Artykuł metodologiczny

Generowanie, utrzymanie i identyfikacja wolnych od zarazków modeli danio pręgowanego od larw do stadiów młodocianych

DOI:

10.3791/66512

⸱

12 kwietnia 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Public Health, Chongqing Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia podstawowe kroki do uzyskania wolnych od zarazków (GF) zarodków ryb i utrzymania ich od larw do stadium młodocianego, w tym pobieranie próbek i wykrywanie ich sterylnego statusu. Zastosowanie modeli GF w przypadku infekcji jest ważne dla zrozumienia roli drobnoustrojów w zdrowiu gospodarza.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio pręgowany służy jako cenne modele do badań nad wzrostem, odpornością i mikrobiotą jelitową ze względu na ich genomiczne podobieństwa do ssaków, przezroczyste zarodki rozwijające się w stosunkowo czystym środowisku kosmówkowym i niezwykle szybki rozwój larw w porównaniu do modeli gryzoni. Danio pręgowany (Danio rerio) wolny od zarazków (GF) ma kluczowe znaczenie dla oceny toksyczności zanieczyszczeń i tworzenia modeli chorób podobnych do ludzkich związanych z funkcjami mikrobiologicznymi. W porównaniu z modelami hodowanymi konwencjonalnie (CR) (ryby we wspólnej hodowli), danio pręgowany GF pozwala na dokładniejszą manipulację mikrobiotą gospodarza, pomagając w określeniu związku przyczynowego między mikroorganizmami a gospodarzami. W związku z tym odgrywają one kluczową rolę w pogłębianiu naszego zrozumienia tych relacji. Jednak modele zebry z GF są zwykle generowane i badane we wczesnych stadiach życia (od zarodków do larw) ze względu na ograniczenia w funkcjonowaniu układu odpornościowego i wchłanianiu składników odżywczych. Badanie to optymalizuje tworzenie, utrzymanie i identyfikację wczesnych modeli danio pręgowanego GF bez karmienia i z długotrwałym karmieniem przy użyciu pokarmu GF (takiego jak Artemia sp., krewetki solankowe). W trakcie całego procesu codziennie pobierano próbki i przeprowadzano hodowlę, a następnie identyfikowano je za pomocą wielu detekcji, w tym płytek i sekwencjonowania 16S rRNA. Zarejestrowano wskaźnik aseptyki, przeżywalność i wskaźniki rozwoju zebry GF, aby zapewnić jakość i ilość wygenerowanych modeli. Co ważne, badanie to dostarcza szczegółowych informacji na temat technik izolacji bakterii i infekcji u ryb z GF, umożliwiając efektywne tworzenie modeli ryb GF od larw do stadiów młodocianych przy wsparciu pokarmowym GF. Stosując te procedury w badaniach biomedycznych, naukowcy mogą lepiej zrozumieć związki między funkcjami bakterii jelitowych a zdrowiem gospodarza.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrobiota (tj. archeony, bakterie, eukarya i wirusy) odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu zdrowia gospodarza i przyczynia się do rozwoju różnych chorób, wpływając na procesy fizjologiczne i patologiczne poprzez symbiotyczne interakcje w obrębie bariery jelitowej, powierzchni nabłonka i funkcji mucyny u osób1,2,3. Skład mikrobioty na różnych etapach życia, od niemowlęctwa po młodość, dorosłość i starzenie się, a także jej obecność w różnych miejscach, takich jak nozdrza, jama ustna, skóra i jelita, jest dynamicznie kształtowany przez różne siedliska i środowiska4. Mikrobiota jelitowa organizmów bierze udział we wchłanianiu składników odżywczych, odpowiedzi immunologicznej, inwazji patogenów, regulacji metabolicznej itp5,6. Badania na pacjentach wykazały, że zaburzenia mikrobioty jelitowej są związane z otyłością u ludzi, zaburzeniami snu, depresją, nieswoistymi zapaleniami jelit (IBD), chorobami neurodegeneracyjnymi (choroba Parkinsona, Alzheimera), starzeniem się i różnymi nowotworami7,8,9. Co więcej, interaktywne szlaki między mikrobiotą jelitową a gospodarzami obejmują czynniki zapalne, neuroprzekaźniki, metabolity, barierę jelitową i stres oksydacyjny, jak zaobserwowano w poprzednich badaniach z wykorzystaniem modeli myszy i ryb10,11.

Ostatnio, wiele podejść lub terapii związanych z bakteriami, w tym potencjalne probiotyki i przeszczep mikrobioty kałowej (FMT), zostało zbadanych pod kątem tych zaburzeń w modelach klinicznych i zwierzęcych. Badania te opierają się na odkryciach związanych z osią mikrobiota-jelito-mózg/wątroba/nerki, produktami pochodzącymi z mikrobioty i zmienioną aktywnością receptorów12,13. Jednak rozwój, różne funkcje i mechanizmy systemu mikrobiota-gospodarz są nadal nie w pełni poznane i zidentyfikowane ze względu na złożoność społeczności mikrobiologicznej i wyzwanie związane z generowaniem potężnych modeli chorób podobnych do ludzkich.

Aby rozwiązać te problemy, w połowieXIX wieku pilnie zaproponowano modele zwierzęce wolne od zarazków (GF), które zostały opracowane głównie wXX wieku. Kolejne udoskonalenia, w tym modele poddane działaniu antybiotyków i gnotobiotyków, wraz z postępem w technologiach wykrywania i obserwacji drobnoustrojów, jeszcze bardziej udoskonaliły te modele14,15,16. Zwierzęta GF, stworzone przez wymazanie własnego tła i unikanie mikroorganizmów środowiskowych, oferują doskonałą strategię badania interakcji między mikroorganizmami a ich gospodarzami17. Dzięki zastosowaniu modeli zwierzęcych i udoskonalonych protokołów naukowcom udało się odtworzyć podobny skład mikrobiologiczny występujący u pacjentów myszy i ryb z GF. Ponadto inne modele zwierzęce GF, takie jak psy, kurczaki i świnie, zapewniają różnorodne opcje jako obiekty badań18,19,20,21. Podejście to umożliwiło badania nad potencjalnym wpływem terapeutycznym mikrobiomów komensalnych na różne choroby, w tym immunoterapię nowotworów u ludzi16,18. Modele GF oferują dokładniejszy wgląd w charakterystykę i mechanizmy kolonizacji, migracji, namnażania i interakcji określonych bakterii w obrębie gospodarzy. Dostarcza to nowych, kluczowych informacji na temat występowania i rozwoju chorób związanych z mikrobiotą22,23. Historia tworzenia i stosowania danio pręgowanego GF w badaniach mikrobiologicznych ewoluowała od raportów Rawlsa i in. w 2004 r. oraz Batesa i in. w 2006 r. do protokołu Melancon i in. z 2017 r16,24,25. Jednak wykonalność modeli GF dla dorosłych lub hodowlanych jest nadal długotrwałym procesem, któremu towarzyszy zmienna długowieczność, wskaźniki sukcesu i wyzwania zdrowotne.

Wśród różnych modeli zwierzęcych, danio pręgowany (Danio rerio) wyróżnia się jako kluczowe narzędzie zarówno dla badań podstawowych, jak i biomedycznych ze względu na korzystne podobieństwo do ludzkich organów i genomiki, krótki cykl rozwojowy, wysoką płodność i przezroczyste zarodki19,26. Danio pręgowany, służąc jako wiarygodne modele chorób człowieka, oferują wizualną reprezentację procesów fizjologicznych i patologicznych in vivo, dostarczając wglądu w atrakcyjne cechy interakcji gospodarz-mikroorganizm. Warto zauważyć, że danio pręgowany wykazuje odrębne linie komórkowe, co pozwala na obrazowanie fizjologii jelit, dynamiki drobnoustrojów, gonad i rozwoju reprodukcyjnego, dojrzewania układu odpornościowego gospodarza, zachowania i metabolizmu27. Zarodki danio pręgowanego rozwijają się w ochronnych pasmówkach aż do wyklucia, przekształcając się w larwy po 3 dniach od zapłodnienia (dpf). Aktywnie polują na pokarm w ilości 5 dpf i osiągają dojrzałość płciową około 3 miesiące po zapłodnieniu (mpf)28. Pierwszy udany wolny od zarazków (GF) grygowany, opisany przez Rawls et al.24, wykazał, że larwy karmione autoklawizowaną paszą po wchłonięciu żółtka wykazywały nekrozę tkanek od 8 dpf i całkowitą śmierć po 20 dpf. Wskazywało to na wpływ diety lub znaczenie uwzględnienia egzogennego zaopatrzenia w składniki odżywcze w eksperymentach z udziałem długoterminowego (>7 dpf) GF fish29. Kolejne badania udoskonaliły protokół generowania ryb GF, wykorzystując sterylny pokarm i metody udoskonalone w różnych modelach ryb16.

