Testy trombolizy in vitro często miały trudności z odtworzeniem warunków in vivo, czy to w trawionej skrzeplinie, czy w środowisku, w którym tromboliza zachodzi. W tym artykule badamy, w jaki sposób sprzężenie pętli Chandlera i testu fluorometrycznej fibrynolizy przepływowej w czasie rzeczywistym (RT-FluFF) jest wykorzystywane do monitorowania lizy skrzepów ex vivo o wysokiej wierności.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Śledzenie fibrynolizy skrzepów krwi pełnej uformowanych w pętli Chandlera pod wpływem przepływu ścinającego w modelu trombolizy in vitro
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Choroba zakrzepowo-zatorowa i związane z nią powikłania są główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie, a różne testy zostały opracowane w celu sprawdzenia skuteczności leków trombolitycznych zarówno in vitro, jak i in vivo. Rośnie zapotrzebowanie na bardziej fizjologicznie istotne modele skrzepów in vitro do opracowywania leków ze względu na złożoność i koszty związane z modelami zwierzęcymi, a także często brak ich przekładalności na ludzką fizjologię. Przepływ, ciśnienie i szybkość ścinania są ważnymi cechami układu krążenia, przy czym skrzepy powstające pod wpływem przepływu wykazują inną morfologię i charakterystykę trawienia niż skrzepy powstające statycznie. Czynniki te są często niereprezentowane w konwencjonalnych testach trawienia skrzepów in vitro, co może mieć implikacje farmakologiczne, które wpływają na wskaźniki powodzenia translacji leków.
Test Real-T ime Orometric Flulowing Fibrinolysis (RT-FluFF) został opracowany jako platforma do testowania trombolizy o wysokiej wierności, która wykorzystuje fluorescencyjnie znakowane skrzepy powstałe pod wpływem przepływu ścinającego, które są następnie trawione za pomocą krążącego osocza w obecności lub bez fibrynolitycznych środków farmaceutycznych. Modyfikacja natężenia przepływu zarówno na etapie tworzenia skrzepów, jak i trawienia skrzepów pozwala systemowi naśladować warunki tętnicze, płucne i żylne w bardzo zróżnicowanych konfiguracjach eksperymentalnych. Pomiary mogą być wykonywane w sposób ciągły za pomocą fluorometru in-line lub poprzez pobieranie dyskretnych punktów czasowych, a także konwencjonalny pomiar masy skrzepu w punkcie końcowym. Test RT-FluFF to elastyczny system, który pozwala na śledzenie trawienia skrzepów w czasie rzeczywistym w warunkach przepływu, które dokładniej odwzorowują warunki fizjologiczne in vivo, przy jednoczesnym zachowaniu kontroli i odtwarzalności systemu badań in vitro.
Wprowadzenie
Choroby zasadniczo wynikające z etiologii zakrzepowo-zatorowej stanowią główne źródło zachorowalności i śmiertelności w dzisiejszym społeczeństwie. Objawy patogenezy zakrzepowo-zatorowej obejmują między innymi zawały mięśnia sercowego, udary niedokrwienne, zakrzepice żył głębokich i zatorowość płucną1. Ogromna liczba trwających badań, obejmujących wiele dyscyplin, koncentruje się na opracowaniu bezpiecznych i skutecznych metod radzenia sobie z patogenną zakrzepicą. Różnice w tętniczych i żylnych objawach zakrzepicy oraz różne lokalizacje anatomiczne doprowadziły do opracowania różnych podejść do leczenia. Jednak leczenie doraźne na ogół opiera się na stosowaniu trombolizy farmakologicznej za pomocą aktywatorów plazminogenu z możliwością trombektomii mechanicznej w pewnych okolicznościach klinicznych2.
Rozwój nowatorskich strategii leczenia farmakologicznego opiera się zasadniczo zarówno na modelach zwierzęcych in vivo, jak i modelach trawienia in vitro do testów przedklinicznych3,4. Modele in vivo w naturalny sposób korzystają z ich zdolności do uchwycenia złożonej interakcji różnych parametrów fizjologicznych na skuteczność leczenia, które obejmują klirens środków farmaceutycznych, a także interakcje komórkowe z lekami. Jednak ta sama złożoność często sprawia, że takie modele są dość kosztowne i wprowadzają dodatkowe problemy przy próbie wyizolowania leżącej u podstaw farmakodynamiki/kinetyki u zwierząt, które znacznie różnią się od fizjologii człowieka. Opracowanie modeli in vitro przyczyniło się do tego, że umożliwiło przeprowadzenie destylowanych warunków testowych, w których można opracowywać leki i przeprowadzać badania przesiewowe, ale często brakuje im wierności niezbędnej do odtworzenia badanego stanu chorobowego.
