Artykuł metodologiczny

Rejestrowanie i analizowanie multimodalnej dynamiki zespołów neuronalnych na zintegrowanej z CMOS matrycy mikroelektrod o dużej gęstości

5.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66473

⸱

8 marca 2024

 ,  ,  ,  , 
1Group of "Biohybrid Neuroelectronics (BIONICS)", German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 2Faculty of Medicine Carl Gustav Carus, Technical University Dresden, 3Dresden Center for Intelligent Materials (DCIM), Technical University Dresden

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj używamy HD-MEA, aby zagłębić się w dynamikę obliczeniową dużych zespołów neuronalnych, szczególnie w hipokampie, obwodach opuszki węchowej i ludzkich sieciach neuronowych. Uchwycenie aktywności czasoprzestrzennej w połączeniu z narzędziami obliczeniowymi zapewnia wgląd w złożoność zespołu neuronalnego. Metoda ta pomaga lepiej zrozumieć funkcje mózgu, potencjalnie identyfikując biomarkery i metody leczenia zaburzeń neurologicznych.

Streszczenie

Sieci neuronowe o dużej skali i ich złożone mikroobwody są niezbędne do generowania percepcji, poznania i zachowania, które wyłaniają się z wzorców czasoprzestrzennej aktywności neuronalnej. Te dynamiczne wzorce wyłaniające się z grup funkcjonalnych połączonych ze sobą zespołów neuronalnych ułatwiają precyzyjne obliczenia w zakresie przetwarzania i kodowania wieloskalowych informacji neuronowych, napędzając w ten sposób wyższe funkcje mózgu. Aby zbadać obliczeniowe zasady dynamiki neuronalnej leżące u podstaw tej złożoności i zbadać wieloskalowy wpływ procesów biologicznych na zdrowie i chorobę, zasadnicze znaczenie odegrały równoległe nagrania na dużą skalę. W tym przypadku matryca mikroelektrod o dużej gęstości (HD-MEA) została wykorzystana do badania dwóch modalności dynamiki neuronalnej - obwodów opuszki hipokampa i opuszki węchowej z wycinków mózgu myszy ex-vivo oraz sieci neuronowe z hodowli komórkowych in vitro ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Platforma HD-MEA, z 4096 mikroelektrodami, umożliwia nieinwazyjne, wielomiejscowe, bezznacznikowe zapisy zewnątrzkomórkowych wzorców wypalania z tysięcy zespołów neuronalnych jednocześnie w wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej. Podejście to pozwala na scharakteryzowanie kilku cech elektrofizjologicznych obejmujących całą sieć, w tym wzorców aktywności impulsowej pojedynczej/wielu jednostek oraz lokalnych oscylacji potencjału pola. Aby przeanalizować te wielowymiarowe dane neuronowe, opracowaliśmy kilka narzędzi obliczeniowych obejmujących algorytmy uczenia maszynowego, automatyczne wykrywanie i klasyfikację zdarzeń, teorię grafów i inne zaawansowane analizy. Uzupełniając te potoki obliczeniowe o tę platformę, zapewniamy metodologię badania dużej, wieloskalowej i multimodalnej dynamiki od zespołów komórek do sieci. Może to potencjalnie poszerzyć naszą wiedzę na temat złożonych funkcji mózgu i procesów poznawczych w zdrowiu i chorobie. Zaangażowanie w otwartą naukę i wgląd w obliczeniową dynamikę neuronalną na dużą skalę może usprawnić modelowanie inspirowane mózgiem, obliczenia neuromorficzne i algorytmy uczenia się neuronowego. Co więcej, zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw upośledzonych wielkoskalowych obliczeń neuronowych i ich wzajemnie powiązanej dynamiki mikroobwodów może doprowadzić do identyfikacji konkretnych biomarkerów, torując drogę do dokładniejszych narzędzi diagnostycznych i celowanych terapii zaburzeń neurologicznych.

Wprowadzenie

Zespoły neuronalne, często nazywane zespołami komórek, odgrywają kluczową rolę w kodowaniu neuronowym, ułatwiając skomplikowane obliczenia do przetwarzania wieloskalowych informacji neuronowych1,2,3. Zespoły te leżą u podstaw tworzenia rozległych sieci neuronalnych i ich zniuansowanych mikroukładów4. Takie sieci i ich wzorce oscylacyjne napędzają zaawansowane funkcje mózgu, w tym percepcję i poznanie. Podczas gdy szeroko zakrojone badania dotyczyły konkretnych typów neuronów i ścieżek synaptycznych, głębsze zrozumienie, w jaki sposób neurony wspólnie tworzą zespoły komórkowe i wpływają na czasoprzestrzenne przetwarzanie informacji w obwodach i sieciach, pozostaje nieuchwytne5.

Ostre, ex-vivo wycinki mózgu są kluczowymi narzędziami elektrofizjologicznymi do badania nienaruszonych obwodów neuronalnych, oferując kontrolowane warunki do badania wzorców aktywności oscylacyjnej funkcji neuronalnych, transmisji synaptycznej i łączności, z implikacjami w testach farmakologicznych i modelowaniu chorób6,7,8. Ten protokół badania podkreśla dwa kluczowe obwody mózgowe - hipokampowo-korowy (HC) zaangażowany w procesy uczenia się i pamięci9,10, oraz opuszkę węchową (OB) odpowiedzialną za dyskryminację zapachów11,12,13. W tych dwóch regionach nowe funkcjonalne neurony są stale generowane przez neurogenezę dorosłego człowieka przez całe życie w mózgach ssaków14. Oba obwody wykazują wielowymiarowe dynamiczne wzorce aktywności neuronalnej i wrodzoną plastyczność, które uczestniczą w ponownym okablowaniu istniejącej sieci neuronowej i ułatwiają alternatywne strategie przetwarzania informacji, gdy jest to wymagane15,16.

Ostre, ex-vivo modele wycinków mózgu są niezbędne do zgłębienia funkcjonalności mózgu i zrozumienia mechanizmów choroby na poziomie mikroukładów. Jednak hodowle komórkowe in vitro pochodzące z sieci neuronalnych indukowanych przez ludzi pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) oferują obiecującą drogę badań translacyjnych, płynnie łącząc wyniki eksperymentów na zwierzętach z potencjalnym leczeniem klinicznym u ludzi17,18. Te skoncentrowane na człowieku testy in vitro służą jako niezawodna platforma do oceny toksyczności farmakologicznej, umożliwiając precyzyjne badania przesiewowe leków i kontynuując badania nad innowacyjnymi strategiami terapeutycznymi opartymi na komórkach19,20. Uznając kluczową rolę modelu neuronalnego iPSC, poświęciliśmy trzeci moduł tego badania protokołu, aby dokładnie zbadać cechy funkcjonalne sieci pochodnych i dostroić powiązane protokoły hodowli komórkowych.

Te elektrogeniczne moduły neuronowe były powszechnie badane przy użyciu technik takich jak wapń (obrazowanie Ca2+), zapisy patch-clamp i matryce mikroelektrod o niskiej gęstości (LD-MEA). Podczas gdy obrazowanie Ca2 + oferuje mapowanie aktywności pojedynczej komórki, jest to metoda oparta na znakowaniu komórek, utrudniona ze względu na niską rozdzielczość czasową i wyzwania w długoterminowych zapisach. LD-MEA nie mają precyzji przestrzennej, podczas gdy patch-clamp, będąc inwazyjną techniką jednomiejscową i pracochłonną, często daje niski wskaźnik sukcesu21,22,23. Aby sprostać tym wyzwaniom i skutecznie badać aktywność w całej sieci, pojawiły się wielkoskalowe jednoczesne zapisy neuronowe, które stały się kluczowym podejściem do zrozumienia obliczeniowych zasad dynamiki neuronalnej leżących u podstaw złożoności mózgu i ich implikacji dla zdrowia i choroby24,25.

W tym protokole JoVE demonstrujemy metodę rejestracji neuronowej na dużą skalę, opartą na MEA O WYSOKIEJ GĘSTOŚCI (HD-MEA) do przechwytywania czasoprzestrzennej aktywności neuronalnej w różnych modalnościach mózgu, w tym w obwodach hipokampa i opuszki węchowej z ostrych wycinków mózgu myszy ex-vivo (Rysunki 1A-C) oraz ludzkich sieci neuronalnych pochodzących z iPSC in vitro (Rysunki 1D-E), wcześniej zgłoszone przez naszą grupę i innych kolegów26,27,28,29,30,31,32,33,34,35. HD-MEA, zbudowany w oparciu o technologię CMOS (Complementary-metal-oxide-semiconductor), może pochwalić się wbudowanymi obwodami i wzmocnieniem, umożliwiając zapisy w czasie poniżej milisekundy na matrycy 7mm2 rozmiar36. To nieinwazyjne podejście rejestruje wielomiejscowe, bezznacznikowe zewnątrzkomórkowe wzorce wypalania z tysięcy zespołów neuronalnych jednocześnie przy użyciu 4096 mikroelektrod w wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej, ujawniając skomplikowaną dynamikę lokalnych potencjałów pola (LFP) i wielojednostkowej aktywności impulsowej (MUA)26,29.

Biorąc pod uwagę ogrom danych generowanych przez tę metodologię, zaawansowane ramy analityczne są niezbędne, ale stanowią wyzwanie37. Opracowaliśmy narzędzia obliczeniowe, które obejmują automatyczne wykrywanie zdarzeń, klasyfikację, teorię grafów, uczenie maszynowe i inne zaawansowane techniki (Rysunek 1F)26,29,38,39. Integrując HD-MEA z tymi narzędziami analitycznymi, opracowano holistyczne podejście do badania skomplikowanej dynamiki od pojedynczych zespołów komórek do szerszych sieci neuronowych w różnych modalnościach neuronowych. To połączone podejście pogłębia naszą wiedzę na temat dynamiki obliczeniowej w normalnych funkcjach mózgu i oferuje wgląd w anomalie występujące w stanach patologicznych28. Co więcej, spostrzeżenia wynikające z tego podejścia mogą napędzać postępy w modelowaniu inspirowanym mózgiem, obliczeniach neuromorficznych i algorytmach uczenia się neuronowego. Ostatecznie metoda ta jest obiecująca, jeśli chodzi o odkrycie podstawowych mechanizmów stojących za zakłóceniami sieci neuronowych, potencjalną identyfikację biomarkerów i ukierunkowanie tworzenia precyzyjnych narzędzi diagnostycznych i ukierunkowanych metod leczenia schorzeń neurologicznych.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z obowiązującymi przepisami europejskimi i krajowymi (Tierschutzgesetz) i zostały zatwierdzone przez lokalne władze (Landesdirektion Sachsen; 25-5131/476/14).

