującego większość emisji GFP, ale blokującego dużą część widma autofluorescencji) przed fotopowielaczem 2 (który zbiera zielone emisje) oraz poprzez zmniejszenie autofluorescencji tkanek poprzez przechowywanie utrwalonych tkanek przez 3 lub więcej dni w krioprotektowalu¹¹. Jednak bakterie powinny nadal wyrażać co najmniej kilka tysięcy kopii GFP lub innych białek fluorescencyjnych na komórkę. Z drugiej strony, należy unikać nadmiernego poziomu białka fluorescencyjnego, aby zminimalizować koszty fitnessu, które mogą prowadzić do osłabienia zjadliwości²³.

Poprawna segmentacja bakterii fluorescencyjnych w tkankach może być potwierdzona przez immunohistochemię pobranych skrawków tkanek po obrazowaniu. W szczególności obiekty barwione przeciwciałem przeciwko składnikom powierzchni bakteryjnej, takim jak lipopolisacharyd, można dopasować do obrazu fluorescencyjnego uzyskanego za pomocą tomografii STP (Ryc. 5). Ważne jest, aby pamiętać, że niektóre barwione komórki Salmonelli nie mają białek fluorescencyjnych, a tym samym wykrywalnej fluorescencji zarówno w mikroskopii konfokalnej, jak i tomografii STP. Komórki te to Salmonella, które zostały zabite przez układ odpornościowy gospodarza, co wykazano za pomocą sortowania metodą cytometrii przepływowej i hodowli wzrostu z pojedynczych posortowanych komórek, a także ścisłej korelacji między liczbą jednostek tworzących kolonie na płytkach agarowych a liczbą fluorescencyjnych komórek Salmonelli określoną za pomocą cytometrii przepływowej²⁴. Ponadto utrata plazmidu może prowadzić do powstania niefluorescencyjnych komórek żywotnych i należy to przetestować poprzez posiew na pożywce z odpowiednimi antybiotykami i bez nich, odpowiadającymi markerowi selekcyjnemu na plazmidzie. W przypadku plazmidów pochodzących z pSC101 utrata plazmidu in vivo jest rzadka¹⁹. W przypadku większości chromosomalnie zintegrowanych kaset ekspresyjnych, takich jak sifB::gfp używanych w¹¹, utrata ekspresji jest niewykrywalna in vivo. Jeśli segmentacja jest niezgodna z danymi immunohistochemicznymi, należy zmodyfikować potok segmentacji.

Rozdzielczość tomografii STP jest niewystarczająca do rozdzielenia pojedynczych komórek bakteryjnych w gęsto upakowanych mikrokoloniach. Jednak całkowita intensywność fluorescencji mikrokolonii umożliwia oszacowanie liczby komórek Salmonelli. Wymaga to szczepu fluorescencyjnego o wysoce jednorodnym poziomie fluorescencji, takiego jak Salmonella sifB::gfp¹¹. Połączenie szacowanej liczby komórek Salmonelli dla wszystkich mikrokolonii i pojedynczych komórek daje całkowite obciążenie tkanek bakteryjnych, które jest zgodne z alternatywnymi metodami, takimi jak posiew lub cytometria przepływowa homogenatów tkankowych¹¹. Posiewu i cytometrii przepływowej nie można wykonać bezpośrednio z tych samych tkanek, ponieważ muszą one być utrwalone perfuzją w tomografii STP. Zamiast tego muszą być wykonane z dodatkowymi zwierzętami, które nie są stałe. Jeśli mediana ładunku bakteryjnego określona przez różne podejścia różni się więcej niż 3-krotnie, żywotność bakterii fluorescencyjnych może być zagrożona (w przypadku niższych jednostek tworzących kolonie) lub niektóre bakterie mogą utracić fluorescencyjny konstrukt reporterowy (w przypadku wyższych jednostek tworzących kolonie). Konieczne będzie przeprowadzenie eksperymentu kontrolnego w celu zidentyfikowania źródła takich rozbieżności.