Powszechnie spotykane protokoły in vitro do testowania nowych trombolityków polegają na wykorzystaniu skrzepów powstałych i poddanych lizie w warunkach statycznych, gdzie resztkowa masa skrzepu służy jako pierwszorzędowy punkt końcowy5,6. Niestety, takie techniki nie uwzględniają mechanicznych aspektów lizy skrzepów, takich jak przepływ turbulentny i spadki ciśnienia transskrzepliny, które mogą znacząco zmienić farmakodynamikę badanych leków. Dodatkowo skrzepy powstające w warunkach statycznych zawierają mikroarchitekturę, która różni się od skrzepów fizjologicznych. Wykazano w sposób powtarzalny, że obecność ścinania podczas tworzenia skrzepów wpływa na wynikające z tego cechy skrzepu, takie jak aktywacja płytek krwi i sieciowanie fibryny. Skrzepy powstające pod wpływem przepływu ścinającego wykazują złożoną niejednorodność od czubka do ogona, której nie ma w statycznie utworzonych skrzepach7,8. Takie odstępstwa od fizjologicznej architektury skrzepów mogą mieć wpływ na ważną charakterystykę rozwoju leku, która obejmuje penetrację leku w skrzeplinie i późniejszą skuteczność lizy9.
Aby rozwiązać niektóre z tych ograniczeń związanych z użyciem modeli statycznego krzepnięcia/lizy skrzepów, zastosowanie pętli Chandlera zarówno do tworzenia skrzepów, jak i lizy skrzepów w obecności ścinania spowodowało odrodzenie10. Chociaż takie systemy pozwalają na lepsze odwzorowanie dynamiki przepływu i generują skrzepy o bardziej fizjologicznie istotnej architekturze w porównaniu ze stosunkowo statycznymi testami, ich uproszczone warunki przepływu nadal stanowią odchylenie od warunków fizjologicznych. Wreszcie, podjęto również podejścia mikroprzepływowe ze względu na łatwość obrazowania i jednolite wzorce przepływu; Pozostają one jednak znaczącym odejściem od warunków fizjologicznych oczekiwanych w obrębie większych naczyń dotkniętych głównie w większości klinicznie istotnych zaburzeń zakrzepowo-zatorowych11,12.
Mając na uwadze powyższą dyskusję, opracowaliśmy model trombolizy in vitro o wysokiej wierności do przedklinicznych badań przesiewowych leków trombolitycznych. Model ma na celu rozwiązanie niektórych z obecnych pułapek opisanych powyżej w dziedzinie nowych badań przesiewowych terapii trombolitycznej i został zwalidowany pod kątem odtwarzalności i czułości przy różnych stężeniach tkankowego aktywatora plazminogenu (tPA). Opisany tutaj system oferuje fizjologiczne przepływy ścinające wykorzystujące pompę perystaltyczną, tłumik ciśnienia, podgrzewany zbiornik, dwa czujniki ciśnienia, fluorometr liniowy i fluorescencyjnie oznakowany analog skrzepu formowanego przy ścinaniu pętli Chandlera, aby ułatwić śledzenie fibrynolizy w czasie rzeczywistym13. Podsumowując, cały system nazywa się Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF Assay)14, a ten manuskrypt omówi zawiłości pomyślnego ustawiania i uruchamiania testów w tym modelu trombolizy in vitro o wysokiej wierności.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie metody wymienione poniżej są zgodne z protokołami instytucjonalnej komisji rewizyjnej (IRB) i instytucjonalnym komitetem etyki badań na ludziach. Wszyscy zdrowi ochotnicy wyrazili pisemną i świadomą zgodę przed oddaniem krwi. Warto zauważyć, że wszystkie materiały, do których odwołuje się protokół, znajdują się w Tabeli Materiałów. Podczas gdy ludzkie WB i osocze są omawiane w tym protokole, można kupić i zastąpić je krwią zwierząt badawczych i produktami krwiodawczymi zubożonymi w czynniki.
1. Pobieranie krwi pełnej
- Pobrać pełną krew żylną (WB) od zdrowych ochotników, którzy wyrazili na to zgodę, stosując standardowe techniki flebotomii.
