Ten artykuł przedstawia przewodnik do pobierania próbek z sześciu ważnych i różnorodnych narządów u dorosłego Xenopus, do których można szybko i łatwo dotrzeć: komora serca, płat wątroby, trzustka, ciała tłuszczowe, sparowane nerki i skóra.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Techniki szybkiego pobierania próbek z sześciu kluczowych narządów u dorosłego Xenopus
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Xenopus od ponad stu lat jest potężnym organizmem modelowym do zrozumienia rozwoju i chorób kręgowców. Podczas gdy techniki analizy eksperymentalnej i sekcji zarodka zostały dobrze udokumentowane, opisy dorosłych struktur i narządów Xenopus, wraz z technikami pracy z dorosłymi, nie zostały zaktualizowane w celu uwzględnienia wymagań takich nowoczesnych podejść, jak proteomika ilościowa i transkryptomika pojedynczych komórek. Perspektywa skoncentrowana na typie komórki i genach wymaga kontrastujących obserwacji w stadiach embrionalnych z tymi w tkankach dorosłych. Narządy larwy przechodzą znaczące zmiany w ich ogólnej strukturze, morfologii i lokalizacji anatomicznej na całej długości przejścia od larwy do dorosłego osobnika, w szczególności podczas masywnej przebudowy metamorfozy. Ustanowienie solidnych standardów identyfikacji i sekcji narządów ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia spójności zbiorów danych pochodzących z badań przeprowadzonych w różnych laboratoriach. Niniejszy protokół identyfikuje sześć narządów u dorosłego Xenopusa, demonstrując metody preparowania i pobierania próbek z komory serca, wątroby, ciała tłuszczowego, trzustki, sparowanej nerki i skóry dorosłego Xenopusa. W zależności od metod konserwacji, wypreparowane narządy mogą być wykorzystane do proteomiki ilościowej, transkryptomiki pojedynczej komórki/jąder, hybrydyzacji in situ, immunohistochemii, histologii itp. Protokół ten ma na celu standaryzację pobierania próbek tkanek i ułatwienie badań wielolaboratoryjnych układów narządów dorosłych.
Wprowadzenie
Chociaż dostępna jest "cyfrowa sekcja" dorosłego Xenopusa<sup class="xref">1, powtarzalne pobieranie próbek narządów i tkanek dorosłego Xenopus pozostaje wyzwaniem bez szczegółowej instrukcji dostępnej dla innych dorosłych modeli (np. myszy2,3,4). Ten artykuł ma na celu dostarczenie jasnych wskazówek dotyczących dokładnego i powtarzalnego pobierania próbek narządów od dorosłych Xenopus, podobnych do tego, co jest obecnie dostępne dla ich larw5. Nacisk położono na łatwość ukończenia, aby zachować maksymalną świeżość i uczynić protokół dostępnym dla wszystkich użytkowników.
Chociaż istnieje dokładny przewodnik po sekcjach dla Rana sp.6, a także liczne przewodniki po sekcjach dla innych anuranów7, obecnie nie jest dostępny żaden przewodnik po sekcji i próbkowaniu Xenopus. Dla tych, którzy nie są zaznajomieni z praktykami pobierania próbek lub anatomią, niewielkie różnice między Xenopus a innymi anuranami sprawiają, że zasoby te nie są optymalne do powtarzalnego pobierania próbek tkanek.
Wiele cennych tkanek nie jest uwzględnionych i nawet jest odrzucanych w niniejszym przewodniku; ma to na celu zapewnienie świeżości tkanek. Sześć próbek jest na tyle ograniczonych, że tkanki te można pobrać w czasie krótszym niż godzina po rozpoczęciu bicia serca, niezależnie od doświadczenia i poziomu umiejętności użytkownika. Bardziej zaawansowane i szczegółowe przewodniki dotyczące pobierania wielu innych tkanek są w trakcie opracowywania jako osobne dokumenty towarzyszące.
Dla mniej doświadczonych użytkowników, zawsze zaleca się, aby ten protokół został najpierw wypróbowany na zwierzętach poddanych eutanazji z powodów innych niż eksperymenty, zanim pobierze się próbki od zwierząt, które są trudne do zastąpienia (np. transgenicznych, zwierząt w zaawansowanym wieku, itp.). Idealnie byłoby, gdyby wszystkie zwierzęta, od których pobrano próbki, były zdrowe, a jeśli są samicami, nie miały owulacji w ciągu ostatnich dwóch tygodni.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami i przepisami Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3). Reprezentatywne wyniki przedstawiono zarówno dla perfuzyjnego, jak i nieperfundowanego dojrzałego samca albinosa Xenopus laevis.
