Opisujemy protokół ekstrakcji wysokiej jakości jąder z indukowanych kriokonserwowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących ze zrębu/śródbłonka i komórek krwi, aby wspierać analizy sekwencjonowania nowej generacji pojedynczego jądra. Wytwarzanie wysokiej jakości, nienaruszonych jąder jest niezbędne w eksperymentach multiomicznych, ale dla niektórych laboratoriów może stanowić barierę wejścia w tę dziedzinę.
Artykuł metodologiczny
Izolacja jądrowa z kriokonserwowanych komórek krwi pochodzących z in vitro
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Modele oparte na indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (iPSC) są doskonałymi platformami do zrozumienia rozwoju krwi, a komórki krwi pochodzące z iPSC mają użyteczność translacyjną jako odczynniki do testów klinicznych i transfuzjowalne terapie komórkowe. Pojawienie się i rozszerzenie analizy multiomicznej, w tym między innymi sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra (snRNAseq) i testu sekwencjonowania chromatyny dostępnej dla transpozazy (snATACseq), oferuje potencjał do zrewolucjonizowania naszego zrozumienia rozwoju komórek. Obejmuje to biologię rozwojową z wykorzystaniem modeli krwiotwórczych in vitro. Jednak wyizolowanie nienaruszonych jąder z hodowanych lub pierwotnych komórek może być technicznie trudne. Różne typy ogniw często wymagają dostosowanych preparatów jądrowych w zależności od sztywności i zawartości komórek. Te trudności techniczne mogą ograniczać jakość danych i stanowić barierę dla badaczy zainteresowanych prowadzeniem badań multiomicznych. Kriokonserwacja próbek jest często konieczna ze względu na ograniczenia w pobieraniu i/lub przetwarzaniu komórek, a zamrożone próbki mogą stanowić dodatkowe wyzwanie techniczne dla nienaruszonej izolacji jądrowej. W tym manuskrypcie przedstawiamy szczegółową metodę izolowania wysokiej jakości jąder z komórek pochodzących z iPSC na różnych etapach rozwoju układu krwiotwórczego in vitro do zastosowania w przepływach pracy multiomiki jednojądrowej. Opracowanie metody skoncentrowaliśmy na izolacji jąder z przylegających komórek zrębu/śródbłonka pochodzących z iPSC oraz nieprzylegających hematopoetycznych komórek progenitorowych, ponieważ reprezentują one bardzo różne typy komórek pod względem tożsamości strukturalnej i komórkowej. Opisane kroki rozwiązywania problemów ograniczyły zlepianie się jądra i szczątki, umożliwiając odzyskanie jąder w wystarczającej ilości i jakości do dalszych analiz. Podobne metody mogą być zaadaptowane do izolowania jąder od innych typów komórek kriokonserwowanych.
Wprowadzenie
Hematopoeza jest stosunkowo dobrze scharakteryzowanym systemem rozwojowym, ale niezdolność do podsumowania procesu powstawania krwinek in vitro świadczy o niepełnym zrozumieniu powiązanych czynników. Modele hematopoezy oparte na indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (iPSC) mogą pomóc w wyjaśnieniu kluczowych czynników rozwojowych i związanej z nimi biologii. System iPSC stanowi również doskonały model do badania chorób krwi, a komórki krwi oparte na iPSC zostały opracowane w celu wytwarzania odczynników istotnych translacyjnie i terapeutycznie1,2,3,4. Badania na pojedynczych komórkach były szeroko stosowane do badania biologii rozwojowej opartej na iPSC, w tym typów komórek, które są wytwarzane podczas hematopoezy5. W porównaniu z masowym sekwencjonowaniem RNA, które nie może wywnioskować relacji między subpopulacjami komórek6, modalności jednokomórkowe pozwalają na ocenę heterogeniczności komórek i mogą ułatwić identyfikację i charakterystykę rozwoju komórki6,7.