Jednak większość badań nad modelami zebry GF skupiała się na wczesnych etapach życia, obejmujących infekcję bakteryjną przy 5 dpf przez 24 godziny do 48 godzin, z próbkami pobranymi przed 7 dpf na zakończenie eksperymentów25,30,31. Powszechnie wiadomo, że mikrobiota organizmów, w tym ludzi i danio pręgowanego, jest kolonizowana na początku życia i kształtowana podczas wzrostu i rozwoju. Skład pozostaje stabilny w dojrzałych stadiach, a rola mikrobioty w organizmie gospodarza jest kluczowa przez całe życie, zwłaszcza w aspektach związanych ze starzeniem się, neurodegeneracją, otyłością metaboliczną i chorobami jelit3. W związku z tym perspektywy zwierząt GF o dłuższej przeżywalności mogą dostarczyć informacji na temat mechanizmów ról drobnoustrojów w rozwoju i funkcjach narządów gospodarza, biorąc pod uwagę niedojrzały układ odpornościowy i rozrodczy larw ryb we wczesnym okresie życia. Podczas gdy szczepy bakteryjne w jelitach danio pręgowanego zostały wyizolowane i zidentyfikowane w poprzednich badaniach, oferując możliwość infekowania modeli zwierzęcych GF w celu wyboru probiotyków lub badania funkcji bakteryjnych w host19,25, tworzenie i stosowanie modeli ryb GF było przede wszystkim ograniczone do wczesnych etapów życia. To ograniczenie, przypisywane złożonemu procesowi produkcji, wysokim kosztom utrzymania i związanym z tym problemom z żywnością i odpornością, utrudnia wysiłki badawcze mające na celu zbadanie rozwojowych i przewlekłych skutków mikrobioty u gospodarza.

Na przeżywalność, zachowanie, wzrost, dojrzewanie i ogólny stan zdrowia ryb, szczególnie w modelach wolnych od zarazków (GF), znaczący wpływ mają praktyki żywieniowe, obejmujące przyjmowanie i wchłanianie składników odżywczych w okresie otwartym od wczesnych larw do osobników młodocianych32,33. Jednak jednym z wyzwań w hodowli ryb GF jest niedobór odpowiedniej, sterylnej diety, co ogranicza skuteczność wsparcia żywieniowego dla podtrzymania wzrostu i przetrwania larw. Rozwiązanie tego problemu ma kluczowe znaczenie dla przywrócenia życia ryb GF, biorąc pod uwagę ich rozwojowe mechanizmy obronne i słabe zdolności trawienne z powodu braku mikrobiomu jelitowego. Jeśli chodzi o pokarm, żywe krewetki solankowe (Artemia sp.) jawią się jako najbardziej odpowiednia dieta dla larw z otwartymi ustami dla młodych ryb. Zaobserwowano, że ryby karmione żywymi krewetkami solankowymi wykazują wyższe wskaźniki wzrostu i przeżywalności w porównaniu z rybami karmionymi gotowanym żółtkiem jaja lub innymi naturalnymi i syntetycznymi przynętami34. Podczas gdy modele wczesnego życia ryb GF mogą przetrwać dzięki wsparciu żółtka, a modele larw GF mogą być utrzymywane dzięki sterylnemu karmieniu, tworzenie długoterminowych modeli od larw do osobników młodocianych i osiągnięcie dojrzałości płciowej pozostaje wyzwaniem. Ponadto żywność w płatkach lub w proszku jest ograniczona przez nierówny skład odżywczy i może wpływać na jakość wody. W przeciwieństwie do tego, żywa artemia ma takie zalety, jak przetrwanie zarówno w słonej, jak i słodkiej wodzie, mały rozmiar odpowiedni dla larw i dorosłych, łatwość grupowania i wyższa jakość wylęgu35. Opierając się na poprzednich metodach16,24,30, uprościliśmy złożony proces leczenia i rozwiązaliśmy problem diety, ustanawiając łatwą do inkubacji żywą odmianę GF Artemia sp. jako sterylny pokarm przez dłuższy czas niż ryby GF we wczesnym okresie życia.

To badanie przedstawia zoptymalizowany protokół obejmujący (1) generację, (2) utrzymanie, (3) identyfikację wskaźnika sterylności, oraz (4) utrzymanie i karmienie, aby zapewnić wzrost wolnego od zarazków (GF) danio pręgowanego od zarodków do larw i stadiów młodocianych. Wyniki dostarczają wstępnych dowodów na wylęg, przeżywalność, wzrost i bezpłodność danio pręgowanego GF, wraz z podstawowymi wskaźnikami dla GF Artemia sp. jako sterylnego pokarmu. Szczegółowe etapy generowania modeli i przygotowywania sterylnej żywej żywności zapewniają kluczowe wsparcie techniczne w konstruowaniu i stosowaniu długoterminowych modeli ryb GF, a także GF Artemia sp. w badaniach interakcji mikrobiota-gospodarz. Protokół dotyczy izolacji, identyfikacji i infekcji bakterii na modelach ryb GF, przedstawiając metody znakowania fluorescencji bakterii i obserwując ich kolonizację w jelitach ryb pod mikroskopem. Ryby GF, ryby gnotobiotyczne z infekcją bakteryjną lub przeniesione modele mikrobioty ludzkiej będą poddawane różnym detekcjom w celu wyjaśnienia ich funkcji i wpływu na odporność gospodarza, trawienie, zachowanie, regulację transkryptomiczną i aspekty metaboliczne. W dłuższej perspektywie protokół ten może zostać rozszerzony na różne gatunki ryb typu dzikiego, takie jak medaka morska, a potencjalnie na inne wybrane transgeniczne linie danio pręgowanego skorelowane z określonymi tkankami lub chorobami.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty z rybami zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania w Chongqing oraz Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Chongqing w Chinach, a także standardami dla zwierząt doświadczalnych wydanymi przez Państwowe Biuro Jakości i Nadzoru Technicznego (ID Zgody: GB14922-2001 do GBT14927-2001). Danio pręgowany (Danio rerio, typ dziki, szczep AB) pochodziły z Instytutu Hydrobiologii Chińskiej Akademii Nauk i były utrzymywane w laboratorium zgodnie z wcześniej opisanymi procedurami36.

1. Utrzymanie dorosłych ryb danio pręgowanego i zbieranie zarodków

UWAGA: Opierając się na modyfikacjach z poprzednich badań i raportów16,37,38,39, utrzymanie dorosłych ryb pręgowanych, hodowla larw i praktyki dla modeli wolnych od zarazków (GF) w naszym laboratorium zostały przeprowadzone zgodnie z krokami opisanymi poniżej. System ultra-czystego przepływu do hodowli ryb został uzyskany komercyjnie (patrz tabela materiałów). Woda, utrzymywana o zrównoważonym pH, soli i zasadach, jest poddawana filtracji podczas jazdy na rowerze, aby zapewnić czyste warunki.

  1. Dorosłe ryby należy utrzymywać zgodnie z następującą standardową procedurą w systemie automatycznego cyklu (patrz Tabela materiałów) z fotoperiodem ciemności: światło = 10 godzin: 14 godzin w temperaturze 28 °C ± 0,5 °C i karmione świeżo inkubowaną Artemia sp. dwa razy dziennie.
  2. Umieść dojrzałego płciowo dorosłego danio pręgowanego (samiec: samica = 2:1) w zbiornikach ze świeżą i czystą wodą poprzedniej nocy.
  3. Pozwól rybie złożyć ikrę następnego ranka (około 8:30 rano) pod regularną stymulacją światłem w laboratorium. Po 1-2 godzinach przenieś rybę do innego zbiornika.
  4. Zebrać zarodki do wody z systemu automatycznego cyklu jako pożywkę hodowlaną w naczyniu hodowlanym za pomocą jednorazowej pipety Pasteura.

2. Pokolenie zebry GF od zarodków do larw

UWAGA: Procedura generowania ryb wolnych od zarazków (GF) jest opisana w Rysunek 1, podczas gdy podstawowe wskaźniki rozwojowe modeli konwencjonalnych (CR) i GF są przedstawione na Rysunku Uzupełniającym 1. Postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej w laboratoryjnej szafie bezpieczeństwa biologicznego lub okapie z przepływem laminarnym, stosując sterylną technikę aseptyczną w pomieszczeniu czystym.