1. Wycinki mózgu ex-vivo z obwodów opuszek hipokampowo-korowych i węchowych na HD-MEA

  1. Przygotowanie eksperymentalnych roztworów do cięcia i rejestrowania (Rysunek 2A)
    1. W dniu doświadczenia należy przygotować 0,5 l roztworu tnącego o wysokiej zawartości sacharozy i 1 l roztworu rejestrującego sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF) (tabela 1A,B).
      1. Dodaj wszystkie stałe chemikalia do suchej kolby miarowej, a następnie napełnij część drogi wodą podwójnie destylowaną (dd).
      2. Dodać MgCl2 i CaCl2 z 1 M roztworów podstawowych, a następnie napełnić pozostałą część wodą dd. Rozpocznij ciągłe mieszanie mieszadłem magnetycznym, aż widoczne ciała stałe rozpuszczą się ~5 min.
    2. Użyj osmometru do punktu zamarzania, aby sprawdzić osmolarność w zakresie 350-360 mOsm dla roztworu do cięcia o wysokiej zawartości sacharozy i 315-325 mOsm dla roztworu do zapisu aCSF.
    3. Użyj pH-metru, aby sprawdzić pH w zakresie 7,3-7,4 dla roztworu do cięcia o wysokiej zawartości sacharozy i 7,25-7,35 dla roztworu do nagrywania aCSF. Rozpocznij ciągłe bulgotanie z 95% O2 i 5% CO2 .
    4. Umieść roztwór do cięcia o wysokiej zawartości sacharozy na lodzie na co najmniej 30 minut przed krojeniem i rozpocznij ciągłe bulgotanie z 95%O2 i 5% CO2 .
    5. Po 10 minutach karbonizacji napełnij zlewkę o pojemności 50 ml 30 ml roztworu do krojenia i przechowuj w zamrażarce (-20 °C) przez 20-30 minut lub do częściowego zamrożenia.
      UWAGA: Wszystkie roztwory powinny być przygotowywane świeże do każdego eksperymentu. Używana tutaj woda dd to autoklawowana woda ultraczysta przechowywana w temperaturze pokojowej (RT). Ilość przygotowanego roztworu powinna być dostosowana do konkretnego pytania badawczego.
  2. Przygotowanie obszarów roboczych wycinków mózgu (Rysunek 2A)
    1. Przyprowadź zwierzę do pomieszczenia doświadczalnego.
      UWAGA: W tym protokole wykorzystano samice myszy C57BL/J6 w wieku 8-16 tygodni, jak opisano wcześniej26,29,32. Zwierzę powinno mieć możliwość zaaklimatyzowania się przez co najmniej 30 minut po transporcie. Należy unikać transferów na duże odległości (tj. między instytutami) w tym samym dniu, w którym odbywa się eksperyment. Wiek, płeć i szczep zwierzęcia należy określić na podstawie konkretnego pytania badawczego.
    2. Podczas gdy zwierzę aklimatyzuje się, a roztwór o wysokiej zawartości sacharozy stygnie, umieść wymagane narzędzia w każdym wyznaczonym miejscu pracy (patrz Tabela materiałów).
    3. Przygotuj przestrzeń roboczą do odzyskiwania i konserwacji wycinków mózgu. Napełnić komorę odzyskiwania plastrów karbogenicznym roztworem do zapisu aCSF i umieścić komorę w łaźni wodnej ustawionej na 32 °C. Utrzymuj ciągłą karbonizację przez cały czas trwania eksperymentu.
    4. Przygotuj obszar roboczy do przygotowywania wycinków mózgu. Ustaw wibratom - umieść ostrze w uchwycie ostrza wibratomu i skalibruj wibrator do prawidłowych ustawień (prędkość przesuwu ostrza: 0,20 mm/s, amplituda wysokości: 95 μm, kąt nachylenia ostrza: 45°). Napełnij tackę na lód wibratomu lodem, a tackę buforową roztworem tnącym o wysokiej zawartości sacharozy i rozpocznij karbonizację roztworu w tacy buforowej.
    5. Przygotuj miejsce robocze do przygotowania mózgu. Napełnij szklaną szalkę Petriego o średnicy 150 mm lodem i umieść w niej plastikowe naczynie hodowlane o średnicy 90 mm z bibułą filtracyjną. Napełnij plastikowe naczynie do hodowli roztworem do cięcia o wysokiej zawartości sacharozy i rozpocznij karbonowanie. Dodaj kroplę super kleju do schłodzonej płytki próbki i przymocuj formę agarozy.
      UWAGA: Pleśń agarozowa jest przygotowywana co najmniej dzień wcześniej z 3% agarozy w wodzie w niestandardowej formie do mózgu myszy.
    6. Na koniec przygotuj obszar roboczy do ekstrakcji mózgu. Przykryj folię aluminiową bibułą, wyjmij zlewkę o pojemności 50 ml zawierającą roztwór do cięcia o wysokiej zawartości sacharozy i dodaj izofluran do komory anestezjologicznej.
      UWAGA: Znieczulenie zostanie dodane do komory anestezjologicznej ~1 minutę przed umieszczeniem zwierzęcia. Zlewka o pojemności 50 ml z 30 ml roztworu do cięcia o wysokiej zawartości sacharozy zostanie usunięta z zamrażarki o temperaturze -20 °C ~ 2 minuty przed dekapitacją.
  3. Ekstrakcja i krojenie mózgu myszy
    UWAGA: Cała ta procedura powinna być wykonana tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć braku dotlenienia mózgu. Usunięcie mózgu powinno zająć tylko 1-2 minuty od dekapitacji do zanurzenia w roztworze tnącym o wysokiej zawartości sacharozy.
    1. Znieczulić zwierzę odpowiednią dawką izofluranu (0,5 ml/1 l komora anestezjologiczna). Określ głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie łapy; Przed kontynuowaniem potwierdź brak odruchu wycofania łapy.
    2. Przenieś zwierzę na bibułę w obszarze ekstrakcji mózgu i odetnij mu głowę nożyczkami chirurgicznymi.
    3. Włóż nożyczki do tęczówki do pnia mózgu i trzymaj dolne nożyczki równo z kalwarią. Przeciąć wzdłuż szwu strzałkowego, aż do osiągnięcia szwu koronalnego. Umieść nożyczki do tęczówki w oczodołach i przetnij szew metopowy. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby przesunąć boki kalwarii w dół, odsłaniając cały mózg.
      UWAGA: Uważaj zarówno z nożyczkami do tęczówki, jak i kleszczami, aby nie przebić mózgu podczas przecinania szwów.
    4. Wsuń mózg krawędzią zakrzywionych kleszczy do zlewki o pojemności 50 ml z 30 ml roztworu do cięcia o wysokiej zawartości sacharozy. Pozostaw na 1 minutę.
    5. Przenieś mózg do plastikowego naczynia hodowlanego o średnicy 90 mm ze schłodzonym karbogenicznym roztworem tnącym w miejscu pracy do przygotowania mózgu. Ustaw mózg do pozycjonowania w formie agarozy.
    6. Dodaj małą kropkę super kleju do rostralnego końca formy agarozowej. Umieść mózg w formie za pomocą szpatułki. Upewnij się, że mózg jest umieszczony grzbietową stroną do dołu w celu poziomego krojenia.
      UWAGA: Położenie kleju w formie zmieni się w zależności od obszaru zainteresowania (ROI). W przypadku plastrów hipokampowo-korowych (HC) i opuszki węchowej (OB) upewnij się, że OB jest ustabilizowany, a boki mózgu pozostają wolne od kleju. Zbyt dużo kleju wpłynie na jakość krojenia i spowoduje rozdarcia podczas krojenia wibratomem.
    7. Przenieś płytkę z próbką do tacki buforowej, przesuń ostrze na miejsce pod odpowiednim kątem i zwiększ wysokość tacki buforowej, aby zbliżyć ostrze jak najbliżej mózgu.
    8. Plastyk z prędkością 0,20 mm/s w odstępach 300 μm tkanek HC i OB, a następnie zbieraj je po każdym krojeniu za pomocą szklanej pipety Pasteura.
    9. Pozostaw plastry w komorze regeneracyjnej wypełnionej płynem CSF w łaźni wodnej o temperaturze 32 °C na 45 minut, a następnie przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że plastry nie zachodzą na siebie i są całkowicie wystawione na działanie roztworu karbogenowego.
      UWAGA: Należy pamiętać o utrzymywaniu ciągłej karbonizacji wszystkich roztworów i wszystkich wymienionych komór zawierających roztwór. Regulator ciśnienia może być używany do utrzymania stałego karbonowania.

2. Ludzka sieć neuronowa oparta na iPSC in vitro na HD-MEA

UWAGA: Wszystkie neurony iPSC użyte w tym badaniu są pozyskiwane komercyjnie (patrz Tabela materiałów). Te ludzkie komórki różnicowały się ze stabilnych linii komórkowych iPS, które pochodziły z ludzkiej krwi obwodowej lub fibroblastów.

