Opisano nową metodę iniekcji dootrzewnowej (IP) u dorosłych ryb pręgowanych. W przypadku stosowania związków toksycznych, takich jak doksorubicyna, procedura ta jest bardziej skuteczna niż dwie wcześniej opisane metody IP. Technika ta została zaprojektowana tak, aby mogła być łatwo zaadoptowana przez badaczy z ograniczonym doświadczeniem w modelowaniu danio pręgowanego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Technika iniekcji dootrzewnowej u dorosłych danio pręgowanego, która minimalizuje uszkodzenia ciała i związaną z nimi śmiertelność
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dorosły danio pręgowany (Danio rerio), który jest genetycznie dostępny, jest wykorzystywany jako cenny model kręgowców do badania ludzkich zaburzeń, takich jak kardiomiopatia. Wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP) jest ważną metodą, która dostarcza związki do organizmu w celu testowania efektów terapeutycznych lub generowania modeli chorobowych, takich jak kardiomiopatia wywołana doksorubicyną (DIC). Obecnie istnieją dwie metody wstrzykiwania adresu IP. Obie metody mają ograniczenia w obchodzeniu się ze związkami toksycznymi, takimi jak doksorubicyna, które powodują skutki uboczne objawiające się poważnym uszkodzeniem kształtu ciała i śmiercią ryb. Chociaż te niedociągnięcia można przezwyciężyć poprzez szeroko zakrojone szkolenie badaczy, pożądana jest nowa metoda wstrzykiwania IP, która ma minimalne skutki uboczne. W tym miejscu opisano unikalną metodę wstrzykiwania IP, która jest w stanie poradzić sobie z toksycznymi związkami. Konsekwentne obniżanie czynności serca może skutkować bez ponoszenia znacznej śmierci ryb. Technika ta może być łatwo opanowana przez badaczy, którzy mają minimalne doświadczenie z dorosłymi danio pręgowanymi.
Wprowadzenie
Danio rerio) zyskał uwagę jako eksperymentalny model do badania chorób ludzkich, ponieważ zwierzę to charakteryzuje się wysoką homologią genów i narządów do ludzi, zewnętrznym zapłodnieniem, łatwością manipulacji genetycznej i przezroczystością ciała do wczesnej dojrzałości, co ułatwia niezliczone zastosowania obrazowania1. W przeciwieństwie do prostego procesu dostarczania leków bezpośrednio do wody dla zarodków i larw danio pręgowanego, podawanie leków dorosłym danio pręgowanym stanowi bardziej skomplikowane i wymagające przedsięwzięcie2.
U dorosłych ryb związki mogą być dostarczane za pomocą technik pasywnego dostarczania leków, takich jak bezpośrednie podawanie do wody, lub za pomocą doustnych metod dostarczania leków, takich jak gavaging2. Inne podejścia obejmują powlekanie pokarmu dla ryb związkami, a następnie karmienie ryb3 oraz bezpośrednie podawanie leków nierozpuszczalnych w wodzie w określonym stężeniu, w tym wstrzyknięcia zaoczodołowe lub dootrzewnowe4,5. Podawanie dootrzewnowe jest preferowane w badaniach in vivo modeli choroby ze względu na jego wyraźne zalety farmakokinetyczne6. Metoda ta zapewnia wysokie stężenie leku i wydłużony okres półtrwania w jamie otrzewnej, oferując skuteczną drogę dostarczania leku7,8. Podejście to jest powszechnie stosowane w warunkach badawczych w celu zapewnienia optymalnego wchłaniania i dystrybucji leków 9. Podczas gdy metody oparte na iniekcjach okazują się skuteczne w przypadku pojedynczego podania, długotrwałe i powtarzające się wstrzyknięcia często prowadzą do uszkodzenia organizmu i przewlekłej infekcji2.
Obecnie istnieją dwie metody wstrzykiwania IP u dorosłych zerbafish4,10. Jednak obie metody mają ograniczenia w dostarczaniu toksycznych związków, takich jak doksorubicyna, co prowadzi do poważnych uszkodzeń kształtu ciała i śmiertelności ryb. Skutki uboczne mogą znacznie skomplikować interpretację danych. Chociaż te wyzwania mogą być rozwiązane za pomocą szeroko zakrojonego szkolenia10, istnieje wyraźna potrzeba nowej metody wstrzykiwania IP, która minimalizuje skutki uboczne.