  1. Umyj zarodki za pomocą wody z kultur ryb i usuń kał, zanieczyszczenia oraz martwe lub niezapłodnione jaja.
  2. Przenieś zarodki w temperaturze 2 hpf na wysterylizowane płytki (do 480 zarodków na sterylne naczynie o średnicy 10 cm) wypełnione roztworem pożywki danio pręgowanego wolnego od zarazków antybiotyku (AB-GZM, patrz tabela materiałów) i posiewu w temperaturze 28,5 °C przez 6-8 godzin
    UWAGA: AB-GZM stosuje się do leczenia zarodków przez kilka godzin w celu wyeliminowania mikroorganizmów powierzchniowych, a GZM bez antybiotyków stosuje się do hodowli ryb GF w podsekwencji. Zwykle doskonały czas hodowli wynosi 6 godzin).
  3. Wyklucz jaja z białymi plamami lub białawym wyglądem i wybierz te, które są normalnie rozwinięte, wyświetlając przezroczyste i nienaruszone koperty do dalszego przetwarzania.
  4. Opłucz zarodki za pomocą AB-GZM trzy razy w ciągu 10 minut.
  5. Moczyć zarodki w 0,2 g/l roztworu jodu powidonu (PVP-I) przez 1 minutę (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Wyższe stężenie i dłużej niż 2 minuty wpłynie na śmiertelność i wylęg zarodków.
  6. Umyj zarodki za pomocą wolnego od zarazków podłoża danio pręgowanego (GZM) trzy razy w ciągu 10 minut.
  7. Dodaj zarodki do roztworu roboczego podchlorynu sodu (NaClO), szczelnie przykryj probówki do mikrowirówek o pojemności 50 ml i wybielaj przez 15 minut. W tym okresie zawieś zarodki w roztworze wybielacza, delikatnie je potrząsając.
  8. Umyj zarodki za pomocą GZM trzy razy w ciągu 10 minut.
  9. Przenieść zarodki na sterylne 6-dołkowe płytki z 5 zarodkami i 10 ml GZM na dołek. Hoduj je na ultra czystej platformie lub inkubatorze z fotoperiodem ciemności: światło = 10 godzin: 14 godzin w temperaturze 28 °C ± 0,5 °C. Gęstość kultury będzie miała wpływ na szybkość sterylności.
  10. Codziennie odnawiaj pożywkę hodowlaną, usuwając zużyte GZM, zbierając je jako próbki do wykrywania stanu sterylnego i uzupełniając każdą studzienkę tą samą objętością sterylnego GZM.
  11. Zapisz podstawowe wskaźniki rozwoju zarodków/larw GF, w tym wskaźnik przeżywalności, wskaźnik wylęgu, bicie serca, długość i wagę ciała itp19.
  12. Przenieść rybę GF do odpowiednich pojemników (szalek, kolb do hodowli komórkowych lub szklanych butelek z pokrywkami) o zwiększonej objętości, zapewniając sterylny pokarm przez cały proces wzrostu.

3. Utrzymanie zebry GF od larwy do młodego

  1. Odnów GZM bez karmienia przed 7 dpf i codziennie wykrywaj stany sterylne (patrz krok 5).
  2. Larwy danio pręgowanego od 8 dpf do stadiów młodocianych należy karmić sterylnym żółtkiem jaja (10 μl przygotowanego roztworu podstawowego na studzienkę) raz dziennie przed zmianą GZM.
  3. Młodociane osobniki GF od 14 dpf karmić wysterylizowanym żółtkiem jaja zmieszanym z GF Artemia sp. raz dziennie (1-3 artemia/larwy, patrz krok 4), stopniowo zwiększając masę pokarmu wraz ze wzrostem i rozwojem ryb GF.
  4. Zapewnij żółtko jaja do momentu, gdy wszystkie ryby będą mogły spożyć Artemia nauplii.
    UWAGA: GF Artemia powinna zostać poddana testom sterylności przed użyciem. Oceń liczbę pozostałych naupliusów artemii, obserwuj postępy w pościgu i chwytaniu oraz zbadaj ciało ryby ze spożytym pokarmem, aby wskazać sukces karmienia.
  5. Od 28 dpf do wczesnych stadiów dorosłych, karmić GF Artemia raz dziennie (3-5 Artemia/larwy) i oczyszczać niewykorzystane lub martwe Artemia i martwe ryby do odpadu GZM jako codzienne próbki.
  6. Podczas wzrostu ryb GF należy zmienić płytki 6-dołkowe po 7 dpf na sterylne płytki lub kolby do hodowli komórkowych z 8 na 21 dpf, a następnie na sterylne butelki po 21 dpf. Zwiększ pożywkę hodowlaną i masę pokarmu zgodnie z liczbą i wagą ryb GF w każdym pojemniku.
  7. Codziennie odnawiaj GZM i sprawdzaj próbki, aby upewnić się, że modele GF odniosły sukces.
    UWAGA: Utrzymanie modeli ryb wolnych od zarazków (GF) do wczesnej dorosłości i dojrzałości płciowej jest wyzwaniem, przy niskim średnim wskaźniku przeżywalności na poziomie 30 dpf, zwykle poniżej 10%. Przypisuje się to przede wszystkim słabej odporności, opóźnionemu rozwojowi i upośledzonej funkcji jelit.

4. Przygotowanie nauplii GF Artemia jako sterylnego pokarmu dla chronicznych modeli ryb GF

UWAGA: Metoda uprawy i przygotowania artemii wolnej od zarazków (GF) jest opisana w Rysunek 2. Należy pamiętać, że wszystkie poniższe kroki są wykonywane w laboratoryjnej komorze bezpieczeństwa biologicznego, przy użyciu sterylnej techniki aseptycznej.

  1. Płukać 0,25 g torbieli artemii za pomocą 2,4 g/l podchlorynu sodu (NaClO, patrz tabela materiałów) przez 5 minut.
  2. Przefiltruj wypłukane torbiele artemii wysterylizowanym ultragęstym filtrem (około 170 oczek w otworze) i umyj wysterylizowaną ultraczystą wodą trzy razy, za każdym razem przez 1-2 minuty.
  3. Przenieś umyte cysty artemii do 100 ml 2,5% wysterylizowanej wody z soli fizjologicznej, wymieszaj i zapakuj do aseptycznego wylęgu zgodnie z krokami wymienionymi poniżej.
  4. Roztwór mieszaniny cyst artemii poddanych działaniu artemii o objętości 50 ml należy zapakować do sterylnej butelki o objętości 100 ml, zamknąć folią i inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem przy 150 obr./min, w temperaturze 30 °C przez 18 godzin do 24 godzin ze światłem.
  5. Wyekstrahuj około 30 ml nauplii wylęgowej artemii ze środkowej i dolnej warstwy za pomocą jednorazowej pipety Pasteura.
    UWAGA: Zapobiegaj przedostawaniu się pływających jaj i pustych skorupek do górnej warstwy. Wskaźniki wolnych od zarazków (GF) torbieli artemii i nauplii inkubowanych przez 24 godziny przedstawiono w Rysunek 3.
  6. Przefiltruj artemię filtrem sterylizującym i umyj je w zlewce sterylizującej ze sterylizującą ultraczystą wodą trzy razy, za każdym razem około 30 s do 1 minuty. Na koniec dodaj 4 ml wysterylizowanej ultraczystej wody, aby przygotować mieszany roztwór Artemia.
  7. Za pomocą jednorazowej pipety Pasteura wydobądź aktywnie pływającą artemię z górnej warstwy, umyj i przygotuj roztwór nauplii do karmienia i aseptycznej identyfikacji.

5. Identyfikacja modeli ryb GF na wszystkich etapach życia

UWAGA: Przez cały okres życia ryb wolnych od zarazków (GF), kluczowe wskaźniki i codzienne wykrywanie próbek są kluczowe dla zapewnienia sukcesu modeli. Ten krok podsumowuje powszechną klasyfikację próbek i zwykłe metody identyfikacji (Rysunek 4).

  1. Codziennie obserwuj i licz stan przeżywalności i wskaźnik larw danio pręgowanego GF. W eksperymentach obliczających powiązane dawki, ryby GF są hodowane na 24- lub 48-dołkowych płytkach z jedną rybą na studzienkę.
    1. Wskaźnik przeżywalności = (liczba żywych ryb w momencie obserwacji / całkowita liczba jaj) × 100%.
    2. Wskaźnik sterylności = (liczba sterylnych ryb/liczba ryb, które przeżyły) × 100%.
      UWAGA: Protokół ten koncentruje się na sterylnym wskaźniku żywych ryb. Liczbę bezpłodnych ryb określa się poprzez zliczenie ryb z udanym GF po wielokrotnych kontrolach wśród żywych ryb. Wszelkie martwe ryby lub modele GF żywych ryb, które zawiodły z powodu obecności bakterii, są eliminowane podczas kolejnych procedur GF.
  2. Pobrać następujące próbki larw danio pręgowanego GF.
    1. Pożywka hodowlana zebryka GF z każdej studzienki lub pojemnika na butelkę.
    2. Pokarm dla ryb, taki jak sterylne żółtko jaja i GF Artemia.
    3. Pożywka odpadowa, w tym fragmenty błony jajowej po wykluciu oraz resztki pokarmowe lub kał w okresach żerowania od larw do młodych ryb.
    4. Próbki martwych ryb w celu identyfikacji obecności bakterii.
    5. Pożywka rybna i środki stosowane w leczeniu zarodków jako kontrola sterylna.
    6. Próbki z materiałów, platformy operacyjnej, inkubatora itp.
  3. Wykrywaj próbki pobierane codziennie przy użyciu wielu metod.
    1. Najpierw należy zastosować metodę płytki do rozsiewania i płytek hodowlanych w inkubatorze w temperaturze 30 °C.
      1. Pokryć 20-50 μl próbki pożywki odpadowej na płytce z agarem sojowym z tryptikazą (TSA) (patrz tabela materiałów) w warunkach tlenowych.
      2. Pokryć 20-50 μl próbki pożywki odpadowej na płytce TSA w warunkach beztlenowych.
      3. Pokryć 20-50 μl próbki pożywki odpadowej na płytkach TSA z krwią (patrz tabela materiałów) w warunkach tlenowych.
      4. Pokryć 20-50 μl próbki pożywki odpadowej na płytkach TSA krwi w warunkach beztlenowych.
    2. Po drugie, użyj metody hodowli płynnej.
      1. Pobrać 200 μl próbki do probówek tlenowych z pożywką z bulionu do infuzji mózgowo-sercowej (BHI) (patrz tabela materiałów) i wyhodować w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C, 150-180 obr./min.
      2. Dodać 200 μl próbki do probówek beztlenowych z pożywką BHI i wyhodować w inkubatorze w temperaturze 30 °C.
      3. Dodać 200 μl próbki do probówek tlenowych z pożywką z bulionu sojowego z tryptikazy (TSB), a następnie wyhodować w inkubatorze do wytrząsania w temperaturze 30 °C, 150-180 obr./min.
      4. Dodać 200 μl próbki do probówek beztlenowych z pożywką TSB i wyhodować w inkubatorze w temperaturze 30 °C.
    3. Po trzecie, użyj techniki molekularnej-16s test reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).
      1. Analizę próbki ścieków za pomocą dwóch par starterów 27F i 1492R oraz 63F i 1387R (tabela 1).
        UWAGA: Główną mieszaninę PCR przygotowano zgodnie z Tabelą 2 przy użyciu dostępnego na rynku zestawu do polimerazy DNA (patrz Tabela materiałów), a maszynę do PCR skonfigurowano z programem określonym w Tabeli 3.
      2. Po zakończeniu programu PCR zbadaj produkty za pomocą 1% elektroforezy w żelu agarozowym40 w docelowych pasmach 1465 pz (przy użyciu starterów 27F i 1492R) lub 1324 pz (przy użyciu starterów 63F i 1387R), aby wywnioskować sterylność próbek.
  4. Rejestruj i obserwuj testy sterylności, w tym posiewy na płytkach i pożywkach od 24 godzin do 3 dni i 7 dni, podczas których brak kolonii na płytkach i brak zmętnienia w cieczy wskazują na udaną konstrukcję modeli GF. Obserwuj i zapisuj płytkę i podłoże po 24 godzinach, 48 godzinach, 72 godzinach, 96 godzinach, 120 godzinach, 144 godzinach i 168 godzinach.