  1. Powlekanie chipów HD-MEA do hodowli ludzkich komórek iPSC in vitro (Rysunek 2B)
    1. Umieść chip HD-MEA na platformie rejestrującej akwizycję, napełnij zbiornik PBS i przetestuj chip przed powlekaniem. Uruchom oprogramowanie Brainwave. Wybierz Plik > nową sesję nagrywania. Ustaw parametry nagrywania tak, aby częstotliwość nagrywania wynosiła 50 Hz, a częstotliwość próbkowania 18 kHz/elektrodę. Zmień przesunięcie wzmacniacza, aby skalibrować chip. Patrz Tabela 2, aby zapoznać się ze wskazówkami dotyczącymi rozwiązywania problemów.
      UWAGA: Parametry częstotliwości nagrywania i częstotliwości próbkowania będą zależeć od typu danych i indywidualnych wymagań systemowych.
    2. Sterylizuj i kondycjonuj wstępnie HD-MEA.
      1. Pod maską przetrzyj chip i szklany pierścień chusteczką zwilżoną 96% etanolem (EtOH), a następnie umieść każde urządzenie na sterylnej szalce Petriego o wymiarach 100 mm x 20 mm i napełnij zbiornik MEA 70% EtOH na 20 minut.
      2. Odessać EtOH i umyć zbiornik sterylną, przefiltrowaną wodą dd-water 3 razy. Dodać 1 ml pożywki do kondycjonowania wstępnego i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
        UWAGA: Podłoże do kondycjonowania wstępnego musi być roztworem na bazie soli, aby powierzchnia HD-MEA była bardziej hydrofilowa. Może to obejmować wcześniej przygotowane kompletne pożywki BrainPhys (BP) (nie >3 miesiące) (Tabele 1C).
    3. Płaszcz HD-MEA. Następnego dnia odessać pożywkę do kondycjonowania wstępnego. Dodaj 1 ml 0,1 mg/ml poli-dl-ornityny (PDLO), aby pokryć cały obszar aktywny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc w inkubatorze.
    4. Przygotuj i podgrzej nośnik do RT. Protokoły te wykorzystują funkcjonalne ludzkie neurony iPSC z dwóch komercyjnych źródeł; W związku z tym komponenty nośników różnią się w zależności od dostawcy. Jeden protokół jest opisany w (Tabele 1C, D) .
    5. Odessać PDLO, umyć 3 razy wodą dd-water i pozostawić frytki do wyschnięcia pod maską na 10 minut.
    6. Napełnij szalkę Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm sterylną, przefiltrowaną wodą i umieść ją obok wióra, aby utrzymać odpowiednią wilgotność i uniknąć parowania wysianych komórek w kolejnych krokach.
  2. Posiewanie i utrzymanie ludzkich neuronów iPSC w HD-MEA (Rysunek 2B)
    1. Rozmrozić i rozcieńczyć komórki do pożądanych komórek na stężenie mikrolitra (tj. 1000 komórek/μl, aby uzyskać gęstość 50 000 komórek w kropli 50 μl na HD-MEA) (Tabela 1C).
    2. Odpipetować zawiesinę komórek na powierzchni obszaru aktywnego chipa za pomocą pożywki o wysokiej zawartości lamininy (tabela 1D).
    3. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 45-60 min.
    4. Delikatnie napełnij 2 ml pożywki w zbiorniku HD-MEA (Tabela 1C).
    5. Wykonaj 100% zmianę podłoża w dniu 1 (DIV1) po wysiewie przy użyciu pożywek RT (Tabela 1C). Zmieniaj 50% nośników co 3-4 dni. Utrzymuj HD-MEA w inkubacji w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez cały czas trwania eksperymentu.
      UWAGA: Delikatnie pipetować, aby uniknąć przemieszczenia komórek. Sprawdź kolor nośnika pod kątem zanieczyszczeń. Interwał i ilość wymiany pożywki można określić na podstawie indywidualnych pytań badawczych lub potrzeb/specyfikacji komórek.
    6. Opcjonalnie: Sprawdź postęp wzrostu hodowli komórkowej między DIV4-DIV8 pod pionowym mikroskopem kontrastu różnicowego interferencyjnego (DIC) po oczyszczeniu stolika za pomocą >70% EtOH.

3. Duże nagrania neuronowe ex-vivo i in vitro z HD-MEA

  1. Przygotowanie miejsca do nagrywania wycinków mózgu (Rysunek 2A)
    1. Podczas gdy wycinki mózgu dochodzą do siebie, umieść wymagane narzędzia w każdym wyznaczonym miejscu pracy (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Główna konfiguracja systemu musi zostać zoptymalizowana i przetestowana na długo przed dniem eksperymentalnym wycinka mózgu. System perfuzyjny (przewody wlotowe, przewody wylotowe pompy, rurki i uziemienie) musi zostać przetestowany za pomocą PBS lub aCSF i HD-MEA na platformie nagrywającej, aby zapewnić czysty sygnał, zwiększony stosunek sygnału do szumu i brak szumów perfuzyjnych.
    2. Pokryj chip HD-MEA 0,1 mg/ml PDLO w celu zwiększenia sprzężenia tkanka-chip i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 20 minut.
    3. Podczas inkubacji chipów należy wypełnić grawitacyjny system perfuzyjny i linie zapisem CSF. Zapewnić ciągłą karbonizację systemu perfuzyjnego. Ustaw natężenie przepływu 4,5 ml/min i temperaturę 37 °C.
    4. Umieść chip HD-MEA na platformie rejestrującej akwizycję, napełnij zbiornik płynem CSF, przetestuj system perfuzyjny i rozwiąż problem z pozostałym szumem systemu.
      1. Uruchom oprogramowanie Brainwave. Wybierz Plik > nową sesję nagrywania. Ustaw parametry nagrywania tak, aby częstotliwość nagrywania wynosiła 1 Hz, a częstotliwość próbkowania 14 kHz/elektrodę. Zmień przesunięcie wzmacniacza, aby skalibrować chip. Patrz Tabela 2, aby zapoznać się ze wskazówkami dotyczącymi rozwiązywania problemów.
        UWAGA: Parametry częstotliwości nagrywania i częstotliwości próbkowania będą zależeć od typu danych i indywidualnych wymagań systemowych.
    5. Upewnij się, że obszar nagrywania jest ciemny przez system oświetlenia pomieszczenia lub zacienioną klatkę na stole optycznym.
    6. Ustaw mikroskop stereoskopowy w stosunku do zbiornika chipa HD-MEA i obszaru aktywnego w celu uzyskania obrazu.
    7. Umieść kotwę w zbiorniku na wióry, aby zrównoważyć.
      UWAGA: Anchor to wykonana na zamówienie platynowa harfa z minimalnymi drutami wspomagającymi natlenienie; Dostępne są jednak niektóre komercyjne.
    8. Dodaj związki farmakologiczne do odpowiednich probówek perfuzyjnych.
      UWAGA: W tym protokole uzyskano zarówno spontaniczne, jak i farmakologicznie wywołane 100 μM 4-aminopirydyny (4-AP), jak opisano wcześniej. Związki farmakologiczne mogą być dostosowane do konkretnego pytania badawczego.
    9. W miejscu pracy do przygotowywania wycinków mózgu umieść nową plastikową miskę do hodowli o średnicy 90 mm na szklanej szalce Petriego o średnicy 150 mm. Dodaj płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) i rozpocznij karbonowanie.
  2. Nagrania w całym obwodzie z warstw HC i OB przy użyciu HD-MEAs
    UWAGA: Łączenie plastrów powinno być wykonywane tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć braku natlenienia plastrów. Sprzężenie powinno zająć tylko ~1 minutę od początkowego umieszczenia mikrowyciętego wycinka w obszarze aktywnym chipa do końcowego uruchomienia systemu perfuzyjnego.
    1. Wyjmij plasterek z komory odzyskiwania wycinków mózgu za pomocą szklanej pipety i umieść go w plastikowym naczyniu hodowlanym o średnicy 90 mm z ciągłą karbonizacją. Za pomocą narzędzia do mikrodysekcji wyizoluj HC lub OB od otaczającej tkanki wycinka mózgu.
    2. Przenieść izolowane ostre plastry HC lub OB za pomocą szklanej pipety do zbiornika HD-MEA. Delikatnie wyrównaj plasterek na obszarze aktywnym MEA za pomocą cienkiego pędzla. Dobrze zassaj wszystkie roztwory z chipa HD-MEA za pomocą systemu aspiracji.
    3. Delikatnie umieść kotwicę na plasterku za pomocą kleszczy.
      UWAGA: Kotwę należy umieszczać bez ruchu plastru, aby uniknąć utraty złącza.
    4. Delikatnie dodać roztwór do zbiornika na wióry i uruchomić system perfuzyjny.
      UWAGA: Zapewnić przepływ laminarny z wlotu perfuzji i wylotu pompy, aby uzyskać optymalne parametry nagrywania.
    5. Upewnij się, że obszar nagrywania jest odpowiednio przyciemniony przez system oświetlenia pomieszczenia lub za pomocą zacienionej klatki na stole optycznym.
    6. Pozwól plastrowi zaaklimatyzować się przez 10 minut przed rozpoczęciem nagrań lub dodatkowej modulacji farmakologicznej.
    7. Uruchom oprogramowanie Brainwave. Wybierz Plik > nową sesję nagrywania. Ustaw parametry nagrywania tak, aby częstotliwość nagrywania wynosiła 1 Hz, a częstotliwość próbkowania 14 kHz/elektrodę. Zmień przesunięcie wzmacniacza, aby skalibrować chip.
      UWAGA: Jak wspomniano wcześniej w sekcji 3.1.4.1, podczas wykonywania testów systemu należy upewnić się, że stosuje się te same parametry nagrywania.
    8. Naciśnij przycisk Nagraj, aby rozpocząć akwizycję z ustawionymi warunkami eksperymentalnymi.
    9. Bezpośrednio po ostatnim nagraniu uchwyć obrazowanie świetlne ostrego wycinka mózgu. Przenieś plasterek z powrotem do komory odzyskiwania plastrów, usuń wszelki materiał organiczny sprzężony z wiórem za pomocą szczotki i kontynuuj z następnym plasterkiem. Wyczyść HD-MEA zgodnie z opisem w sekcji 3.4.
  3. Przygotowanie miejsca roboczego do nagrywania iPSC przez człowieka oraz nagrań w całej sieci na HD-MEA (Rysunek 2B)
    UWAGA: Zmień nośnik dzień przed nagraniem lub bezpośrednio po zarejestrowaniu iPSC u ludzi (Tabela 1C). W badaniach z wykorzystaniem neuronów funkcjonalnych pożywka była zmieniana co 4 dni, a na 4, 8, 16 i 24 pożywkach DIV zmieniano natychmiast po zapisach iPSC.
    1. Zapewnij sterylne środowisko pracy, czyszcząc platformę akwizycyjną HD-MEA za pomocą >70% EtOH.
    2. Delikatnie umieść nasadkę na bazie polidimetylosiloksanu (PDMS) z odniesieniem do pierścienia HD-MEA pod maską. Przenieś układ HD-MEA do obszaru roboczego nagrywania iPSC i podłącz układ HD-MEA do platformy akwizycyjnej.
    3. Upewnij się, że obszar nagrywania jest odpowiednio przyciemniony przez system oświetlenia pomieszczenia lub zacienioną klatkę na stole optycznym.
    4. Pozwól, aby chip HD-MEA osiągnął równowagę przez 10 minut przed rozpoczęciem nagrań lub dodatkowej modulacji farmakologicznej.
    5. Uruchom oprogramowanie Brainwave. Wybierz Plik > nową sesję nagrywania. Ustaw parametry nagrywania tak, aby częstotliwość nagrywania wynosiła 50 Hz, a częstotliwość próbkowania 18 kHz/elektrodę. Zmień przesunięcie wzmacniacza, aby skalibrować chip.
      UWAGA: Jak wspomniano wcześniej w sekcji 2.1.1, wykonując test systemu przed powlekaniem i powlekaniem, należy upewnić się, że stosuje się te same parametry nagrywania.
    6. Rejestrować spontaniczną aktywność wypalania lub farmakologicznie indukowane reakcje z ludzkiej sieci iPSC w każdym dniu planu eksperymentalnego (tj. 4, 8, 16, 24 DIV).
      UWAGA: Nie pozwól, aby chip pozostał poza inkubatorem przez >30 minut, aby utrzymać stabilną temperaturę i wilgotność oraz zapobiec szokowi temperaturowemu komórek.
    7. Inkubować HD-MEA w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w trakcie trwania eksperymentu.
    8. Po zakończeniu eksperymentu napraw sieć neuronową na chipach i zabarwij w celu dalszego obrazowania optycznego lub wyczyść HD-MEA bezpośrednio, jak opisano w kroku 3.4.
  4. Czyszczenie chipów HD-MEA
    1. Po eksperymencie wyrzuć roztwór zgodnie z prawidłowym usuwaniem odpadów i spłucz wodą.
    2. Dodaj wybrany detergent, wyczyść obszar aktywny i cały zbiornik za pomocą patyczka higienicznego, a następnie wyrzuć detergent. Uzupełnij detergentem, inkubuj przez 20 minut, a następnie wyrzuć detergent.
    3. Dokładnie spłucz wodą laboratoryjną. Następnie spłucz 3-4 razy wodą dd.
    4. Użyj ciśnienia powietrza, aby dokładnie wysuszyć chip HD-MEA.