Tomografia STP zapewnia lokalizację komórek bakteryjnych w strukturze 3D zainfekowanych tkanek. Drugie sygnały harmoniczne kolagenu zapewniają anatomiczne punkty orientacyjne, takie jak tętnice i beleczki. Ponadto komórki gospodarza można barwić in vivo, wstrzykując przeciwciało do markerów powierzchniowych przed perfuzją (Rysunek 5 i Figura 6). Barwienie to zapewnia dodatkowe punkty orientacyjne dla przedziałów tkankowych i określonych mikrośrodowisk, w tym ognisk zapalnych (markery wewnątrzkomórkowe i niektóre przedziały z barierami dyfuzyjnymi, takie jak biała miazga śledzionowa lub mózg, nie są łatwo dostępne, odpowiednie do tego barwienia in vivo). Podejście to ujawniło białą miazgę śledziony jako przedział tkankowy, który umożliwia długoterminowe przeżycie Salmonelli podczas chemioterapii przeciwdrobnoustrojowej¹¹.

Na koniec, Salmonella replikująca się w umiarkowanym lub wolnym tempie może być zidentyfikowana i zlokalizowana w strukturze 3D tkanek za pomocą szczepów, które wyrażają timer^bac, pojedynczy komórkowy reporter szybkości replikacji^11,15.

Rysunek 1: Procedura obrazowania całego narządu za pomocą seryjnej tomografii dwufotonowej (STP). (A-B) Narząd jest pobierany po perfuzji przezsercowej i przechowywany przez noc w 4% paraformaldehydzie (PFA) w temperaturze 4 °C. (C-E) Narząd jest zanurzany w utlenionej agarozie i sieciowany, a następnie tkanka jest skanowana i cięta za pomocą tomografii STP. Plastry są zbierane do dalszej immunohistochemii. (F-J) Potoki analizy obliczeniowej do ilościowego określania liczby bakterii, potwierdzania obecności bakterii fluorescencyjnych i rekonstrukcji 3D pozycji bakterii. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Konfiguracja seryjnej tomografii dwufotonowej (STP). (A) Tomograf, który łączy (B) obrazowanie 2-fotonowe z (C) automatycznym seryjnym cięciem tkanek. (D) Pobrane wycinki tkanek do badań kontrolnych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Korekta ściegu płytek i iluminacji. Płytki są zszywane, a nierównomierne oświetlenie jest korygowane przy użyciu skorygowanych rozkładów intensywności przy użyciu regularnej minimalizacji energii (CIDRE). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Segmentacja Salmonelli wyrażającej zielone białko fluorescencyjne (GFP) za pomocą maszyny wektorów nośnych (SVM) i konwolucyjnej sieci neuronowej (CNN). (A) Reprezentatywne obrazy obiektów GFP podzielonych na segmenty według SVM (po lewej) i odpowiadające im obrazy (po prawej) z obszarami podzielonymi na segmenty według SVM (pasek skali: 10 μm). (B) Grupowany rozkład wartości czerwono-zielono-niebieskich (RGB) dla podzielonych na segmenty regionów. (C) Reprezentatywne obrazy obiektów nieobjętych GFP, błędnie zidentyfikowanych przez SVM jako bakterie (po lewej). CNN poprawnie odrzuca je jako tło (po prawej, podziałka skali: 10 μm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Wykrycie Salmonelli wyrażającej białko zielonej fluorescencji (GFP) za pomocą tomografii i potwierdzenia za pomocą immunohistochemii. Obrazy tego samego odcinka uzyskane za pomocą tomografii (po lewej) lub mikroskopii konfokalnej po barwieniu przeciwciałem przeciwko lipopolisacharydowi Salmonelli (po prawej). Neutrofile (czerwone) były barwione przez wstrzyknięcie in vivo przeciwciała anty-Ly-6G znakowanego PE przed perfuzją. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Rekonstrukcja 3D i lokalizacja Salmonelli w zakażonej śledzionie myszy. (A) Trójwymiarowa (3D) rekonstrukcja wycinka śledziony o grubości 5 mm i wybarwionego in vivo przed perfuzją przeciwciałem anty-CD169 (kolor czerwony). Niebieski sygnał reprezentuje kolagen wykryty przez drugie harmoniczne. (B) Jedna płaszczyzna optyczna stosu 3D pokazana w (A). Pozycje komórek lub mikrokolonii Salmonelli są oznaczone gwiazdkami. (C) Rekonstrukcja 3D pozycji (gwiazd) Salmonelli w zakażonej wątrobie. Tętnice są widoczne na podstawie ich osłonek kolagenowych (kolor niebieski). Podziałka: 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Lokalny kontekst tkankowy patogenów bakteryjnych ma kluczowe znaczenie dla określenia miejscowych ataków gospodarza, adaptacji bakteryjnych, lokalnego wyniku interakcji patogenów gospodarza i chemioterapii przeciwdrobnoustrojowej oraz indywidualnego wkładu w ogólny wynik choroby. Obrazowanie bakterii wielkości mikrometra w narządach o rozmiarach centymetrów było wyzwaniem. Seryjna tomografia dwufotonowa (STP) zapewnia wystarczającą rozdzielczość przestrzenną do wykrywania pojedynczych komórek bakteryjnych w całych narządach, zautomatyzowane sekcje i obrazowanie oraz wystarczającą przepustowość (~1 narząd dziennie)¹¹. Podczas gdy antygeny gospodarza mogą być barwione in vivo, komórki patogenu powinny wyrażać odpowiednie białka fluorescencyjne, aby zapewnić kompleksowe wykrywanie wewnątrzkomórkowych komórek patogenu. Uzyskane w ten sposób zestawy danych (0,5-1,5 terabajta na narząd) stanowią poważne wyzwanie dla infrastruktury IT w zakresie analizy i przechowywania danych.

