Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie, utrzymanie i identyfikacja wolnych od zarazków modeli danio pręgowanego od larw do stadiów młodocianych

3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66512

⸱

12 kwietnia 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Public Health, Chongqing Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia podstawowe kroki do uzyskania wolnych od zarazków (GF) zarodków ryb i utrzymania ich od larw do stadium młodocianego, w tym pobieranie próbek i wykrywanie ich sterylnego statusu. Zastosowanie modeli GF w przypadku infekcji jest ważne dla zrozumienia roli drobnoustrojów w zdrowiu gospodarza.

Streszczenie

Danio pręgowany służy jako cenne modele do badań nad wzrostem, odpornością i mikrobiotą jelitową ze względu na ich genomiczne podobieństwa do ssaków, przezroczyste zarodki rozwijające się w stosunkowo czystym środowisku kosmówkowym i niezwykle szybki rozwój larw w porównaniu do modeli gryzoni. Danio pręgowany (Danio rerio) wolny od zarazków (GF) ma kluczowe znaczenie dla oceny toksyczności zanieczyszczeń i tworzenia modeli chorób podobnych do ludzkich związanych z funkcjami mikrobiologicznymi. W porównaniu z modelami hodowanymi konwencjonalnie (CR) (ryby we wspólnej hodowli), danio pręgowany GF pozwala na dokładniejszą manipulację mikrobiotą gospodarza, pomagając w określeniu związku przyczynowego między mikroorganizmami a gospodarzami. W związku z tym odgrywają one kluczową rolę w pogłębianiu naszego zrozumienia tych relacji. Jednak modele zebry z GF są zwykle generowane i badane we wczesnych stadiach życia (od zarodków do larw) ze względu na ograniczenia w funkcjonowaniu układu odpornościowego i wchłanianiu składników odżywczych. Badanie to optymalizuje tworzenie, utrzymanie i identyfikację wczesnych modeli danio pręgowanego GF bez karmienia i z długotrwałym karmieniem przy użyciu pokarmu GF (takiego jak Artemia sp., krewetki solankowe). W trakcie całego procesu codziennie pobierano próbki i przeprowadzano hodowlę, a następnie identyfikowano je za pomocą wielu detekcji, w tym płytek i sekwencjonowania 16S rRNA. Zarejestrowano wskaźnik aseptyki, przeżywalność i wskaźniki rozwoju zebry GF, aby zapewnić jakość i ilość wygenerowanych modeli. Co ważne, badanie to dostarcza szczegółowych informacji na temat technik izolacji bakterii i infekcji u ryb z GF, umożliwiając efektywne tworzenie modeli ryb GF od larw do stadiów młodocianych przy wsparciu pokarmowym GF. Stosując te procedury w badaniach biomedycznych, naukowcy mogą lepiej zrozumieć związki między funkcjami bakterii jelitowych a zdrowiem gospodarza.

Wprowadzenie

Mikrobiota (tj. archeony, bakterie, eukarya i wirusy) odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu zdrowia gospodarza i przyczynia się do rozwoju różnych chorób, wpływając na procesy fizjologiczne i patologiczne poprzez symbiotyczne interakcje w obrębie bariery jelitowej, powierzchni nabłonka i funkcji mucyny u osób1,2,3. Skład mikrobioty na różnych etapach życia, od niemowlęctwa po młodość, dorosłość i starzenie się, a także jej obecność w różnych miejscach, takich jak nozdrza, jama ustna, skóra i jelita, jest dynamicznie kształtowany przez różne siedliska i środowiska4. Mikrobiota jelitowa organizmów bierze udział we wchłanianiu składników odżywczych, odpowiedzi immunologicznej, inwazji patogenów, regulacji metabolicznej itp5,6. Badania na pacjentach wykazały, że zaburzenia mikrobioty jelitowej są związane z otyłością u ludzi, zaburzeniami snu, depresją, nieswoistymi zapaleniami jelit (IBD), chorobami neurodegeneracyjnymi (choroba Parkinsona, Alzheimera), starzeniem się i różnymi nowotworami7,8,9. Co więcej, interaktywne szlaki między mikrobiotą jelitową a gospodarzami obejmują czynniki zapalne, neuroprzekaźniki, metabolity, barierę jelitową i stres oksydacyjny, jak zaobserwowano w poprzednich badaniach z wykorzystaniem modeli myszy i ryb10,11.

Ostatnio, wiele podejść lub terapii związanych z bakteriami, w tym potencjalne probiotyki i przeszczep mikrobioty kałowej (FMT), zostało zbadanych pod kątem tych zaburzeń w modelach klinicznych i zwierzęcych. Badania te opierają się na odkryciach związanych z osią mikrobiota-jelito-mózg/wątroba/nerki, produktami pochodzącymi z mikrobioty i zmienioną aktywnością receptorów12,13. Jednak rozwój, różne funkcje i mechanizmy systemu mikrobiota-gospodarz są nadal nie w pełni poznane i zidentyfikowane ze względu na złożoność społeczności mikrobiologicznej i wyzwanie związane z generowaniem potężnych modeli chorób podobnych do ludzkich.

Aby rozwiązać te problemy, w połowieXIX wieku pilnie zaproponowano modele zwierzęce wolne od zarazków (GF), które zostały opracowane głównie wXX wieku. Kolejne udoskonalenia, w tym modele poddane działaniu antybiotyków i gnotobiotyków, wraz z postępem w technologiach wykrywania i obserwacji drobnoustrojów, jeszcze bardziej udoskonaliły te modele14,15,16. Zwierzęta GF, stworzone przez wymazanie własnego tła i unikanie mikroorganizmów środowiskowych, oferują doskonałą strategię badania interakcji między mikroorganizmami a ich gospodarzami17. Dzięki zastosowaniu modeli zwierzęcych i udoskonalonych protokołów naukowcom udało się odtworzyć podobny skład mikrobiologiczny występujący u pacjentów myszy i ryb z GF. Ponadto inne modele zwierzęce GF, takie jak psy, kurczaki i świnie, zapewniają różnorodne opcje jako obiekty badań18,19,20,21. Podejście to umożliwiło badania nad potencjalnym wpływem terapeutycznym mikrobiomów komensalnych na różne choroby, w tym immunoterapię nowotworów u ludzi16,18. Modele GF oferują dokładniejszy wgląd w charakterystykę i mechanizmy kolonizacji, migracji, namnażania i interakcji określonych bakterii w obrębie gospodarzy. Dostarcza to nowych, kluczowych informacji na temat występowania i rozwoju chorób związanych z mikrobiotą22,23. Historia tworzenia i stosowania danio pręgowanego GF w badaniach mikrobiologicznych ewoluowała od raportów Rawlsa i in. w 2004 r. oraz Batesa i in. w 2006 r. do protokołu Melancon i in. z 2017 r16,24,25. Jednak wykonalność modeli GF dla dorosłych lub hodowlanych jest nadal długotrwałym procesem, któremu towarzyszy zmienna długowieczność, wskaźniki sukcesu i wyzwania zdrowotne.