6. Identyfikacja próbek GF Artemia przed żerowaniem na rybach GF

UWAGA: Aby wykryć próbki GF Artemia, które są niezbędne jako żywy pokarm przed żerowaniem na rybach GF (Rysunek 4), wykonaj poniższe kroki.

  1. Zbierz próbki modeli GF Artemia.
    1. Nieleczone torbiele artemii.
    2. Leczone torbiele artemii GF.
    3. Wyklute nauplii artemii GF.
    4. Sterylizowana ultraczysta woda jako kontrola.
  2. Wykryj GF Artemia za pomocą następujących metod.
    1. Metodę płytki rozprowadzającej służy do wykrywania próbek poprzez powlekanie ich płytkami TSA i płytkami TSA z krwią w warunkach tlenowych i beztlenowych. Inkubować je w temperaturze 30 °C.
    2. Użyj ciekłego podłoża do wykrywania próbek w tlenowych i beztlenowych probówkach TSB i BHI. Hodowla w wytrząsarce przy 150-180 obr./min, 30 °C.
    3. Użyj testu PCR, aby wykryć obecność bakterii w próbkach pobranych przy użyciu 16s rybosomalnych genów docelowych RNA, starterów 27F i 1492R, 63F i 1387R (Tabela 1). Objętość i program przedstawiono w Tabeli 2 i Tabeli 3.
  3. Zapisz wyniki: Wykryj produkt PCR za pomocą 1% elektroforezy w żelu agarozowym40 dla pasm docelowych o wartości 1465 pz (przy użyciu starterów 27F i 1492R) lub 1324 pz (przy użyciu starterów 63F i 1387R). Wyniki badań na płytkach i płynnym podłożu mogą zapewnić sterylny stan GF Artemia przed użyciem jako pokarm dla ryb GF.

7. Izolacja i identyfikacja szczepów bakterii jelitowych od danio pręgowanego

UWAGA: Aby zbadać funkcje jelit in vitro i in vivo, konieczne jest wyizolowanie szczepów bakteryjnych od danio pręgowanego, które również stanowią źródło gatunku dla potencjalnych probiotyków przesiewanych przez infekcję przy użyciu zwierząt GF (Rysunek 5). W tym protokole opisujemy tradycyjną metodę preparacji w celu uzyskania treści jelitowej, przy czym próbki można również pobrać bezpośrednio z żywych znieczulonych ryb (dane nie pokazane).

  1. Wybierz zdrowego dorosłego danio pręgowanego i umyj go sterylną wodą. Wykonaj następujące czynności na czystej ławce.
  2. Znieczulać ryby 100 mg/l MS-222 przez 5-10 minut.
  3. Użyj 75% alkoholu do leczenia powierzchni ciała ryby.
  4. Wyciąć jelita ryb i wytłoczyć zawartość jelitową za pomocą pożywki TSB lub BHI.
  5. Inkubować supernatant jelitowy, stosując TSA, płytkę krwi, TSB i pożywkę BHI w warunkach tlenowych i beztlenowych.
  6. Przetłumacz bakterie, aby uzyskać szczep sygnałowy i zarejestrować charakterystykę różnych kolonii.
  7. Przechowywać bakterie w 30% glicerolu w temperaturze -80 °C.
  8. Następnie zidentyfikuj bakterie jelitowe poprzez ekstrakcję genomowego DNA i sekwencjonowanie PCR.
    UWAGA: Główne etapy ekstrakcji genomowego DNA bakteryjnego obejmują odwirowanie cieczy, dysocjację RNazy A i proteazy K, ekstrakcję alkoholem etylowym, płukanie i rozpuszczanie przy użyciu dostępnych na rynku zestawów zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
  9. Analizuj sekwencje 16S za pomocą National Center for Biotechnology Information (NCBI) i Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) z bazą danych Bacteria and Archaea40,41(patrz Tabela materiałów).
  10. Wybierz najlepiej dopasowane bakterie i postacie, aby zidentyfikować izolowane szczepy jelitowe na poziomie rodzaju.
  11. Wykrywanie funkcji metabolicznych szczepów bakteryjnych za pomocą dostępnych na rynku zestawów (patrz tabela materiałów).

8. Etykietowanie grypy, infekcja i kolonizacja bakterii w jelitach zebry GF

UWAGA: Przed zakażeniem zebry GF, wyizolowane bakterie zostały zmodyfikowane barwnikami i policzone, dzięki czemu kolonizacja i migracja mikroorganizmów stała się widoczna w sposób ciągły i in vivo (Rysunek 6).

  1. Wybierz potencjalne pożyteczne bakterie lub dominujące szczepy o dużej liczebności w żywicielu, aby zainfekować modele ryb GF.
    UWAGA: Bakterie użyte w tym badaniu to Aeromonas sp. i Vibrio sp. (patrz Tabela Materiałów), wybrane z 8 rodzajów, które zostały wyizolowane i zidentyfikowane z dorosłego danio pręgowanego typu dzikiego w laboratorium42.
  2. Oznacz świeże bakterie barwnikami CM-Dil (patrz Tabela materiałów) i wystaw je na działanie zebry GF w stężeniu 5 dpf o stężeniu 10 6-108 jednostek tworzących kolonie (CFU)/ml.
  3. Obserwuj fluorescencję pod mikroskopem fluorescencyjnym w powiększeniu 3×, aby wskazać kolonizację i rozmieszczenie bakterii w jelicie larw zebry GF od 6 dpf i 14 dpf.
  4. Ręcznie policz liczbę bakterii w rybach GF za pomocą kultury płytkowej w każdym punkcie czasowym.
  5. Wykryj kolonie i sekwencje, aby upewnić się, że infekcja zakończyła się sukcesem z docelowymi szczepami bakteryjnymi.
  6. Zbierz próbki ryb GF z infekcją bakteryjną do kolejnych testów, w tym neurobehawioralnych, wskaźników rozwojowych, analizy histopatologicznej i pomiarów hormonów itp43,44,45.
    UWAGA: Bakterie użyte w eksperymencie z infekcją powinny być świeżo odzyskane i świeżo wyhodowane w płynnym pożywce.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele drobnego z GF mogą być efektywnie produkowane, wykorzystując obfite jaja ikrowane przez pary danio pręgowanego, z protokołem zoptymalizowanym na podstawie poprzednich modeli ryb GF35. Pojedyncza 6-dołkowa płytka może wyhodować około 30-48 zarodków/larw, co pozwala na gromadzenie obszernych danych i analizę statystyczną. Po sterylnym traktowaniu zarodki GF są hodowane w czystym inkubatorze aż do wyklucia się do larw po 48-72 godzinach i codziennie zmieniane GZM z wykrywaniem pobranych próbek, co ma kluczowe znaczenie dla utrzymania stanu wolnego od zarazków (Rysunek 1). Po 7 dpf należy przygotować pokarm z żółtka jaja i żywej artemii dla larw do stadiów młodocianych. Podczas wzrostu i rozwoju ryb objętość, pojemnik i gęstość GZM powinny być regulowane lub zmieniane w czasie, aby uniknąć śmierci i braku stanu sterylnego. Jeśli wykrycie nie wykaże zanieczyszczenia bakteryjnego, udane modele GF mogą być utrzymywane jako modele przewlekłe od młodości do wczesnej dorosłości, ale w praktyce wskaźnik przeżycia jest znacznie niższy. Wreszcie, wskaźnik sterylności, wskaźnik przeżycia, wskaźnik rozwoju, zachowanie, analiza histopatologiczna i profil transkrypcji modeli ryb GF i CR mogą być mierzone w celu zbadania wpływu mikrobioty i pól przesiewowych leków. W tym badaniu porównano kluczowe wskaźniki rozwojowe (rysunek uzupełniający 1), a wskaźnik wylęgu ryb GF był o 45,7% niższy niż ryb CR, z 60% przy 72 hpf. Częstość akcji serca larw GF przy 7 dpf była znacznie niższa przy 18,2 uderzeniach/10 s w porównaniu z rybami CR przy 22,6 uderzeniach/10 s, ale nie było różnicy między obiema grupami przy 14 dpf przy częstości 23,5-23,8 uderzeń/10 s. Wskaźnik przeżywalności ryb GF przy 7 dpf był taki sam jak dla ryb CR i wynosił 86,7%, ale spadł do 60% przy 14 dpf w porównaniu z 80% dla ryb CR. Jednak wskaźniki przeżywalności zarówno ryb GF, jak i CR spadły do 25%-10% po okresie otwierania ust, kiedy nabyły zdolności lub nawyki żywieniowe. Nieutrzymanie sterylnego statusu ryb było jedną z przyczyn niższego wskaźnika przeżywalności. Dlatego karmienie i utrzymywanie składników odżywczych od etapu młodocianego do wczesnej dorosłości jest krytycznym wyzwaniem w hodowli ryb.