4. Analiza dużych nagrań neuronowych z HD-MEA

UWAGA: Podczas gdy krok 4.1 jest specyficzny dla oprogramowania Brainwave, krok 4.2 może być modyfikowany w zależności od dostępnego na rynku typu urządzenia HD-MEA każdego użytkownika.

  1. Wstępne przetwarzanie danych pierwotnych i wykrywanie zdarzeń
    1. Otwórz nagrany plik surowych danych (.brw) w oprogramowaniu Brainwave. Wybierz Analiza > Wykrywanie LFP lub Wykrywanie skoków.
      UWAGA: Detekcja LFP wykorzystuje filtrowanie IIR z dolnoprzepustowym filtrem Butterwortha>4 rzędu (1-100 Hz). Algorytmy twardego progu obejmują wysoki próg 150 μV, niski próg -150 μV, okno energetyczne między 70-120 ms, okres refrakcji 10 ms i maksymalny czas trwania zdarzenia wynoszący 1 s. Wykrywanie pojedynczych i impulsów MUA wykorzystuje filtrowanie IIR z górnoprzepustowym filtrem Butterwortha 4. rzędu (300-3500 Hz). Stosuje się algorytm PTSD ze współczynnikiem odchylenia standardowego wynoszącym 8, szczytowym okresem życia wynoszącym 2 ms i okresem refrakcji wynoszącym 1 ms.
    2. W przypadku nagrań obwodów HC i OB dodaj opcję Advanced Workspace (Zaawansowana przestrzeń robocza) w pliku wykrytych zdarzeń (.bxr), aby zaimportować obraz światła strukturalnego przechwycony z mikroskopu stereoskopowego. Podczas badania obwodów HC na dużą skalę należy utworzyć warstwy strukturalne zawierające zakręt zębaty (DG), hilus, Cornu Ammonis 1 (CA1), Cornu Ammonis 3 (CA3), korę śródwęchową (EC) i korę okołowęchową (PC). Podczas badania obwodów OB na dużą skalę należy utworzyć warstwy strukturalne zawierające warstwę nerwu węchowego (ONL), warstwę kłębuszkową (GL), warstwę splotu zewnętrznego (EPL), warstwę komórek mitralnych (MCL) i warstwę komórek ziarnistych (GCL). Rozważ EPL i MCL jako warstwę projekcyjną (PL), w tym korę węchową (OCx).
  2. Przetwarzanie danych za pomocą niestandardowego potoku obliczeniowego języka Python
    1. Odszumianie
      1. Przeczytaj plik .bxr za pomocą niestandardowego skryptu Pythona26,29,32 i pakiet Pythona h5py 3.6.0.
      2. Wyodrębnij ciągi kolców odnoszące się do nagrań sieciowych iPSC i ciągi zdarzeń LFP odnoszące się do nagrań obwodów HC i OB wycinków mózgu.
      3. Scharakteryzuj zdarzenia, w których całkowita liczba aktywnych elektrod jest mniejsza niż 0,1% lub 10% średniej liczby aktywnych elektrod na średnie zdarzenie lub wykryte zdarzenia wykraczające poza statystycznie uzasadniony zakres szybkości wyzwalania jako zdarzenia losowe i usuń je. Dodatkowo zastosuj wartości progowe amplitudy i czasu trwania zdarzenia.
        UWAGA: W przypadku zakresu szybkostrzelności brane są pod uwagę 0,1-15 skoków/s i 0,1-60 zdarzeń LFP/min. Są to przykładowe wartości progowe szybkości używane dla analizowanych zestawów danych. Progi szybkości, amplitudy i czasu trwania będą zależeć od poszczególnych danych.
      4. Zapisz wynikowe dane ciągu zdarzeń wraz z towarzyszącymi informacjami czasowo-przestrzennymi w formacie pliku .npy.
    2. Rakramy
      1. Odczytaj filtrowane pliki .npy i .bxr zdarzenia i wygeneruj wykres rastrowy za pomocą funkcji pyplot Matplotlib (https://matplotlib.org/3.5.3/api/_as_gen/matplotlib.pyplot.html).
      2. Dodatkowo, w przypadku nagrań wycinków mózgu ze specyficznością warstwy, posortuj i pogrupuj identyfikatory elektrod na podstawie warstw utworzonych w kroku 4.1.2.
    3. Średnia aktywność przy wypalaniu
      1. Przetwarzaj dane szeregów czasowych z pliku .bxr, obliczając średnią szybkość wyzwalania każdej elektrody (liczba zdarzeń/czas nagrywania).
      2. Skonstruuj macierz danych, w której wiersze i kolumny reprezentują współrzędne elektrod w matrycy HD-MEA 64 x 64, gdzie każda wartość matrycy oznacza średnią szybkość wypalania.
      3. Korzystaj z biblioteki do kreślenia, takiej jak imshow Matplotlib lub funkcje mapy cieplnej Seaborn w Pythonie.
      4. Wykorzystaj tutaj "gorącą" mapę kolorów, tworząc informacyjną mapę cieplną, która wizualnie przedstawia rozkład przestrzenny średnich szybkości wypalania w całym układzie elektrod.
    4. Reprezentatywne ścieżki przebiegu
      1. Odczytaj dane szeregów czasowych z pliku .brw i wygeneruj ślad falowy za pomocą funkcji pyplot Matplotlib. (https://matplotlib.org/3.5.3/api/_as_gen/matplotlib.pyplot.html).
      2. Wprowadź żądany identyfikator elektrody, przedział czasowy i pasmo częstotliwości, aby uzyskać reprezentatywny ślad przebiegu. Pasma częstotliwości zdefiniowane w tych analizach obejmują oscylacje LFP o niskiej częstotliwości (1-100 Hz) z filtrowanymi pasmami pasma δ, θ, β i γ pasmami częstotliwości; ostre tętnienia fal (SWR) (140-220 Hz); oraz wysokotonowe pojedyncze i MUA (300-3500 Hz). Pasma częstotliwości δ, θ, β i γ wynoszą odpowiednio 1-4 Hz, 5-12 Hz, 13-35 Hz i 35-100 Hz.
    5. Gęstość widmowa mocy
      1. Odczytaj dane szeregów czasowych z pliku .brw i oblicz periodogramy, aby dostrzec dominujące częstotliwości leżące u podstaw aktywności oscylacyjnej w każdym szeregu czasowym.
      2. Skonstruuj pseudo-kolorowe spektrogramy dynamiki częstotliwościowo-czasowej.
        UWAGA: Widma są obliczane przy użyciu metody Welcha z wykorzystaniem szybkiej transformaty Fouriera zarejestrowanych LFP do oszacowania spektralnej gęstości mocy41.
      3. Wprowadź żądany identyfikator elektrody, przedział czasowy i pasmo częstotliwości, aby uzyskać mapę gęstości widmowej. Pasma częstotliwości zdefiniowane w tych analizach obejmują zakresy opisane w kroku 4.2.4.
    6. Funkcjonalna łączność
      1. W przypadku nagrań obwodu wycinka mózgu wykonaj kroki 4.2.6.2-4.2.6.4.
      2. Odczytaj dane szeregów czasowych z pliku .brw i oblicz kowariancję krzyżową między parami aktywnych elektrod w tablicy 64 x 64, stosując współczynnik korelacji Pearsona (PCC)42.
      3. Dopasuj wektorowy model autoregresyjny do szeregów czasowych przy użyciu wielowymiarowej przyczynowości Grangera w celu ilościowego określenia wpływu jednego szeregu czasowego na inny.
      4. Stosowanie funkcji bezpośredniego transferu (DTF) w celu oceny kierunkowego przepływu informacji w obrębie skorelowanych łączy.
        UWAGA: Łączność funkcjonalna w sieci wielowarstwowej jest ustanawiana przez ustawienie progu wartości korelacji na podstawie wartości powyżej średniej i dwóch odchyleń standardowych wszystkich wartości kowariancji krzyżowej43,44.
      5. Aby zarejestrować iPSC, wykonaj kroki 4.2.6.6-4.2.6.8.
      6. Odczyt danych spiketrains z pliku .bxr i obliczenie macierzy 64x64 współczynników korelacji PCC między wszystkimi kombinacjami połączonych ciągów spajków przy użyciu funkcji spike_train_correlation (https://elephant.readthedocs.io/en/v0.7.0/reference/spike_train_correlation.html).
        UWAGA: Łączność funkcjonalna w sieci wielowarstwowej jest ustalana przez ustawienie progu wartości korelacji na podstawie wartości powyżej średniej i dwóch odchyleń standardowych wszystkich wartości kowariancji krzyżowej.
      7. Ponadto zaimplementuj filtry przestrzenno-czasowe (STF) i procedury filtrowania progów opóźnień zależnych od odległości (DdLT) na macierzy połączeń, aby wyeliminować potencjalne sparowane połączenia przekraczające maksymalną prędkość propagacji (ustawioną na 400 mm/s)45.
      8. Wyodrębnij ujemne piki z wynikowych macierzy korelacji krzyżowej za pomocą operacji filtrowania i progowania, aby zidentyfikować połączenia hamujące za pomocą algorytmu filtrowanego i znormalizowanego histogramu korelacji krzyżowej (FNCCH)45.
      9. Przekształć każdą macierz połączeń w plik grafu dynamicznego (.gexf).
    7. Mapy połączeń sieciowych
      1. Otwórz laboratorium danych w programie Gephi w wersji 9.2 (https://gephi.org) dla dynamicznego wykresu do wykreślania określonych przedziałów czasowych.
      2. Zastosuj układ geograficzny w oknie układu do tworzenia map przestrzennych.
      3. Umieść ograniczenia parametrów na Zakresie stopni i Wadze krawędzi dla porównania.
      4. Przypisz kolor węzła, rozmiar krawędzi i rozmiar stopnia, aby uzyskać lepszą wizualizację.