Wśród różnych modeli zwierzęcych, danio pręgowany (Danio rerio) wyróżnia się jako kluczowe narzędzie zarówno dla badań podstawowych, jak i biomedycznych ze względu na korzystne podobieństwo do ludzkich organów i genomiki, krótki cykl rozwojowy, wysoką płodność i przezroczyste zarodki19,26. Danio pręgowany, służąc jako wiarygodne modele chorób człowieka, oferują wizualną reprezentację procesów fizjologicznych i patologicznych in vivo, dostarczając wglądu w atrakcyjne cechy interakcji gospodarz-mikroorganizm. Warto zauważyć, że danio pręgowany wykazuje odrębne linie komórkowe, co pozwala na obrazowanie fizjologii jelit, dynamiki drobnoustrojów, gonad i rozwoju reprodukcyjnego, dojrzewania układu odpornościowego gospodarza, zachowania i metabolizmu27. Zarodki danio pręgowanego rozwijają się w ochronnych pasmówkach aż do wyklucia, przekształcając się w larwy po 3 dniach od zapłodnienia (dpf). Aktywnie polują na pokarm w ilości 5 dpf i osiągają dojrzałość płciową około 3 miesiące po zapłodnieniu (mpf)28. Pierwszy udany wolny od zarazków (GF) grygowany, opisany przez Rawls et al.24, wykazał, że larwy karmione autoklawizowaną paszą po wchłonięciu żółtka wykazywały nekrozę tkanek od 8 dpf i całkowitą śmierć po 20 dpf. Wskazywało to na wpływ diety lub znaczenie uwzględnienia egzogennego zaopatrzenia w składniki odżywcze w eksperymentach z udziałem długoterminowego (>7 dpf) GF fish29. Kolejne badania udoskonaliły protokół generowania ryb GF, wykorzystując sterylny pokarm i metody udoskonalone w różnych modelach ryb16.

Jednak większość badań nad modelami zebry GF skupiała się na wczesnych etapach życia, obejmujących infekcję bakteryjną przy 5 dpf przez 24 godziny do 48 godzin, z próbkami pobranymi przed 7 dpf na zakończenie eksperymentów25,30,31. Powszechnie wiadomo, że mikrobiota organizmów, w tym ludzi i danio pręgowanego, jest kolonizowana na początku życia i kształtowana podczas wzrostu i rozwoju. Skład pozostaje stabilny w dojrzałych stadiach, a rola mikrobioty w organizmie gospodarza jest kluczowa przez całe życie, zwłaszcza w aspektach związanych ze starzeniem się, neurodegeneracją, otyłością metaboliczną i chorobami jelit3. W związku z tym perspektywy zwierząt GF o dłuższej przeżywalności mogą dostarczyć informacji na temat mechanizmów ról drobnoustrojów w rozwoju i funkcjach narządów gospodarza, biorąc pod uwagę niedojrzały układ odpornościowy i rozrodczy larw ryb we wczesnym okresie życia. Podczas gdy szczepy bakteryjne w jelitach danio pręgowanego zostały wyizolowane i zidentyfikowane w poprzednich badaniach, oferując możliwość infekowania modeli zwierzęcych GF w celu wyboru probiotyków lub badania funkcji bakteryjnych w host19,25, tworzenie i stosowanie modeli ryb GF było przede wszystkim ograniczone do wczesnych etapów życia. To ograniczenie, przypisywane złożonemu procesowi produkcji, wysokim kosztom utrzymania i związanym z tym problemom z żywnością i odpornością, utrudnia wysiłki badawcze mające na celu zbadanie rozwojowych i przewlekłych skutków mikrobioty u gospodarza.

Na przeżywalność, zachowanie, wzrost, dojrzewanie i ogólny stan zdrowia ryb, szczególnie w modelach wolnych od zarazków (GF), znaczący wpływ mają praktyki żywieniowe, obejmujące przyjmowanie i wchłanianie składników odżywczych w okresie otwartym od wczesnych larw do osobników młodocianych32,33. Jednak jednym z wyzwań w hodowli ryb GF jest niedobór odpowiedniej, sterylnej diety, co ogranicza skuteczność wsparcia żywieniowego dla podtrzymania wzrostu i przetrwania larw. Rozwiązanie tego problemu ma kluczowe znaczenie dla przywrócenia życia ryb GF, biorąc pod uwagę ich rozwojowe mechanizmy obronne i słabe zdolności trawienne z powodu braku mikrobiomu jelitowego. Jeśli chodzi o pokarm, żywe krewetki solankowe (Artemia sp.) jawią się jako najbardziej odpowiednia dieta dla larw z otwartymi ustami dla młodych ryb. Zaobserwowano, że ryby karmione żywymi krewetkami solankowymi wykazują wyższe wskaźniki wzrostu i przeżywalności w porównaniu z rybami karmionymi gotowanym żółtkiem jaja lub innymi naturalnymi i syntetycznymi przynętami34. Podczas gdy modele wczesnego życia ryb GF mogą przetrwać dzięki wsparciu żółtka, a modele larw GF mogą być utrzymywane dzięki sterylnemu karmieniu, tworzenie długoterminowych modeli od larw do osobników młodocianych i osiągnięcie dojrzałości płciowej pozostaje wyzwaniem. Ponadto żywność w płatkach lub w proszku jest ograniczona przez nierówny skład odżywczy i może wpływać na jakość wody. W przeciwieństwie do tego, żywa artemia ma takie zalety, jak przetrwanie zarówno w słonej, jak i słodkiej wodzie, mały rozmiar odpowiedni dla larw i dorosłych, łatwość grupowania i wyższa jakość wylęgu35. Opierając się na poprzednich metodach16,24,30, uprościliśmy złożony proces leczenia i rozwiązaliśmy problem diety, ustanawiając łatwą do inkubacji żywą odmianę GF Artemia sp. jako sterylny pokarm przez dłuższy czas niż ryby GF we wczesnym okresie życia.

