Ten artykuł opisuje protokół badania interakcji DNA-białko za pomocą systemu interferometrii biowarstwowej (BLI) opartego na streptawidynie. Przedstawiono w nim podstawowe kroki i rozważania dotyczące wykorzystania podstawowej lub zaawansowanej kinetyki wiązania w celu określenia powinowactwa wiązania równowagi (KD) oddziaływania.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza interakcji DNA-białko za pomocą interferometrii biowarstwowej opartej na streptawidynie
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Interakcje białko-DNA leżą u podstaw podstawowych procesów komórkowych. Zrozumienie tych interakcji ma kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia mechanizmów molekularnych różnych szlaków. Kluczowe czynniki, takie jak struktura, sekwencja i długość cząsteczki DNA, mogą znacząco wpływać na wiązanie białek. Interferometria biowarstwowa (BLI) to bezznacznikowa technika, która mierzy kinetykę wiązania między cząsteczkami, oferując proste i precyzyjne podejście do ilościowego badania interakcji białko-DNA. Główną przewagą BLI nad tradycyjnymi metodami opartymi na żelu jest jej zdolność do dostarczania w czasie rzeczywistym danych na temat kinetyki wiązania, umożliwiając dokładny pomiar stałej dysocjacji równowagi (KD) dla dynamicznych interakcji białko-DNA. W artykule przedstawiono podstawowy protokół wyznaczania wartości KD interakcji między białkiem replikacyjnym DNA, białkiem replikacyjnym A (RPA) i substratem jednoniciowego DNA (ssDNA). RPA wiąże ssDNA z wysokim powinowactwem, ale musi być również łatwo przemieszczany, aby ułatwić kolejne interakcje białek w szlakach biologicznych. W opisanym teście BLI biotynylowane ssDNA jest unieruchamiane na biosensorze pokrytym streptawidyną. Następnie mierzy się kinetykę wiązania (asocjację i dysocjację) RPA z DNA związanym z biosensorem. Uzyskane dane są analizowane w celu uzyskania precyzyjnych wartości stałej szybkości asocjacji (ka), stałej szybkości dysocjacji (kd) i stałej wiązania równowagi (KD) za pomocą oprogramowania systemowego.
Wprowadzenie
Białka komórkowe odgrywają kluczową rolę w organizowaniu złożonych procesów biologicznych, które zachodzą w organizmach żywych. Optymalne funkcjonowanie tych szlaków zależy od wzajemnych oddziaływań między białkami i innymi biomolekułami wewnątrz komórki, w tym interakcji z białkami partnerskimi i kwasami nukleinowymi1. Tak więc zrozumienie zawiłości procesów komórkowych wymaga głębokiego zrozumienia dynamiki interakcji białko-kwas nukleinowy.
Tradycyjnie, interakcje białko-kwas nukleinowy były badane za pomocą testów EMSAs2. W tym teście białka są inkubowane z syntetycznymi oligonukleotydami ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie przynęty, analitu, i czyszczenie uchwytów na krople
- Ustawianie instrumentu: Włącz instrument co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem eksperymentu. Pozwoli to lampie się rozgrzać.
- Przygotowanie do usuwania i czyszczenia
- Bufor do oddzielania: Przygotować 50 ml 0,15 M kwasu fosforowego [pH 2,0]).
- Bufor czyszczący: Przygotować 10 ml 0,5 N HCl.
- Przygotowanie bufora BLI
- Przygotuj 50 ml 1x buforu BLI (50 mM Tris pH 7,5, 1 m....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W metodzie BLI białe światło jest odbijane od interfejsu warstwy biologicznej/buforu oraz wewnętrznego interfejsu referencyjnego do spektrometru. Rejestrowany jest powstały wzór interferencyjny, a przesunięcie widmowe jest mierzone w czasie i przedstawiane jako odpowiedź w postaci krzywych wiązania w nm. Reprezentacyjna ilustracja przedstawiająca końcówkę biosensora z i bez wiązania analitytu oraz odpowiadające im przesunięcie długości fali widmowej (nm) znajduje się na Rysunku 1. Krzywe wią.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Możliwość analizy kinetyki wiązania dowolnego białka z jego substratem za pomocą BLI zapewnia środki do wyizolowania i scharakteryzowania określonych czynników (takich jak sekwencja, struktura lub długość DNA) rządzących interakcjami białko-DNA w komórce19. System Octet N1, który opiera się na zasadach interferometrii biowarstw, pozwala na ilościowy pomiar oddziaływań białko-białko i białko-kwasy nukleinowe. Ponadto przy użyciu tej metodologii można określić interakcje między lipidami, przeciwciał.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana z grantów National Science Foundation (1929346) i American Cancer Society (RSG-21-028-01). Chcielibyśmy również podziękować członkom laboratorium Balakrishnan za pomocne dyskusje.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,5 ml mikroprobówki wirówkowe | Globe Scientific | 111554A | |
| 96 Well Standard Black Microplate | Dot Scientific | 4ti-0223 | |
| Biotynylowany oligonukleotyd poli dT | IDT | ||
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
| Ditiothreitol (DTT) | Dot Scientific | DSD11000-10 | |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) | Dot Scientific | DSE57020-500 | |
| Kwas solny | Fisher Naukowy | A144-500 | |
| Chusteczki Kimtec Science | Oprogramowanie Kimtech | 34120 | |
| Octet N1 | Sartorius | 1.4.0.13 | |
| Biosensor Octet SA | Sartorius | 18-5019 | |
| PBS pH 7,2 (10x) | Gibco | 1666711 | |
| Test osobisty System oktetu N1 | Sartorius | ||
| Kwas fosforowy | Ward's Science | 470302-024 | |
| Chlorek sodu (NaCl) | Dot Scientific | DSS23020-5000 | |
| Tris Base | Dot Scientific | DST60040-5000 | |
| Tween20 | Bio-Rad | 170-6531 |
Bibliografia
- Kalodimos, C. G., et al. Structure and flexibility adaptation in non-specific and specific protein-DNA complexes. Science. 305 (5682), 386-389 (2004).
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-op....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
