Tutaj prezentujemy protokół elektroforezy w żelu fibrynogenowo-poliakrylamidowym (PAGE) do szybkiego oddzielania i wyświetlania czynników fibrynogenolitycznych Sipunculus nudus.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Szybka separacja i wyświetlanie aktywnych czynników fibrynogenolitycznych w Sipunculus nudus za pomocą elektroforezy w żelu fibrynogenowo-poliakryloamidowym
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Środki fibrynogenolityczne, które mogą bezpośrednio rozpuszczać fibrynogen, były szeroko stosowane w leczeniu przeciwzakrzepowym. Ogólnie rzecz biorąc, identyfikacja nowych czynników fibrynogenolitycznych wymaga najpierw oddzielenia każdego składnika, a następnie sprawdzenia ich aktywności fibrynogenolitycznej. Obecnie elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE) i chromatografia są najczęściej stosowane na etapie separacji. Tymczasem test płytki fibrynogenu i PAGE oparty na produktach reakcji są zwykle przyjmowane w celu pokazania ich aktywności fibrynogenolitycznej. Jednak ze względu na czasoprzestrzenne rozdzielenie tych dwóch etapów, niemożliwe jest rozdzielenie i wyświetlenie aktywnych czynników fibrynogenolitycznych za pomocą tego samego żelu. Aby uprościć procesy separacji i wyświetlania identyfikacji czynników fibrynogenolitycznych, skonstruowaliśmy nową metodę fibrynogen-PAGE do szybkiego oddzielania i wyświetlania czynników fibrynogenolitycznych robaków orzechowych (Sipunculus nudus) w tym badaniu. Metoda ta obejmuje przygotowanie fibrynogenu-PAGE, elektroforezę, renaturację, inkubację, barwienie i odbarwianie. Aktywność fibrynogenolityczną i masę cząsteczkową białka można wykryć jednocześnie. Zgodnie z tą metodą udało nam się wykryć więcej niż jeden aktywny czynnik fibrynogenolityczny homogenianu robaków arachidowych w ciągu 6 godzin. Co więcej, ta metoda fibrynogenu-PAGE jest przyjazna czasowo i kosztowo. Co więcej, metoda ta może być wykorzystana do badania czynników fibrynogenolitycznych innych organizmów.
Wprowadzenie
W ostatnich latach, ze względu na ciągły wzrost chorób zakrzepowych, choroby zakrzepowe stały się nowym poważnym globalnym problemem zdrowotnym1. Obecnie leki przeciwzakrzepowe dzieli się na trzy grupy: leki przeciw agregacji płytek krwi, leki przeciwzakrzepowe i leki trombolityczne. Wśród nich leki trombolityczne, takie jak urokinaza (UK), tkankowy aktywator plazminogenu (tPA) itp., są jedynymi klinicznie stosowanymi lekami, które mogą hydrolizować skrzeplinę2. W międzyczasie opracowywane są bardziej bezpieczne i skuteczne leki trombolityczne poprzez identyfikację nowych leków trombolitycznych 3.
Jednakże, identyfikacja nowych środków trombolitycznych jest czasochłonna i pracochłonna, co głównie obejmuje etapy separacji/oczyszczania i charakteryzacji/sprawdzania. Pierwszym z nich jest oddzielenie każdego składnika, a drugim wyświetlenie ich aktywności fibryno(geno)litycznej4,5. W poprzednich badaniach, pomimo faktu, że udało nam się wyizolować nowy enzym fibryno(geno)lityczny (sFE) z robaka orzechowego (Sipunculus nudus) za pomocą chromatografii powinowactwa i testu płytki fibryny(ogenu)6,7,8, procesy te są tak czasochłonne i pracochłonne. Po pierwsze, konieczne jest określenie, czy homogenaty robaków orzechowych mają aktywność fibryno(geno)lityczną za pomocą metody płytki fibryny(ogenu) i produktów reakcji opartych na PAGE9. Następnie należy przeprowadzić serię chromatografii, takich jak chromatografia jonowymienna, chromatografia filtracji żelowej, chromatografia powinowactwa i inne metody, w celu separacji i oczyszczania10,11. Następnie ponownie przeprowadza się test na płytce fibrynowej w celu sprawdzenia aktywności fibrynogenolitycznej każdego oddzielonego składnika. Na koniec przeprowadza się natywny PAGE i dodecylosiarczan sodu (SDS)-PAGE w celu określenia masy cząsteczkowej aktywnych czynników fibrynogenolitycznych12. Dlatego tak ważne jest szybkie oddzielenie i wyświetlenie aktywnych czynników fibrynogenolitycznych.