Kolejnym kluczowym czynnikiem wpływającym na wzrost i rozwój ryb jest karmienie. W tym badaniu badamy wiele metod pozyskiwania artemii GF jako żywego pokarmu dla długoterminowych larw drobnego danio pręgowanego GF do osobników młodocianych i dorosłych (proces pokazany w Rysunek 2). Ze względu na codzienne stosowanie pokarmu dla ryb GF, zoptymalizowany protokół dla GF Artemia powinien być łatwy, oszczędzający czas i ekonomiczny w praktyce. Po porównaniu aktywnego ruchu i śmierci/bezruchu naupliów obserwowanych przez mikroskop, charakterystyki naupliusów, niewyklutych jaj i skorupy, metoda jest udoskonalona. Po codziennej inkubacji wskaźniki świeżej GF Artemia uzyskanej z butelek, w tym wylęg, przeżywalność i wskaźnik deformacji oraz długość i masę nauplii, obserwowano i mierzono pod mikroskopem (Ryc. 3). Po leczeniu wskaźnik wylęgu torbieli artemii był wysoki, średnio 88,15%, przeżywalność naupliów pływackich wynosiła 77,83%, a wskaźnik wad rozwojowych wynosił 1,87%. Długość ciała naupliów wynosiła 546,70 μm, a wskaźnik masy ciała 3,80 mg/100, które nadają się do połowu i karmienia ryb od larw w okresie miesięcznym do stadiów młodocianych i dorosłych.

Wykrywanie ryb GF i artemii GF jest również ważne dla utrzymania modelu. Zgodnie z pobraniem próbek i wieloma metodami testowymi, wyniki mogą zapewnić sukces leczonych zarodków danio pręgowanego i torbieli artemii na płytce hodowlanej i płynnym podłożu (Rysunek 4). Różne próbki pobierane codziennie powinny być wykrywane jako sterylne we wszystkich metodach badawczych, które mogą następnie wskazywać modele GF w momencie pobierania. Artemia GF powinna być wykrywana przed karmieniem ryb GF lub wyniki inkubatora na płytce i pożywce powinny odnosić się do stanu sterylnego świeżych, żywych nauplii. Oznacza to, że hoduj GF Artemia z cyst na płytkach TSA lub płynnym szkle TSB lub BHI w inkubacji wstrząsów, które można wykorzystać do jednoczesnego generowania GF Artemia i sterylnej weryfikacji. Protokół GF Artemia może pomieścić ograniczoną liczbę larw do żerowania. Podczas procesu karmienia było oczywiste, że artemia GF pływała w obrębie GZM, a następnie została schwytana i skonsumowana przez larwy ryb GF.

Zastosowania modeli ryb GF obejmują różne dziedziny biologii i medycyny, umożliwiając między innymi badanie funkcji mikroorganizmów, wzrostu i rozwoju, mechanizmów chorobowych oraz badań przesiewowych probiotyków lub leków46. W tym badaniu, na przykład, dwie główne bakterie jelitowe, Aeromonas sp. i Vibrio sp., zostały wyizolowane z danio pręgowanego. Przeprowadzono charakterystykę i identyfikację kolonii, a także zmierzono wiele funkcji metabolicznych in vitro przy użyciu dostępnych na rynku zestawów (Ryc. 5). Bakterie te zostały wyizolowane i zidentyfikowane za pomocą sekwencjonowania 16S, a wyniki wybuchu zostały przedstawione w poprzednim raporcie42. Zidentyfikowane szczepy bakterii umożliwiają prowadzenie badań naukowych nad wpływem pojedynczej lub złożonej mikrobioty na zdrowie gospodarza poprzez zakażenie modeli ryb GF. Przezroczystość larw ryb pozwala na obserwację komórek bakteryjnych znakowanych fluorescencyjnie za pomocą barwników CM-Dil, ujawniając kolonizację i dystrybucję w jelitach ryb GF (pokazane na Ryc. 6). Po zakażeniu bakteryjnym przy 5 dpf, larwy danio pręgowanego GF mogą być obrazowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i stale obserwowane od 6 do 14 dpf, dostarczając wglądu w funkcje mikrobiologiczne w połączeniu ze wskaźnikami rozwojowymi, zmianami histopatologicznymi i zmianami molekularnymi47.

figure-results-1
Rysunek 1: Protokół GF danio pręgowanego od zarodków do larw i osobników młodocianych. Kluczowe etapy w tworzeniu zebry GF obejmują: (1) Pobranie zarodków od danio pręgowanego typu dzikiego i umieszczenie w AB-GZM. (2) Płukanie środkami PVP-I i NaClO, aby zapewnić całkowitą sterylność. (3) Hodowla zarodków/larw GF na płytkach 6-dołkowych z GZM, codzienne odnawianie podłoża. (4) Regulacja warunków hodowli dla optymalnego wzrostu i rozwoju. (5) Pobieranie próbek na różnych etapach rozwoju, a następnie badanie sterylności przy użyciu metod płytki i płynnego podłoża. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Protokół przygotowania GF Artemia jako żywego pokarmu dla ryb GF. Kluczowe kroki obejmują: (1) Płukanie torbieli artemii w celu uzyskania całkowitej sterylności. (2) Przygotowanie torbieli GF w pożywce. (3) Inkubacja w roztworze soli przez 24 godziny w celu ułatwienia wylęgu. (4) Filtracja nieudanych wylęgów i pustych jaj w celu zebrania aktywnych naupliusów. (5) Mycie zebranych naupliów w celu usunięcia zanieczyszczeń, zapewniając wysokiej jakości i wolną od zanieczyszczeń żywą żywność. (6) Badanie sterylności artemii GF przed karmieniem larw ryb GF. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Wskaźniki torbieli i naupliów GF Artemia inkubowane przez 24 godziny. (A) Nieleczone torbiele artemii z filmem zanieczyszczeń (pasek skali: 500 μm). (B) Poddane działaniu artemii torbiele o lekko wypukłej powierzchni po wchłonięciu przez wodę i czystszym wyglądzie (pasek skali: 500 μm). (C) Badanie mikroskopowe świeżo inkubowanych żywych nauplii GF Artemia (skala paska: 2000 μm) oraz (D) powiększenie ze skalą 1000 μm. Kliknij tutaj aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Sterylne wykrywanie ryb GF na każdym etapie życia i GF Artemia. (A) Sterylne testy próbek ryb CR i GF przy użyciu płynnego podłoża TSB i BHI, TSA i płytek krwi w warunkach tlenowych i beztlenowych. (B) Sterylne testy nieleczonych torbieli artemii, torbieli artemii GF i naupliów przy użyciu płynnego podłoża TSB i BHI, TSA i płytek krwi w warunkach tlenowych i beztlenowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Izolacja i identyfikacja bakterii jelitowych u danio pręgowanego. (A) Szczepy bakterii, charakterystyka kolonii, mapy sekwencjonowania 16S (przykłady: Aeromonas sp. i Vibrio sp.). (B) Przystąpienie do rodzaju i NCBI. (C) Funkcje metaboliczne bakterii wyizolowanych z jelita danio pręgowanego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Infekcja i kolonizacja szczepów bakterii jelitowych u zebrygowanego GF. (A) Odzyskiwanie wyizolowanych i zidentyfikowanych szczepów bakteryjnych do eksperymentów z infekcjami. (B) Znakowanie bakterii barwnikami fluorescencyjnymi i zakażenie larw zebry GF przy 5 dpf. Powiększenie: 1x. (C) Obserwacja rozmieszczenia i kolonizacji bakterii (Vibrio sp.) w tkankach jelitowych in vivo. Powiększenie: 3x. (D) Liczenie CFU bakterii (Aeromonas sp. i Vibrio sp.) w każdej larwie ryby poprzez codzienne pobieranie próbek. Dane przedstawiają średnią ± SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

PodkładySekwencje (5'-3')Długość produktu
27FAGAGTTTGATCMTGGCTCAG1465 punktów bazowych
1492RACGGYTACCTTGTTACGACTT
63FCAGGCCTAACACATGCAAGTC powiedział:1324 punktów bazowych
1387RGGGCGGWGTGTACAGGC powiedział:

Tabela 1: Startery używane do wykrywania bakterii.