UWAGA: Upewnij się, że przestrzegane są uniwersalne środki ostrożności w celu zmniejszenia ryzyka kontaktu z krwią lub innymi potencjalnie zakaźnymi materiałami w całym tym protokole. Konieczne jest użycie rękawiczek, fartucha laboratoryjnego i przyłbicy. - Zebrać ~50 ml WB bezpośrednio do probówek z 3,2% cytrynianem sodu i natychmiast zebrać w probówkach o pojemności 50 ml do późniejszego użycia.
UWAGA: Konieczne jest wyrzucenie probówki przed pobraniem krwi do probówki z cytrynianem, a także upewnienie się, że probówki są napełnione do objętości zalecanej przez producenta. Świeżo pobrany WB najlepiej odtworzy dynamikę krzepnięcia gospodarza. Dopuszczalne jest krótkotrwałe przechowywanie WB w temperaturze pokojowej (≤4 h przed użyciem). WB nie jest przechowywany przez noc, ponieważ wykazano, że wpływa to na dynamikę krzepnięcia podczas badania za pomocą tromboelastografii15.
2. Tworzenie się skrzepów
- Do 3 ml cytrynowanej krwi pełnej dodać fluorescencyjnie (izotiocyjanian fluoresceiny [FITC]) znakowany fibrynogenem (FITC-Fg) do końcowego stężenia 60 μg/ml (stosunek 1:50 fluorescencyjnie znakowanego fibrynogenu do niezmodyfikowanego fibrynogenu przy założeniu endogennego stężenia fibrynogenu w osoczu 3 mg/ml).
UWAGA: Stosunek ten można zwiększyć nawet do 1:10 przy minimalnym wpływie na morfologię skrzepu. 13, 14 Fluorescencyjnie oznaczony fibrynogen można kupić lub wytworzyć w wyniku reakcji fibrynogenu z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC). Mieszanie fibrynogenu należy wykonać ≤5 minut przed rozpoczęciem biegu.- Jeśli fibrynogen został wcześniej podzielony na porcje i zamrożony, należy sprawdzić rozmrożony FITC-Fg, aby upewnić się, że polimeryzacja nie rozpoczęła się przedwcześnie, co czyni go bezużytecznym (upewnić się, że w roztworze nie ma cząstek stałych lub włókien).
- Przygotuj zestaw pętli Chandlera z bębnem o średnicy 120 mm w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C (Rysunek 1). Upewnij się, że urządzenie pętli Chandlera jest w stanie obracać się ze stałą prędkością obrotową 0-90 obr./min podczas całego procesu tworzenia skrzepów.
UWAGA: Dodatkowe ustawienia i modyfikacje pętli Chandlera można znaleźć w Zeng et al.16. - Wytnij rurkę (średnica wewnętrzna 5/32", średnica zewnętrzna 7/32") i uformuj pętle, które mocno, ale nie ciasno przylegają do bębna. Aby uzyskać omówiony tutaj zalecany rozmiar rurki, wytnij standardową probówkę PCR o pojemności 200 μl, która będzie używana jako łącznik do łączenia końców rurki w celu utworzenia zamkniętej pętli.
UWAGA: Różne rozmiary rurek mogą być wykorzystane do produkcji skrzepów o różnych rozmiarach16. - Zainicjuj krzepnięcie krwi, dodając 200 mM roztworu chlorku wapnia w stosunku 1:17 roztworu wapnia do krwi pełnej. Załaduj krew do rurki (wypełnij ~50% objętości probówki) za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml. Natychmiast umieść pętlę na bębnie pętli Chandlera, łącząc końce i rozpocznij obrót.
- Upewnij się, że przed załadowaniem należy zapewnić prawidłowe wymieszanie z delikatnym odwróceniem, aby uniknąć problemów wynikających z osadzania się składników WB.
- Upewnij się, że przy każdym uruchomieniu do każdej probówki dodawana jest taka sama ilość krwi, ponieważ może to wpłynąć na rozmiar skrzepu, jeśli nie będzie utrzymywana na stałym poziomie.
- Ponieważ pęcherzyki w kolumnie krwi mogą również wpływać na krzepliwość krwi, usuń je, delikatnie przesuwając rurkę w sposób przypominający "huśtawkę", aby ułatwić ucieczkę pęcherzyków przed załadowaniem ich do bębna.
- Obracaj bęben częściowo zanurzony w łaźni wodnej z prędkością obrotową 40 obr./min, aby uzyskać obliczoną szybkość ścinania ~450 s-1.
