Artykuł metodologiczny

Szybka separacja i wyświetlanie aktywnych czynników fibrynogenolitycznych w Sipunculus nudus za pomocą elektroforezy w żelu fibrynogenowo-poliakryloamidowym

DOI:

10.3791/66536

⸱

19 kwietnia 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University, 2Medicine School, Huaqiao University, 3Department of Laboratory Medicine, Hospital of Huaqiao University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół elektroforezy w żelu fibrynogenowo-poliakrylamidowym (PAGE) do szybkiego oddzielania i wyświetlania czynników fibrynogenolitycznych Sipunculus nudus.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Środki fibrynogenolityczne, które mogą bezpośrednio rozpuszczać fibrynogen, były szeroko stosowane w leczeniu przeciwzakrzepowym. Ogólnie rzecz biorąc, identyfikacja nowych czynników fibrynogenolitycznych wymaga najpierw oddzielenia każdego składnika, a następnie sprawdzenia ich aktywności fibrynogenolitycznej. Obecnie elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE) i chromatografia są najczęściej stosowane na etapie separacji. Tymczasem test płytki fibrynogenu i PAGE oparty na produktach reakcji są zwykle przyjmowane w celu pokazania ich aktywności fibrynogenolitycznej. Jednak ze względu na czasoprzestrzenne rozdzielenie tych dwóch etapów, niemożliwe jest rozdzielenie i wyświetlenie aktywnych czynników fibrynogenolitycznych za pomocą tego samego żelu. Aby uprościć procesy separacji i wyświetlania identyfikacji czynników fibrynogenolitycznych, skonstruowaliśmy nową metodę fibrynogen-PAGE do szybkiego oddzielania i wyświetlania czynników fibrynogenolitycznych robaków orzechowych (Sipunculus nudus) w tym badaniu. Metoda ta obejmuje przygotowanie fibrynogenu-PAGE, elektroforezę, renaturację, inkubację, barwienie i odbarwianie. Aktywność fibrynogenolityczną i masę cząsteczkową białka można wykryć jednocześnie. Zgodnie z tą metodą udało nam się wykryć więcej niż jeden aktywny czynnik fibrynogenolityczny homogenianu robaków arachidowych w ciągu 6 godzin. Co więcej, ta metoda fibrynogenu-PAGE jest przyjazna czasowo i kosztowo. Co więcej, metoda ta może być wykorzystana do badania czynników fibrynogenolitycznych innych organizmów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich latach, ze względu na ciągły wzrost chorób zakrzepowych, choroby zakrzepowe stały się nowym poważnym globalnym problemem zdrowotnym1. Obecnie leki przeciwzakrzepowe dzieli się na trzy grupy: leki przeciw agregacji płytek krwi, leki przeciwzakrzepowe i leki trombolityczne. Wśród nich leki trombolityczne, takie jak urokinaza (UK), tkankowy aktywator plazminogenu (tPA) itp., są jedynymi klinicznie stosowanymi lekami, które mogą hydrolizować skrzeplinę2. W międzyczasie opracowywane są bardziej bezpieczne i skuteczne leki trombolityczne poprzez identyfikację nowych leków trombolitycznych 3.

Jednakże, identyfikacja nowych środków trombolitycznych jest czasochłonna i pracochłonna, co głównie obejmuje etapy separacji/oczyszczania i charakteryzacji/sprawdzania. Pierwszym z nich jest oddzielenie każdego składnika, a drugim wyświetlenie ich aktywności fibryno(geno)litycznej4,5. W poprzednich badaniach, pomimo faktu, że udało nam się wyizolować nowy enzym fibryno(geno)lityczny (sFE) z robaka orzechowego (Sipunculus nudus) za pomocą chromatografii powinowactwa i testu płytki fibryny(ogenu)6,7,8, procesy te są tak czasochłonne i pracochłonne. Po pierwsze, konieczne jest określenie, czy homogenaty robaków orzechowych mają aktywność fibryno(geno)lityczną za pomocą metody płytki fibryny(ogenu) i produktów reakcji opartych na PAGE9. Następnie należy przeprowadzić serię chromatografii, takich jak chromatografia jonowymienna, chromatografia filtracji żelowej, chromatografia powinowactwa i inne metody, w celu separacji i oczyszczania10,11. Następnie ponownie przeprowadza się test na płytce fibrynowej w celu sprawdzenia aktywności fibrynogenolitycznej każdego oddzielonego składnika. Na koniec przeprowadza się natywny PAGE i dodecylosiarczan sodu (SDS)-PAGE w celu określenia masy cząsteczkowej aktywnych czynników fibrynogenolitycznych12. Dlatego tak ważne jest szybkie oddzielenie i wyświetlenie aktywnych czynników fibrynogenolitycznych.