SkładnikiJednostekObjętość (μL)
Polimeraza DNA Taq2,5 U/μL0,1
10× Bufor (Mg2+)---2.1
Mieszanina dNTP2,5 mM1.6
Podkład 27F10 μM1
Podkład 1492R10 μM1
H2O wolne od DNA/RNA---Rozdział 13,2
Matrycowy DNA---1
Całkowita objętość---20

Tabela 2: Końcowe stężenie i objętość składników na reakcję.

kroktemperaturaGodzinaCykli
Początkowa denaturacja95 °CCzas trwania: 4 min--
denaturacja 94 °C1 min35
Wyżarzanie55 °C1 min
rozszerzenie72 °C1 min
Końcowe przedłużenie72 °CCzas trwania: 10 min--
trzymać4 °C∞--

Tabela 3: Program PCR do amplifikacji genu 16S rRNA.

Rysunek uzupełniający 1: Krytyczne wskaźniki rozwojowe modeli <[>grybo) i CR. (A) Wskaźnik wylęgu ryb zebry CR i GF przy 72 hpf, oraz (B) uderzenia serca/10 s ryb CR i GF przy 7 dpf i 14 dpf. Wskaźniki przeżywalności (%) ryb CR i GF zmniejszyły się z 7 dni i 14 dni przy 86%, 60%-80% do 10%-25% przy 30 dpf. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krytyczne kroki w protokołach przygotowywania ryb i żywności GF
Podczas tworzenia modeli ryb GF zaangażowano kilka krytycznych etapów, w tym przygotowanie sterylnych materiałów, sterylizację zarodków, codzienną odnawianie GZM, pobieranie różnych próbek i sterylne badanie każdej próbki przy użyciu wielu metod. Jednym z tych etapów jest wstępne leczenie zarodków, które ma fundamentalne i decydujące znaczenie dla powodzenia modeli GF. Czynniki kontrolne, ich stężenia i czasy leczenia mają kluczowe znaczenie dla osiągnięcia optymalnych wskaźników sterylizacji i powodzenia wylęgu. Podczas obchodzenia się z zarodkami ryb GF do larw należy zachować szczególną ostrożność, obejmując codzienną wymianę podłoża i upewnienie się, że materiały i platformy są dokładnie sterylizowane przy użyciu światła ultrafioletowego lub autoklawowania podczas wyjmowania płytek z inkubatora. Monitorowanie warunków temperaturowych i czasu pracy w okresie zimowym jest niezbędne, aby zapobiec śmierci larw spowodowanej niższymi temperaturami na czystych ławach.

Sterylne żółtko jaja i artemia GF powinny zostać wykryte przed podaniem rybom po 7 dpf, aby zapewnić ich sterylny stan dla długoterminowych modeli GF. W okresie karmienia oczyszczanie resztek jedzenia jest ważne jako część próbek pobieranych w celu wykrycia podczas odnawiania podłoża odpadowego. Pojemnik, objętość GZM i masa pokarmu powinny być dostosowane wraz z etapami wzrostu i rozwoju, aby zapobiec utracie ryb GF z powodu ograniczonego otoczenia i problemów z jakością wody. Regularne monitorowanie i dostosowywanie tych parametrów przyczynia się do pomyślnej konserwacji modeli ryb GF.

Modyfikacje i znaczenie tych protokołów
Uproszczony, trzyetapowy proces generowania zarodków danio pręgowanego GF, obejmujący zoptymalizowane czynniki, stężenia i czasy ekspozycji roztworów AB-GZM, PVP-I i NaClO, zapewnia wysoki wskaźnik sterylności i zdrowy rozwój modeli. Ponadto udoskonalono sterylne metody wykrywania próbek dziennych, aby obejmowały płytki i kultury płynnych pożywek w warunkach tlenowych i beztlenowych, a także techniki molekularne wykorzystujące popularne startery bakteryjne. Dalsze doświadczenia w testowaniu zanieczyszczeń bakteryjnych i grzybiczych mają na celu optymalizację zanieczyszczeń izolatorowych i sterylnych testów podczas technik GF na zwierzętach48.

Specyficzny protokół dla nauplii GF Artemia jako żywego pokarmu dla modeli ryb został zbadany w naszym badaniu, a patent został przyznany PPJ i DSP przez Chińską Narodową Administrację Własności Intelektualnej (nr 1. ZL202210482684.8). Długoterminowe modele ryb GF są konsekwentnie ograniczane przez nieodpowiednie i nieodpowiednie odżywianie, co pogłębia słabości funkcji jelitowych związanych z trawieniem i wchłanianiem. Jako wiarygodne źródło pożywienia dla modeli medaka i danio pręgowanego na różnych etapach życia, GF Artemia sp. powinna być łatwa do przygotowania dzięki prostej procedurze, krótkiemu czasowi inkubacji i sterylnemu wykrywaniu w czasie rzeczywistym do codziennego użytku. W tej metodzie normalne torbiele artemii są płukane w stężeniu NaClO wystarczającym do aseptyki, a następnie inkubowane w butelce pokrytej folią, a także na płytce i w płynnym podłożu w celu wykrycia. Obsługuje to świeżo wykluwające się nauplia do karmienia ryb GF. Wskaźnik sterylności i wskaźnik wylęgu artemii, a także długość ciała, waga i aktywność są doskonałe, co wskazuje na dostępne zastosowania w praktyce.

Znaczenie tych modyfikacji w protokołach żywieniowych dla ryb i GF przynosi korzyści naukowcom w tworzeniu modeli na zarodkach, larwach, stadiach młodocianych, a nawet we wczesnych stadiach dorosłych i dorosłych w modach morskich i słodkowodnych. Długoterminowe zwierzęta GF będą udzielać pozwolenia jako modele in vivo w badaniach nad badaniami przesiewowymi leków i funkcjami mikrobiologicznymi podczas wzrostu i rozwoju gospodarza, zwłaszcza w okresie dojrzałości odporności i powiązanych linii komórek jelitowych. Na przykład larwy danio pręgowanego posiadają odporność wrodzoną tylko w pierwszym tygodniu, a następnie rozwijają system odporności adaptacyjnej w ciągu 7-21 dpf, wraz z dojrzałością grasicy31,49. Co więcej, modele ryb GF mogą zapewnić możliwość analizy interakcji bakteria-bakteria i mikrobiota-gospodarz z obserwacją na żywo dynamicznych procesów kolonizacji i migracji w organizmach50,51.

Ograniczenia metody
Hodowla ryb GF od osobników młodocianych do wczesnych osobników dorosłych (28 dpf-2,5 mpf) i dojrzałych płciowo osobników dorosłych (>2,5 mpf) pozostaje wyzwaniem ze względu na zwiększoną śmiertelność i ryzyko skażenia bakteryjnego podczas konserwacji modelu. Ograniczenia te wynikają przede wszystkim z braku odpowiednich systemów autokultury dla ryb żyjących w środowisku GF. Systemy te powinny obejmować czyste powietrze, wodę i system żywnościowy, aby skutecznie utrzymać zwierzęta i ich środowisko, zapewniając całkowitą izolację od mikroorganizmów zewnętrznych. W przeciwieństwie do innych modeli zwierzęcych GF, takich jak myszy i kurczaki52, uzyskanie zebry GF poprzez operacje anatomiczne od rodziców CR jest trudne ze względu na ich nawyki wodne i naturalny styl nawożenia.

Traktowanie dorosłych zwierząt jako całkowicie pozbawionych mikrobioty jelitowej jest również wyzwaniem. Podczas gdy antybiotykoterapia może wywołać stan podobny do stanu wolnego od określonych patogenów (SPF), charakteryzujący się zmniejszoną mikrobiotą wykrywaną w próbkach kału, osiągnięcie prawdziwych modeli GF dorosłych ryb pozostaje trudne. Wyzwania związane z ustanowieniem i utrzymaniem modeli GF, zwłaszcza w okresie przechodzenia ze stanów młodocianych do długotrwałych, są znaczące. Uznaje się znaczenie potomstwa GF, takiego jak jaja GF F1 lub F2 od dorosłych ryb GF, w badaniach mikrobiologicznych. Jednak pokonanie wyzwań związanych z ustanowieniem i utrzymaniem długoterminowych modeli dorosłych ryb GF wymaga znacznego czasu.

Warto zauważyć, że opracowano gnotobiotycznego danio pręgowanego ze specyficzną kolonizacją bakteryjną, wykazującego przewlekłą przeżywalność w oparciu o modele GF. Niemniej jednak nie ma pewności, czy modele te mogą służyć jako realna alternatywa dla modeli GF w infekcjach bakteryjnych i badaniach biomedycznych.