UWAGA: Zapoznaj się z Zeng et al., aby uzyskać informacje na temat obliczanych nożyc na podstawie rozmiaru rurki i prędkości obrotowej (od 20 do 60 obr./min)16. Typowe szybkości ścinania żył i tętnic wynoszą odpowiednio 20-200 s-1 i 300-1,000 s-1, przy czym ~ 400-500 s-1 jest reprezentatywne dla tętnicy płucnej. - Pozwól na tworzenie się skrzepów przez 40-60 minut w warunkach słabego oświetlenia, aby zminimalizować fotowybielanie fluorescencyjnie znakowanego fibrynogenu.
- Po osiągnięciu pożądanego czasu krzepnięcia usuń skrzepy z rurki i natychmiast je zużyj. Aby zapewnić delikatne usunięcie skrzepów bez naruszania struktury, delikatnie odwróć rurkę, aby skrzep powoli wysunął się z rurki do małego pojemnika.
UWAGA: Przechowywanie powstałych skrzepów w osoczu cytrynianowym lub PBS przez noc w temperaturze 4 °C może mieć wpływ na późniejszą analizę trawienia skrzepów w pętli przepływu.
3. Konfiguracja urządzenia RT-FluFF
- Upewnij się, że aparat pętli przepływu jest podłączony, jak pokazano na Rysunek 2 i że wszystkie połączenia są bezpieczne. Krótko mówiąc, aparat pętli przepływu obejmuje, w kolejności kierunku przepływu: pompę > przepustnicę > czujnik ciśnienia wlotowego > czujnik ciśnienia skrzepu > wylotowego > fluorometr > podgrzewany zbiornik > pompę. Dostosuj wybór wydajności pompy, eksperymentalnego natężenia przepływu, średnicy i długości rurki, temperatury, objętości zbiornika oraz rozmiaru/geometrii skrzepu, aby dopasować go do potrzeb eksperymentalnych unikalnych dla każdego badania.
UWAGA: W tym przykładzie rurka o tej samej średnicy, która została użyta w pętli Chandlera, została użyta dla RT-FluFF. Rurka może być używana do wielu przebiegów tego samego dnia, ale musi być monitorowana pod kątem degradacji lub wycieku i wymieniana/płukana w razie potrzeby. Zaleca się płukanie ciepłą wodą destylowaną między cyklami. W zależności od projektu eksperymentalnego może być konieczna wymiana rurki po każdym uruchomieniu. - Po zabezpieczeniu wszystkich przewodów włącz monitor ciśnienia. Sprawdź, czy monitor ciśnienia wskazuje 0 mmHg zarówno dla czujnika wlotowego, jak i wylotowego. Jeśli tak się nie stanie, otwórz zawory, aby upewnić się, że czujniki ciśnienia są otwarte na ciśnienie atmosferyczne i wyzeruj czujniki.
- Włącz używany blok grzewczy lub łaźnię wodną i monitoruj temperaturę w trakcie eksperymentu. Utrzymuj temperaturę bliską 37 °C, aby naśladować fizjologiczną temperaturę ludzkiego ciała.
- Włącz pompę do żądanego natężenia przepływu, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków i sprawdzić, czy czujniki ciśnienia działają.
UWAGA: Natężenie przepływu ~160 ml/min w tym rozmiarze rurki będzie reprezentować szybkość ścinania ~500 s-1. - Wyłącz pompę, aby ułatwić ładowanie skrzepu.
4. Ładowanie skrzepu do pętli przepływu
- Jeśli wcześniej wykonany skrzep, który był przechowywany, jest używany, należy doprowadzić skrzep do temperatury pokojowej przed załadowaniem go do systemu pętli przepływu.
- Utrata masy skrzepu jest ważnym pomiarem końcowym w testach trombolizy. Najlepszą praktyką jest pomiar masy skrzepu tuż przed załadowaniem go do pętli przepływu, zamiast polegania na wcześniejszych pomiarach.
- Pomiary masy skrzepów powinny być zawsze wykonywane w ten sam sposób za każdym razem, aby zapewnić spójność między próbkami i w różnych dniach testu, ponieważ zawartość cieczy w skrzepach i na nich może znacząco wpływać na ich masę. Najlepszą praktyką jest delikatne osuszanie skrzepów na chusteczkach laboratoryjnych, aż przestaną uwalniać znaczną ilość płynu na chusteczkę, uważając, aby nie ściskać skrzepu przez cały proces pomiaru.