Aby szybko oddzielić i wyświetlić aktywne czynniki fibrynogenolityczne w homogenatach robaków orzechowych, opracowano nową metodę fibrynogenu-PAGE, łącząc metody PAGE i płytki fibrynogenu, tj. substraty środków fibrynomolitycznych fibrynogenu zostały dodane do natywnego żelu PAGE. Po natywnej stronie składniki zostały oddzielone według ich masy cząsteczkowej. Tymczasem każdy aktywny składnik fibrynogenolityczny może być wyświetlany przez barwienie. Dzięki tej metodzie udało nam się wykryć więcej niż jeden aktywny czynnik fibrynogenolityczny homogenatu robaka orzechowego w ciągu 6 godzin. Co więcej, ta metoda fibrynogenu-PAGE jest przyjazna czasowo i kosztowo. Co więcej, metoda ta może być wykorzystana do badania czynników fibrynogenolitycznych innych organizmów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie homogenatu z robaków orzechowych

  1. Do homogenizatora dodać 50 g robaków orzeszków ziemnych i 150 ml roztworu soli fizjologicznej.
  2. Homogenizować przy 24000 obr./min przez 60 s.
    UWAGA: Powtórz 3 razy.
  3. Odwirować homogenat o stężeniu 9710 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Zebrać supernatant jako homogenat robaka orzechowego do dalszych badań.

2. Preparat żelowy Fibrinogen-PAGE

  1. Odważyć 0,01 g fibrynogenu w szklanej zlewce o pojemności 50 ml.
  2. Dodać 1,9 ml DDH2O, 1,3 ml Tris-HCl (1,5 M, pH 8,8) i 0,05 ml SDS (10% m/v) do zlewki; dobrze wymieszać pipetując.
  3. Umieścić zlewkę w temperaturze 37 °C na 30 min.
    UWAGA: Ten krok polega na rozpuszczeniu fibrynogenu.
  4. Dodać 1,7 ml akrylamidu (30% m/v), 0,05 ml nadsiarczanu amonu (APS; 10%, m/v), 0,002 ml TEMED; dobrze wymieszać pipetując.
    UWAGA: To jest żel separacyjny.
  5. Wlej żel separujący do 10-dołkowej formy żelowej.
  6. Dodać 2 ml DDH2O do formy żelowej; odczekać 30 minut.
  7. Dokładnie usuń wodę, obracając formę do góry nogami.
  8. Dodać 1,4 ml DDH2O, 0,25 ml Tris-HCl (1,0 M, pH 6,8), 0,02 ml SDS (10%, m/v), 0,33 ml akrylamidu (30%, m/v), 0,02 ml APS (10%, w/v), 0,002 ml tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) do zlewki; dobrze wymieszać pipetując.
    UWAGA: To jest ładowanie żelu.
  9. Wlej żel ładujący do tej samej formy żelowej, co w kroku 2.5; natychmiast włóż grzebień.
    UWAGA: Zastosowany tutaj żel fibrynogen-PAGE składał się z fibrynogenu (0,2%) zawierającego żel separujący i żel obciążający. Stężenie fibrynogenu można dostosować w zależności od potrzeb.

3. Elektroforeza

  1. Przygotowany żel fibrinogen-PAGE wraz z formą klejową umieścić w zbiorniku do elektroforezy; wlać 1300 ml roztworu do elektroforezy (1,963 g Tris, 12,22 g glicyny, 0,65 g SDS i 1300 ml DDH2O) do zbiornika; wyjąć grzebień.
  2. Dodać 5 μl 5x niedenaturującego buforu ładującego do 20 μl sFE i 20 μl homogenatu robaków orzeszków ziemnych; dobrze wymieszać pipetując; załadować je do przygotowanego żelu fibrinogen-PAGE.
    UWAGA: Nie gotuj mieszaniny. sFE jest enzymem fibryno(geno)litycznym zidentyfikowanym wcześniej6,7,8 i jest stosowany jako kontrola pozytywna w tym badaniu. Homogenat robaka orzecha ziemnego jest próbką, którą należy wykryć. Niedenaturujący bufor ładujący bez błękitu bromofenolowego, β-merkaptoetanolu i SDS w porównaniu z buforem ładującym SDS-PAGE. Każdy tor próbki jest oddzielony buforem ładującym 1x SDS-PAGE, aby wyraźnie wykryć ruch białka.
  3. Elektroforezę należy wykonywać przy napięciu 80 V przez 30 minut lub przy napięciu 120 V przez 20 minut.
  4. Usuń żel fibrinogen-PAGE z formy klejowej.