W tej metodzie składa się kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, wymagany jest szczep patogenu z wykrywalną i jednorodną ekspresją białka fluorescencyjnego GFP lub YFP. Idealnie, kaseta ekspresji chromosomalnej²⁵ jest używana w celu zminimalizowania niejednorodności fluorescencji spowodowanej zmiennością liczby kopii plazmidu. Wymagana jest wystarczająca intensywność fluorescencji, ale należy unikać nadmiernych poziomów białka fluorescencyjnego, aby uniknąć upośledzenia zdolności patogenu²³. Odpowiednie poziomy ekspresji można uzyskać poprzez wybór odpowiedniego promotora i precyzyjne dostrojenie miejsca wiązania rybosomów²⁵ lub całego regionu 5' nieulegającego translacji (UTR)²⁶. Po drugie, utrwalenie perfuzji powinno obejmować wstępne przemycie buforem w celu usunięcia jak największej liczby erytrocytów z krążenia krwi. Jest to szczególnie ważne dla śledziony i wątroby (chociaż całkowite usunięcie erytrocytów z tych narządów jest trudne). Pozostałe erytrocyty pochłaniają światło w widzialnej części widma, pogarszając jakość obrazowania²⁷. Po trzecie, przechowywanie utrwalonych tkanek w krioprotektancie ma kluczowe znaczenie dla zmniejszenia autofluorescencji tkanek, która jest szczególnie wysoka w tkankach objętych stanem zapalnym i może przyćmić stosunkowo słabą fluorescencję komórek patogenu¹¹. Po czwarte, skuteczne sieciowanie tkanki z otaczającym blokiem agarozy ma kluczowe znaczenie dla płynnego cięcia wibratomu bez wyskakiwania tkanki z bloku agarozy. Po piąte, sygnały fluorescencyjne i ich identyfikacja jako komórek chorobotwórczych muszą być niezależnie weryfikowane przy użyciu metod ortogonalnych, takich jak barwienie przeciwciałami przeciwko składnikom patogenu (takim jak lipopolisacharyd dla bakterii Gram-ujemnych) i mikroskopia konfokalna skrawków pobranych z tomografu¹¹. Niektóre zakażone tkanki zawierają cząstki autofluorescencyjne o podobnym kształcie i nakładających się na siebie widmach fluorescencji, które można łatwo błędnie zinterpretować jako komórki chorobotwórcze. Po szóste, ilość komórek patogenu w mikrokoloniach powinna być porównana z podejściami ortogonalnymi, takimi jak mikroskopia konfokalna, w celu oceny dokładności. Całkowite obciążenia bakteryjne na podstawie tych obliczeń należy zweryfikować poprzez porównanie z podejściami ortogonalnymi, takimi jak cytometria przepływowa i posiew.