Wyniki

Multimodelowe mapowanie spatiotemporalne i ekstrakcja cech wyładowań oscylacyjnych
Aby ilościowo określić zdarzenia LFP i kolców w całej sieci, które wyłoniły się z dynamicznych zespołów neuronalnych, zbadano synchroniczne, wielkoskalowe wzorce wyładowań w obwodach HC i OB oraz w sieciach ludzkich iPSC. Obwody z zapisów skrawków mózgu z kroku 3.2 oraz zapisane sieci iPSC z kroku 3.3 zostały przeanalizowane zgodnie z krokami 4.1-4.2 protokołu. Najpierw przeprowadzono detekcję zdarzeń i odszumianie dla wszystkich zapisanych zbiorów danych, z rozdzielczością regionalną zgodnie ze specyfikacją obwodów. Następnie wykreślono topograficzne mapy przestrzenne w pseudokolorach dla średnich wielkoskalowych wzorców wyładowań LFP i kolców, rastergramy wykrytych zdarzeń oraz reprezentatywne 5-s ślady przefiltrowanych przebiegów (Rysunki 3A-I). Topograficzne mapy pseudokolorowe wzorców częstotliwości wyładowań LFP i kolców w dużej skali nałożono na odpowiednie obrazy optyczne HC (Rysunek 3A), OB (Rysunek 3B) i ludzkiej sieci neuronalnej iPSC (Rysunek 3C) zarejestrowane za pomocą mikroskopu. Pozwala to na badanie poszczególnych wzorców oscylacyjnych i odpowiedzi w obrębie obwodów i sieci. Rastergramy HC i OB zawierają liczby wykrytych zdarzeń LFP posortowane według warstw DG, Hilus, CA3, CA1, EC i PC obwodu HC oraz warstw ONL, OCx, GL, PL i GCL sieci OB w 60-s przedziałach czasowych (Rysunki 3D,E). Rastergram ludzkich iPSC przedstawia synchroniczne wykryte zdarzenia kolców połączonej hodowanej sieci w 20-s przedziałach czasowych (Rysunek 3G). Następnie, reprezentatywne 5-s ślady zdarzeń z wielkoskalowych miejsc rejestracji HD-MEA pokazują zakres zarejestrowanych częstotliwości oscylacyjnych w obwodach HC (np. wybrana elektroda w CA3) (Rysunek 3G) i OB (np. wybrana elektroda w GL) (Rysunek 3H) oraz aktywność seryjną kolców wielojednostkowych w ludzkiej sieci iPSC z czterech wybranych aktywnych elektrod w matrycy (Rysunek 3I). Przykładowe sygnały te wykazują sygnatury biosygnałów, w tym niskoczęstotliwościowe oscylacje LFP (1-100 Hz) z przefiltrowanymi pasmowo pasmami częstotliwości δ, θ, β i γ; ripple sharp wave (SWR) (140-220 Hz) oraz wysokoczęstotliwościowe pojedyncze kolce i MUA (300-3500 Hz). Na koniec zastosowano analizę gęstości widmowej mocy (PSD), aby jednocześnie ilościowo określić amplitudę mocy konkretnego pasma oscylacyjnego w połączonych obwodach HC i OB zarejestrowanych za pomocą HD-MEA (Rysunki 3J,K).

Multimodal funkcjonalny konektom w skali całej sieci
Aby wywnioskować wielkoskalową łączność wielowarstwowych sieci neuronalnych na podstawie wzorców jednoczesnego wyładowywania aktywnych zespołów neuronów, obliczono kowariancję krzyżową między parami aktywnych elektrod w wykrytych zdarzeniach zgodnie z krokiem 4.2.6 protokołu. W tym przypadku współczynnik korelacji został posortowany według warstw w obwodzie HC i OB lub pozostawiony bez sortowania w sieci iPSC, a następnie zapisany w macierzy symetrycznej. Funkcjonalne konektomy obwodów HC i OB wygenerowano, stosując wielowymiarową przyczynowość Grangera oraz funkcję transferu kierunkowego (DTF), aby ilościowo określić wpływ jednego szeregu czasowego na drugi i ocenić kierunkowy przepływ informacji w skorelowanych połączeniach w poszczególnych sieciach. Mapowanie konektomu HC (Ryc. 4A) i OB (Ryc. 4B) oraz wizualizacja sieci zostały wykonane przy użyciu programu Gephi w wersji 9.2 (https://gephi.org). W celu porównania obwodów plastrów mózgu HC i OB zastosowano podobne ograniczenia parametrów, co zilustrowało 100 s funkcjonalnej łączności wykrytych zdarzeń LFP. Węzły są skalowane zgodnie z siłą stopnia, przy czym kolor węzła wskazuje warstwę, a kolor połączenia identyfikuje połączenia wewnątrz- i międzywarstwowe. Funkcjonalne konektomy ludzkich sieci iPSC wygenerowano poprzez zastosowanie filtrów czasowo-przestrzennych (STF) i progów opóźnienia zależnych od odległości (DdLT), aby usprawnić wybór istotnych połączeń i doprecyzować identyfikację znaczących relacji poprzez zastosowanie analizy filtrowanego i znormalizowanego histogramu korelacji krzyżowej (FNCCH). Mapowanie konektomu ludzkich sieci iPSC na całym chipie HD-MEA (Ryc. 4C) oraz wizualizacja zostały wykonane przy użyciu programu Gephi. Kolor węzła wskazuje wejście pobudzające lub hamujące, a kolor połączenia identyfikuje konkretne połączenia.