To badanie przedstawia zoptymalizowany protokół obejmujący (1) generację, (2) utrzymanie, (3) identyfikację wskaźnika sterylności, oraz (4) utrzymanie i karmienie, aby zapewnić wzrost wolnego od zarazków (GF) danio pręgowanego od zarodków do larw i stadiów młodocianych. Wyniki dostarczają wstępnych dowodów na wylęg, przeżywalność, wzrost i bezpłodność danio pręgowanego GF, wraz z podstawowymi wskaźnikami dla GF Artemia sp. jako sterylnego pokarmu. Szczegółowe etapy generowania modeli i przygotowywania sterylnej żywej żywności zapewniają kluczowe wsparcie techniczne w konstruowaniu i stosowaniu długoterminowych modeli ryb GF, a także GF Artemia sp. w badaniach interakcji mikrobiota-gospodarz. Protokół dotyczy izolacji, identyfikacji i infekcji bakterii na modelach ryb GF, przedstawiając metody znakowania fluorescencji bakterii i obserwując ich kolonizację w jelitach ryb pod mikroskopem. Ryby GF, ryby gnotobiotyczne z infekcją bakteryjną lub przeniesione modele mikrobioty ludzkiej będą poddawane różnym detekcjom w celu wyjaśnienia ich funkcji i wpływu na odporność gospodarza, trawienie, zachowanie, regulację transkryptomiczną i aspekty metaboliczne. W dłuższej perspektywie protokół ten może zostać rozszerzony na różne gatunki ryb typu dzikiego, takie jak medaka morska, a potencjalnie na inne wybrane transgeniczne linie danio pręgowanego skorelowane z określonymi tkankami lub chorobami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty z rybami zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania w Chongqing oraz Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Chongqing w Chinach, a także standardami dla zwierząt doświadczalnych wydanymi przez Państwowe Biuro Jakości i Nadzoru Technicznego (ID Zgody: GB14922-2001 do GBT14927-2001). Danio pręgowany (Danio rerio, typ dziki, szczep AB) pochodziły z Instytutu Hydrobiologii Chińskiej Akademii Nauk i były utrzymywane w laboratorium zgodnie z wcześniej opisanymi procedurami36.

1. Utrzymanie dorosłych ryb danio pręgowanego i zbieranie zarodków

UWAGA: Opierając się na modyfikacjach z poprzednich badań i raportów16,37,38,39, utrzymanie dorosłych ryb pręgowanych, hodowla larw i praktyki dla modeli wolnych od zarazków (GF) w naszym laboratorium zostały przeprowadzone zgodnie z krokami opisanymi poniżej. System ultra-czystego przepływu do hodowli ryb został uzyskany komercyjnie (patrz tabela materiałów). Woda, utrzymywana o zrównoważonym pH, soli i zasadach, jest poddawana filtracji podczas jazdy na rowerze, aby zapewnić czyste warunki.

  1. Dorosłe ryby należy utrzymywać zgodnie z następującą standardową procedurą w systemie automatycznego cyklu (patrz Tabela materiałów) z fotoperiodem ciemności: światło = 10 godzin: 14 godzin w temperaturze 28 °C ± 0,5 °C i karmione świeżo inkubowaną Artemia sp. dwa razy dziennie.
  2. Umieść dojrzałego płciowo dorosłego danio pręgowanego (samiec: samica = 2:1) w zbiornikach ze świeżą i czystą wodą poprzedniej nocy.
  3. Pozwól rybie złożyć ikrę następnego ranka (około 8:30 rano) pod regularną stymulacją światłem w laboratorium. Po 1-2 godzinach przenieś rybę do innego zbiornika.
  4. Zebrać zarodki do wody z systemu automatycznego cyklu jako pożywkę hodowlaną w naczyniu hodowlanym za pomocą jednorazowej pipety Pasteura.

2. Pokolenie zebry GF od zarodków do larw

UWAGA: Procedura generowania ryb wolnych od zarazków (GF) jest opisana w Rysunek 1, podczas gdy podstawowe wskaźniki rozwojowe modeli konwencjonalnych (CR) i GF są przedstawione na Rysunku Uzupełniającym 1. Postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej w laboratoryjnej szafie bezpieczeństwa biologicznego lub okapie z przepływem laminarnym, stosując sterylną technikę aseptyczną w pomieszczeniu czystym.

  1. Umyj zarodki za pomocą wody z kultur ryb i usuń kał, zanieczyszczenia oraz martwe lub niezapłodnione jaja.
  2. Przenieś zarodki w temperaturze 2 hpf na wysterylizowane płytki (do 480 zarodków na sterylne naczynie o średnicy 10 cm) wypełnione roztworem pożywki danio pręgowanego wolnego od zarazków antybiotyku (AB-GZM, patrz tabela materiałów) i posiewu w temperaturze 28,5 °C przez 6-8 godzin
    UWAGA: AB-GZM stosuje się do leczenia zarodków przez kilka godzin w celu wyeliminowania mikroorganizmów powierzchniowych, a GZM bez antybiotyków stosuje się do hodowli ryb GF w podsekwencji. Zwykle doskonały czas hodowli wynosi 6 godzin).
  3. Wyklucz jaja z białymi plamami lub białawym wyglądem i wybierz te, które są normalnie rozwinięte, wyświetlając przezroczyste i nienaruszone koperty do dalszego przetwarzania.
  4. Opłucz zarodki za pomocą AB-GZM trzy razy w ciągu 10 minut.
  5. Moczyć zarodki w 0,2 g/l roztworu jodu powidonu (PVP-I) przez 1 minutę (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Wyższe stężenie i dłużej niż 2 minuty wpłynie na śmiertelność i wylęg zarodków.
  6. Umyj zarodki za pomocą wolnego od zarazków podłoża danio pręgowanego (GZM) trzy razy w ciągu 10 minut.
  7. Dodaj zarodki do roztworu roboczego podchlorynu sodu (NaClO), szczelnie przykryj probówki do mikrowirówek o pojemności 50 ml i wybielaj przez 15 minut. W tym okresie zawieś zarodki w roztworze wybielacza, delikatnie je potrząsając.
  8. Umyj zarodki za pomocą GZM trzy razy w ciągu 10 minut.
  9. Przenieść zarodki na sterylne 6-dołkowe płytki z 5 zarodkami i 10 ml GZM na dołek. Hoduj je na ultra czystej platformie lub inkubatorze z fotoperiodem ciemności: światło = 10 godzin: 14 godzin w temperaturze 28 °C ± 0,5 °C. Gęstość kultury będzie miała wpływ na szybkość sterylności.
  10. Codziennie odnawiaj pożywkę hodowlaną, usuwając zużyte GZM, zbierając je jako próbki do wykrywania stanu sterylnego i uzupełniając każdą studzienkę tą samą objętością sterylnego GZM.
  11. Zapisz podstawowe wskaźniki rozwoju zarodków/larw GF, w tym wskaźnik przeżywalności, wskaźnik wylęgu, bicie serca, długość i wagę ciała itp19.
  12. Przenieść rybę GF do odpowiednich pojemników (szalek, kolb do hodowli komórkowych lub szklanych butelek z pokrywkami) o zwiększonej objętości, zapewniając sterylny pokarm przez cały proces wzrostu.