- Zanurzyć skrzep w osoczu (autologicznym lub z dopasowanym typem) lub innym roztworze fazy ruchomej używanym w pętli przepływu (takim jak PBS lub pożywka zdefiniowana) w płytkim pojemniku, takim jak szalka wagowa. Roztwór fazy ruchomej powinien być pobierany bezpośrednio ze zbiornika systemowego o pojemności 50 ml w celu kontroli całkowitej objętości systemu. Na etapie ładowania skrzepu nie powinien być obecny żaden środek trombolityczny ani farmaceutyczny. Zaleca się, aby całkowita objętość fazy ruchomej do uruchomienia pętli przepływu wynosiła ≥50 ml i powinna być spójna we wszystkich próbkach.
- Zdejmij środkową część rurki pętli przepływowej (między czujnikami wlotowymi i wylotowymi) i podłącz strzykawkę o pojemności 10 ml do jednego końca rurki.
- Używając wolnego końca rurki, umieść ją w plazmie (lub fazie ruchomej) i nabierz niewielką objętość roztworu, aby zagruntować rurkę. Następnie umieść wlot rurki w pobliżu skrzepu, dokładnie badając skrzep, aby zidentyfikować głowę (zwykle nieco grubszy koniec skrzepu) i ogon (koniec naprzeciwko głowy). Głowica skrzepu powinna być ustawiona w kierunku czujnika ciśnienia wlotowego i z dala od wylotu. Umieść rurkę na "ogonowym" końcu skrzepu i zassaj ją do rurki za pomocą strzykawki.
UWAGA: w przypadkach, gdy nie można wizualnie określić kierunku głowy/ogona skrzepu, kierunkowość najlepiej przypisać na podstawie znajomości kierunku obrotu z pętli Chandlera - głowa skrzepu jest skierowana w przeciwnym kierunku niż obrót bębna. - Podłącz rurkę z powrotem do głównego aparatu tak, aby skrzep znajdował się najbliżej czujnika ciśnienia wylotowego (głowa skrzepu powinna być skierowana w stronę przeciwną do czujnika wylotu). Zabezpiecz skrzep w jego pozycji, nakłuwając rurkę i główkę skrzepu dwiema igłami 30 G w kształcie "X". Pozostaw te igły na czas trwania biegu.
UWAGA: W zależności od ustawień dampener i pompy, mogą być konieczne dodatkowe igły, aby zapewnić, że skrzep nie rozpadnie się przedwcześnie. W razie potrzeby do rurki za skrzepem można dodać sitko, aby zapobiec cyrkulacji fragmentów skrzepu w systemie. Po ustaleniu ustalonej liczby igieł do utrzymania skrzepu, utrzymuj ją stałą we wszystkich warunkach. - Pobrać pozostałą część roztworu fazy ruchomej i umieścić ją w probówce o pojemności 50 ml jako zbiornik.
- Umieść zbiornik w łaźni wodnej i włóż rurkę wlotową i wylotową (wylot pochodzi z fluorometru, a wlot wchodzi do głowicy pompy).
- Sprawdź, czy używany fluorometr jest podłączony i monitorowany. Sprawdzić, czy wartość początkowa jest odpowiednia w porównaniu z punktem odniesienia dla systemu opartego wyłącznie na fazie ruchomej na początku eksperymentu.
UWAGA: Jeśli fluorometr in-line nie jest dostępny, seryjne okresowe pobieranie próbek ze zbiornika może być przeprowadzane w określonych odstępach czasu przez cały okres analizy pętli przepływu. Zebrane frakcje można odczytać za pomocą 96-dołkowej płytki natychmiast po zakończeniu eksperymentu na dowolnym dostępnym na rynku spektrofotometrze. - Dodaj 500 μl 100 000 ng/ml tPA bezpośrednio do objętości zbiornika, aby uzyskać końcowe stężenie 1 000 ng/ml tPA w 50 ml. Objętość, stężenie i konkretny dodany lek będą zależeć od pożądanego docelowego stężenia w krążeniu i objętości zbiornika systemu.
- Przed uruchomieniem pompy należy sprawdzić następujące elementy:
- Wszystkie skrzyżowania są bezpieczne.
- Dwa zawory nad czujnikami ciśnienia znajdują się w odpowiedniej pozycji zamkniętej.
- Wszelkie resztki osocza (lub płynu) zostały wymienione w zbiorniku.
- Trombolityk został dodany do zbiornika i odpowiednio wymieszany.
- Rurka doprowadzająca znajduje się blisko dna zbiornika (zapewnia to minimalne pęcherzyki).