Schemat multimodalnych biohybrydowych platform neuroelektronicznych; obwody neuronalne, obrazowanie optyczne, analiza danych.
Rysunek 1: Przegląd platformy eksperymentalnej i obliczeniowej opartej na wielkoskalowym HD-MEA. (A) Izometryczny schemat naszych multimodalnych biohybrydowych platform neuroelektronicznych zrealizowanych z wykorzystaniem HD-MEA w technologii CMOS w celu rejestracji dynamiki neuronalnej z obwodów i sieci neuronalnych HC, OB oraz ludzkich iPSC. (B) Schematyczny przebieg procesu przygotowania skrawków mózgu myszy oraz organizacji stanowiska pracy w celu uzyskania skrawków HC i OB. (C) Przedstawienia topograficzne wielkoskalowych wzorców wyładowań rejestrowanych jednocześnie z całych skrawków HC i OB, nałożone na optyczne obrazy skrawków wraz z wyekstrahowanymi zewnątrzkomórkowymi przebiegami potencjałów. (D) Schematyczne przedstawienie sieci neuronalnej iPSC pochodzącej od ludzi. (E) Mikrofotografie fluorescencyjne obrazujące komórkowe c-fos oraz somatyczne/dendrytyczne MAP-2 całej ludzkiej sieci neuronalnej na chipie HD-MEA (lewa) zestawione z mapą średniej aktywności wyładowań całej sieci (prawa). (F) Rama obliczeniowa obejmująca zaawansowaną analizę danych, mapowanie łączności oraz narzędzia sztucznej inteligencji i uczenia maszynowego do analizy wielowymiarowych danych neuronalnych uzyskanych z wielkoskalowych pomiarów na HD-MEAs. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Procedura preparowania skrawków mózgu ex-vivo na HD-MEA, układ do rejestracji i obrazowania sieci neuronalnych.
Rysunek 2: Układy stanowisk pracy do przygotowania i rejestracji skrawków mózgu ex-vivo oraz hodowli ludzkich iPSC in-vitro. (A) Schematyczny przebieg procesu ilustrujący układ przygotowania skrawków HC i OB, zawierający niezbędne narzędzia i sprzęt na każdym stanowisku pracy. (B) Schematyczne przedstawienie przygotowania hodowli ludzkich iPSC, wraz z niezbędnymi narzędziami i urządzeniami. Pełna lista materiałów znajduje się w krokach 1.2.2, 2.1, 2.2, 3.1.1, 3.3 oraz w Tabeli materiałów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obwody hipokampalno-węchowe; mapy ciepła aktywności neuronalnej; wykresy impulsów; dane widma częstotliwości.
Rycina 3: Mapowanie i wyodrębnianie czasoprzestrzennych wzorców dynamiki sieci. (A-C) Przestrzenne mapy średniego LFP i częstotliwości impulsów, obliczone na podstawie pięciominutowych zapisów, nałożone na obraz świetlny z mikroskopu. (D-F) Wykresy rastrowe przedstawiające wykryte, odszumione zdarzenia LFP w 60-sekundowej podpróbce danych oraz impulsy w 20-sekundowej podpróbce danych. (G-I) Reprezentatywne wyodrębnienie śladu przebiegu z 5-sekundowego fragmentu podpróbki danych z wykresu rastrowego (zaznaczone na czerwono na wykresie rastrowym), przedstawione jako surowe pasma oscylacyjne LFP (1-100 Hz); pasma częstotliwości δ (1-4 Hz), θ (5-12 Hz), β (13-35 Hz) i γ (35-100 Hz); SWR (140-220 Hz); oraz wysokoczęstotliwościowe impulsy pojedyncze i MUA (300-3500 Hz). (J,K) Mapy gęstości widmowej mocy szybkich i wolnych oscylacji LFP (1-100 Hz) oraz SWR (140-220 Hz). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schematy sieci neuronalnych hipokampa, opuszki węchowej i iPSC; mapa obwodów neuronalnych i łączności.
Rysunek 4: Organizacja multimodalnych funkcjonalnych konektomów w skali całej sieci. (A-C) Mapy Gephi ilustrujące funkcjonalną łączność węzłów, gdzie węzły odpowiadają jednej z przykładowych legend paska kolorów (poniżej), natomiast połączenia (krawędzie) są zacieniowane tak, aby pasowały do łączonych węzłów. Przykładowe legendy dla warstw (A) HC, (B) OB i (C) iPSC są wyświetlane na macierzy 64 x 64. Warstwy HC i OB zostały wykreślone w 100-s przedziale czasowym, aby skutecznie zredukować liczbę widocznych węzłów i połączeń na potrzeby wizualizacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Roztwory do przygotowania skrawków mózgu oraz pożywki dla kultur neuronalnych iPSC. (A) Roztwór do cięcia z wysoką zawartością sacharozy do przygotowania skrawków mózgu ex-vivo. (B) Roztwór aCSF do rejestracji, stosowany do przygotowania skrawków mózgu ex-vivo oraz rejestracji. (C-D) Protokół pożywek dla ludzkich neuronów iPSC, gdzie (C) to kompletna pożywka BrainPhys stosowana do rozmrażania komórek, powlekania chipów HD-MEA oraz utrzymania kultur na HD-MEA, a (D) to pożywka do nakładania kropel stosowana podczas wysiewania komórek na HD-MEA. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Rozwiązywanie typowych problemów z akwizycją zapisów HD-MEA. Lista powszechnych problemów, ich potencjalnych przyczyn oraz rozwiązań związanych z chipami HD-MEA, platformą rejestracyjną, szumem systemowym i oprogramowaniem. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Skomplikowana dynamika czasoprzestrzennej aktywności neuronalnej, wyłaniająca się z połączonych ze sobą zespołów neuronalnych, od dawna jest przedmiotem intryg w neurobiologii. Tradycyjne metodologie, takie jak patch-clamp, standardowe obrazowanie MEA i Ca2+, dostarczyły cennych informacji na temat złożoności mózgu. Jednak często nie są one w stanie uchwycić kompleksowej dynamiki obliczeniowej obejmującej całą sieć 21,22,23. Protokół techniczny platformy HD-MEA, szczegółowo opisany w tym badaniu JoVE, stanowi znaczący krok naprzód, oferując panoramiczny obraz dynamiki neuronalnej w różnych modalnościach, od zespołów komórkowych po ekspansywne sieci (tj. ostre, ex-vivo mysie wycinki mózgu i ludzkie sieci iPSC in vitro)26,29,30,32.

Ostre, ex-vivo wycinki mózgu myszy były podstawowym narzędziem w badaniach neuronalnych, ułatwiając badania molekularne i obwodowe 6,7. Jednak wyzwanie, jakim jest utrzymanie żywotności tkanek, jest stałym wąskim gardłem. Protokół opisany w tym badaniu wprowadza krytyczne modyfikacje w celu optymalizacji jakości i trwałości tych plastrów, aby wykorzystać ich zalety na platformie HD-MEA. Protokół ten podkreśla znaczenie - i) Osiągnięcia jednorodności plastrów, dla której użycie wibratomu jest preferowane w stosunku do rozdrabniacza tkanek ze względu na jego precyzję i zminimalizowane uszkodzenie tkanek, pomimo kompromisu w postaci dłuższego czasu krojenia. ii) Zapewnienie stałej karbonizacji w całym procesie, od ekstrakcji do rejestracji, w celu utrzymania żywotności tkanek. iii) Regulacja temperatury i zapewnienie odpowiedniego czasu na regenerację przed nagraniem. iv) Wykorzystanie bloku agarozy lub formy do stabilizacji mózgu, zapobiegania rozdarciom i zminimalizowania kontaktu z klejem. v) Utrzymanie optymalnych natężeń przepływu karbogenicznego aCSF w zbiorniku HD-MEA w celu zapewnienia zdrowia plastrów przy jednoczesnym unikaniu problemów, takich jak rozprzęganie, hałas i dryft (Tabela 2).

Zarówno w przypadku wycinków mózgu myszy, jak i preparatów iPSC u ludzi, poprawa sprzężenia między elektrodą a tkanką ma kluczowe znaczenie 30,46,47. Nasz protokół podkreśla znaczenie wykorzystania cząsteczki sprzyjającej adhezji poli-dl-ornityny (PDLO). Cząsteczka ta nie tylko zwiększa powierzchnię do wykrywania sygnałów elektrycznych, ale także zwiększa przewodność elektryczną46. W ten sposób wspomaga adhezję komórkową, wzrost i rozwój funkcjonalnych właściwości sieci. Taka optymalizacja odgrywa kluczową rolę w zwiększaniu skuteczności platformy HD-MEA. To z kolei zapewnia dokładną i spójną analizę konektomów ex-vivo i in vitro w mikroskali oraz ich czasoprzestrzennych sekwencji wypalania. Warto zauważyć, że wykazano, że PDLO przewyższa inne substraty, takie jak polietylenoimina (PEI) i poli-l-ornityna (PLO) w promowaniu spontanicznej aktywności wypalania i reagowaniu na bodźce elektryczne w hodowlach neuronów. Dodatkowo, PDLO został wykorzystany do funkcjonalizacji powierzchni w HD-MEA i wykazano, że poprawia interfejs sprzężenia elektroda-plasterek i zwiększa stosunek sygnału do szumu zarówno w warstwach OB, jak i HC26,29. Dodanie specjalnie zbudowanej platynowej kotwicy dodatkowo zwiększa sprzężenie interfejsu elektroda-plasterek, prowadząc do nagrań o wyższym stosunku sygnału do szumu.

Wykorzystanie HD-MEA zarówno do wycinków mózgu myszy ex-vivo, jak i ludzkich sieci iPSC in vitro wprowadza metodę biegłą w badaniu ekstensywnej, wieloskalowej i multimodalnej dynamiki. To innowacyjne podejście wiąże się jednak ze znacznymi wyzwaniami, zwłaszcza w zakresie zarządzania danymi 48,49,50,51. Pojedyncze nagranie HD-MEA uzyskane z częstotliwością próbkowania 18 kHz/elektrodę generuje oszałamiającą ilość danych 155 MB/s. Ilość danych gwałtownie rośnie, gdy weźmie się pod uwagę wiele wycinków, różne schorzenia farmakologiczne lub przedłużone okresy rejestracji. Taki napływ informacji wymaga solidnej infrastruktury pamięci masowej i zaawansowanych narzędzi obliczeniowych do usprawnienia przetwarzania. Zdolność platformy HD-MEA do jednoczesnego gromadzenia danych z tysięcy zespołów neuronalnych jest zarówno dobrodziejstwem, jak i przeszkodą. Zapewnia doskonały wgląd w dynamikę obliczeniową funkcji mózgu, ale wymaga również wyrafinowanych ram analitycznych. W tym protokole JoVE przedstawiliśmy przykłady strategii obliczeniowych, w tym wykrywania zdarzeń na dużą skalę, klasyfikacji, teorii grafów, analizy częstotliwości i uczenia maszynowego. Metody te podkreślają intensywne wysiłki podejmowane w celu sprostania wyzwaniom związanym z analizą złożonych danych neuronowych. Niemniej jednak nadal istnieje spore pole do opracowania bardziej zaawansowanych narzędzi obliczeniowych do analizy tych wielowymiarowych zestawów danych neuronowych. Uzbrojona w odpowiednie narzędzia i metodologie, potencjał platformy HD-MEA został zwiększony, oferując głęboki wgląd w zawiłości funkcji mózgu zarówno w zdrowych, jak i patologicznych warunkach.