Do ważnych modyfikacji szeroko stosowanego protokołu STP należy umieszczenie filtra wąskoprzepustowego 510/20 nm przed fotopowielaczem 2¹¹, w celu zmniejszenia interferencji zielono-żółtej autofluorescencji, która jest szczególnie silna w zakażonej i zapalnej wątrobie, śledzionie i plamach Peyera. Silna autofluorescencja i zwiększone rozpraszanie światła przez takie narządy w porównaniu z mózgiem (co dominuje w innych zastosowaniach STP) generuje również potrzebę skuteczniejszej korekcji nierównomiernego oświetlenia. Kolejną modyfikacją jest to, że protokół ten wykorzystuje w tym celu podejście CIDRE²² (ryc. 3) oraz segmentację bakterii opartą na sztucznej inteligencji. Wreszcie, wstępne przetwarzanie tkanek zostało zmienione poprzez włączenie etapu inkubacji w krioprotektancie w temperaturze -20 °C, co zmniejsza autofluorescencję tkanek, a tym samym ułatwia wykrywanie małych komórek patogennych o stosunkowo słabej fluorescencji¹¹.

Rozwiązywanie problemów może być konieczne, jeśli nie można wykryć żadnych sygnałów patogenu lub segmentacja zapewnia niewystarczającą czułość (zbyt wiele komórek patogenu jest pomijanych) lub niewystarczającą precyzję (zbyt wiele cząstek tła jest segmentowanych jako komórki patogenu). Jeśli autofluorescencja tkanek tła jest wykrywalna, ale sygnałów patogenu jest zbyt mało, patogeny mogą zawierać niewystarczającą ilość białek fluorescencyjnych. Można to sprawdzić za pomocą mikroskopii konfokalnej wycinków tkanek z tej samej zakażonej tkanki lub cytometrii przepływowej homogenatów tkankowych^19,28. Podstawowymi przyczynami mogą być niewystarczające poziomy ekspresji lub niestabilność kasety z ekspresją. Strategie łagodzenia mogą obejmować alternatywne promotory do napędzania ekspresji, adaptację kodonów genów kodujących białko fluorescencyjne dla gatunku patogenu, zastosowanie konstruktów episomalnych o wyższej liczbie kopii lub stabilizację kaset ekspresji przez integrację chromosomów lub komplementację zrównoważoną-letalną²⁹. Wybór białka fluorescencyjnego jest również ważny, ale wykrywanie jest możliwe za pomocą GFP.mut2, mWasabi, YPet i TIMER^bac. Jeśli segmentacja jest niedokładna, może to być spowodowane zbyt słabą fluorescencją patogenu, którą można rozwiązać w sposób opisany powyżej, lub zbyt wysokim tłem autofluorescencji tkankowej. Rozległa perfuzja roztworu płuczącego lub przedłużona inkubacja w buforze magazynowym bezpośrednio przed osadzeniem w bloku agarozy i tomografia mogą rozwiązać te problemy. Wreszcie, do precyzyjnej klasyfikacji wymagane jest wystarczające wytrenowanie sieci neuronowej, ale nadmierne trenowanie może prowadzić do nadmiernego dopasowania, które pogarsza wydajność nowych próbek.