Aby szybko oddzielić i wyświetlić aktywne czynniki fibrynogenolityczne w homogenatach robaków orzechowych, opracowano nową metodę fibrynogenu-PAGE, łącząc metody PAGE i płytki fibrynogenu, tj. substraty środków fibrynomolitycznych fibrynogenu zostały dodane do natywnego żelu PAGE. Po natywnej stronie składniki zostały oddzielone według ich masy cząsteczkowej. Tymczasem każdy aktywny składnik fibrynogenolityczny może być wyświetlany przez barwienie. Dzięki tej metodzie udało nam się wykryć więcej niż jeden aktywny czynnik fibrynogenolityczny homogenatu robaka orzechowego w ciągu 6 godzin. Co więcej, ta metoda fibrynogenu-PAGE jest przyjazna czasowo i kosztowo. Co więcej, metoda ta może być wykorzystana do badania czynników fibrynogenolitycznych innych organizmów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie homogenatu z robaków orzechowych
- Do homogenizatora dodać 50 g robaków orzeszków ziemnych i 150 ml roztworu soli fizjologicznej.
- Homogenizować przy 24000 obr./min przez 60 s.
UWAGA: Powtórz 3 razy. - Odwirować homogenat o stężeniu 9710 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
- Zebrać supernatant jako homogenat robaka orzechowego do dalszych badań.
2. Preparat żelowy Fibrinogen-PAGE
- Odważyć 0,01 g fibrynogenu w szklanej zlewce o pojemności 50 ml.
- Dodać 1,9 ml DDH2O, 1,3 ml Tris-HCl (1,5 M, pH 8,8) i 0,05 ml SDS (10% m/v) do zlewki; dobrze wymieszać pipetując.
- Umieścić zlewkę w temperaturze 37 °C na 30 min.
UWAGA: Ten krok polega na rozpuszczeniu fibrynogenu. - Dodać 1,7 ml akrylamidu (30% m/v), 0,05 ml nadsiarczanu amonu (APS; 10%, m/v), 0,002 ml TEMED; dobrze wymieszać pipetując.
UWAGA: To jest żel separacyjny. - Wlej żel separujący do 10-dołkowej formy żelowej.
- Dodać 2 ml DDH2O do formy żelowej; odczekać 30 minut.
- Dokładnie usuń wodę, obracając formę do góry nogami.
- Dodać 1,4 ml DDH2O, 0,25 ml Tris-HCl (1,0 M, pH 6,8), 0,02 ml SDS (10%, m/v), 0,33 ml akrylamidu (30%, m/v), 0,02 ml APS (10%, w/v), 0,002 ml tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) do zlewki; dobrze wymieszać pipetując.
UWAGA: To jest ładowanie żelu. - Wlej żel ładujący do tej samej formy żelowej, co w kroku 2.5; natychmiast włóż grzebień.
UWAGA: Zastosowany tutaj żel fibrynogen-PAGE składał się z fibrynogenu (0,2%) zawierającego żel separujący i żel obciążający. Stężenie fibrynogenu można dostosować w zależności od potrzeb.
3. Elektroforeza
- Przygotowany żel fibrinogen-PAGE wraz z formą klejową umieścić w zbiorniku do elektroforezy; wlać 1300 ml roztworu do elektroforezy (1,963 g Tris, 12,22 g glicyny, 0,65 g SDS i 1300 ml DDH2O) do zbiornika; wyjąć grzebień.
- Dodać 5 μl 5x niedenaturującego buforu ładującego do 20 μl sFE i 20 μl homogenatu robaków orzeszków ziemnych; dobrze wymieszać pipetując; załadować je do przygotowanego żelu fibrinogen-PAGE.