Tutaj naszym celem jest opracowanie nowej metody wstrzykiwania IP, zoptymalizowanej pod kątem skutecznego dostarczania doksorubicyny do dorosłego danio pręgowanego, ułatwiając generowanie niezawodnych modeli kardiomiopatii wywołanej doksorubicyną (DIC) przy zminimalizowaniu uszkodzeń ciała i związanej z tym śmiertelności.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie przeprowadzone procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Mayo Clinic, zgodnie ze standardami określonymi w „Guide for the Care and Use of Laboratory Animals” (National Academies Press, 2011). Wszystkie danio pręgowane wykorzystane w badaniu należą do szczepu Wild Indian Karyotype (WIK). Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego w badaniu znajdują się w Tabeli materiałów.
1. Przygotowanie i przechowywanie roztworu zapasowego doksorubicyny
- Należy pozyskać doxorubicinę z komercyjnego źródła.
UWAGA: Doxorubicyna jest światłoczuła, dlatego należy ją nabyć w formie proszku i przechowywać w nieprzezroczystych pojemnikach, aby chronić ją przed ekspozycją na światło. Wszystkie etapy przygotowania proszku Dox należy przeprowadzać w dygestorium chemicznym. - Całkowicie rozpuścić proszek Dox w wodzie destylowanej i przygotować roztwór zapasowy o końcowym stężeniu 5 mg/mL.
- Przygotować alikwoty roztworu zapasowego, rozdzielając go do probówek o pojemności 1,5 mL.
- Owiniąć probówki folią aluminiową, aby chronić je przed ekspozycją na światło.
- Przechowywać alikwoty roztworu Dox w temperaturze 4 °C w przypadku przechowywania krótkoterminowego (<1 miesiąca) lub w -20 °C w przypadku przechowywania długoterminowego10.
2. Grupowanie ryb według masy ciała
- Pogrupuj ryby o różnicy BW wynoszącej mniej niż 10% przed kolejnym etapem wstrzykiwania.
UWAGA: Aby usprawnić ten etap, ryby z odchyleniem BW poniżej 10% są klasyfikowane jako ryby o tym samym rozmiarze. - Pozostaw ryby na 24-godzinną głodówkę przed wstrzyknięciem.
- Znieczul ryby, używając wody dla embrionów zawierającej 0,16 mg/mL trikainy przez 1 min.
- Wyjmij ryby z wody z trikainą i osusz obie strony ciała ryby czystym papierem filtrowanym, aby usunąć nadmiar wody.
- Zmierz i zapisz BW każdej ryby, a następnie niezwłocznie przenieś ryby do zbiornika regeneracyjnego wypełnionego świeżą wodą systemową.
UWAGA: Wstrzyknięcie Dox wykonano u ryb po osiągnięciu 3 miesięcy wieku. W niniejszym badaniu naukowcy wykorzystali ryby w wieku od 3 do 10 miesięcy. BW dojrzałych zebrafish szczepu WIK może wynosić od 0,2 g do 0,5 g. Przedłużona anestezja trwająca ponad 5 min, po której nastąpiło wstrzyknięcie Dox, prowadziła do wysokiej śmiertelności ryb.
3. Przygotowanie igły i stanowiska do iniekcji
- Wyznaczyć objętość iniekcji roztworu zapasu Dox (np. 5 mg/mL) potrzebną dla każdej ryby na podstawie średniej masy ciała, aby osiągnąć docelową dawkę 20 µg/g.
- Użyć następującego wzoru do obliczenia objętości iniekcji:
- Dodać 1x zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS), aby rozcieńczyć roztwór Dox obliczony w kroku 1 do iniekcji, osiągając objętość całkowitą 5 µL.
UWAGA: Przygotować roztwór zbiorczy dla każdej grupy ryb na podstawie ich BW i uwzględnić dodatkowe 3 ryby w każdej grupie, aby zapewnić brak niedoboru roztworu do iniekcji w trakcie eksperymentu. - Delikatnie opukać probówkę, a następnie krótko wirować w mikrowirówce z maksymalną prędkością, aby zebrać roztwór w temperaturze pokojowej przez 10 s.
- Umieścić przygotowany roztwór na lodzie i chronić go przed ekspozycją na światło.
- Umieścić czystą szalkę Petriego o średnicy 100 mm z gąbką pod spodem pod mikroskopem stereoskopowym, a następnie ustawić ostrość.
UWAGA: Gąbka posiada rowek o długości 4 cm. Elastyczne cofanie się gąbki zapewni rybie podparcie i utrzyma jej ciało w odpowiedniej pozycji. Gąbkę można wykorzystać ponownie. - Wyposażyć mikrostrzykawkę 10 µL w igłę skośną 34 G.