Tworzenie komórek krwiotwórczych z iPSC wymaga sekwencyjnego różnicowania poprzez prymitywne smugi, mezodermy i stany śródbłonka, aby utworzyć hemogenne komórki śródbłonka. Hemogenne komórki śródbłonka są bezpośrednimi prekursorami hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych8. Te typy komórek mają niezwykle różne właściwości morfologiczne i komórkowe. Wiedza na temat krajobrazu epigenetycznego i dynamiki rozwoju modeli komórek krwiotwórczych pochodzących z in vitro jest ograniczona, chociaż jest to wiedza niezbędna do uwolnienia pełnego potencjału terapeutycznego systemu iPSC. W wielu przypadkach tylko metody analizy pojedynczych komórek pozwalają na identyfikację populacji komórek, aktywności transkrypcyjnej, krajobrazów chromatyny i mechanizmów regulacyjnych, które rządzą rozwojem wśród heterogenicznych preparatów komórkowych.
Dwie metodologie, sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNAseq) i sekwencjonowanie RNA pojedynczych jąder (snRNAseq), mogą ujawnić wglądy transkrypcyjne na poziomie pojedynczej komórki9. Głównym czynnikiem decydującym o trafności i wiarygodności danych jest bezkompromisowe zapotrzebowanie na próbki spełniające rygorystyczne kryteria jakości. Obejmują one precyzyjne wymagania dotyczące gęstości komórek/jąder, optymalnej żywotności i minimalnego zbrylania. Przygotowanie pojedynczych jąder może być trudne technicznie. Mogą pojawić się dodatkowe wyzwania związane z wykorzystaniem wcześniej kriokonserwowanych komórek.
Zwracamy uwagę na cztery ważne potencjalne ograniczenia dla standardowych podejść scRNAseq. Po pierwsze, standardowe protokoły generowania zawiesin komórkowych często odnoszą się do preparatów ze świeżych komórek lub tkanek, a nie do tych pobranych po krioprezerwacji10. Może to ograniczyć użyteczność potencjalnie cennych zasobów. Po drugie, skuteczność dysocjacji różnych typów komórek jest zmienna. Na przykład wiele typów komórek odpornościowych ulega dysocjacji ze względną łatwością. W przeciwieństwie do tego, komórki zrębu, fibroblasty i komórki śródbłonka, które normalnie są osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej i błonie podstawnej, mają unikalne właściwości komórkowe, które mogą komplikować izolację jąder11,12. Właściwości te mogą wymagać agresywnych protokołów dysocjacji, co może zagrozić integralności strukturalnej bardziej delikatnych populacji komórek. Po trzecie, niektóre komórki (np. megakariocyty) mogą przekraczać średnicę 100 μm i stwarzać trudności dla kilku istniejących komercyjnych platform jednokomórkowych13. Ponadto niewłaściwe obchodzenie się z nimi może prowadzić do uszkodzenia komórek i reakcji na stres podczas początkowych etapów izolacji komórek, w tym hydrolizy enzymatycznej i dysocjacji mechanicznej, co może wpływać na profile ekspresji genów11,14.
Z tych i innych powodów, podejście oparte na pojedynczym jądrze może być preferowaną alternatywą dla metod jednokomórkowych15. Biorąc pod uwagę wyższą stabilność błony jądrowej w porównaniu z błoną komórkową, otoczka jądrowa może pozostać nienaruszona nawet po krioprezerwacji tkanek16. Może to ułatwić ekstrakcję jądrową i zwiększyć różnorodność typów próbek odpowiednich do metod sekwencjonowania nowej generacji. Po drugie, jądra wykazują zwiększoną odporność na zakłócenia mechaniczne i mają tendencję do wykazywania mniejszej liczby przesunięć transkrypcyjnych podczas dysocjacji14. Dlatego jądra mogą zapewnić większą stabilność RNA i bardziej powtarzalne profile transkrypcyjne. Trzecią godną uwagi zaletą metod z pojedynczymi jądrami jest brak ograniczeń wielkości komórek i możliwość zastosowania do większych komórek, takich jak kardiomiocyty lub megakariocyty12. Po czwarte, jądra służą jako odpowiednie substraty do analiz multiomicznych, które oferują rozszerzony wgląd w zintegrowaną analizę ekspresji genów, dostępnych regionów chromatyny i innych parametrów17, umożliwiając głębsze zrozumienie heterogeniczności, rozwoju i stanów funkcjonalnych komórek18.