UWAGA: Nie gotuj mieszaniny. sFE jest enzymem fibryno(geno)litycznym zidentyfikowanym wcześniej6,7,8 i jest stosowany jako kontrola pozytywna w tym badaniu. Homogenat robaka orzecha ziemnego jest próbką, którą należy wykryć. Niedenaturujący bufor ładujący bez błękitu bromofenolowego, β-merkaptoetanolu i SDS w porównaniu z buforem ładującym SDS-PAGE. Każdy tor próbki jest oddzielony buforem ładującym 1x SDS-PAGE, aby wyraźnie wykryć ruch białka. - Elektroforezę należy wykonywać przy napięciu 80 V przez 30 minut lub przy napięciu 120 V przez 20 minut.
- Usuń żel fibrinogen-PAGE z formy klejowej.
4. Renaturacja
- Przenieś żel fibrinogen-PAGE do plastikowego pudełka.
- Do pudełka dodać 100 ml Tris-HCl (0,05 M, pH 7,4) i 2 ml Triton X-100. Umieść go na wytrząsarce z prędkością 60-70 obr./min na 10 minut.
- Usunąć bufor do płukania, pipetując.
UWAGA: Powtórz trzy razy.
5. Inkubacja
- Dodaj 50 ml Tris-HCl (0,05 M, pH 7,4) do plastikowego pudełka.
- Inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 h.
UWAGA: Czas inkubacji można dostosować w zależności od siły aktywności fibrynogenolitycznej.
6. Barwienie
- Usunąć bufor inkubacyjny przez pipetowanie.
- Dodaj 50 ml roztworu Coomassie Brillant Blue Staining do pudełka i umieść pudełko na wytrząsarce z prędkością 60-70 obr./min na 30 minut.
7. Odbarwianie
- Usunąć roztwór barwiący za pomocą pipetowania.
- Dodaj 50 ml DDH2O do pudełka.
- Umieść pudełko na wytrząsarce z prędkością 60-70 obr./min przez 30 min.
UWAGA: DD H2O został tutaj użyty jako roztwór odbarwiający. Czas wytrząsania można dostosować w zależności od siły aktywności fibrynogenolitycznej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po elektroforezie wszystkie prążki markera były wyraźnie widoczne. W ścieżkach ładowania 1x SDS-PAGE widoczne były jedynie prążki 10 kDa (błękit bromofenolowy). Próbki sFE i dżdżownic orzeszkowych nie wykazały żadnych obserwowalnych prążków (Rysunek 1). Mimo że prążki próbek nie są widoczne, prawidłowe działanie markera i błękitu bromofenolowego wskazało, że elektroforeza przebiegła pomyślnie, a próbki zostały rozdzielone zgodnie z ich masą cząsteczkową.
Choć cały...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
sFE to nowy enzym fibryno(geno)lityczny wyizolowany z robaków orzechowych przez nasz zespółwcześniej 3,6,8,13. Jednak procesy identyfikacji sFE były czasochłonne i pracochłonne, obejmowały wykrywanie aktywności fibrynogenolitycznej, separację składników białkowych i etapy potwierdzania aktywności. Jako prosta metoda, test płytkowy fibrynogenu jest najczęściej stosowany na wstępnym etapie badań ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
To badanie zostało sfinansowane przez Biuro Nauki i Technologii miasta Xiamen (nr 3502Z20227197), Biuro Nauki i Technologii prowincji Fujian (nr 2019J01070; Nr 2022J01311) oraz projekt innowacji i przedsiębiorczości wysokiego poziomu talentów w ramach planu nauki i technologii Quanzhou (nr 2022C015R). Dziękujemy Fucai Wang (Uniwersytet Huaqiao) i Lei Tongowi (Uniwersytet Huaqiao) za ich pomoc techniczną.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl (pH 6,8) | Solarbio | T1020 | |
| 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) | Solarbio | T1010 | |
| 30% akrylamid/bis-akryloamid | Biosharp | BL513B | |
| Nadsiarczan amonu | XiLONG SCIENTIFIC | 7727-54-0 | |
| Zlewka | PYREX | 2-9425-02 | |
| Probówka wirówkowa (1,5 ml) | Biosharp | BS-15-M | |
| Inkubator do stałej temperatury | JINGHONG | JHS-400 | |