3. Utrzymanie zebry GF od larwy do młodego

  1. Odnów GZM bez karmienia przed 7 dpf i codziennie wykrywaj stany sterylne (patrz krok 5).
  2. Larwy danio pręgowanego od 8 dpf do stadiów młodocianych należy karmić sterylnym żółtkiem jaja (10 μl przygotowanego roztworu podstawowego na studzienkę) raz dziennie przed zmianą GZM.
  3. Młodociane osobniki GF od 14 dpf karmić wysterylizowanym żółtkiem jaja zmieszanym z GF Artemia sp. raz dziennie (1-3 artemia/larwy, patrz krok 4), stopniowo zwiększając masę pokarmu wraz ze wzrostem i rozwojem ryb GF.
  4. Zapewnij żółtko jaja do momentu, gdy wszystkie ryby będą mogły spożyć Artemia nauplii.
    UWAGA: GF Artemia powinna zostać poddana testom sterylności przed użyciem. Oceń liczbę pozostałych naupliusów artemii, obserwuj postępy w pościgu i chwytaniu oraz zbadaj ciało ryby ze spożytym pokarmem, aby wskazać sukces karmienia.
  5. Od 28 dpf do wczesnych stadiów dorosłych, karmić GF Artemia raz dziennie (3-5 Artemia/larwy) i oczyszczać niewykorzystane lub martwe Artemia i martwe ryby do odpadu GZM jako codzienne próbki.
  6. Podczas wzrostu ryb GF należy zmienić płytki 6-dołkowe po 7 dpf na sterylne płytki lub kolby do hodowli komórkowych z 8 na 21 dpf, a następnie na sterylne butelki po 21 dpf. Zwiększ pożywkę hodowlaną i masę pokarmu zgodnie z liczbą i wagą ryb GF w każdym pojemniku.
  7. Codziennie odnawiaj GZM i sprawdzaj próbki, aby upewnić się, że modele GF odniosły sukces.
    UWAGA: Utrzymanie modeli ryb wolnych od zarazków (GF) do wczesnej dorosłości i dojrzałości płciowej jest wyzwaniem, przy niskim średnim wskaźniku przeżywalności na poziomie 30 dpf, zwykle poniżej 10%. Przypisuje się to przede wszystkim słabej odporności, opóźnionemu rozwojowi i upośledzonej funkcji jelit.

4. Przygotowanie nauplii GF Artemia jako sterylnego pokarmu dla chronicznych modeli ryb GF

UWAGA: Metoda uprawy i przygotowania artemii wolnej od zarazków (GF) jest opisana w Rysunek 2. Należy pamiętać, że wszystkie poniższe kroki są wykonywane w laboratoryjnej komorze bezpieczeństwa biologicznego, przy użyciu sterylnej techniki aseptycznej.

  1. Płukać 0,25 g torbieli artemii za pomocą 2,4 g/l podchlorynu sodu (NaClO, patrz tabela materiałów) przez 5 minut.
  2. Przefiltruj wypłukane torbiele artemii wysterylizowanym ultragęstym filtrem (około 170 oczek w otworze) i umyj wysterylizowaną ultraczystą wodą trzy razy, za każdym razem przez 1-2 minuty.
  3. Przenieś umyte cysty artemii do 100 ml 2,5% wysterylizowanej wody z soli fizjologicznej, wymieszaj i zapakuj do aseptycznego wylęgu zgodnie z krokami wymienionymi poniżej.
  4. Roztwór mieszaniny cyst artemii poddanych działaniu artemii o objętości 50 ml należy zapakować do sterylnej butelki o objętości 100 ml, zamknąć folią i inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem przy 150 obr./min, w temperaturze 30 °C przez 18 godzin do 24 godzin ze światłem.
  5. Wyekstrahuj około 30 ml nauplii wylęgowej artemii ze środkowej i dolnej warstwy za pomocą jednorazowej pipety Pasteura.
    UWAGA: Zapobiegaj przedostawaniu się pływających jaj i pustych skorupek do górnej warstwy. Wskaźniki wolnych od zarazków (GF) torbieli artemii i nauplii inkubowanych przez 24 godziny przedstawiono w Rysunek 3.
  6. Przefiltruj artemię filtrem sterylizującym i umyj je w zlewce sterylizującej ze sterylizującą ultraczystą wodą trzy razy, za każdym razem około 30 s do 1 minuty. Na koniec dodaj 4 ml wysterylizowanej ultraczystej wody, aby przygotować mieszany roztwór Artemia.
  7. Za pomocą jednorazowej pipety Pasteura wydobądź aktywnie pływającą artemię z górnej warstwy, umyj i przygotuj roztwór nauplii do karmienia i aseptycznej identyfikacji.

5. Identyfikacja modeli ryb GF na wszystkich etapach życia

UWAGA: Przez cały okres życia ryb wolnych od zarazków (GF), kluczowe wskaźniki i codzienne wykrywanie próbek są kluczowe dla zapewnienia sukcesu modeli. Ten krok podsumowuje powszechną klasyfikację próbek i zwykłe metody identyfikacji (Rysunek 4).