Poprzez profilowanie iPSC podczas rozwoju hematopoetycznego, podejścia multiomiczne mogą pomóc w zdefiniowaniu procesów rozwojowych w modelach chorób normalnych lub patologicznych. Porównania komórek pochodzących z iPSC z komórkami lub tkankami pierwotnymi mogą również zapewnić ocenę wierności modelu iPSC biologii in vivo, ułatwiając ulepszenie modelu iPSC oraz odkrycie nowych populacji komórek i czynników napędzających tworzenie krwi.
Chociaż wielu grupom udało się z powodzeniem przejść przez izolację jądrową i wynikającą z tego analizę sekwencjonowania nowej generacji, izolowanie jąder wysokiej jakości pozostaje barierą dla niektórych laboratoriów zainteresowanych przeprowadzaniem analiz opartych na pojedynczym jądrze. Manuskrypt ten szczegółowo opisuje protokół izolowania wysokiej jakości jąder z wcześniej kriokonserwowanych komórek pochodzących z iPSC. Skupiliśmy się na przylegających komórkach zrębu / śródbłonka i nieprzylegających hematopoetycznych komórkach progenitorowych, ponieważ reprezentują one bardzo różne typy komórek pod względem struktury i zawartości, które wymagają dostosowanych modyfikacji i rozwiązywania problemów w celu zwiększenia odzyskiwania wysokiej jakości jąder nadających się do sekwencjonowania nowej generacji lub innych eksperymentów.
Protokół
1. Kriokonserwacja komórek
- Zamrażać >1 x 106 izolowanych komórek pochodzących z iPSC na ml w 1 ml 90% FBS i 10% DMSO. Umieść kriowiale w pojemniku do zamrażania w temperaturze -80°C, aby zmniejszyć prędkość zamrażania i zoptymalizować odzyskiwanie żywotnych komórek (tabela materiałów). Przewiduj znaczną utratę komórek, która może się różnić w zależności od warunków hodowli i tożsamości komórki.
- Przenieść z -80 °C do przechowywania ciekłego azotu w ciągu 24 godzin.
2. Rozmrażanie komórek
- Pobrać kriowial z magazynu ciekłego azotu i rozmrażać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 2 minuty. Wyjąć z łaźni wodnej, gdy nadal widoczne są małe kryształki lodu.
- Przenieś komórki z kriowialu do pustej probówki o pojemności 15 ml i powoli dodaj 10 ml wstępnie podgrzanego podłoża (RPMI 1640 + 10% FBS), ostrożnie mieszając. Wirować przy 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 25 °C.
- Odessać supernatant i rozpuścić w 1 ml DPBS uzupełnionego 2% FBS i 1 mM CaCl2 (tabela materiałów). Ostrożnie wymieszać, pipetując 3x za pomocą mikropipety o pojemności 1000 μl. Przenieść do probówki z okrągłym dnem polistyrenu o pojemności 5 ml.
3. Usuwanie martwych komórek
- Dodać 50 μl koktajlu do usuwania martwych komórek (tabela materiałów) do 1 ml zawiesiny komórek. Do mieszanki komórkowej dodać 50 μl koktajlu selekcyjnego biotyny. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Etapy te oznaczają martwe komórki Aneksyny V+ zawarte w zawiesinie komórkowej za pomocą biotyny.
- Energicznie wiruj przez 30 s, kulki dekstranu przeznaczone do zubożania niechcianych typów komórek oznaczonych biotyną (Tabela materiałów). Dodać 100 μl kulek dekstranu do zawiesiny komórek i wymieszać, delikatnie pipetując 2x w górę i w dół za pomocą mikropipety o pojemności 1000 μl (tabela materiałów).