1. Przygotowanie eksperymentalne
UWAGA: Jeśli protokół perfuzji8 jest przestrzegany przed próbkowaniem, przejdź do kroku 2.2.
- Upewnij się, że instytucja badawcza zatwierdziła technikę eutanazji opisaną w niniejszym protokole.
- Przygotować roztwór 5 g/l MS-222 (metanosulfonian trikainy) i 5 g/l wodorowęglanu sodu (patrz tabela materiałów). Objętość musi być większa niż objętość wymagana do pokrycia zwierząt poddawanych całkowitej eutanazji. Sprawdź pH, aby upewnić się, że wynosi ≥7.
- Przeprowadzić pierwotną eutanazję, umieszczając Xenopus w roztworze do eutanazji; zwierzę pozostanie zanurzone w wodzie przez łącznie 1 godzinę.
- Ustaw stację preparacyjną tak, aby natychmiast po pobraniu próbki wszystkie tkanki mogły zostać przepłukane w schłodzonym PBS lub 0,7x PBS9 (w zależności od potrzeb eksperymentalnych), sprawdzone i przycięte pod lampą o powiększeniu 5x (lub większym). Stacja ta musi również umożliwiać użytkownikowi wymianę wszystkich kleszczy i nożyczek lub wycieranie ich do czysta między użyciami.
- Gdy żaba znajduje się w roztworze przez 1 godzinę, pierwotna eutanazja została zakończona. Usuń żabę i sprawdź utratę reakcji na ból, wykonując uszczypnięcie stopy.
- Zapisz odpowiednie szczegóły dotyczące zwierzęcia, takie jak gatunek, szczep, płeć, wiek i stan zdrowia, a także to, czy doszło do perfuzji. Zważ Xenopus i wykonaj wszelkie dodatkowe pomiary, takie jak długość pyska.
- Połóż żabę na grzbiecie i przypnij kończyny bliżej ciała (Rysunek 1).
- Za pomocą nożyczek preparacyjnych przeciąć skórę, w górę linii środkowej, a następnie bocznie, tworząc dwie klapy.
- Odnosząc się do Rysunek 2, zidentyfikuj linea alba i użyj kleszczy, aby ją chwycić i odciągnąć od jamy celomicznej. Ostrożnie przetnij mięśnie za pomocą nożyczek. Wykonaj dwie klapy ze ściany wnęki. Wytnij lub przypnij wszystkie klapy, aby nie przeszkadzały.
- Zidentyfikuj serce, które nadal będzie bić. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby zmniejszyć kości krucze (Rysunek 2), aby uzyskać lepszy dostęp do serca.
UWAGA: Jeśli serce przestało bić przed pobraniem próbki, należy zauważyć, że świeżość próbki została naruszona.
2. Pobieranie próbek
UWAGA: Jeśli zwierzę zostało poddane perfuzji, przejdź do kroku 2.2.
- Zidentyfikuj cienkie osierdzie i napnij je kleszczami do tkanek (Ryc. 3).
- Za pomocą końcówki nożyczek do irydektomii delikatnie przebij osierdzie, uważając, aby nie przeciąć leżących pod spodem tkanek. Obierz osierdzie z dala od 3 komór serca.
- Użyj kleszczy, aby chwycić komorę za wierzchołek, określ, gdzie przyczepia się do małżowin usznych i pnia tętniczego (Rysunek 4) i przetnij ją poniżej tych przyczepów (Rysunek 5). W razie potrzeby przyciąć komorę tak, aby nie były widoczne żadne tkanki z małżowin usznych lub pnia tętniczego, a jasna tkanka zastawki będzie nadal widoczna wewnątrz komory.
UWAGA: U zwierząt bez perfuzji usunięcie komory może kwalifikować się jako wtórna eutanazja. - Widoczne będą 3 płaty wątroby (Rysunek 6 i Rysunek 7). Chwyć wargę lewego płata (po prawej stronie widza) i delikatnie unieś ją tak, aby widoczne były przewody wątrobowe i torbielowate (Ryc. 8). Próbkuj dolną 1/3 płata poniżej tych nasadek (Rysunek 9).