4. Renaturacja

  1. Przenieś żel fibrinogen-PAGE do plastikowego pudełka.
  2. Do pudełka dodać 100 ml Tris-HCl (0,05 M, pH 7,4) i 2 ml Triton X-100. Umieść go na wytrząsarce z prędkością 60-70 obr./min na 10 minut.
  3. Usunąć bufor do płukania, pipetując.
    UWAGA: Powtórz trzy razy.

5. Inkubacja

  1. Dodaj 50 ml Tris-HCl (0,05 M, pH 7,4) do plastikowego pudełka.
  2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 h.
    UWAGA: Czas inkubacji można dostosować w zależności od siły aktywności fibrynogenolitycznej.

6. Barwienie

  1. Usunąć bufor inkubacyjny przez pipetowanie.
  2. Dodaj 50 ml roztworu Coomassie Brillant Blue Staining do pudełka i umieść pudełko na wytrząsarce z prędkością 60-70 obr./min na 30 minut.

7. Odbarwianie

  1. Usunąć roztwór barwiący za pomocą pipetowania.
  2. Dodaj 50 ml DDH2O do pudełka.
  3. Umieść pudełko na wytrząsarce z prędkością 60-70 obr./min przez 30 min.
    UWAGA: DD H2O został tutaj użyty jako roztwór odbarwiający. Czas wytrząsania można dostosować w zależności od siły aktywności fibrynogenolitycznej.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po elektroforezie, wszystkie pasma markera były wyraźnie widoczne. Pasy załadunkowe 1x SDS-PAGE pokazywały tylko pasma 10 kDa (błękit bromofenolowy). Próbki sFE i robaków orzechowych nie wykazywały żadnych obserwowalnych prążków (Ryc. 1). Chociaż pasma próbek nie są widoczne, działanie markera i błękitu bromofenolowego wskazywało, że elektroforeza zakończyła się sukcesem, a próbki zostały rozdzielone zgodnie z ich masą cząsteczkową.

Chociaż cały żel zmienił kolor na niebieski z powodu barwienia, odbarwienie sprawiło, że obszar, w którym fibrynogen został zdegradowany przez czynniki fibrynomolityczne, stał się przezroczysty. W porównaniu z markerem, sFE wskazywało na aktywne pasmo fibrynogenolityczne w pobliżu 25 kDa. Homogenat robaka orzechowego wykazywał 25 kDa, 33 kDa, 43 kDa i szereg pasm większych niż 70 kDa (Rysunek 2). Wyniki wykazały, że sFE zawierał tylko 25 kDa składnika fibrynogenolitycznego, ale homogenat robaka orzechowego zawierał składniki sFE i inne czynniki fibrynogenolityczne. Rysunek uzupełniający 1 jest przykładem obrazu żelu przedstawiającego marker w kolorze ciemnoniebieskim, a próbki docelowe jako jasne pasma.

figure-results-1
Rysunek 1: Żel po elektroforezie. M: Znacznik; Tor 1: 1x bufor ładowania SDS-PAGE; Tor 2: sFE; Tor 3: 1x bufor ładowania SDS-PAGE; Tor 4: homogenat robaka orzechowego; Tor 5: 1x bufor ładowania SDS-PAGE. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Żel po odbarwieniu. M: Znacznik; Tor 1: 1x bufor ładowania SDS-PAGE; Tor 2: sFE; Tor 3: 1x bufor ładowania SDS-PAGE; Tor 4: homogenat robaka orzechowego; Tor 5: 1x bufor ładowania SDS-PAGE. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Obraz żelu przedstawiający marker w kolorze ciemnoniebieskim i próbki docelowe jako jasne pasma. M: Znacznik; Tor 1: 1x bufor ładowania SDS-PAGE; Tor 2: sFE; Tor 3: 1x bufor ładowania SDS-PAGE; Tor 4: homogenat robaka orzechowego; Tor 5: 1x bufor ładowania SDS-PAGE. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