- Dodać 1,3 ml DPBS zawierającego 2% FBS i 1 mM CaCl2 do zawiesiny komórek i wymieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół 2x za pomocą mikropipety o pojemności 1000 μl. Umieść probówkę w magnesie (tabela materiałów) i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
- Odwróć magnes i rurkę, aby wlać wzbogaconą zawiesinę żywych komórek do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4°C. Usunąć większość supernatantu i ponownie zawiesić w 1 ml DPBS + 0,04% BSA. Delikatnie wymieszać, pipetując 3x za pomocą mikropipety o pojemności 1000 μl.
4. Izolacja jąder
- Odwirować zawiesinę żywych komórek o sile 460 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, a następnie odessać supernatant, upewniając się, że nie dochodzi do uszkodzenia osadu komórkowego.
- Dodać 100 μl świeżo przygotowanego 0,5-krotnego buforu do lizy schłodzonego na lodzie (Tabela 1) i delikatnie wymieszać, pipetując 10x za pomocą mikropipety o pojemności 100 μl. Inkubować 3 minuty na lodzie.
- Dodać 500 μl schłodzonego buforu do przemywania (tabela 2) do probówki bez mieszania. Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
5. Mycie i ocena jąder
- Odessać supernatant i dodać 500 μl schłodzonego buforu do płukania, aby rozpuścić pozostały nienaruszony osad bez mieszania. Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć cały supernatant bez naruszania osadu jądrowego.
- Zawiesić w 120 μl schłodzonego, rozcieńczonego buforu jąder (tabela 3). Przefiltrować zawiesinę komórek za pomocą sitka do komórek o wielkości 40 μm (tabela materiałów).
- Wybarwić 0,4% błękitem trypanowym i wizualnie ocenić jakość izolowanych jąder pod mikroskopem 10x (Tabela Materiałów).
6. Przetwarzanie izolowanych jąder
- Utrzymuj jądra na lodzie. Natychmiast przystąp do dalszego przetwarzania, ponieważ z czasem może dojść do zbrylenia się jądra i wymagać dodatkowych etapów filtracji.
Wyniki
Powyższy protokół zastosowano do ekstrakcji jąder z kriozachowanych adherentnych komórek zrazowych/śródbłonkowych pochodzących z iPSC oraz nieadherentnych (pływających) komórek progenitorowych krwiotwórczych. Szczegółowy schemat procedury izolacji jąder znajduje się na Rysunku 1.
W celu badania morfologicznego wyizolowane jądra barwiono błękitem trypanu i wizualizowano pod mikroskopem. Ocena morfologii jąder jest kluczowa bezpośrednio przed przetwarzaniem, ponieważ zanieczyszczenia lub skupiska jąder mogą ograniczyć lub uniemożliwić uzyskanie wysokiej jakości danych z powodu zatykania precyzyjnych instrumentów mikrofluidycznych. Badanie mikroskopowe jąder wyizolowanych z próbki przygotowanej zgodnie z konwencjonalnym protokołem zestawu wykazało obecność zanieczyszczeń oraz ≥1 agregatu jądrowego na wizualizowane pole (Rysunek 2A-B). Próbki te zostały odrzucone ze względu na niską jakość.
Wysokiej jakości jądra są okrągłe i nienaruszone, z minimalną ilością grudek lub całkowitym ich brakiem, tak jak te, które zaobserwowaliśmy po optymalizacji metody (Rysunek 2C-D). W tych próbkach nie zaobserwowaliśmy agregatów ani grudkowania. Jądra te charakteryzowały się wystarczającą jakością i ilością, aby umożliwić dalsze przetwarzanie i analizę. Podobne rozwiązywanie problemów i optymalizacja protokołu mogą potencjalnie zostać zastosowane w odniesieniu do innych kriokonserwowanych typów komórek.