Obecnie żadna inna metoda nie jest w stanie zobrazować całych narządów w rozdzielczości przestrzennej wystarczającej do wykrycia pojedynczych bakterii. Przyszłe ulepszenia w oczyszczaniu tkanek i mikroskopii arkuszowej mogą osiągnąć podobną rozdzielczość. Może to umożliwić obrazowanie z większą prędkością i większą liczbą kanałów fluorescencyjnych.

Istotnym ograniczeniem STP jest rozdzielczość pikseli w płaszczyźnie wynosząca ~0,5 μm i rozdzielczość pionowa od 5 do 10 μm, co jest niewystarczające do rozdzielenia blisko położonych bakterii, np. w gęsto upakowanej mikrokolonii. Możliwe jest jednak pobranie skrawków tkanek po tomografii w celu wtórnej mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości wybranych części tkanki. Kolejnym ograniczeniem STP jest dostępność tylko trzech kanałów fluorescencyjnych, co ogranicza liczbę fluoroforów, które mogą być obrazowane jednocześnie. Ponownie, wtórna analiza pobranych skrawków tkanek za pomocą metod multipleksowania może ujawnić lokalizację i intensywność znacznie większej liczby markerów dla wybranych części tkanki. Informacje te można zintegrować z ogólną strukturą 3D otaczającej tkanki, jak określono za pomocą STP.

Podsumowując, protokół ten umożliwia szczegółowe badania interakcji gospodarz-patogen na poziomie lokalnym i całego narządu. Protokół powinien być łatwy do dostosowania do innych patogenów (pod warunkiem, że można je uzyskać w postaci szczepów fluorescencyjnych), innych narządów i różnych gatunków gospodarzy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chemicals
Agaroza Low Melt	Roth	Art. 6351.5 25g
Kwas borowy	Sigma-Aldrich	6768-500G
Klej błyskawiczny Loctite 435	Henkel
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148
Poli(glikol etylenowy)	Sigma-Aldrich	P5413-1kg
Poliwinylopirolidon	Sigma-Aldrich	PVP-100G
Borowodorek sodu	Sigma-Aldrich	71321-25g
Wodorotlenek sodu	Merck	106453
Periodynian sodu	Sigma-Aldrich	311448-100G
Fosforan sodu dwuzasadowy	Sigma-Aldrich	71640-250G
Fosforan sodu jednozasadowy dwuwodny	Sigma-Aldrich	71500-1KG
Tetraboran sodu	Sigma-Aldrich	221732-100g
Sacharoza	AppliChem	A4734,1000
Sól fizjologiczna buforowana trisem (TBS)	Merck	T5912-1L
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Próżnia filtracja 500	TPP	TPP99250
Equipment
Blade	Campden Instruments Limited	01-01-4692
MAITAI Laser	Spectra-Physics
Odklejanie plastikowej formy	Sigma-Aldrich	E6032-1CS
Tomograf TissueCyte 1000	TissueVision
Przeciwciało/barwniki
DAPI	Merck	D9542-5MG
strong>Primary przeciwciała
anti-LPS Salmonella, królik	Sifin	REF TS 1624
anty-CD169-PE, klon 3D6.112	Biolegend
anty-Ly-6G-PE, klon 1A8	Biolegend	127608
Przeciwciała drugorzędowe	Invitrogen
kurczak anty-królik Alexa 647	Invitrogen	A-21443
Software	Company	Version
Fiji	Image J	1.54g lub nowszy
MATLAB	MathWorks	2017b/2018b lub nowszy
Orchestrator (tomograf)	Oprogramowanie do wizualizacji TissueVision
Imaris	Oxford Instruments	9.9.0 lub nowsze