- Rurka wylotowa jest zabezpieczona i znajduje się na odpowiedniej wysokości dla żądanego ciśnienia (w zależności od tego, która lokalizacja naczynia jest modelowana).
- Kierunek obrotów pompy jest prawidłowy (Kolejność przepływu: Pompa > Dampener > Clot > Fluorometr > Zbiornik > Pompa).
- Jeśli obroty pompy są ustawione bardzo wysoko (>150 obr./min), zacznij od mniejszej prędkości i zwiększaj, aby upewnić się, że szybka zmiana ciśnienia nie rozdrobni skrzepu ani nie spowoduje wycieku z rurki.
- Upewnij się, że system odpowiednio rejestruje dane z fluorometru i/lub materiały są przygotowane do okresowego pobierania próbek fazy ruchomej w celu odczytów punktów czasowych po eksperymencie.
- Włącz pompę i ustaw ją tak, aby osiągnęła żądane objętościowe natężenie przepływu 160 ml/min lub zwiększ natężenie przepływu, aż do osiągnięcia żądanego ciśnienia. System wypełni się płynem i pęcherzykami. Bąbelki sztucznie podniosą odczyty fluorometryczne, więc obserwuj, aż bąbelki się znikną. Gdy to zrobią, wyłącz światła i rozpocznij pobieranie danych.
- Pozostawić pompę pracującą do momentu, gdy skrzep ulegnie znacznemu zmniejszeniu lub upłynie pożądany czas eksperymentu (≥60 min). W razie potrzeby dodawaj odczynniki do systemu przez cały czas trwania eksperymentu przez zbiornik, aby stworzyć unikalne warunki eksperymentalne testujące różne warianty trombolityczne.
UWAGA: Czas eksperymentu będzie zależał od natężenia przepływu pompy (poziomu ścinania) i stężenia trombolitycznego. - Po zakończeniu testu zmniejsz objętościowe natężenie przepływu i wyjmij rurkę wlotową, gdy pompa nadal pracuje, aby wepchnąć większość płynu z układu do zbiornika (w rurce pozostanie pewna faza ruchoma). Odłącz sekcję rurki zawierającą skrzep po stronie czujnika ciśnienia wylotowego rurki i opuść ją do łodzi wagowej.
- Usuń igły, które utrzymują skrzep na miejscu, aby zebrać resztki płynu z wnętrza systemu i fragmenty skrzepu/skrzepu. W razie potrzeby należy użyć strzykawki, aby oczyścić system.
- Zważyć i przetworzyć pozostały skrzep do dodatkowej analizy, takiej jak obliczenie procentu utraconej masy lub do badania histologicznego.
5. Czyszczenie systemu
- Pomiędzy próbkami przepłukać cały układ ciepłą wodą o wysokiej prędkości obrotowej (>150 obr./min). Załaduj wodę do zbiornika i przepuść przez system przez co najmniej 2 minuty, opróżnij i uruchom ponownie, aby wykonać dwa pełne płukania systemu. Po tych płukaniach, jeśli odczyt fluorometru nie powróci do wartości wyjściowej, powtórz proces płukania dla dodatkowego cyklu. Jeśli nadal nie powróciła do linii podstawowej, całkowicie wymień rurkę przed oznaczeniem następnej próbki.