Zasadniczo, platforma HD-MEA, po zintegrowaniu ze szczegółowymi protokołami i narzędziami obliczeniowymi, oferuje transformacyjne podejście do zrozumienia skomplikowanych operacji mózgu. Rejestrując dynamikę na dużą skalę, wieloskalową i multimodalną, zapewnia bezcenny wgląd w procesy, takie jak uczenie się, pamięć i przetwarzanie informacji. Co więcej, jego zastosowanie w sieciach iPSC u ludzi in vitro może zrewolucjonizować badania przesiewowe leków i medycynę spersonalizowaną. Jednak, chociaż platforma ta stanowi znaczący postęp w badaniach neurobiologicznych, ważne jest, aby uznać i zająć się nieodłącznymi wyzwaniami technicznymi. Dzięki ciągłemu doskonaleniu i integracji zaawansowanych narzędzi obliczeniowych, platforma HD-MEA jest gotowa zapoczątkować nową erę precyzyjnych narzędzi diagnostycznych, identyfikacji specyficznych biomarkerów i celowanych terapii zaburzeń neurologicznych.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych lub finansowych interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez fundusze instytucjonalne (DZNE), Stowarzyszenie Helmholtza w ramach Funduszu Walidacji Helmholtza (HVF-0102) oraz Dresden International Graduate School for Biomedicine and Bioengineering (DIGS-BB). Chcielibyśmy również podziękować platformie do testów behawioralnych na zwierzętach w DZNE-Dresden (Alexander Garthe, Anne Karasinsky, Sandra Günther i Jens Bergmann) za ich wsparcie. Pragniemy potwierdzić, że część rysunku 1 została stworzona przy użyciu platformy BioRender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szklana szalka Petriego 150 mmogólnaprzestrzeń robocza do przygotowania mózgu, przestrzeń robocza do nagrywania wycinków mózgu
0,22 i mu; m Sterylna jednostka filtrująca RóżneRóżne
90 mm Plastikowe naczynie do hodowliTPP93100Miejsce do przygotowywania mózgu, Miejsce do nagrywania wycinków mózgu
AgaroseRoth6351.5Miejsce do przygotowywania mózgu
Forma agarozowaNIESTANDARDOWEMiejsce pracy do przygotowania mózgu; Specjalnie zaprojektowany projekt drukarki 3D, dostępny na życzenie
Folia aluminiowaogólnaogólna przestrzeń robocza do ekstrakcji mózgu
Komora anestezjologicznaogólnaogólna przestrzeń robocza do ekstrakcji mózgu; Różne zlewki, ściółki itp
Kwas askorbinowySigma AldrichA4544-25GMiejsce pracy do przygotowywania roztworów
Różne zlewkiogólneMiejsce pracy do przygotowywania roztworów; 50 ml
Różne LuersCole Parmer45511-00Obszar nagrywania wycinków mózgu
Różne kolby miaroweogólneogólne przygotowanie roztworu Obszar roboczy; 500 mL, 1 L
B27 SuplementLife Technologies17504-044Protokół dostawcy komercyjnego BrainXell
BDNFPeprotech450-02Protokół dostawcy komercyjnego BrainXell
Szafa bezpieczeństwa biologicznego z lampą UVRóżneHD-MEA Powłoka, poszycie, konserwacja Przestrzeń robocza
BrainPhys Neuronal Medium Technologie STEMCELL 05790 CDI i Protokół BrainXell dla dostawców komercyjnych
Oprogramowanie Brainwave3Brain AGWersja 4Obszar roboczy do nagrywania Brain Slice i Human iPSC
BrainXell  Test neuronów glutaminergiczne MózgXell  BX-0300 Protokół dostawcy komercyjnego BrainXell
CaCl2Sigma Aldrich21115-100MLPrzestrzeń robocza do przygotowywania roztworów
CarbogenogólnyogólnyWszystkie obszary robocze; 95%/5% mieszaniny O2 i CO2
Inkubator do hodowli komórkowych RóżneRóżne
Układ HD-MEA oparty na CMOS3Brain AGCUSTOMBrain Slice i Human iPSC Recording Workspace
Stożkowe probówki, 50 mL, Falcon (probówki wirówkowe) Technologie STEMCELL 38010 Protokół dostawcy komercyjnego CDI
uziemiające z zaciskiem krokodylkowymJWQIDIB06WGZG17WObszar nagrywania Brain Slice
Zakrzywione kleszczeFST11052-10Przestrzeń robocza do ekstrakcji mózgu
DMEM/F12 Technologie o średniejżywotności  11330-032Protokół dostawcy handlowego BrainXell
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez Ca2+ i Mg2+ (D-PBS)STEMCELL Technologies 37350 Protokół dostawcy komercyjnego CDI
Bibuła filtracyjnaMacherey-Nagel531 011Przygotowanie mózgu Przestrzeń robocza
Drobna szczotkaLeonhardy773Miejsce do przygotowania wycinków mózgu, Kleszcze do nagrywania fragmentów mózgu
VITLAB67895Miejsce do nagrywania Brain Slice
GDNFPeprotech450-10Protokół dostawcy komercyjnego BrainXell
GeltrexLife TechnologieA1413201Protokół dostawcy komercyjnego BrainXell
Szklana pipeta PasteuraRoth4518Miejsce robocze do przygotowania plasterków mózgu, miejsce do nagrywania wycinków mózgu
Glukoza Sigma AldrichG7021-1KGPrzestrzeń robocza do przygotowywania roztworów
GlutaMAXLife Technologies35050-061Protokół dostawcy komercyjnego BrainXell
Oparty na grawitacji System perfuzyjnyALAVC3-8xGObszar roboczy do nagrywania Brain Slice
HD-MEA Platforma nagraniowa3Brain AGCUSTOMGrzałka do pracy do nagrywania Brain Slice i iPSC
Warner InstrumentsTC-324CObszar roboczy do nagrywania wycinków mózgu
Hemocytometr lub automatyczny licznik komórekRóżneHD-MEA Powlekanie, galwanizacja, konserwacja Przestrzeń robocza
Hypo NeedlesWarner Instruments641489Brain Slice Recording
Workspace iCell GlutaNeurons Kit, 01279 CDIR1061 Protokół dostawcy komercyjnego CDI
Irys ScissorsVantageV95-304Przestrzeń robocza do ekstrakcji mózgu
IsofluraneBaxterHDG9623Przestrzeń robocza do ekstrakcji mózgu
KClSigma AldrichP5405-250GMiejsce przygotowania roztworu
Laminin Sigma-Aldrich L2020 Protokół dostawcy komercyjnego CDI
Magazyn ciekłego azotu RóżnePowlekanie, powlekanie, konserwacja Przestrzeń robocza HD-MEA
Mieszadło magnetyczneOgólnePrzygotowanie roztworu Miejsce pracy
metaloweThorlabsHW-KIT2/MObszar nagrywania plasterków mózgu MgCl
2Sigma AldrichM1028-100MLObszar roboczy do przygotowywania roztworów
MgSO4Sigma Aldrich63138-250GPrzygotowanie roztworu
Uchwyt narzędziowy do mikrodysekcji w miejscu pracy Braun4606108VMiejsce do przygotowania plasterków mózgu, miejsce do nagrywania plasterków mózgu
Igła do mikrodysekcjiBraun 9186166Obszar roboczy do przygotowania Brain Slice, Obszar roboczy do nagrywania Brain Slice
Modułowy mikroskop stereoskopowyLeicaCUSTOMObszar roboczy do nagrywania Brain Slice; niestandardowe specyfikacje i modyfikacje
N2 SuplementLife Technologies17502-048CDI i Protokół dostawcy komercyjnego BrainXell
Rozwiązanie NaClSigma AldrichS3014-1KG Miejsce pracy do przygotowania
NaH2PO4Sigma AldrichS0751-100GMiejsce pracy do przygotowania roztworu
NaHCO3Sigma AldrichS5761-500GMiejsce pracy do przygotowania roztworu
Neurobasal Medium Life Technologies21103-049Protokół dostawcy komercyjnego BrainXell
System klatek optycznychThorlabsAssortedBrain Slice Recording
Workspace Stół optyczny z płytką stykowąThorlabsSDA7590Obszar roboczy do nagrywania Brain Slice
PDLOSigma AldrichP0671Powłoka HD-MEA, miejsce do nagrywania Brain Slice
Penicylina-streptomycyna, 100x Thermo Fisher Naukowy 15140-122 Protokół dostawcy komercyjnego CDI
Końcówki do pipetTipONES1120-8810Pipety do nagrywania Brain Slice w miejscu pracy
 RóżneRóżne
Platynowa kotwicaNIESTANDARDOWEMiejsce do nagrywania Brain Slice Rurki
Różnerobocze do nagrywania plasterków mózgu
PompaMasterFlex78018-22Miejsce do nagrywania Brain Slice
Żyletka10179960Przygotowanie mózgu
Elektroda referencyjna Nasadka do hodowli komórekCUSTOM CUSTOMPrzestrzeń robocza do nagrywania iPSC u ludzi; Specjalnie zaprojektowany projekt drukarki 3D, dostępny na żądanie
Gumowa żarówka do pipetDuran Wheaton Kimble292000205Obszar roboczy do przygotowania plasterków mózgu, obszar roboczy do nagrywania plasterków mózgu
Pipety serologiczne, 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mlRóżne
Komora odzyskiwania plastrówNIESTANDARDOWENIESTANDARDOWEObszar roboczy odzyskiwania wycinków mózgu; Specjalnie zaprojektowany projekt drukarki 3D, dostępny na życzenie
SzpatułkaISOLAB047.06.150Przestrzeń robocza do przygotowania mózgu
SacharozaSigma Aldrich84100-1KGMiejsce do przygotowywania roztworów
Super GlueUHU358221Miejsce do przygotowania plasterków mózgu
Nożyczki chirurgicznePeters InstrumentsBC 344Przestrzeń robocza do ekstrakcji mózgu
Wirówka stołowa RóżneRóżneRóżne TGF
-β 1Peprotech100-21CBrainXell Protokół dostawcy komercyjnego
BibułkaOgólnyogólnyobszar roboczy do ekstrakcji mózgu
Trypan BlueSTEMCELL Technologies Numer katalogowy: 07050 Protokół dostawcy komercyjnego CDI
Mikroskop pionowyOlympusCUSTOMPrzestrzeń robocza do obrazowania; Niestandardowe specyfikacje i modyfikacje:
VacusipIntegra159010Brain Slice Recording Workspace
VibratomeLeicaVT1200sBrain Slice Preparation Workspace; Zawiera: Płytka na próbkę, taca buforowa, tacka na lód, narzędzie do trzymania płytki na próbkę, narzędzie do regulacji ostrza wibratomu
Vibratome BladePersonnaN/ABrain Slice Preparation Workspace
Kąpiel wodnaLaudaL000595Brain Slice Recovery Workspace
ogólna . rodzaje rodzaje ogólne polietylenowe różne obszary Apollo różne