Rycina 1: Schemat ilustrujący ekstrakcję jąder z komórek kriokonserwowanych. Przedstawienie wizualne szczegółowo opisujące etapy izolacji jąder z komórek kriokonserwowanych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 2: Jądra wyizolowane z krio konserwowanych komórek pochodzących z ludzkich iPSC. Wyizolowane jądra z adherentnych komórek zrębowych/śródbłonkowe barwione błękitem trypanu wykazują znaczną ilość zanieczyszczeń (A) w postaci małych cząsteczek oraz (B) agregatów jądrowych (duża cząsteczka), co uniemożliwiło dalsze analizy. Po wprowadzeniu przedstawionych tutaj modyfikacji technicznych, wysokiej jakości jądra zostały wyizolowane z (C) krio konserwowanych ludzkich komórek progenitorowych krwi pochodzących z iPSC lub (D) populacji komórek zrębowych/śródbłonkowe w ilościach wystarczających do przeprowadzenia dalszych analiz. Dla odniesienia, te nieadherentne komórki progenitorowe krwi zostały pobrane w dniu 9 + 8, a adherentne komórki zrębowe/śródbłonkowe w dniu 9 + 7 różnicowania krwiotwórczego, zgodnie z opisem w4. Należy zauważyć, że morfologia jądra może różnić się w zależności od typu komórki. Pasek skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Przygotowanie buforu | |||
| 0,5X bufor lizujący | Roztwór zapasowy | Końcowy | 2 mL |
| Bufor lizujący 1X | 1X | 0,5X | 1 ml |
| Bufor do rozcieńczania lizatu | 1 mL | ||
| Bufor do lizy | Roztwór zapasowy | Końcowy | 2 mL |
| BSA | 10% | 1% | 200 µL |
| Digitonina | 5% | 0.01% | 4 µL |
| DTT | 1000 mM | 1 mM | 2 µL |
| MgCl2 | 1 M | 3 mM | 6 µl |
| NaCl | 5 M | 10 mM | 4 µL |
| Zamiennik Nonidet P40 | 10% | 0.10% | 20 µL |
| Woda wolna od nukleaz | 1,67 ml | ||
| inhibitor RNazy | 40 U/µl | 1 j./µl | 50 µl |
| Tris-HCl (pH 7,4) | 1 M | 10 mM | 20 µL |
| Tween-20 | 10% | 0.10% | 20 µL |
| Bufor rozcieńczający do lizy | Roztwór zapasowy | Końcowy | 2 ml |
| BSA | 10% | 1% | 200 µl |
| DTT | 1000 mM | 1 mM | 2 µL |
| MgCl2 | 1 M | 3 mM | 6 µL |
| NaCl | 5 M | 10 mM | 4 µL |
| Woda wolna od nukleaz | 1,72 mL | ||
| inhibitor RNazy | 40 U/µl | 1 U/µl | 50 µl |
| Tris-HCl (pH 7,4) | 1 M | 10 mM | 20 µl |
Tabela 1: Przygotowanie 0,5x buforu lizującego. Roztwór ten jest przeznaczony do procedury izolacji jąder opisanej w kroku 4.2. Bufor lizujący oraz bufor do rozcieńczania lizy są mieszane w celu przygotowania 0,5x buforu lizującego. Należy bezwzględnie przygotować świeży bufor bezpośrednio przed każdym eksperymentem i przechowywać go w lodzie. Należy pamiętać, że w przypadku niektórych typów komórek optymalizacja procedury może wymagać zastosowania 1x, 0,5x lub mniejszych rozcieńczeń buforu lizującego, aby ułatwić izolację nienaruszonych jąder.
| Przygotowanie buforu | |||
| Bufor płuczący | Roztwór zapasowy | Końcowy | 4 ml |
| BSA | 10% | 1% | 400 µL |
| DTT | 1000 mM | 1 mM | 4 µL |
| MgCl2 | 1 M | 3 mM | 12 µL |
| NaCl | 5 M | 10 mM | 8 µL |
| Woda wolna od nukleaz | 3,40 ml | ||
| inhibitor RNazy | 40 U/µl | 1 j./µl | 100 µL |
| Tris-HCl (pH 7,4) | 1 M | 10 mM | 40 µL |
| Tween-20 | 10% | 0.10% | 40 µL |
Tabela 2: Przygotowanie buforu płuczącego. Roztwór ten jest wykorzystywany podczas izolacji jąder komórkowych. Należy go przygotować na świeżo przed każdym eksperymentem i przechowywać w lodzie.