- Aby uzyskać lepszy dostęp do tkanek samicy żaby, pomocne jest usunięcie jajnika. Zidentyfikuj jajnik, który jest otoczony warstwą trzewnej otrzewnej zwaną nabłonkiem zarodkowym. Delikatnie przesuń płatki, aż znajdą się na odpowiednich bokach, aby obszar przyczepu był widoczny (Rysunek 10). Te przyczepy są bezpośrednio brzuszne do sparowanej nerki.
- Za pomocą nożyczek usuń jajniki jak najbliżej nerek, nie uszkadzając ich (Ryc. 11).
- Sprawdź płat przyśrodkowy (zwany również płatem przednim) wątroby i zwróć uwagę, jak łączy się on z żołądkiem i dwunastnicą przez krezkę i przewód wątrobowo-trzustkowy (zwany również wspólnym przewodem żółciowym) (Rysunek 6, Rysunek 7 i Rysunek 8).
- Przeciąć krezkę, więzadło wątrobowo-nerkowe za pomocą nożyczek do irydektomii, a także przewód wątrobowo-trzustkowy, w którym styka się z dwunastnicą. Odciąć połączenie trzustki i przewodu wątrobowo-trzustkowego z płatem przyśrodkowym wątroby, tak aby nie była przyczepiona ciemna tkanka wątroby (Ryc. 12).
- Chwyć żołądek kleszczami zębatymi, a górny koniec trzustki kleszczami tkankowymi. Pod 5-krotnym powiększeniem delikatnie oderwij trzustkę od żołądka (Ryc. 13).
UWAGA: Jeśli nie odejdzie czysto, pozostała tkanka trzustki będzie widoczna i można ją usunąć we fragmentach. Alternatywnie trzustkę można metodycznie odłączyć za pomocą nożyczek do irydektomii i kleszczy tkankowych. - Odnosząc się do Rysunek 14A, zidentyfikuj pęcherz moczowy i usuń go, przecinając jak najbliżej kloaki. Wyrzuć tę tkankę.
- Odnosząc się do Rysunek 14B, zidentyfikuj jelito grube i napnij je, aby przeciąć jelito grube jak najbliżej kloaki. Usuń i wyrzuć cały przewód pokarmowy, odcinając otrzewną w miejscu, w którym przyczepia się do śledziony. Grube ciała będą teraz w pełni dostępne.
- Rozsuń grube ciała tak, aby znalazły się po swoich stronach. Widoczny będzie obszar nad nerkami, w którym ciało tłuszczowe łączy się z otrzewną. Chwyć podstawę lewego ciała tłuszczowego (po prawej stronie widza) i użyj nożyczek, aby odciąć je od otrzewnej, pozostawiając niewielki margines, aby nerka nie została uszkodzona (Ryc. 15).
- Usuń i wyrzuć pozostałą tkankę tłuszczową. Sparowane nerki będą teraz w pełni widoczne.
- U samic żab lub samców z wyraźnymi szczątkowymi jajowodami, chwyć jajowód i odciągnij go od nerki i kloaki (Ryc. 16). Przetnij jajowód w miejscu, w którym styka się z kloaką i kontynuuj odciąganie go od nerki, przecinając wszelkie wyraźne przyczepy otrzewnej, gdy staną się widoczne. Wyrzuć tę tkankę.
- Powtórz ten proces z pozostałym jajowodem.
- Nerki są nadal pokryte przezroczystą otrzewnową (zaotrzewnową)10. Użyj kleszczy, aby chwycić nerki i odciąć otrzewną na ich dolnym końcu.
- Wyjdź nerki z jamy celomicznej, używając nożyczek, aby przeciąć otrzewną jak najbliżej nerek, nie uszkadzając ich (Ryc. 17).
- Pod 5-krotnym powiększeniem odetnij nadmiar otrzewnej i wszelkie inne pozostałe tkanki (ciała tłuszczowe, śledziona). Jeśli żaba jest samicą, upewnij się, że pozostała tkanka jajnika została usunięta (Ryc. 18). Jeśli żaba jest samcem, ostrożnie usuń jądro i sprawdź, czy nie ma szczątkowego jajowodu, który może nie być widoczny bez powiększenia (Ryc. 19).
- Usuń szpilki ze zwierzęcia, odwróć je na jego brzuch i ponownie przypnij kończyny zwierzęcia.
- Wybierz jedną z kończyn tylnych, z których chcesz pobrać próbkę, i przypnij stopę tej kończyny.