Przyszłe zastosowania modeli ryb GF
W tym badaniu udoskonaliliśmy protokół generowania modeli danio pręgowanego GF, przechodząc od zarodków do osobników młodocianych. Postęp ten ma znaczące zastosowania w biologii rozwoju, immunologii, badaniach nad chorobami człowieka i organogenezie. Poprzez masową izolację i identyfikację, badanie bada funkcje, mechanizmy i metabolity pochodzenia jelitowego pojedynczych szczepów bakteryjnych. Badanie polega na zakażeniu modeli zebrykowatego GF po otwarciu otworu wentylacyjnego47,53. Dodatkowo znakowane bakterie z fluorescencją ułatwiają obserwację kolonizacji i dystrybucji w żywych larwach GF, wolnych od innych wpływów mikrobiologicznych54. Podobne modele ryb GF, takie jak medaka morska lub słodkowodniczna, mogą być tworzone przy użyciu porównywalnych metod z różnymi środkami lub zmianami podłoża.

Aby zbadać mechanizmy chorób u ludzi, w badaniu wykorzystano metody FMT, przenosząc próbki od pacjentów lub dawców do zdrowych zwierząt lub modeli GF55. W przeciwieństwie do zwierząt hodowanych konwencjonalnie (CR), modele GF dostarczają solidnych dowodów na funkcje mikrobiologiczne, wpływ lub reakcje gospodarza, szczególnie w połączeniu z bakteriofagami w celu regulacji docelowych bakterii w mikrobiocie46.

Podsumowując, danio pręgowany GF służy jako potężne modele do oceny bezpieczeństwa bakteryjnego, skuteczności leków, toksyczności zanieczyszczeń lub interferencji związków, ze względu na ich wrażliwe i czyste środowisko jelitowe. Przyszłe badania nad zastosowaniami ryb GF powinny obejmować różne dziedziny, z potrzebą stworzenia modeli dorosłych ryb GF w celu głębszego zrozumienia funkcji mikrobiologicznych na różnych etapach życia.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół GF Artemia został przyznany jako patent przez Chińską Narodową Administrację Własności Intelektualnej, który złagodzi ograniczone stosowanie metody po uzyskaniu zgody autorów. Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych innych konkurencyjnych lub finansowych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serdecznie dziękujemy za wsparcie od Chongqing Medical University Talent Project (nr R4014 dla DSP i R4020 dla PPJ), National Natural Science Foundation of China (NSFC, No.32200386 dla PPJ), Chongqing Postdoctoral Innovation Mentor Studio (X7928 DSP), oraz Program China-Sri Lanka Joint Center for Water Technology Research and Demonstration przez Chińską Akademię Nauk (CAS)/China-Sri Lanka Joint Center for Education and Research by CAS.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AB-GZMAmfoterycyna:Solarbio;   kanamycyna:Solarbio; Ampicylina: Solarbio.Amfoterycyna: CAS: 1397-89-3;
kanamycyna:CAS: 25380-94-0; Ampicylina: CAS: 69-52-313.		49,6 ml GZM, 50 &mikro; L roztwór podstawowy amfoterycyny (250 &mikro; g/ml), 25 i mikro; L roztwór podstawowy kanamycyny (10 mg/ml) i 250 &mikro; L roztwór podstawowy ampicyliny (20 mg/ml).
Probówki EP 1,5 mL, 15 mL, 50 mlbiosharpBS-15-MDo pobierania próbek i przechowywania środków
2,4 g/L NaClOXILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.CAS: 7681-52-9Rozcieńczony 8% wodnym roztworem podchlorynu sodu.
Płytki 6-dołkowe, 24-, 48-dołkoweLABSELECT 11112Do hodowli ryb
AeronomasNCBI baza danychnr MK1784992019-JPP-ESN
Beztlenowe płytki TSAtrypton: Oxoid ;
pepton sojowy:Solarbio ; NaCl: Biosharp;
agar w proszku: BioFroxx.		trypton:LP0042B;
pepton sojowy:Cat#S9500;
NaCl:BS112;
proszek agarowy: 9002-18-0.		Płytki TSA przygotowano z 400 ml pożywki zawierającej 6 g tryptonu, 2 g peptonu sojowego, 2 g NaCl i 6 g proszku agarowego w systemie beztlenowym.
Beztlenowa stacja roboczaGENE SCIENCEE200GIzolacja bakteryjna, testy sterylne
AnalizaGraphPad Prism 5v6.07Do analizy danych
Zestawy API 20 E  BioMérieux SA, FrancjaNo.1005915090Ref 20100 Zestawy do wykrywania metabolizmu bakterii
Artemia (krewetki solankowe)Shangjia Aquarium Co., Ltd.Cystyartemii marki Aquamaster i jaja krewetek solankowych 
System automatycznego cyklu do hodowli rybNingbo Hairui Technology Co., LtdNo CatUtrzymuj rybę
AutoklawGorliwość SposóbG154DWSPrzygotuj materiały
BHI AerobicCoolaberCat#PM0640BHI przygotowano podłoże, w którym 100 ml podłoża zawierało 3,7 g proszku BHI.
BHI AnaebicCoolaber Cat#PM0640Przygotowano pożywkę BHI i podzielono ją na rurki beztlenowe w systemie beztlenowym.
Inkubator biochemicznyLongYue Co., LtdSPXDla ryb i talerzy Szafa
bezpieczeństwa biologicznegoHaierHR40-IIA2Sterylne leczenie i testowanie
Środek wybielający 0,02 g/L NaClOXILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.CAS: 7681-52-9Roztwór roboczy o stężeniu podchlorynu sodu (NaClO): Rozcieńczony 8% wodnym roztworem podchlorynu sodu lub 166,6 μl 6% podchlorynem sodu w 500 ml wody destylowanej.
Płytki krwi,krew owcza: SolarbioNr kat. TX0030Sterylnie defibrynowana krew owcza została dodana do TSA w celu przygotowania 5% płytek krwi.
Kolba do hodowli komórkowychCorning430639Do hodowli ryb
CM-Dil barwnikiSondy molekularneCat#C7000   Aby oznaczyć bakterie
Inkubator z wytrząsaniem w stałej temperaturzePeiving Co., LtdHZQ-X100Baza danych kultur bakteryjnych
NCBIBaza danych bakterii i archeonówLink: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/
Bakterie FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/
Jednorazowa pipeta PasteuraBiosharpBS-XH-03LSłuży do wymiany wody i przenoszenia jaj
Jednorazowa szalka PetriegoBiosharpBS-90-DDo hodowli zestawów
DNASolaribioCat#D1600Zestawy do ekstrakcji genomowego DNA bakteryjnego 
Pipeta elektrycznaSCILOGEXLevo meZmień wodę
ExiguobacteriumNCBI baza danychnr MK1785042019-JPP-ESN
GZMSól morska: LANDEBAO Co., Ltd.Nie kotSkłada się z 1 l wody i 1,5 ml roztworu soli morskiej (40 g/l), w autoklawie. Zawartość soli morskiej w roztworze GZM wynosiła 60 mg/L.
Laboratoryjny system czystej wodyHitech Co., LtdPrima-S15Przygotuj środki
MikroskopNikonSMZ18Ze światłem fluorescencyjnym do obserwacji larw ryb
Zestawy PCRTIANGENCat#ET101Taq Zestaw polimerazy DNA
PipetaLABSELECT sp-013-10Zmień wodę
Jod powidonu (PVP-I)AladdinLot#H1217005Roztwór wodny jodu powidonu 0,4 g / L czysta woda.
Przetwornica rozrząduPinYi Co., LtdAL-06Do regulacji światła
TSA płytkitrypton: Oxoid ;
pepton sojowy:Solarbio ; NaCl: Biosharp;
agar w proszku: BioFroxx.		trypton:LP0042B;
pepton sojowy:Cat#S9500;
NaCl:BS112;
proszek agarowy: 9002-18-0.		Płytki TSA przygotowano z 400 ml pożywki zawierającej 6 g tryptonu, 2 g peptonu sojowego, 2 g NaCl, 6 g proszku agarowego.
TSB Trypton tlenowy:Oxoid ;
pepton sojowy:Solarbio ; NaCl: Biosharp;		trypton:LP0042B;
pepton sojowy:Cat#S9500;
NaCl:BS112;		Przygotowano pożywkę TSB, w której 400 ml pożywki zawierało 6 g tryptonu, 2 g peptonu sojowego i 2 g NaCl.
TSB Trypton beztlenowy: Oxoid ;
pepton sojowy:Solarbio ; NaCl: Biosharp;		trypton:LP0042B;
pepton sojowy:Cat#S9500;
NaCl:BS112;		Pożywkę TSB przygotowano i podzielono na rurki beztlenowe w systemie beztlenowym.
Ultra-czysty stół warsztatowyAirtechSW-CJ-2FDSterylne leczenie i testowanie
Ultra-czysty system przepływu do hodowli rybMorski sprzęt biologiczny firmaNie kotProdukuj wodę dla ryb
VibrioNCBIbaza danychnr MK1785012019-JPP-ESN
ryb