UWAGA: Podczas eksperymentów rurki mogą być ponownie używane między próbkami; Jednak ze względu na perforację za pomocą igieł służących do utrzymywania skrzepu na miejscu, odcinek rurki między czujnikami ciśnienia wlotowego i wylotowego należy wymieniać po każdym uruchomieniu. W niektórych warunkach eksperymentalnych może być konieczna wymiana całego zestawu przewodów po każdym uruchomieniu lub próbach grupowania w celu wyeliminowania zanieczyszczenia krzyżowego próbki. - Po uruchomieniu wszystkich próbek do eksperymentów tego dnia usuń wszystkie rurki i wyrzuć. Wyszoruj złącza teowe gorącą wodą i szczotką z włosia, aż będą czyste, pozostaw do wyschnięcia, a następnie spłucz strzykawki dampeners gorącą wodą. Użyj 70% EtOH, aby pomóc w bezpłodności.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Tworzenie skrzepów w pętli Chandlera
Podczas tworzenia skrzepów zazwyczaj dążyliśmy do uzyskania czterech powtórzeń, aby upewnić się, że w przypadku wystąpienia jakichkolwiek wartości odstających wśród skrzepów (na podstawie morfologii makroskopowej i masy), wciąż mieliśmy możliwość przeprowadzenia testów trombolizy w trzech powtórzeniach. Przy założeniu optymalnych warunków załadunku, wszystkie skrzepy powinny być dość jednolite pod względem długości (~3.3 cm), masy (~100 mg) i wyglądu, co przedstaw...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Tworzenie i etykietowanie skrzepów
Wykazano, że pętla Chandlera zapewnia łatwy i skuteczny sposób powtarzalnego generowania skrzepów, które naśladują skrzepliny 16 in vivo. Precyzyjne parametry dostrajania, takie jak rozmiar rurki, prędkości obrotowe, średnica bębna i czas krzepnięcia, pozwalają na szybkie generowanie skrzepów w różnych warunkach ścinania, które mogą uchwycić cechy architektoniczne cenione w szeregu skrzeplin naśladujących zarówno źródła tętnicze, ja...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez National Heart, Lung, And Blood Institute of the National Institutes of Health pod numerem R01HL167877. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 30 G Jednorazowe igły podskórne | Exel International | 26439 | Inne materiały eksploatacyjne |
| 6 mm HSS Tokarka Narzędzie 150 mm Długi | uxcell | B07SXGSQ82 | Pętla Chandlera, |
| 96-dołkowa, przezroczysta, płaska, przezroczysta mikropłytka UV | Corning | 3635 | Inne materiały eksploatacyjne, nieobrobiony kopolimer akrylowy, niesterylne |
| niesterylne strzykawki Air-Tite Luer-lock 60 ml | Air-Tite | MLB3 | RT-FluFF, tłumiki |
| Arium Mini Plus Ultrapure Water System | Sartorius | NA | DI źródło wody |
| Chlorek wapnia | Millipore Sigma | C5670 | Inne materiały eksploatacyjne |
| Jednorazowe przetworniki ciśnienia krwi | Instrumenty AD | MLT0670 | Aparatura RT-FluFF |
| Drager Siemans HemoMed Pod | Drager | 5588822 | Aparat RT-FluFF |
| Drager Monitor pacjenta Siemans | Drager | SC 7000 | Aparatura RT-FluFF |
| Bęben (cylinder, średnica 120 mm, szerokość 85 mm) | Pętla Chandlera,Osłona | ||
| twarzy | Moxe SHIELDS10 | Pętla Chandlera, | |
| Fibrynogen z ludzkiego osocza, Alexa Fluor 488 sprzężony | Thermo Scientific | F13191 | Inne materiały eksploatacyjne |
| Złączka, poliwęglan, Czterokierunkowy kran odcinający, męski Luer Lock, niesterylny | Masterflex | 30600-04 | Aparat RT-FluFF |
| Fluoresceina (FITC) | Thermo Scientific | 119245000 | Inne materiały eksploatacyjne |
| Kąpiel wodna ogólnego przeznaczenia | Thermo Scientific | 2839 | Pętla Chandlera, |
| Płyta grzejna 4 i razy; 4 | Fisher Scientific | 1152016H | Aparat RT-FluFF |
| Osocze ludzkie Świeżo mrożone | Zen-Bio | SER-SPL | Inne materiały eksploatacyjne, antykoagulant CPDA-1 |
| Ludzka krew pełna | Zen-Bio | SER-WB-SDS | Inne materiały eksploatacyjne, antykoagulant CPDA-1 |
| Głowica pompy L/S Easy-Load II do wysokowydajnych przewodów precyzyjnych, obudowa PPS, wirnik SS | Aparatura Masterflex | 77200-62 | RT-FluFF, głowica pompy |
| L/S Cyfrowa pompa napędowa o zmiennej prędkości ze zdalnym wejściem/wyjściem, od 6 do 600 obr./min; 90 do 260 VAC | Masterflex | 7528-10 | RT-FluFF, |
| regulator prędkości silnika | CoCocina | ZK-MG | Pętla Chandlera, |
| Rurki Nalgene Złącza typu T | Thermo Scientific | 6151-0312 | Aparat RT-FluFF |
| Przewody pompy perystaltycznej | Masterflex | 06424-15 | Inne materiały eksploatacyjne |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Millipore Sigma | P3813 | Inne materiały eksploatacyjne, Proszek, pH 7,4, do przygotowania roztworów 1 L |
| Zasilacz impulsowy | SoulBay | UC03U | Pętla Chandlera, |
| Thermo Scientific National Target Jednorazowe strzykawki z tworzywa sztucznego 10 ml | Thermo Scientific | S751010 | Inne materiały eksploatacyjne |
| Tkankowy aktywator plazminogenu, ludzki | Millipore Sigma | T0831 | Inne materiały eksploatacyjne |
| ID rurki ID 1/4 '', OD 3/8'' | Fisher Scientific | AGL00017 | Inne materiały eksploatacyjne, pocięte na odcinki 1,5 cm służą do łączenia rurek ze złączami |
| typu TŚrednica wewnętrzna przewodu 5/32", średnica zewnętrzna 7/32" | Tygon | ND-100-65, ADF 00009 | Inne materiały eksploatacyjne |
| V3 365 nm Mini - latarka UV z czarnym światłem | uvBeast | uvB-V3-365-MINI | Pętla Chandlera, służąca do sprawdzania zakończonych skrzepów |
| ZGA37RG ZYTD520 Silnik prądu stałego, 12 V, 100 obr./min | Pętla Pangyoo | ZGA37RG | Chandlera, |
Bibliografia
- Ali, M. R., et al. Aspect of thrombolytic therapy: a review. Scientific World Journal. 2014, 586510(2014).