| Coomas Brillant Blue Roztwór do barwienia | Beyotime | P0017F | |
| Elektroniczna waga analityczna | DENVER | TP-213 | |
| Fibrinogen | Solarbio | F8051 | |
| Końcówki do pipet ładowanych żelem, luzem | Biosharp | BS-200-GTB | |
| Homogenizator | AHS | ATS-1500 | |
| Oscylator o rotacji poziomej | NuoMi | NMSP-600 | |
| Mili-Q Referencyjny | miliporowy | Z00QSV0CN | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | BIO-RAD | 165-8000~165-8007 | |
| N,N,N',N'-Tetramethyloethelenodiamine | Sigma | T9281 | |
| Końcówka do pipety (1 mL) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Końcówka do pipet (10 &mikro; L) | Axygene | T-10XT-C | |
| (200 &mikro; Piper L) | Axygene | T-200XT-C | |
| (1 mL) Pipetor | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| (10 i mikro; L) | ZX98775 | Thermo Fisher Scientific | |
| (200 &mikro; L) | Pipeta do | ZY20280 | |
| (50 &mikro; L) | Thermo Fisher Scientific | ZY15331 | |
| Wirówka z chłodzeniem | cence | H1650R | |
| Dodecylosiarcan sodu | Sigma-Aldrich | V900859 | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| Tris-HCl | Solarbio | T8230 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 |
Bibliografia
- Bikdeli, B., et al. COVID-19 and thrombotic or thromboembolic disease: Implications for prevention, antithrombotic therapy, and follow-up. J Am Coll Cardiol. 75 (23), 2950-2973 (2020).
- Tsivgoulis, G., et al. Thrombolysis for acute ischaemic stroke: current status and future perspectives. Lancet Neurol. 22 (5), 418-429 (2023).
- Tang, M., Hu, C., Lin, H., Yan, H. Fibrinolytic drugs induced hemorrhage: mechanisms and solutions. Blood Coagul Fibrinolysis. 34 (5), 263-271 (2023).
- Lu, M., et al. Purification, characterization, and chemical modification of Bacillus velezensis SN-14 fibrinolytic enzyme. Int J Biol Macromol. 177, 601-609 (2021).
- Abu-Tahon, M. A., Abdel-Majeed, A. M., Ghareib, M., Housseiny, M. M., Abdallah, W. E. Thrombolytic and anticoagulant efficiencies of purified fibrinolytic enzyme produced from Cochliobolus hawaiiensis under solid-state fermentation. Biotechnol Appl Biochem. 70 (6), 1954-1971 (2023).
- Lin, W., Lin, H., Xin, P., Yan, H., Kang, B., Tang, M. A Comprehensive approach to analyze the cell components of cerebral blood clots. J Vis Exp. (197), e65791(2023).
- Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. J Vis Exp. (196), e65631(2023).
- Tang, M., Lin, H., Huang, Y., Xu, R., Cui, X., Yan, H. Plasmin affinity purification method based on agarose gel and plasmin and application thereof. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN116103270A/en?oq=CN202310108470 (2023).
- Walton, P. L. An improved fibrin plate method for the assay of plasminogen activators. Clinica Chimica Acta. 13 (5), 680-684 (1966).
- Ngere, J. B., Ebrahimi, K. H., Williams, R., Pires, E., Walsby-Tickle, J., McCullagh, J. S. O. Ion-exchange chromatography coupled to mass spectrometry in life science, environmental, and medical research. Anal Chem. 95 (1), 152-166 (2023).
- Kato, S., Takeuchi, K., Iwaki, M., Miyazaki, K., Honda, K., Hayashi, T. Chitin- and streptavidin-mediated affinity purification systems: A screening platform for enzyme discovery. Angew Chem Int Ed Engl. 62 (31), e202303764(2023).
- Sharma, N., Sharma, R., Rajput, Y. S., Mann, B., Singh, R., Gandhi, K. Separation methods for milk proteins on polyacrylamide gel electrophoresis: Critical analysis and options for better resolution. International Dairy Journal. 114, 104920(2021).
- Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