| Przygotowanie buforu | |||
| Rozcieńczony bufor do jąder komórkowych | Roztwór stokowy | Końcowy | 1 ml |
| DTT | 1000 mM | 1 mM | 1 µL |
| Woda wolna od nukleaz | 924 µL | ||
| Bufor do izolacji jąder komórkowych | 20X | 1X | 50 µL |
| inhibitor RNazy | 40 U/µL | 1 U/µL | 25 µL |
Tabela 3: Przygotowanie rozcieńczonego buforu do jąder komórkowych. Roztwór ten jest wykorzystywany w kroku 5.2. Należy go przygotować na świeżo przed każdym eksperymentem i przechowywać w lodzie.
Dyskusja
Krytyczne kroki w ramach protokołu
Izolowanie jąder wysokiej jakości ma zasadnicze znaczenie dla pomyślnego wdrożenia obecnych metod sekwencjonowania nowej generacji opartych na pojedynczych jądrach, które szybko się rozwijają. Uznając istniejące bariery dla laboratoriów zainteresowanych tymi podejściami, w szczególności w przypadku próbek kriokonserwowanych, naszym zamiarem było opracowanie techniki izolacji jądrowej dostosowanej do wcześniej zamrożonych komórek. Izolowanie jąder od próbek kriokonserwowanych jest często konieczne w przypadku próbek klinicznych i rzadkich populacji komórek pochodzących z iPSC.
Ważne jest, aby dostosować rozcieńczenie buforu do lizy, czas lizy i częstotliwość filtracji do określonych populacji komórek. Zaobserwowaliśmy, że szczególnie wrażliwe typy komórek, takie jak kriokonserwowane ludzkie hematopoetyczne komórki progenitorowe pochodzące z iPSC, ulegają nadmiernej lizie w czasie krótszym niż minuta z 1-krotnym buforem do lizy. Taka nadmierna liza nie jest jedynie usterką techniczną lub operacyjną. Nadmierna liza i zbrylanie mogą raczej wskazywać na wyciek adhezyjnych materiałów jądrowych. W przypadku przylegających komórek zrębu i śródbłonka o solidnej architekturze cytoszkieletu i błonach o skłonności do tworzenia silnych zrostów komórka-komórka, konieczna była podwójna filtracja w celu usunięcia zlepionych jąder. Agregaty jądrowe mogą blokować kanały mikroprzepływowe, stwarzając namacalne ryzyko dla integralności eksperymentu i potencjalnie uniemożliwiając uzyskanie jakichkolwiek danych.
Odkryliśmy również, że włączenie etapu usuwania martwych komórek znacznie zwiększyło regenerację nienaruszonych jąder, jednocześnie ograniczając zlepianie się i zanieczyszczenia. Na początku eksperymentu konieczne było przetworzenie próbek zawierających >70% żywotnych komórek w oparciu o barwienie błękitem trypanowym. Utrzymywanie wszystkich na lodzie może również pomóc w utrzymaniu rentowności.
Ograniczenia techniki
Opisana metoda została zaprojektowana w celu optymalizacji odzysku jądrowego z hodowanych komórek typu4 pochodzących z iPSC. Możliwe jest, że podobne procedury rozwiązywania problemów wykraczałyby poza komórki indukowane iPSC, obejmując inne typy komórek kriokonserwowanych, ale trudno jest przewidzieć konkretne potrzeby dla poszczególnych próbek lub typów komórek bez testów. Niezależnie od próbki lub typu komórki, dążenie do preparatów jądrowych z <5% pozostałymi żywymi całymi komórkami, minimalizacja agregacji i redukcja nadmiernie zlizowanych jąder powinno bezpośrednio korelować z sukcesem eksperymentalnym.