sFE to nowy enzym fibryno(geno)lityczny wyizolowany z robaków orzechowych przez nasz zespółwcześniej 3,6,8,13. Jednak procesy identyfikacji sFE były czasochłonne i pracochłonne, obejmowały wykrywanie aktywności fibrynogenolitycznej, separację składników białkowych i etapy potwierdzania aktywności. Jako prosta metoda, test płytkowy fibrynogenu jest najczęściej stosowany na wstępnym etapie badań przesiewowych w celu sprawdzenia aktywności fibrynogenolitycznej próbek. Jednak metoda oznaczania płytki fibrynogenu nie może odróżnić, który składnik jest aktywny. W związku z tym chromatografia i metoda natywna/SDS-PAGE muszą być używane do oddzielenia ich składników po wykryciu aktywności. Następnie produkty reakcji są ponownie rozwiązywane przez SDS-PAGE w celu potwierdzenia degradacji substratu fibrynogenu. W tej pracy substrat fibrynogen został dodany do żelu PAGE w celu wykrycia czynnika fibrynogenolitycznego. Po elektroforezie, renaturacji, inkubacji, barwieniu i odbarwieniu, masa cząsteczkowa i aktywność fibrynogenolityczna aktywnych środków fibrynogenolitycznych były wyraźnie widoczne przy użyciu tego samego żelu. Dzięki tej metodzie udało nam się wykryć więcej niż jeden aktywny czynnik fibrynogenolityczny z homogenatu robaka orzechowego w ciągu 6 godzin.

Aby osiągnąć optymalne wyniki, należy zwrócić większą uwagę na przygotowanie żelu fibrinogen-PAGE, renaturację i inkubację. Ogólnie rzecz biorąc, im niższe stężenie fibrynogenu, tym bardziej bezbarwna jest strefa fibrynogenolityczna, co świadczy o aktywności fibrynogenolitycznej środków. Jednak im niższe stężenie fibrynogenu, tym bardziej bezbarwne tło i tym trudniej jest odróżnić strefę fibrynogenolityczną od tła. Czas renaturacji będzie miał znaczący wpływ na aktywność fibrynogenolityczną składników. Jeśli ten czas jest zbyt krótki, aby zmyć SDS w żelu PAGE, aktywność fibrynogenolityczna składników zostanie zahamowana przez resztkową SDS. Podobnie, jeśli czas inkubacji jest zbyt krótki, reakcja fibrynogenolityczna nie jest dokładna. Chociaż czas inkubacji jest zbyt długi, marker używany do wskazywania masy cząsteczkowej zostanie zmyty. W tym badaniu, chociaż warunki te zostały zoptymalizowane, warunki te zostały ustawione tak, aby oddzielić i wyświetlić czynniki fibrynogenolityczne od robaków orzechowych. Tak więc spersonalizowane warunki tych krytycznych kroków powinny być ustalane zgodnie z określonymi czynnikami fibrynogenolitycznymi.

Ważne jest, aby wspomnieć, że ten fibrynogen-PAGE nadaje się tylko do badań przesiewowych czynników fibrynogenolitycznych o aktywności litycznej fibrynogenu, ale nie dla środków o aktywności litycznej fibrynogenu lub aktywacji plazminogenu. Jeśli chcemy uwidocznić te działania, metodę można zoptymalizować, zastępując fibrynogen fibryną lub plazminogenem. Kolejną kwestią, na którą warto zwrócić uwagę, jest to, że aktywne czynniki fibrynogenolityczne testowane w tym badaniu były monomerami, które nie były dotknięte w warunkach elektroforezy SDS. W związku z tym, jeśli badanymi czynnikami są polimery, metodę tę należy dostosować do warunków natywnych PAGE, które nie mogą wyświetlać masy cząsteczkowej. W związku z tym przedstawiona tutaj metoda fibrinogen-PAGE była tylko ogólną wersją podstawową, którą można zoptymalizować w celu szybkiego badania przesiewowego innych czynników fibrynogenolitycznych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane przez Biuro Nauki i Technologii miasta Xiamen (nr 3502Z20227197), Biuro Nauki i Technologii prowincji Fujian (nr 2019J01070; Nr 2022J01311) oraz projekt innowacji i przedsiębiorczości wysokiego poziomu talentów w ramach planu nauki i technologii Quanzhou (nr 2022C015R). Dziękujemy Fucai Wang (Uniwersytet Huaqiao) i Lei Tongowi (Uniwersytet Huaqiao) za ich pomoc techniczną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1  M Tris-HCl (pH 6,8)SolarbioT1020
1,5 M Tris-HCl (pH 8,8)SolarbioT1010
30% akrylamid/bis-akryloamidBiosharpBL513B
Nadsiarczan amonuXiLONG SCIENTIFIC7727-54-0
ZlewkaPYREX2-9425-02
Probówka wirówkowa (1,5 ml)BiosharpBS-15-M
Inkubator do stałej temperaturyJINGHONGJHS-400
Coomas Brillant Blue Roztwór do barwieniaBeyotimeP0017F
Elektroniczna waga analitycznaDENVERTP-213
FibrinogenSolarbioF8051
Końcówki do pipet ładowanych żelem, luzemBiosharpBS-200-GTB
HomogenizatorAHSATS-1500
Oscylator o rotacji poziomejNuoMiNMSP-600
Mili-Q ReferencyjnymiliporowyZ00QSV0CN
Mini-PROTEAN Tetra CellBIO-RAD165-8000~165-8007
N,N,N',N'-TetramethyloethelenodiamineSigmaT9281
Końcówka do pipety (1 mL)AxygeneT-1000XT-C
Końcówka do pipet (10 &mikro; L)AxygeneT-10XT-C
(200 &mikro; Piper L)AxygeneT-200XT-C
(1 mL) PipetorThermo Fisher ScientificZY18723
(10 i mikro; L)ZX98775Thermo Fisher Scientific
(200 &mikro; L)Pipeta doZY20280
(50 &mikro; L)Thermo Fisher ScientificZY15331
Wirówka z chłodzeniemcenceH1650R
Dodecylosiarcan soduSigma-AldrichV900859
TrisSolarbioT8060
Tris-HClSolarbioT8230
Triton X-100SolarbioT8200
Końcówka do pipet Pipetor Thermo Fisher Scientific