- Przepłukać igłę buforem 1x HBSS, aby usunąć pęcherzyki powietrza i udrożnić potencjalne zatory w strzykawce.
- Odmierzyć 5 µL roztworu przygotowanego w kroku 4 do iniekcji.
4. Procedura wstrzykiwania Dox do jamy otrzewnej (IP)
- Umieścić dorosłe ryby w wodzie z dodatkiem 0,16 mg/mL tricainy na 1 min, aby wywołać stan utraty przytomności.
- Ułożyć rybę w rowku osadzonej gąbki brzuchem do góry (Rysunek 1A).
- Wprowadzić igłę pod kątem bliskim 0°, zaczynając od środka płetwy piersiowej w kierunku tylnej części jamy serca (Rysunek 1B).
UWAGA: Należy unikać jakiegokolwiek kontaktu z sercem podczas procedury. - Kierować igłę w stronę ogona, prowadząc ją pod skórą srebrzystą.
UWAGA: Należy umieścić igłę w bliskim sąsiedztwie skóry srebrzystej, dbając o to, aby jej nie zadrapać ani nie przebić. - Monitorować położenie końcówki igły w jamie brzusznej przez cały czas trwania operacji (Rysunek 1C).
UWAGA: Należy unikać uszkodzenia wątroby, jelit, pęcherza pławnego i innych narządów. Należy upewnić się, że igła dotarła do końca jelita, w pobliżu otworu kloaki. - Stopniowo i równomiernie podać 5 µL roztworu Dox, a następnie powoli wycofać igłę wzdłuż pierwotnej ścieżki, aby zapobiec wyciekowi (Rysunek 1D).
- Monitorować jamę brzuszną pod kątem obecności Dox, obserwując czerwone zabarwienie roztworu Dox (Rysunek 1E).
- Szybko przenieść wstrzyknięte ryby do czystego zbiornika przelewnego wypełnionego świeżą wodą systemową, aby pomóc rybom w rekonwalescencji.
UWAGA: Pomiędzy wstrzyknięciami należy jednokrotnie przepłukać igłę buforem 1x HBSS.
5. Opieka nad rybami po iniekcji
- Po wstrzyknięciu zwróć ryby do systemu z cyrkulacją.
- Poddaj wszystkie wstrzyknięte ryby dodatkowemu 24-godzinnemu postowi, aby ułatwić ich rekonwalescencję.
- W ciągu pierwszego tygodnia uważnie obserwuj ryby. Usuwaj martwe osobniki tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć zainfekowania pozostałych ryb.
UWAGA: Śmiertelność ryb w ciągu pierwszych 24 h prawdopodobnie wynika z obrażeń fizycznych powstałych podczas wstrzykiwania lub przedłużonej anestezji. Odnotuj liczbę ryb w celu wygenerowania krzywej przeżywalności. - Wykonaj echokardiografię w celu fenotypowania ryb po wstrzyknięciu Dox w 56. dniu po zabiegu11.
UWAGA: Zapewnij jednolitość warunków i procedur dla odpowiadającej im grupy kontrolnej, której wstrzyknięto roztwór HBSS.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wcześniej w celu podania doksorubicyny u dorosłych rybek danio-zebrafish stosowano dwie metody doszpikowe (IP)4,10. W metodzie I, znanej również jako klasyczna metoda iniekcji IP opisana przez Kinkela i współpracowników4, igłę wprowadzano pod kątem 45° względem linii środkowej między płetwami brzusznymi, z brzuchem skierowanym do góry. W metodzie II, czyli alternatywnej metodzie iniekcji IP opisanej przez Ma i współpracowników
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W odróżnieniu od dwóch istniejących metod wstrzykiwania IP 4,10, nowa metoda wstrzykiwania IP charakteryzuje się następującymi odrębnymi cechami. Po pierwsze, stosowany jest unikalny kąt penetracji igły (bliski zeru); po drugie, igła wnika w rybę przez unikalne miejsce, tj. naturalny otwór na brzusznej powierzchni ryby, który ułatwiłby wstrzyknięcie; I wreszcie ruch igły odbywa się od przodu do tyłu. Regulacje te skutecznie zmniejszają uszkodzenia narząd...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez NIH (HL107304 i HL081753) oraz Fundację Mayo (Centrum Odkryć Biomedycznych i Badań Sercowo-Naczyniowych) do X.X. J.L. jest finansowane przez Fundusze Badań Podstawowych dla Centralnych Uniwersytetów Central South University, nr 56021702. Specjalne podziękowania dla Beninio Gore'a i Quentina Stevensa za zarządzanie obiektem dla danio pręgowanego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 10 μ L Strzykawka NanoFil | World Precision Instruments, Inc | Narzędzie do iniekcji | NANOFIL |