Znaczenie w odniesieniu do istniejących metod
Istotne translacyjnie systemy różnicowania oparte na iPSC mogą prowadzić do powstania wielu typów komórek i komórek progenitorowych. Protokół ten koncentruje się na przylegających komórkach zrębu/śródbłonka pochodzących z iPSC i nieprzylegających hematopoetycznych komórkach progenitorowych jako przykładowych typach komórek, które miały różne wymagania metodologiczne w celu optymalizacji izolacji jądrowej. Przewidujemy, że protokół ten może zostać zaadaptowany i zastosowany do innych typów komórek pochodzących z iPSC w celu zbadania kluczowych etapów rozwoju, uznając, że konieczne jest precyzyjne dostrojenie metod izolacji w zależności od zawartości białka, struktury błony i sztywności komórki. Opisana tu metodologia może jednak pozwolić na odzyskanie wysokiej jakości jąder z szerokiego spektrum kriokonserwowanych typów komórek.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.
Podziękowania
Autorzy dziękują Jasonowi Hatakeyamie (10x Genomics) i Dianie Slater (Children's Hospital of Philadelphia Center for Applied Genomics) za wskazówki i sugestie. Badanie to było wspierane przez National Institutes of Health (HL156052 do CST).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Cell Culture Odczynniki | |||
| dimetylosulfotlenku (DMSO) | Sigma | 673439 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS) | Corning | 21031CV | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | GeminiBio | 100106 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875093 | |
| Cells | |||
| Induced pluripotencjalne komórki macierzyste | N/A | N/D | Komórki iPS użyte w tym badaniu uzyskano za pomocą odczynników do barwienia komórek CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility |
| Cell | |||
| Trypan Blue Solution | Corning | 25900CI | |
| strong>Odczynniki do usuwania martwych komórek | |||
| Chlorek wapnia (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| Zestaw do usuwania martwych komórek EasySep (Aneksyna V) | StemCell Technologies | 17899 | Ten zestaw jest przeznaczony do wyczerpania niepożądanych typów komórek oznaczonych biotyną. Zestaw zawiera koktajl do usuwania martwych komórek (załącznik V), koktajl wyboru biotyny i koraliki dekstranu. Ten zestaw jest ukierunkowany na fosfatydyloserynę na zewnętrznej wlotce błony komórkowej komórek apoptotycznych za pomocą aneksyny V. Niechciane komórki są znakowane aneksyną V, biotynylowanymi przeciwciałami i cząstkami magnetycznymi i oddzielane bez kolumn za pomocą magnesu EasySep. Pożądane komórki są po prostu wylewane do nowej probówki. |
| Materiały | |||
| 10 i mikro; l | Oddziały mikropipet nauka | 470231606 | |
| 100 i mikro; l | Oddziały mikropipet nauka | 470231598 | |
| 1000 i mikro; l Przedłużona uniwersalna końcówka | Oxford Lab Products | OAR-1000XL-SLF | |
| 1000 i mikro; l | Oddziały mikropipet nauka | 470231602 | |
| 2,0 ml Fiolki kriogeniczne | Corning | 431386 | |
| 20 i mikro; l | Oddziały mikropipet nauka | 470231608 | |
| 200 i mikro; l Mikropipety | Wards science | 470231600 | |
| 5ml Polistyrenowa rurka z okrągłym dnem | Falcon | 352063 | |
| Corning DeckWork 0,1-10 i mikro; l Stacja końcówek do | pipet Corning | 4143 | |
| Corning DeckWork 1-200 &mikro; l Stacja końcówek do pipet | Corning | 4144 | |
| Komora licząca | CytoSMART | 699910591 | |
| Filtr siatkowy Flowmi, 40 i mikro; m | Bel-Art | H136800040 | |
| Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| NALGENE Cryo 1° C Pojemnik do zamrażania | Nalgene | 51000001 | |