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bikdeli, B., et al. COVID-19 and thrombotic or thromboembolic disease: Implications for prevention, antithrombotic therapy, and follow-up. J Am Coll Cardiol. 75 (23), 2950-2973 (2020).
  2. Tsivgoulis, G., et al. Thrombolysis for acute ischaemic stroke: current status and future perspectives. Lancet Neurol. 22 (5), 418-429 (2023).
  3. Tang, M., Hu, C., Lin, H., Yan, H. Fibrinolytic drugs induced hemorrhage: mechanisms and solutions. Blood Coagul Fibrinolysis. 34 (5), 263-271 (2023).
  4. Lu, M., et al. Purification, characterization, and chemical modification of Bacillus velezensis SN-14 fibrinolytic enzyme. Int J Biol Macromol. 177, 601-609 (2021).
  5. Abu-Tahon, M. A., Abdel-Majeed, A. M., Ghareib, M., Housseiny, M. M., Abdallah, W. E. Thrombolytic and anticoagulant efficiencies of purified fibrinolytic enzyme produced from Cochliobolus hawaiiensis under solid-state fermentation. Biotechnol Appl Biochem. 70 (6), 1954-1971 (2023).
  6. Lin, W., Lin, H., Xin, P., Yan, H., Kang, B., Tang, M. A Comprehensive approach to analyze the cell components of cerebral blood clots. J Vis Exp. (197), e65791(2023).
  7. Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. J Vis Exp. (196), e65631(2023).
  8. Tang, M., Lin, H., Huang, Y., Xu, R., Cui, X., Yan, H. Plasmin affinity purification method based on agarose gel and plasmin and application thereof. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN116103270A/en?oq=CN202310108470 (2023).
  9. Walton, P. L. An improved fibrin plate method for the assay of plasminogen activators. Clinica Chimica Acta. 13 (5), 680-684 (1966).
  10. Ngere, J. B., Ebrahimi, K. H., Williams, R., Pires, E., Walsby-Tickle, J., McCullagh, J. S. O. Ion-exchange chromatography coupled to mass spectrometry in life science, environmental, and medical research. Anal Chem. 95 (1), 152-166 (2023).
  11. Kato, S., Takeuchi, K., Iwaki, M., Miyazaki, K., Honda, K., Hayashi, T. Chitin- and streptavidin-mediated affinity purification systems: A screening platform for enzyme discovery. Angew Chem Int Ed Engl. 62 (31), e202303764(2023).
  12. Sharma, N., Sharma, R., Rajput, Y. S., Mann, B., Singh, R., Gandhi, K. Separation methods for milk proteins on polyacrylamide gel electrophoresis: Critical analysis and options for better resolution. International Dairy Journal. 114, 104920(2021).
  13. Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

PAGE z u yciem fibrynogenunicienie ziemnetest p ytkowy z fibrynogenemleki trombolitycznerozdzia bia ekoznaczanie masy cz steczkowejchoroby uk adu sercowo naczyniowego

Powiązane artykuły