  1. Codziennie obserwuj i licz stan przeżywalności i wskaźnik larw danio pręgowanego GF. W eksperymentach obliczających powiązane dawki, ryby GF są hodowane na 24- lub 48-dołkowych płytkach z jedną rybą na studzienkę.
    1. Wskaźnik przeżywalności = (liczba żywych ryb w momencie obserwacji / całkowita liczba jaj) × 100%.
    2. Wskaźnik sterylności = (liczba sterylnych ryb/liczba ryb, które przeżyły) × 100%.
      UWAGA: Protokół ten koncentruje się na sterylnym wskaźniku żywych ryb. Liczbę bezpłodnych ryb określa się poprzez zliczenie ryb z udanym GF po wielokrotnych kontrolach wśród żywych ryb. Wszelkie martwe ryby lub modele GF żywych ryb, które zawiodły z powodu obecności bakterii, są eliminowane podczas kolejnych procedur GF.
  2. Pobrać następujące próbki larw danio pręgowanego GF.
    1. Pożywka hodowlana zebryka GF z każdej studzienki lub pojemnika na butelkę.
    2. Pokarm dla ryb, taki jak sterylne żółtko jaja i GF Artemia.
    3. Pożywka odpadowa, w tym fragmenty błony jajowej po wykluciu oraz resztki pokarmowe lub kał w okresach żerowania od larw do młodych ryb.
    4. Próbki martwych ryb w celu identyfikacji obecności bakterii.
    5. Pożywka rybna i środki stosowane w leczeniu zarodków jako kontrola sterylna.
    6. Próbki z materiałów, platformy operacyjnej, inkubatora itp.
  3. Wykrywaj próbki pobierane codziennie przy użyciu wielu metod.
    1. Najpierw należy zastosować metodę płytki do rozsiewania i płytek hodowlanych w inkubatorze w temperaturze 30 °C.
      1. Pokryć 20-50 μl próbki pożywki odpadowej na płytce z agarem sojowym z tryptikazą (TSA) (patrz tabela materiałów) w warunkach tlenowych.
      2. Pokryć 20-50 μl próbki pożywki odpadowej na płytce TSA w warunkach beztlenowych.
      3. Pokryć 20-50 μl próbki pożywki odpadowej na płytkach TSA z krwią (patrz tabela materiałów) w warunkach tlenowych.
      4. Pokryć 20-50 μl próbki pożywki odpadowej na płytkach TSA krwi w warunkach beztlenowych.
    2. Po drugie, użyj metody hodowli płynnej.
      1. Pobrać 200 μl próbki do probówek tlenowych z pożywką z bulionu do infuzji mózgowo-sercowej (BHI) (patrz tabela materiałów) i wyhodować w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C, 150-180 obr./min.
      2. Dodać 200 μl próbki do probówek beztlenowych z pożywką BHI i wyhodować w inkubatorze w temperaturze 30 °C.
      3. Dodać 200 μl próbki do probówek tlenowych z pożywką z bulionu sojowego z tryptikazy (TSB), a następnie wyhodować w inkubatorze do wytrząsania w temperaturze 30 °C, 150-180 obr./min.
      4. Dodać 200 μl próbki do probówek beztlenowych z pożywką TSB i wyhodować w inkubatorze w temperaturze 30 °C.
    3. Po trzecie, użyj techniki molekularnej-16s test reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).
      1. Analizę próbki ścieków za pomocą dwóch par starterów 27F i 1492R oraz 63F i 1387R (tabela 1).
        UWAGA: Główną mieszaninę PCR przygotowano zgodnie z Tabelą 2 przy użyciu dostępnego na rynku zestawu do polimerazy DNA (patrz Tabela materiałów), a maszynę do PCR skonfigurowano z programem określonym w Tabeli 3.
      2. Po zakończeniu programu PCR zbadaj produkty za pomocą 1% elektroforezy w żelu agarozowym40 w docelowych pasmach 1465 pz (przy użyciu starterów 27F i 1492R) lub 1324 pz (przy użyciu starterów 63F i 1387R), aby wywnioskować sterylność próbek.
  4. Rejestruj i obserwuj testy sterylności, w tym posiewy na płytkach i pożywkach od 24 godzin do 3 dni i 7 dni, podczas których brak kolonii na płytkach i brak zmętnienia w cieczy wskazują na udaną konstrukcję modeli GF. Obserwuj i zapisuj płytkę i podłoże po 24 godzinach, 48 godzinach, 72 godzinach, 96 godzinach, 120 godzinach, 144 godzinach i 168 godzinach.

6. Identyfikacja próbek GF Artemia przed żerowaniem na rybach GF

UWAGA: Aby wykryć próbki GF Artemia, które są niezbędne jako żywy pokarm przed żerowaniem na rybach GF (Rysunek 4), wykonaj poniższe kroki.

  1. Zbierz próbki modeli GF Artemia.
    1. Nieleczone torbiele artemii.
    2. Leczone torbiele artemii GF.
    3. Wyklute nauplii artemii GF.
    4. Sterylizowana ultraczysta woda jako kontrola.
  2. Wykryj GF Artemia za pomocą następujących metod.
    1. Metodę płytki rozprowadzającej służy do wykrywania próbek poprzez powlekanie ich płytkami TSA i płytkami TSA z krwią w warunkach tlenowych i beztlenowych. Inkubować je w temperaturze 30 °C.
    2. Użyj ciekłego podłoża do wykrywania próbek w tlenowych i beztlenowych probówkach TSB i BHI. Hodowla w wytrząsarce przy 150-180 obr./min, 30 °C.
    3. Użyj testu PCR, aby wykryć obecność bakterii w próbkach pobranych przy użyciu 16s rybosomalnych genów docelowych RNA, starterów 27F i 1492R, 63F i 1387R (Tabela 1). Objętość i program przedstawiono w Tabeli 2 i Tabeli 3.
  3. Zapisz wyniki: Wykryj produkt PCR za pomocą 1% elektroforezy w żelu agarozowym40 dla pasm docelowych o wartości 1465 pz (przy użyciu starterów 27F i 1492R) lub 1324 pz (przy użyciu starterów 63F i 1387R). Wyniki badań na płytkach i płynnym podłożu mogą zapewnić sterylny stan GF Artemia przed użyciem jako pokarm dla ryb GF.

7. Izolacja i identyfikacja szczepów bakterii jelitowych od danio pręgowanego

UWAGA: Aby zbadać funkcje jelit in vitro i in vivo, konieczne jest wyizolowanie szczepów bakteryjnych od danio pręgowanego, które również stanowią źródło gatunku dla potencjalnych probiotyków przesiewanych przez infekcję przy użyciu zwierząt GF (Rysunek 5). W tym protokole opisujemy tradycyjną metodę preparacji w celu uzyskania treści jelitowej, przy czym próbki można również pobrać bezpośrednio z żywych znieczulonych ryb (dane nie pokazane).

  1. Wybierz zdrowego dorosłego danio pręgowanego i umyj go sterylną wodą. Wykonaj następujące czynności na czystej ławce.
  2. Znieczulać ryby 100 mg/l MS-222 przez 5-10 minut.
  3. Użyj 75% alkoholu do leczenia powierzchni ciała ryby.
  4. Wyciąć jelita ryb i wytłoczyć zawartość jelitową za pomocą pożywki TSB lub BHI.
  5. Inkubować supernatant jelitowy, stosując TSA, płytkę krwi, TSB i pożywkę BHI w warunkach tlenowych i beztlenowych.
  6. Przetłumacz bakterie, aby uzyskać szczep sygnałowy i zarejestrować charakterystykę różnych kolonii.
  7. Przechowywać bakterie w 30% glicerolu w temperaturze -80 °C.
  8. Następnie zidentyfikuj bakterie jelitowe poprzez ekstrakcję genomowego DNA i sekwencjonowanie PCR.
    UWAGA: Główne etapy ekstrakcji genomowego DNA bakteryjnego obejmują odwirowanie cieczy, dysocjację RNazy A i proteazy K, ekstrakcję alkoholem etylowym, płukanie i rozpuszczanie przy użyciu dostępnych na rynku zestawów zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
  9. Analizuj sekwencje 16S za pomocą National Center for Biotechnology Information (NCBI) i Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) z bazą danych Bacteria and Archaea40,41(patrz Tabela materiałów).
  10. Wybierz najlepiej dopasowane bakterie i postacie, aby zidentyfikować izolowane szczepy jelitowe na poziomie rodzaju.
  11. Wykrywanie funkcji metabolicznych szczepów bakteryjnych za pomocą dostępnych na rynku zestawów (patrz tabela materiałów).