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sieber, M., Traulsen, A., Schulenburg, H., Douglas, A. E. On the evolutionary origins of host-microbe associations. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (9), e2016487118(2021).
  2. Sommer, F., Backhed, F. The gut microbiota--masters of host development and physiology. Nat Rev Microbiol. 11 (4), 227-238 (2013).
  3. Kim, S., Jazwinski, S. M. The gut microbiota and healthy aging: A mini-review. Gerontology. 64 (6), 513-520 (2018).
  4. Milani, C., et al. The first microbial colonizers of the human gut: Composition, activities, and health implications of the infant gut microbiota. Microbiol Mol Biol Rev. 81 (4), e00036(2017).
  5. De Vos, W. M., Tilg, H., Van Hul, M., Cani, P. D. Gut microbiome and health: Mechanistic insights. Gut. 71 (5), 1020-1032 (2022).
  6. Shi, N., Li, N., Duan, X., Niu, H. Interaction between the gut microbiome and mucosal immune system. Mil Med Res. 4 (1), 14(2017).
  7. Liu, B. N., Liu, X. T., Liang, Z. H., Wang, J. H. Gut microbiota in obesity. World J Gastroenterol. 27 (25), 3837-3850 (2021).
  8. Aron-Wisnewsky, J., Warmbrunn, M. V., Nieuwdorp, M., Clément, K. Metabolism and metabolic disorders and the microbiome: The intestinal microbiota associated with obesity, lipid metabolism, and metabolic health-pathophysiology and therapeutic strategies. Gastroenterology. 160 (2), 573-599 (2021).
  9. Chen, Y. W., Zhou, J. H., Wang, L. Role and mechanism of gut microbiota in human disease. Front Cell Infect Microbiol. 11, 625913(2021).
  10. Hao, W. Z., Li, X. J., Zhang, P. W., Chen, J. X. A review of antibiotics, depression, and the gut microbiome. Psychiatry Res. 284, 112691(2020).
  11. Nadal, A. L., et al. gut immunity: Using the zebrafish model to understand fish health. Front Immunol. 11, 114(2020).
  12. Asadi, A., et al. Obesity and gut-microbiota-brain axis: A narrative review. J Clin Lab Anal. 36 (5), e24420(2022).
  13. Mlynarska, E., et al. The role of the microbiome-brain-gut axis in the pathogenesis of depressive disorder. Nutrients. 14 (9), 1921(2022).
  14. Yu, Y. J., Raka, F., Adeli, K. The role of the gut microbiota in lipid and lipoprotein metabolism. J Clin Med. 8 (12), 2227(2019).
  15. Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. J Microbiol Biotechnol. 25 (10), 1583-1588 (2015).
  16. Melancon, E., et al. Best practices for germ-free derivation and gnotobiotic zebrafish husbandry. Methods Cell Biol. 138, 61-100 (2017).
  17. Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-microbial interactions. Methods Mol Biol. 1438, 123-135 (2016).
  18. Wang, X. N., Wu, C. W., Wei, H. Humanized germ-free mice for investigating the intervention effect of commensal microbiome on cancer immunotherapy. Antioxid Redox Signal. 37 (16), 1291-1302 (2022).
  19. Jia, P. P., et al. Role of germ-free animal models in understanding interactions of gut microbiota to host and environmental health: A special reference to zebrafish. Environ Pollut. 279, 116925(2021).
  20. Gootenberg, D. B., Turnbaugh, P. J. Companion animals symposium: Humanized animal models of the microbiome. J Anim Sci. 89 (5), 1531-1537 (2011).
  21. Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
  22. Kamareddine, L., Najjar, H., Sohail, M. U., Abdulkader, H., Al-Asmakh, M. The microbiota and gut-related disorders: Insights from animal models. Cells. 9 (11), 2401(2020).
  23. Rogala, A. R., Oka, A., Sartor, R. B. Strategies to dissect host-microbial immune interactions that determine mucosal homeostasis vs. Intestinal inflammation in gnotobiotic mice. Front Immunol. 11, 214(2020).
  24. Rawls, J. F., Samuel, B. S., Gordon, J. I. Gnotobiotic zebrafish reveal evolutionarily conserved responses to the gut microbiota. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4596-4601 (2004).
  25. Bates, J. M., et al. Distinct signals from the microbiota promote different aspects of zebrafish gut differentiation. Dev Biol. 297 (2), 374-386 (2006).
  26. Choi, T. Y., Choi, T. I., Lee, Y. R., Choe, S. K., Kim, C. H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Exp Mol Med. 53 (3), 310-317 (2021).
  27. Xia, H., et al. Zebrafish: An efficient vertebrate model for understanding role of gut microbiota. Mol Med. 28 (1), 161(2022).
  28. Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: Staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  29. Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nat Protoc. 3 (12), 1862-1875 (2008).
  30. Shan, Y., et al. Immersion infection of germ-free zebrafish with listeria monocytogenes induces transient expression of innate immune response genes. Front Microbiol. 6, 373(2015).
  31. Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. A. Zebrafish axenic larvae colonization with human intestinal microbiota. Zebrafish. 15 (2), 96-106 (2018).
  32. Singleman, C., Holtzman, N. G. Growth and maturation in the zebrafish, danio rerio: A staging tool for teaching and research. Zebrafish. 11 (4), 396-406 (2014).
  33. Clift, D., Richendrfer, H., Thorn, R. J., Colwill, R. M., Creton, R. High-throughput analysis of behavior in zebrafish larvae: Effects of feeding. Zebrafish. 11 (5), 455-461 (2014).
  34. Nascimento, M. D., Schorer, M., Dos Santos, J. C. E., Rocha, M. S. A., Pedreira, M. M. Live and frozen Artemia nauplii for catfish (steindachner, 1876) larvae in different salinities. Trop Anim Health Prod. 52 (2), 653-659 (2020).
  35. Jia, P. P., et al. Breaking the mold: The first report on germ-free adult marine medaka (oryzias melastigma) models. bioRxiv. , (2023).
  36. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. JoVE. (69), e4196(2012).
  37. Wilson, C. Aspects of larval rearing. ILAR J. 53 (2), 169-178 (2012).
  38. Aleström, P. a-O., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2020).
  39. Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish. , (2002).
  40. Nursyirwani, N., et al. Phenotype and genotype of lactic acid bacteria (lab) isolated from the tiger grouper Epinephelus fuscoguttatus alimentary tract. F1000Res. 6, 1984(2017).
  41. Karolenko, C., Desilva, U., Muriana, P. M. Microbial profiling of biltong processing using culture-dependent and culture-independent microbiome analysis. Foods. 12 (4), 844(2023).
  42. Jia, P. P., et al. Chronic exposure to graphene oxide (go) induced inflammation and differentially disturbed the intestinal microbiota in zebrafish. Environ Sci Nano. 6 (8), 2452-2469 (2019).
  43. Sun, B. L., et al. Probiotic supplementation mitigates the developmental toxicity of perfluorobutanesulfonate in zebrafish larvae. Sci Total Environ. 799, 149458(2021).
  44. Qian, H. F., Liu, G. F., Lu, T., Sun, L. W. Developmental neurotoxicity of microcystis aeruginosa in the early life stages of zebrafish. Ecotoxicol Environ Saf. 151, 35-41 (2018).
  45. Bertotto, L. B., Catron, T. R., Tal, T. Exploring interactions between xenobiotics, microbiota, and neurotoxicity in zebrafish. Neurotoxicology. 76, 235-244 (2020).
  46. Jia, P. P., et al. Bacteriophage-based techniques for elucidating the function of zebrafish gut microbiota. Appl Microbiol Biotechnol. 107 (7-8), 2039-2059 (2023).
  47. Xin, G. Y., et al. Gut bacteria vibrio sp. And aeromonas sp. Trigger the expression levels of proinflammatory cytokine: First evidence from the germ-free zebrafish. Fish Shellfish Immunol. 106, 518-525 (2020).
  48. Dremova, O., et al. Sterility testing of germ-free mouse colonies. Front Immunol. 14, 1275109(2023).
  49. Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, danio rerio: A gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev Comp Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
  50. Rolig, A. S., Parthasarathy, R., Burns, A. R., Bohannan, B. J. M., Guillemin, K. Individual members of the microbiota disproportionately modulate host innate immune responses. Cell Host Microbe. 18 (5), 613-620 (2015).
  51. Stressmann, F. A., et al. Mining zebrafish microbiota reveals key community-level resistance against fish pathogen infection. ISME J. 15 (3), 702-719 (2021).
  52. Guitton, E., et al. Production of germ-free fast-growing broilers from a commercial line for microbiota studies. JoVE. (160), e61148(2020).
  53. Rea, V., Bell, I., Ball, T., Van Raay, T. Gut-derived metabolites influence neurodevelopmental gene expression and wnt signaling events in a germ-free zebrafish model. Microbiome. 10 (1), 132(2022).
  54. Russo, P., et al. Zebrafish gut colonization by mcherry-labelled lactic acid bacteria. Appl Microbiol Biotechnol. 99 (8), 3479-3490 (2015).
  55. Rawls, J. F., Mahowald, M. A., Ley, R. E., Gordon, J. I. Reciprocal gut microbiota transplants from zebrafish and mice to germ-free recipients reveal host habitat selection. Cell. 127 (2), 423-433 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikrobiota gospodarzamikrobiom jelitowymanipulacja mikrobiotizolacja bakteriisekwencjonowanie 16S rRNAsterylna ywnofunkcje mikrobiologiczne

Powiązane artykuły