| Odczynniki do izolacji jąder< / strong> | Odczynniki do izolacji jąder zawierają bufor do lizy, Bufor płuczący i rozcieńczony bufor jąder oraz bufor rozcieńczający lizę. Skład tych przedstawiono w tabelach 1, 2 i 3. Nasza metoda izolacji jąder poprawiła izolację w stosunku do standardowych protokołów zestawu (np. 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338]). Protokół ten może być używany z kilkoma zestawami komercyjnymi, w tym z pakietem odczynników do ekspresji genów Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent, 16 rxns (PN-1000283). | ||
| Zestaw do usuwania martwych komórek | STEMCELL | 17899 | |
| Digitonina | Thermo Fisher Scientific | BN2006 | |
| DL-Ditiotreitol roztwór (DTT) | Sigma | 646563 | |
| Filtr siatkowy Flowmi Cell, 40 &mikro; m | Bel-Art | H136800040 | |
| MACS albumina surowicy bydlęcej (BSA) roztwór | podstawowy Miltenyi Biotec | 130091376 | |
| Chlorek magnezu (MgCl2) | Sigma | 7786303 | |
| roztwór chlorku magnezu, 1 M | Sigma | M1028 | |
| Nonidet P40 Substytut | Sigma | 74385 | |
| Bez nukleazy Water | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| Bufor jąder (20X) | 10X Genomics | 2000153 | |
| Protector Inhibitor RNazy | Sigma | 3335399001 | |
| Chlorek sodu (NaCl) | Sigma | S7653-250G | |
| Roztwór chlorku sodu, 5 M | Sigma | 59222C | |
| Chlorowodorek Trizma Soultion, pH 7,4 | Sigma | T2194 | |
| Chlorowodorek Trizma (Tris-HCl) (pH 7,4) | Sigma | T3252-500G | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| Inne urządzenia | |||
| Automatyczny licznik komórek | CytoSMART | 699910591 | |
| Mikroskop | Zeiss | Primostar 3 |
Bibliografia
- Ito, Y., et al. Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production. Cell. 174 (3), 636-648 (2018).
- An, H. H., et al. The use of pluripotent stem cells to generate diagnostic tools for transfusion medicine. Blood. 140 (15), 1723-1734 (2022).
- Zeng, J., Tang, S. Y., Toh, L. L., Wang, S. Generation of "Off-the-Shelf" Natural Killer Cells from Peripheral Blood Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rep. 9 (6), 1796-1812 (2017).
- Pavani, G., et al. Modeling primitive and definitive erythropoiesis with induced pluripotent stem cells. Blood Adv. , (2024).
- Chen, X., et al. Integrative epigenomic and transcriptomic analysis reveals the requirement of JUNB for hematopoietic fate induction. Nat Comm. 13 (1), 3131(2022).
- Yu, X., Abbas-Aghababazadeh, F., Chen, Y. A., Fridley, B. L. Statistical and bioinformatics analysis of data from bulk and single-cell RNA sequencing experiments. Methods Mol Biol. 2194, 143-175 (2021).
- Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clin Transl Med. 12 (3), e694(2022).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat med. 26 (5), 792-802 (2020).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. J Am Soc Nephrol. 30 (1), 23-32 (2019).
- Nadelmann, E. R., et al. Isolation of nuclei from mammalian cells and tissues for single-nucleus molecular profiling. Curr Protoc. 1 (5), e132(2021).
- Del-Aguila, J. L., et al. A single-nuclei RNA sequencing study of Mendelian and sporadic AD in the human brain. Alzheimer's Res Ther. 11 (1), 71(2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS one. 13 (12), e0209648(2018).
- Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).
- Maciejowski, J., Hatch, E. M. Nuclear membrane rupture and its consequences. Ann Rev Cell Dev Biol. 36, 85-114 (2020).
- Fang, R., et al. Comprehensive analysis of single cell ATAC-seq data with SnapATAC. Nat Comm. 12 (1), 1337(2021).
- Baysoy, A., Bai, Z., Satija, R., Fan, R. The technological landscape and applications of single-cell multi-omics. Nat Rev. Mol Cell Biol. 24 (10), 695-713 (2023).
Przedruki i uprawnienia