8. Etykietowanie grypy, infekcja i kolonizacja bakterii w jelitach zebry GF

UWAGA: Przed zakażeniem zebry GF, wyizolowane bakterie zostały zmodyfikowane barwnikami i policzone, dzięki czemu kolonizacja i migracja mikroorganizmów stała się widoczna w sposób ciągły i in vivo (Rysunek 6).

  1. Wybierz potencjalne pożyteczne bakterie lub dominujące szczepy o dużej liczebności w żywicielu, aby zainfekować modele ryb GF.
    UWAGA: Bakterie użyte w tym badaniu to Aeromonas sp. i Vibrio sp. (patrz Tabela Materiałów), wybrane z 8 rodzajów, które zostały wyizolowane i zidentyfikowane z dorosłego danio pręgowanego typu dzikiego w laboratorium42.
  2. Oznacz świeże bakterie barwnikami CM-Dil (patrz Tabela materiałów) i wystaw je na działanie zebry GF w stężeniu 5 dpf o stężeniu 10 6-108 jednostek tworzących kolonie (CFU)/ml.
  3. Obserwuj fluorescencję pod mikroskopem fluorescencyjnym w powiększeniu 3×, aby wskazać kolonizację i rozmieszczenie bakterii w jelicie larw zebry GF od 6 dpf i 14 dpf.
  4. Ręcznie policz liczbę bakterii w rybach GF za pomocą kultury płytkowej w każdym punkcie czasowym.
  5. Wykryj kolonie i sekwencje, aby upewnić się, że infekcja zakończyła się sukcesem z docelowymi szczepami bakteryjnymi.
  6. Zbierz próbki ryb GF z infekcją bakteryjną do kolejnych testów, w tym neurobehawioralnych, wskaźników rozwojowych, analizy histopatologicznej i pomiarów hormonów itp43,44,45.
    UWAGA: Bakterie użyte w eksperymencie z infekcją powinny być świeżo odzyskane i świeżo wyhodowane w płynnym pożywce.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Modele GF u danio pręgowanego można efektywnie wytworzyć, wykorzystując liczne jaja znieśione przez pary ryb, przy zastosowaniu protokołu zoptymalizowanego na podstawie wcześniejszych modeli ryb GF35. Pojedyncza płytka 6-dołkowa pozwala na hodowlę około 30-48 embrionów/larw, co umożliwia gromadzenie wystarczającej ilości danych i przeprowadzenie analizy statystycznej. Po sterylizacji embriony GF są hodowane w czystym inkubatorze aż do wyklucia się larw w czasie 48-72 h; GZM jest wymieniane codzien...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Krytyczne kroki w protokołach przygotowywania ryb i żywności GF
Podczas tworzenia modeli ryb GF zaangażowano kilka krytycznych etapów, w tym przygotowanie sterylnych materiałów, sterylizację zarodków, codzienną odnawianie GZM, pobieranie różnych próbek i sterylne badanie każdej próbki przy użyciu wielu metod. Jednym z tych etapów jest wstępne leczenie zarodków, które ma fundamentalne i decydujące znaczenie dla powodzenia modeli GF. Czynniki kontrolne, ich stężenia i czasy leczenia mają kluczowe znac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Protokół GF Artemia został przyznany jako patent przez Chińską Narodową Administrację Własności Intelektualnej, który złagodzi ograniczone stosowanie metody po uzyskaniu zgody autorów. Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych innych konkurencyjnych lub finansowych interesów.