- Usuń płat skóry w kształcie migdała znad mięśnia brzuchatego łydki/kości piszczelowej (Ryc. 20).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wykorzystując Rysunek 1 do Rysunku 20 i postępując zgodnie ze wszystkimi krokami niniejszego protokołu, komora serca, lewy płat wątroby, trzustka, lewe ciała tłuszczowe, sparowane nerki oraz płat skóry zostały precyzyjnie wycięte w ciągu godziny od eutanazji. W tym czasie próbki są płukane i przycinane tak, aby wyglądały jak pokazano na Rysunku 21.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ponieważ protokół ten ma na celu maksymalizację świeżości, niektóre próbki mogą zawierać niepożądane tkanki. Na przykład przewód wątrobowo-trzustkowy i niektóre krezki są pobierane za pomocą trzustki, a niektóre tkanki otrzewnej, nadnercza i moczowody zawsze będą pobierane za pomocą sparowanych nerek. Jeśli świeżość nie jest problemem, można uzyskać bardziej precyzyjne pobieranie próbek przy użyciu zmodyfikowanych technik.
Wygląd i lokalizacja narządów są porównywalne między płciami i gatunkam...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez R24OD031956 grantowe NIH. Dziękujemy Samancie Jalbert, Jill Ralston i Corze Anderson za ich pomoc i wsparcie, a także naszej redaktorce i anonimowym recenzentom za ich pomocne opinie
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 5x Szkło powiększające ze światłem LED i podstawką | amazon.com B08QJ6J8P1 | światło nie może wytwarzać ciepła | |
| Jednorazowe pipety transferowe | VWR | 414004-036 | |
| Kleszcze preparacyjne drobno zakończone | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Nożyczki preparacyjne ostre pionowe, proste 6,5" | VWR | 76457-374 | |
| Taca preparcyjna | Arkusze styropianu | Fisher Scinetific | 14-370-284 |
| Pojemnik do eutanazji | US Plastic | Pozycja 2860 | alternatywnych nieprzezroczystych pojemników dopuszczalne |
| pokrywy pojemnika do eutanazji | US Plastic | Pozycja 3047 | |
| Nożyczki do irydektomii 6 " | vwr | 470018-938 | Nożyczki do tęczówki są akceptowalną alternatywą |
| MS-222: Syncaina (dawniej trykaina) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Wodorowęglan sodu, proszek, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Kleszczyki do próbek, ząbkowane | VWR | 82027-442 | |
| Kołki teowe do preparowania | Fisher Scinetific | S99385 |
Bibliografia
- Porro, L. B., Richards, C. T. Digital dissection of the model organism Xenopus laevis using contrast-enhanced computed tomography. J Anat. 231 (2), 169-191 (2017).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (23), 91-106 (2003).
- Kittel, B., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 413-431 (2004).
- Morawietz, G., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice - Part 3 - A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 433-449 (2004).
- Patmann, M. D., Shewade, L. H., Schneider, K. A., Buchholz, D. R. Xenopus tadpole tissue harvest. Cold Spring Harb Protoc. 2017 (11), 097675(2017).
- Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Dissection of a Frog (Rana sp.). Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 213-263 (2016).
- O'Rourke, D. P. Amphibians used in research and teaching. ILAR J. 48 (3), 183-187 (2007).
- Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. Effective rapid blood perfusion in Xenopus. JoVE. (issue), e65287(2023).
- Balls, M., Worley, R. S. Amphibian cells in vitro. II. Effects of variations in medium osmolarity on a permanent cells line isolated from Xenopus. Exp Cell Res. 76 (2), 333-336 (1973).
- Holz, P. H., Raidal, S. R. Comparative renal anatomy of exotic species. Vet North Am Exot Anim Pract. 9 (1), 1-11 (2006).
- Trott, K. A., et al. Characterization of a Mycobacterium ulcerans-like infection in a colony of African tropical clawed frogs (Xenopus tropicalis). Comp Med. 54 (3), 309-317 (2004).
- Fremont-Rahl, J. J., et al. Mycobacterium liflandii outbreak in a research colony of Xenopus (Silurana) tropicalis frogs. Vet Pathol. 48 (4), 856-867 (2011).
- Green, S. L., Parker, J., Davis, C., Bouley, D. M. Ovarian hyperstimulation syndrome in gonadotropin-treated laboratory South African clawed frogs (Xenopus laevis). J Am Assoc Lab Anim Sci. 46 (3), 64-67 (2007).
- Vitt, L. J., Caldwell, J. P. Anatomy of amphibians and reptiles. Herpetol. Herpetol. , 35-81 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