Bibliografia

  1. Hebb, D. O. The Organization of Behavior; A Neuropsychological Theory. , Wiley. New York. (1949).
  2. Cossart, R., Garel, S. Step by step: cells with multiple functions in cortical circuit assembly. Nat Rev Neurosci. 23, 395-410 (2022).
  3. Carrillo-Reid, L., Yuste, R. Playing the piano with the cortex: role of neuronal ensembles and pattern completion in perception and behavior. Curr Opin Neurobiol. 64, 89-95 (2020).
  4. Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7, 446-451 (2004).
  5. Buzsáki, G. Neural Syntax: Cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68 (3), 362-385 (2010).
  6. Huang, Y., Williams, J. C., Johnson, S. M. Brain slice on a chip: opportunities and challenges of applying microfluidic technology to intact tissues. Lab Chip. 12 (12), 2103-2117 (2012).
  7. Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Curr Neuropharmacol. 5 (1), 19-33 (2007).
  8. Bliss, T. V. P., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361, 31-39 (1993).
  9. Anderson, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'Keefe, L. The Hippocampus Book. , Oxford University Press. New York. (2006).
  10. Lisman, J., et al. Viewpoints: how the hippocampus contributes to memory, navigation and cognition. Nat Neurosci. 20, 1434-1447 (2017).
  11. Mori, K., Nagao, H., Yoshihara, Y. The olfactory bulb: Coding and processing of odor molecule information. Science. 286 (5440), 711-715 (1999).
  12. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: A molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
  13. Bushdid, C., Magnasco, M. O., Vosshall, L. B., Keller, A. Humans can discriminate more than 1 trillion olfactory stimuli. Science. 343 (6177), 1370-1372 (2014).
  14. Kempermann, G. Why new neurons? Possible functions for adult hippocampal neurogenesis. J Neurosci. 23 (3), 635-638 (2003).
  15. Aimone, J. B., Wiles, J., Gage, F. H. Computational influence of adult neurogenesis on memory encoding. Neuron. 61 (2), 187-202 (2009).
  16. Nithianantharajah, J., Hannan, A. J. Enriched environments, experience-dependent plasticity and disorders of the nervous system. Nat Rev Neurosci. 7, 697-709 (2006).
  17. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  18. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77 (3), 440-456 (2013).
  19. Rajamohan, D., et al. Current status of drug screening and disease modelling in human pluripotent stem cells. Bioessays. 35 (3), 281-298 (2013).
  20. Heilker, R., Traub, S., Reinhardt, P., Schöler, H. R., Sterneckert, J. iPS cell derived neuronal cells for drug discovery. Trends Pharmacol Sci. 35 (10), 510-519 (2014).
  21. Zhao, S. R., Mondéjar-Parreño, G., Li, D., Shen, M., Wu, J. C. Technical applications of microelectrode array and patch clamp recordings on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Vis Exp. (186), e64265(2022).
  22. Hamill, O. P., McBride, D. W. Induced membrane hypo/hyper-mechanosensitivity: A limitation of patch-clamp recording. Annu Rev Physiol. 59, 621-631 (1997).
  23. Manz, K. M., Siemann, J. K., McMahon, D. G., Grueter, B. A. Patch-clamp and multi-electrode array electrophysiological analysis in acute mouse brain slices. STAR Protoc. 2 (2), 100442(2021).
  24. Lee, C. H., Park, Y. K., Lee, K. Recent strategies for neural dynamics observation at a larger scale and wider scope. Biosens Bioelectron. 240, 115638(2023).
  25. Urai, A. E., Doiron, B., Leifer, A. M., Churchland, A. K. Large-scale neural recordings call for new insights to link brain and behavior. Nat Neurosci. 25 (1), 11-19 (2022).
  26. Hu, X., Khanzada, S., Klütsch, D., Calegari, F., Amin, H. Implementation of biohybrid olfactory bulb on a high-density CMOS-chip to reveal large-scale spatiotemporal circuit information. Biosens Bioelectron. 198, 113834(2022).
  27. Amin, H., Marinaro, F., Tonelli, D. D. P., Berdondini, L. Developmental excitatory-to-inhibitory GABA-polarity switch is disrupted in 22q11.2 deletion syndrome: A potential target for clinical therapeutics. Sci Rep. 7 (1), 15752(2017).
  28. Amin, H., Nieus, T., Lonardoni, D., Maccione, A., Berdondini, L. High-resolution bioelectrical imaging of Aβ-induced network dysfunction on CMOS-MEAs for neurotoxicity and rescue studies. Sci Rep. 7 (1), 2460(2017).
  29. Emery, B. A., Hu, X., Khanzada, S., Kempermann, G., Amin, H. High-resolution CMOS-based biosensor for assessing hippocampal circuit dynamics in experience-dependent plasticity. Biosens Bioelectron. 237, 115471(2023).
  30. Amin, H., et al. Electrical responses and spontaneous activity of human iPS-derived neuronal networks characterized for 3-month culture with 4096-electrode arrays. Front Neurosci. 10, 121(2016).
  31. Lonardoni, D., et al. Recurrently connected and localized neuronal communities initiate coordinated spontaneous activity in neuronal networks. PLoS Comput Biol. 13 (7), e1005672(2017).
  32. Emery, B. A., et al. Large-scale multimodal recordings on a high-density neurochip: Olfactory bulb and hippocampal networks. 2022 44th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine & Biology Society (EMBC). , Glasgow, Scotland, United Kingdom. 3111-3114 (2022).
  33. Rossi, L., Emery, B. A., Khanzada, S., Hu, X., Amin, H. Pharmacologically and electrically-induced network-wide activation of olfactory bulb with large-scale biosensor. 2023 IEEE BioSensors Conference (BioSensors). , London, United Kingdom. 1-4 (2023).
  34. Emery, B. A., et al. Recording network-based synaptic transmission and LTP in the hippocampal network on a large-scale biosensor. 2023 IEEE BioSensors Conference (BioSensors). , London, United Kingdom. 1-4 (2023).
  35. Hierlemann, A., Frey, U., Hafizovic, S., Heer, F. Growing cells atop microelectronic chips: Interfacing electrogenic cells in vitro with CMOS-based microelectrode arrays). Proceedings of the IEEE. 99 (2), 252-284 (2011).
  36. Berdondini, L., et al. Active pixel sensor array for high spatio-temporal resolution electrophysiological recordings from single cell to large scale neuronal networks. Lab Chip. 9, 2644-2651 (2009).
  37. Siegle, J. H., Hale, G. J., Newman, J. P., Voigts, J. Neural ensemble communities: open-source approaches to hardware for large-scale electrophysiology. Curr Opin Neurobiol. 32, 53-59 (2015).
  38. Amin, H., Maccione, A., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. High-density MEAs reveal lognormal firing patterns in neuronal networks for short and long term recordings. 2015 7th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering (NER). , Montpellier, France. 1000-1003 (2015).
  39. Altuntac, E., et al. Bottom-up neurogenic-inspired computational model. 2023 IEEE BioSensors Conference (BioSensors). , London, United Kingdom. 1-4 (2023).
  40. Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. J Neurosci Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
  41. Welch, P. D. The use of fast Fourier transform for the estimation of power spectra: A method based on time averaging over short, modified periodograms. IEEE Transactions on Audio and Electroacoustics. 15 (2), 70-73 (1967).
  42. Eggermont, J. J., Munguia, R., Pienkowski, M., Shaw, G. Comparison of LFP-based and spike-based spectro-temporal receptive fields and cross-correlation in cat primary auditory cortex. PLoS One. 6 (5), e20046(2011).
  43. Damos, P. Using multivariate cross correlations, Granger causality and graphical models to quantify spatiotemporal synchronization and causality between pest populations. BMC Ecol. 16, 33(2016).
  44. Kaminski, M. J., Blinowska, K. J. A new method of the description of the information flow in the brain structures. Biol Cybern. 65, 203-210 (1991).
  45. Pastore, V. P., Massobrio, P., Godjoski, A., Martinoia, S. Identification of excitatory-inhibitory links and network topology in large-scale neuronal assemblies from multi-electrode recordings. PLoS Comput Biol. 14 (8), e1006381(2018).
  46. Amin, H., Dipalo, M., De Angelis, F., Berdondini, L. Biofunctionalized 3D nanopillar arrays fostering cell guidance and promoting synapse stability and neuronal activity in networks. ACS Appl Mater Interfaces. 10 (17), 15207-15215 (2018).
  47. Woeppel, K., Yang, Q., Cui, X. T. Recent advances in neural electrode-tissue interfaces. Curr Opin Biomed Eng. 4, 21-31 (2017).
  48. Steinmetz, N. A., Koch, C., Harris, K. D., Carandini, M. Challenges and opportunities for large-scale electrophysiology with Neuropixels probes. Curr Opin Neurobiol. 50, 92-100 (2018).
  49. Siegle, J. H., Hale, G. J., Newman, J. P., Voigts, J. Neural ensemble communities: open-source approaches to hardware for large-scale electrophysiology. Curr Opin Neurobiol. 32, 53-59 (2015).
  50. Freeman, J. Open source tools for large-scale neuroscience. Curr Opin Neurobiol. 32, 156-163 (2015).
  51. Stevenson, I. H., Kording, K. P. How advances in neural recording affect data analysis. Nat Neurosci. 14 (2), 139-142 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przestrzenno-czasowa aktywność neuronalnarejestracje zewnątrzkomórkoweprzygotowanie skrawków mózguobwody hipokampaobwody opuszki węchowejsieci neuronalne iPSClokalne potencjały polowedetekcja kolców
Rejestrowanie i analizowanie multimodalnej dynamiki zespołów neuronalnych na zintegrowanej z CMOS matrycy mikroelektrod o dużej gęstości
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.