Podziękowania

Serdecznie dziękujemy za wsparcie od Chongqing Medical University Talent Project (nr R4014 dla DSP i R4020 dla PPJ), National Natural Science Foundation of China (NSFC, No.32200386 dla PPJ), Chongqing Postdoctoral Innovation Mentor Studio (X7928 DSP), oraz Program China-Sri Lanka Joint Center for Water Technology Research and Demonstration przez Chińską Akademię Nauk (CAS)/China-Sri Lanka Joint Center for Education and Research by CAS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AB-GZMAmfoterycyna:Solarbio;   kanamycyna:Solarbio; Ampicylina: Solarbio.Amfoterycyna: CAS: 1397-89-3;
kanamycyna:CAS: 25380-94-0; Ampicylina: CAS: 69-52-313.		49,6 ml GZM, 50 &mikro; L roztwór podstawowy amfoterycyny (250 &mikro; g/ml), 25 i mikro; L roztwór podstawowy kanamycyny (10 mg/ml) i 250 &mikro; L roztwór podstawowy ampicyliny (20 mg/ml).
Probówki EP 1,5 mL, 15 mL, 50 mlbiosharpBS-15-MDo pobierania próbek i przechowywania środków
2,4 g/L NaClOXILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.CAS: 7681-52-9Rozcieńczony 8% wodnym roztworem podchlorynu sodu.
Płytki 6-dołkowe, 24-, 48-dołkoweLABSELECT 11112Do hodowli ryb
AeronomasNCBI baza danychnr MK1784992019-JPP-ESN
Beztlenowe płytki TSAtrypton: Oxoid ;
pepton sojowy:Solarbio ; NaCl: Biosharp;
agar w proszku: BioFroxx.		trypton:LP0042B;
pepton sojowy:Cat#S9500;
NaCl:BS112;
proszek agarowy: 9002-18-0.		Płytki TSA przygotowano z 400 ml pożywki zawierającej 6 g tryptonu, 2 g peptonu sojowego, 2 g NaCl i 6 g proszku agarowego w systemie beztlenowym.
Beztlenowa stacja roboczaGENE SCIENCEE200GIzolacja bakteryjna, testy sterylne
AnalizaGraphPad Prism 5v6.07Do analizy danych
Zestawy API 20 E  BioMérieux SA, FrancjaNo.1005915090Ref 20100 Zestawy do wykrywania metabolizmu bakterii
Artemia (krewetki solankowe)Shangjia Aquarium Co., Ltd.Cystyartemii marki Aquamaster i jaja krewetek solankowych 
System automatycznego cyklu do hodowli rybNingbo Hairui Technology Co., LtdNo CatUtrzymuj rybę
AutoklawGorliwość SposóbG154DWSPrzygotuj materiały
BHI AerobicCoolaberCat#PM0640BHI przygotowano podłoże, w którym 100 ml podłoża zawierało 3,7 g proszku BHI.
BHI AnaebicCoolaber Cat#PM0640Przygotowano pożywkę BHI i podzielono ją na rurki beztlenowe w systemie beztlenowym.
Inkubator biochemicznyLongYue Co., LtdSPXDla ryb i talerzy Szafa
bezpieczeństwa biologicznegoHaierHR40-IIA2Sterylne leczenie i testowanie
Środek wybielający 0,02 g/L NaClOXILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.CAS: 7681-52-9Roztwór roboczy o stężeniu podchlorynu sodu (NaClO): Rozcieńczony 8% wodnym roztworem podchlorynu sodu lub 166,6 μl 6% podchlorynem sodu w 500 ml wody destylowanej.
Płytki krwi,krew owcza: SolarbioNr kat. TX0030Sterylnie defibrynowana krew owcza została dodana do TSA w celu przygotowania 5% płytek krwi.
Kolba do hodowli komórkowychCorning430639Do hodowli ryb
CM-Dil barwnikiSondy molekularneCat#C7000   Aby oznaczyć bakterie
Inkubator z wytrząsaniem w stałej temperaturzePeiving Co., LtdHZQ-X100Baza danych kultur bakteryjnych
NCBIBaza danych bakterii i archeonówLink: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/
Bakterie FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/
Jednorazowa pipeta PasteuraBiosharpBS-XH-03LSłuży do wymiany wody i przenoszenia jaj
Jednorazowa szalka PetriegoBiosharpBS-90-DDo hodowli zestawów
DNASolaribioCat#D1600Zestawy do ekstrakcji genomowego DNA bakteryjnego 
Pipeta elektrycznaSCILOGEXLevo meZmień wodę
ExiguobacteriumNCBI baza danychnr MK1785042019-JPP-ESN
GZMSól morska: LANDEBAO Co., Ltd.Nie kotSkłada się z 1 l wody i 1,5 ml roztworu soli morskiej (40 g/l), w autoklawie. Zawartość soli morskiej w roztworze GZM wynosiła 60 mg/L.
Laboratoryjny system czystej wodyHitech Co., LtdPrima-S15Przygotuj środki
MikroskopNikonSMZ18Ze światłem fluorescencyjnym do obserwacji larw ryb
Zestawy PCRTIANGENCat#ET101Taq Zestaw polimerazy DNA
PipetaLABSELECT sp-013-10Zmień wodę
Jod powidonu (PVP-I)AladdinLot#H1217005Roztwór wodny jodu powidonu 0,4 g / L czysta woda.
Przetwornica rozrząduPinYi Co., LtdAL-06Do regulacji światła
TSA płytkitrypton: Oxoid ;
pepton sojowy:Solarbio ; NaCl: Biosharp;
agar w proszku: BioFroxx.		trypton:LP0042B;
pepton sojowy:Cat#S9500;
NaCl:BS112;
proszek agarowy: 9002-18-0.		Płytki TSA przygotowano z 400 ml pożywki zawierającej 6 g tryptonu, 2 g peptonu sojowego, 2 g NaCl, 6 g proszku agarowego.
TSB Trypton tlenowy:Oxoid ;
pepton sojowy:Solarbio ; NaCl: Biosharp;		trypton:LP0042B;
pepton sojowy:Cat#S9500;
NaCl:BS112;		Przygotowano pożywkę TSB, w której 400 ml pożywki zawierało 6 g tryptonu, 2 g peptonu sojowego i 2 g NaCl.
TSB Trypton beztlenowy: Oxoid ;
pepton sojowy:Solarbio ; NaCl: Biosharp;		trypton:LP0042B;
pepton sojowy:Cat#S9500;
NaCl:BS112;		Pożywkę TSB przygotowano i podzielono na rurki beztlenowe w systemie beztlenowym.
Ultra-czysty stół warsztatowyAirtechSW-CJ-2FDSterylne leczenie i testowanie
Ultra-czysty system przepływu do hodowli rybMorski sprzęt biologiczny firmaNie kotProdukuj wodę dla ryb
VibrioNCBIbaza danychnr MK1785012019-JPP-ESN
ryb