| 34 G igła | World Precision Instruments, Inc | NI34BV-2 | narzędzie do wkłuwania |
| 60 mm szalka Petriego | fisher scientific/fisherbrand | FB0875713A | umieszczania gąbki |
| Mikroskop preparacyjny | Nikon | SMZ800 | Injceting Dox Dox |
| chlorowodorek doksorubicyny | lek Sigma | D1515-10MG | do tworzenia modelu DIC |
| Echokardiografia | VISUAL SONICS | Vevo 3100 | pomiar czynności serca |
| Gąbka piankowa | Jaece Industries | L800-D Umieszczanie | ryb |
| Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBBS) | Thermo Fisher | 14025076 | Pojazd do |
| mikrowirówki Dox | southernlabware | MyFuge/C1012 | zbiera rozwiązanie Dox |
| Waga precyzyjna | Torbal | AD60 | Waga cyfrowa |
| Tricaine | Argent | MS-222 | znieczulająca do ryb |
| Eppendorf | 1,5 ml | przechowywanie | |
| vevo LAB oprogramowanie | FUJIFILM VISUAL SONICS | 5.6.0 | Kwantyfikacja serca |
Bibliografia
- Tavares, B., Lopes, S. S. The importance of Zebrafish in biomedical research. Acta Medica Portuguesa. 26 (5), 583-592 (2013).
- Dang, M., Henderson, R. E., Garraway, L. A., Zon, L. I. Long-term drug administration in the adult zebrafish using oral gavage for cancer preclinical studies. Disease Model Mech. 9 (7), 811-820 (2016).
- Sciarra, J. B., Tyler, A., Kolb, A. A gelatin-based diet for oral dosing juvenile to adult zebrafish (Danio rerio). Lab Animal Sci Prof. , https://api.semanticscholar.org/CorpusID:85611302 32-35 (2014).
- Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal injection into adult zebrafish. J Vis Exp. (42), e2126(2010).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. (34), e1645(2009).
- Liu, J., et al. Intraperitoneally delivered mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis through THBS1-mediated induction of IL-10-competent regulatory B cells. Front Immunol. 13, 853894(2022).
- De Smet, L., Ceelen, W., Remon, J. P., Vervaet, C. Optimization of drug delivery systems for intraperitoneal therapy to extend the residence time of the chemotherapeutic agent. The Scientific World Journal. 2013, 720858(2013).
- Dakwar, G. R., et al. Nanomedicine-based intraperitoneal therapy for the treatment of peritoneal carcinomatosis-Mission possible. Adv Drug Deliv Rev. 108, 13-24 (2017).
- Al Shoyaib, A., Archie, S. R., Karamyan, V. T. Intraperitoneal route of drug administration: should it be used in experimental animal studies. Pharmaceutical Res. 37, 1-17 (2020).
- Ma, X., Ding, Y., Wang, Y., Xu, X. A doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish. J Vis Exp. (136), e57567(2018).
- Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Disease Model Mech. 10 (1), 63-76 (2017).
- Christidi, E., Brunham, L. R. Regulated cell death pathways in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Cell Death Dis. 12 (4), 339(2021).
- Zhu, W., Shou, W., Payne, R. M., Caldwell, R., Field, L. J. A mouse model for juvenile doxorubicin-induced cardiac dysfunction. Pediatric Res. 64 (5), 488-494 (2008).
- Podyacheva, E. Y., Kushnareva, E. A., Karpov, A. A., Toropova, Y. G. Analysis of models of doxorubicin-induced cardiomyopathy in rats and mice. A modern view from the perspective of the pathophysiologist and the clinician. Frontiers Pharmacol. 12, 670479(2021).
- Chaoul, V., et al. Assessing drug administration techniques in zebrafish models of neurological disease. Int J Mol Sci. 24 (19), 14898(2023).
- Lu, X., Lu, L., Gao, L., Wang, Y., Wang, W. Calycosin attenuates doxorubicin-induced cardiotoxicity via autophagy regulation in zebrafish models. Biomed Pharmacother. 137, 111375(2021).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