- Bhogal, P., Andersson, T., Maus, V., Mpotsaris, A., Yeo, L. Mechanical thrombectomy-A brief review of a revolutionary new treatment for thromboembolic stroke. Clin Neuroradiol. 28 (3), 313-326 (2018).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
- Kaiser, E. E., West, F. D. Large animal ischemic stroke models: replicating human stroke pathophysiology. Neural Regen Res. 15 (8), 1377-1387 (2020).
- Elnager, A., et al. In vitro whole blood clot lysis for fibrinolytic activity study using d-dimer and confocal microscopy. Adv Hematol. 2014, 814684(2014).
- Prasad, S., et al. Development of an in vitro model to study clot lysis activity of thrombolytic drugs. Thromb J. 4, 14(2006).
- Robbie, L. A., Young, S. P., Bennett, B., Booth, N. A. Thrombi formed in a Chandler loop mimic human arterial thrombi in structure and RAI-1 content and distribution. Thromb Haemost. 77 (3), 510-515 (1997).
- Mutch, N. J., et al. Model thrombi formed under flow reveal the role of factor XIII-mediated cross-linking in resistance to fibrinolysis. J Thromb Haemost. 8 (9), 2017-2024 (2010).
- Blinc, A., Kennedy, S. D., Bryant, R. G., Marder, V. J., Francis, C. W. Flow through clots determines the rate and pattern of fibrinolysis. Thromb Haemost. 71 (2), 230-235 (1994).
- Mutch, N. J., et al. The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro. Br J Pharmacol. 153 (1), 124-131 (2008).
- Herbig, B. A., Yu, X., Diamond, S. L. Using microfluidic devices to study thrombosis in pathological blood flows. Biomicrofluidics. 12 (4), 042201(2018).
- Jigar Panchal, H., Kent, N. J., Knox, A. J. S., Harris, L. F. Microfluidics in haemostasis: A review. Molecules. 25 (4), 833(2020).
- Zeng, Z., et al. Fluorescently conjugated annular fibrin clot for multiplexed real-time digestion analysis. J Mater Chem B. 9 (45), 9295-9307 (2021).
- Zeng, Z., Christodoulides, A., Alves, N. J. Real-time tracking of fibrinolysis under constant wall shear and various pulsatile flows in an in-vitro thrombolysis model. Bioeng Transl Med. 8 (3), e10511(2023).
- Christodoulides, A., Zeng, Z., Alves, N. J. In-vitro thromboelastographic characterization of reconstituted whole blood utilizing cryopreserved platelets. Blood Coagul Fibrinolysis. 32 (8), 556-563 (2021).
- Zeng, Z., Nallan Chakravarthula, T., Christodoulides, A., Hall, A., Alves, N. J. Effect of Chandler loop shear and tubing size on thrombus architecture. J Mater Sci Mater Med. 34 (5), 24(2023).
- Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop. J Biomech Eng. 136 (7), (2014).
- Wojdyla, M., Raj, S., Petrov, D. Absorption spectroscopy of single red blood cells in the presence of mechanical deformations induced by optical traps. J Biomed Opt. 17 (9), (2012).
- Wu, J. H., Diamond, S. L. A fluorescence quench and dequench assay of fibrinogen polymerization, fibrinogenolysis, or fibrinolysis. Anal Biochem. 224 (1), 83-91 (1995).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