Bibliografia

  1. Sieber, M., Traulsen, A., Schulenburg, H., Douglas, A. E. On the evolutionary origins of host-microbe associations. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (9), e2016487118(2021).
  2. Sommer, F., Backhed, F. The gut microbiota--masters of host development and physiology. Nat Rev Microbiol. 11 (4), 227-238 (2013).
  3. Kim, S., Jazwinski, S. M. The gut microbiota and healthy aging: A mini-review. Gerontology. 64 (6), 513-520 (2018).
  4. Milani, C., et al. The first microbial colonizers of the human gut: Composition, activities, and health implications of the infant gut microbiota. Microbiol Mol Biol Rev. 81 (4), e00036(2017).
  5. De Vos, W. M., Tilg, H., Van Hul, M., Cani, P. D. Gut microbiome and health: Mechanistic insights. Gut. 71 (5), 1020-1032 (2022).
  6. Shi, N., Li, N., Duan, X., Niu, H. Interaction between the gut microbiome and mucosal immune system. Mil Med Res. 4 (1), 14(2017).
  7. Liu, B. N., Liu, X. T., Liang, Z. H., Wang, J. H. Gut microbiota in obesity. World J Gastroenterol. 27 (25), 3837-3850 (2021).
  8. Aron-Wisnewsky, J., Warmbrunn, M. V., Nieuwdorp, M., Clément, K. Metabolism and metabolic disorders and the microbiome: The intestinal microbiota associated with obesity, lipid metabolism, and metabolic health-pathophysiology and therapeutic strategies. Gastroenterology. 160 (2), 573-599 (2021).
  9. Chen, Y. W., Zhou, J. H., Wang, L. Role and mechanism of gut microbiota in human disease. Front Cell Infect Microbiol. 11, 625913(2021).
  10. Hao, W. Z., Li, X. J., Zhang, P. W., Chen, J. X. A review of antibiotics, depression, and the gut microbiome. Psychiatry Res. 284, 112691(2020).
  11. Nadal, A. L., et al. gut immunity: Using the zebrafish model to understand fish health. Front Immunol. 11, 114(2020).
  12. Asadi, A., et al. Obesity and gut-microbiota-brain axis: A narrative review. J Clin Lab Anal. 36 (5), e24420(2022).
  13. Mlynarska, E., et al. The role of the microbiome-brain-gut axis in the pathogenesis of depressive disorder. Nutrients. 14 (9), 1921(2022).
  14. Yu, Y. J., Raka, F., Adeli, K. The role of the gut microbiota in lipid and lipoprotein metabolism. J Clin Med. 8 (12), 2227(2019).
  15. Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. J Microbiol Biotechnol. 25 (10), 1583-1588 (2015).
  16. Melancon, E., et al. Best practices for germ-free derivation and gnotobiotic zebrafish husbandry. Methods Cell Biol. 138, 61-100 (2017).
  17. Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-microbial interactions. Methods Mol Biol. 1438, 123-135 (2016).
  18. Wang, X. N., Wu, C. W., Wei, H. Humanized germ-free mice for investigating the intervention effect of commensal microbiome on cancer immunotherapy. Antioxid Redox Signal. 37 (16), 1291-1302 (2022).
  19. Jia, P. P., et al. Role of germ-free animal models in understanding interactions of gut microbiota to host and environmental health: A special reference to zebrafish. Environ Pollut. 279, 116925(2021).
  20. Gootenberg, D. B., Turnbaugh, P. J. Companion animals symposium: Humanized animal models of the microbiome. J Anim Sci. 89 (5), 1531-1537 (2011).
  21. Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
  22. Kamareddine, L., Najjar, H., Sohail, M. U., Abdulkader, H., Al-Asmakh, M. The microbiota and gut-related disorders: Insights from animal models. Cells. 9 (11), 2401(2020).
  23. Rogala, A. R., Oka, A., Sartor, R. B. Strategies to dissect host-microbial immune interactions that determine mucosal homeostasis vs. Intestinal inflammation in gnotobiotic mice. Front Immunol. 11, 214(2020).
  24. Rawls, J. F., Samuel, B. S., Gordon, J. I. Gnotobiotic zebrafish reveal evolutionarily conserved responses to the gut microbiota. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4596-4601 (2004).
  25. Bates, J. M., et al. Distinct signals from the microbiota promote different aspects of zebrafish gut differentiation. Dev Biol. 297 (2), 374-386 (2006).
  26. Choi, T. Y., Choi, T. I., Lee, Y. R., Choe, S. K., Kim, C. H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Exp Mol Med. 53 (3), 310-317 (2021).
  27. Xia, H., et al. Zebrafish: An efficient vertebrate model for understanding role of gut microbiota. Mol Med. 28 (1), 161(2022).
  28. Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: Staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  29. Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nat Protoc. 3 (12), 1862-1875 (2008).
  30. Shan, Y., et al. Immersion infection of germ-free zebrafish with listeria monocytogenes induces transient expression of innate immune response genes. Front Microbiol. 6, 373(2015).
  31. Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. A. Zebrafish axenic larvae colonization with human intestinal microbiota. Zebrafish. 15 (2), 96-106 (2018).
  32. Singleman, C., Holtzman, N. G. Growth and maturation in the zebrafish, danio rerio: A staging tool for teaching and research. Zebrafish. 11 (4), 396-406 (2014).
  33. Clift, D., Richendrfer, H., Thorn, R. J., Colwill, R. M., Creton, R. High-throughput analysis of behavior in zebrafish larvae: Effects of feeding. Zebrafish. 11 (5), 455-461 (2014).
  34. Nascimento, M. D., Schorer, M., Dos Santos, J. C. E., Rocha, M. S. A., Pedreira, M. M. Live and frozen Artemia nauplii for catfish (steindachner, 1876) larvae in different salinities. Trop Anim Health Prod. 52 (2), 653-659 (2020).
  35. Jia, P. P., et al. Breaking the mold: The first report on germ-free adult marine medaka (oryzias melastigma) models. bioRxiv. , (2023).
  36. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. JoVE. (69), e4196(2012).
  37. Wilson, C. Aspects of larval rearing. ILAR J. 53 (2), 169-178 (2012).
  38. Aleström, P. a-O., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2020).
  39. Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish. , (2002).
  40. Nursyirwani, N., et al. Phenotype and genotype of lactic acid bacteria (lab) isolated from the tiger grouper Epinephelus fuscoguttatus alimentary tract. F1000Res. 6, 1984(2017).
  41. Karolenko, C., Desilva, U., Muriana, P. M. Microbial profiling of biltong processing using culture-dependent and culture-independent microbiome analysis. Foods. 12 (4), 844(2023).
  42. Jia, P. P., et al. Chronic exposure to graphene oxide (go) induced inflammation and differentially disturbed the intestinal microbiota in zebrafish. Environ Sci Nano. 6 (8), 2452-2469 (2019).
  43. Sun, B. L., et al. Probiotic supplementation mitigates the developmental toxicity of perfluorobutanesulfonate in zebrafish larvae. Sci Total Environ. 799, 149458(2021).
  44. Qian, H. F., Liu, G. F., Lu, T., Sun, L. W. Developmental neurotoxicity of microcystis aeruginosa in the early life stages of zebrafish. Ecotoxicol Environ Saf. 151, 35-41 (2018).
  45. Bertotto, L. B., Catron, T. R., Tal, T. Exploring interactions between xenobiotics, microbiota, and neurotoxicity in zebrafish. Neurotoxicology. 76, 235-244 (2020).
  46. Jia, P. P., et al. Bacteriophage-based techniques for elucidating the function of zebrafish gut microbiota. Appl Microbiol Biotechnol. 107 (7-8), 2039-2059 (2023).
  47. Xin, G. Y., et al. Gut bacteria vibrio sp. And aeromonas sp. Trigger the expression levels of proinflammatory cytokine: First evidence from the germ-free zebrafish. Fish Shellfish Immunol. 106, 518-525 (2020).
  48. Dremova, O., et al. Sterility testing of germ-free mouse colonies. Front Immunol. 14, 1275109(2023).
  49. Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, danio rerio: A gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev Comp Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
  50. Rolig, A. S., Parthasarathy, R., Burns, A. R., Bohannan, B. J. M., Guillemin, K. Individual members of the microbiota disproportionately modulate host innate immune responses. Cell Host Microbe. 18 (5), 613-620 (2015).
  51. Stressmann, F. A., et al. Mining zebrafish microbiota reveals key community-level resistance against fish pathogen infection. ISME J. 15 (3), 702-719 (2021).
  52. Guitton, E., et al. Production of germ-free fast-growing broilers from a commercial line for microbiota studies. JoVE. (160), e61148(2020).
  53. Rea, V., Bell, I., Ball, T., Van Raay, T. Gut-derived metabolites influence neurodevelopmental gene expression and wnt signaling events in a germ-free zebrafish model. Microbiome. 10 (1), 132(2022).
  54. Russo, P., et al. Zebrafish gut colonization by mcherry-labelled lactic acid bacteria. Appl Microbiol Biotechnol. 99 (8), 3479-3490 (2015).
  55. Rawls, J. F., Mahowald, M. A., Ley, R. E., Gordon, J. I. Reciprocal gut microbiota transplants from zebrafish and mice to germ-free recipients reveal host habitat selection. Cell. 127 (2), 423-433 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Mikrobiota gospodarzamikrobiom jelitowymanipulacja mikrobiotąizolacja bakteriisekwencjonowanie 16S rRNAsterylna żywnośćfunkcje mikrobiologiczne
Generowanie, utrzymanie i identyfikacja wolnych od zarazków modeli danio pręgowanego od larw do stadiów młodocianych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.