Znaczenie małych kolonii w lekooporności Candida spp. nie zostało w pełni zbadane. Przeciwdrobnoustrojowa terapia fotodynamiczna (aPDT) stanowi obiecującą strategię walki z lekoopornymi infekcjami grzybiczymi. Badanie to pokazuje, że aPDT za pośrednictwem róży bengalskiej skutecznie dezaktywuje Candida glabrata i indukuje drobne kolonie, prezentując unikalną procedurę.
Artykuł metodologiczny
Indukcja drobnych kolonii w Candida glabrate za pomocą terapii fotodynamicznej za pośrednictwem Rose Bengal
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W obliczu 40% śmiertelności u pacjentów z candedemią, lekooporne Candida i ich drobne mutanty pozostają głównym wyzwaniem terapeutycznym. Przeciwdrobnoustrojowa terapia fotodynamiczna (aPDT) jest ukierunkowana na wiele struktur grzybiczych, w przeciwieństwie do antybiotyków/leków przeciwgrzybiczych, potencjalnie udaremniając oporność. Tradycyjne metody indukowania małych kolonii opierają się na bromku etydyny lub flukonazolu, które mogą wpływać na wrażliwość na leki i reakcje na stres. W badaniu tym oceniano zastosowanie zielonego światła (szczyt 520 nm) i fotouczulacza różowego bengalu (RB) w celu zwalczania lekoopornego izolatu Candida glabrata. Wyniki ujawniły, że leczenie aPDT znacząco hamowało wzrost komórek (redukcja o ≥99,9%) i skutecznie indukowało tworzenie drobnych kolonii, o czym świadczy zmniejszony rozmiar i utrata barwienia mitochondrialnego wskaźnika redoks. Badanie to dostarcza wstępnych dowodów na to, że aPDT może indukować małe kolonie w wielolekoopornym szczepie C. glabrata in vitro, oferując potencjalnie przełomowe podejście do zwalczania opornych infekcji grzybiczych.
Wprowadzenie
Infekcje grzybicze, szczególnie te wywołane przez Candida albicans i coraz bardziej oporną na leki Candida glabrata, stanowią poważne globalne zagrożenie1. Infekcje te mogą być śmiertelne, szczególnie dla pacjentów hospitalizowanych i osób z osłabionym układem odpornościowym. Rosnąca oporność na leki przeciwgrzybicze zagraża kontroli inwazyjnej kandydozy, ciężkiej infekcji grzybiczej o wysokiej śmiertelności, zwłaszcza u Candida albicans2. Oporne szczepy utrudniają skuteczne leczenie, potencjalnie zwiększając zarówno złożoność, jak i śmiertelność. W hrabstwie Alameda w Kalifornii w USA C. glabrata stał się najbardziej rozpowszechnionym gatunkiem inwazyjnym3. Na tę zmianę w występowaniu i rozmieszczeniu gatunków Candida mogą mieć wpływ lokalne praktyki opieki zdrowotnej, dane demograficzne pacjentów, stosowanie środków przeciwgrzybiczych oraz występowanie czynników ryzyka zakażeń Candida.
Drobne mutanty w Candida, pozbawione funkcjonalnych mitochondriów, ujawniają, jak te organelle wpływają na reakcję na leki, zjadliwość i odporność na stres4,5. C. glabrata łatwo tworzy te kolonie, zyskując wrażliwość na polieny, jednocześnie tracąc ją na rzecz azoles6. Wrażliwość na azole i funkcja oddechowa są ze sobą ściśle powiązane, a zmniejszone oddychanie prowadzi do oporności poprzez utratę mitochondrialnego DNA7. Małe kolonie C. glabrata z opornością na azol zostały wyizolowane z próbek ludzkiego kału od biorcy przeszczepu szpiku kostnego poddanego leczeniu flukonazolem8 oraz z butelek do hodowli krwi pacjentów z infekcjami krwi9. Ich potencjalne implikacje dla oporności na leki, zjadliwości i reakcji na stres podkreślają ich znaczenie kliniczne. Dodatkowo, ich wyjątkowe właściwości sprawiają, że są cennymi narzędziami do badania fundamentalnych pytań w biologii mitochondrialnej5. Wraz z postępem badań nad drobnymi mutantami, ich zastosowania zarówno w badaniach klinicznych, jak i podstawowych prawdopodobnie będą się rozszerzać.
To badanie wykazało, że terapia fotodynamiczna (PDT) może indukować drobne kolonie u C. glabrata, rozszerzając zakres metod poza tradycyjne techniki wystawiania C. glabrata na działanie bromku etydyny lub flukonazolu.
Protokół
1. Hodowla C. glabrata
UWAGA: Do eksperymentów użyto wielolekoopornego C. glabrata (C2-1000907), który jest odporny na większość środków przeciwgrzybiczych, w tym flukonazol. Warunki doświadczalne mogą wymagać dostosowania do konkretnego szczepu, ponieważ mogą występować różnice między różnymi szczepami. We wszystkich eksperymentach wykorzystano Candidę w fazie logarytmicznej wyhodowaną w temperaturze 25 °C (naśladującą naturalną infekcję) w celu uzyskania konsystencji. Brak strzępek u C. glabrata upraszcza kwantyfikację w porównaniu z C. albicans, który tworzy strzępki w temperaturze 37 °C10.
- Aby przygotować kulturę C. glabrata w fazie logarytmicznej, wybierz pojedynczą kolonię z płytki agarowej i przenieś ją do szklanej probówki z 3 ml sterylnego pożywki z dekstrozy peptonowej (YPD) (patrz Tabela materiałów). Inkubować przez 14-16 godzin w temperaturze 25 °C z wytrząsaniem (155 obr./min, kąt 45° w celu zwiększenia przepuszczalności powietrza do pożywki).
- Po inkubacji rozcieńczyć kulturę świeżym YPD do OD600 0,1 przy użyciu sterylnej techniki. Inkubować w temperaturze 25 °C przez 6 godzin, wytrząsając przy 155 obr./min. Sprawdź fazę logarytmiczną C. glabrata, mierząc OD600. Celuj w 0,65-1,00, co odpowiada 1 × 10 7-1,5 × 107 komórek/ml.
2. Indukcja drobnych kolonii za pomocą bromku etydyny, flukonazolu i terapii fotodynamicznej
- Indukcja drobnych kolonii bromku etydyny
- Dostosuj zawiesinę drożdży do OD600 0,1 (5 × 106 komórek/ml) z YPD do końcowej objętości 3 ml, a następnie dodać 30 μl bulionu bromku etydyny (10 mg/ml) (patrz tabela materiałów) dla końcowego stężenia 100 μg/ml.
- Zawiesinę drożdży inkubować przez noc (16-18 godzin) w temperaturze 25 °C, 155 obr./min, pod kątem 45°. Dostosuj do OD600 wynoszącego 0,65 (1 × 107 komórek/ml). Wykonać 10-krotną serię rozcieńczeń na 96-dołkowej płytce, dodając 20 μl dostosowanej zawiesiny drożdży do 180 μl PBS na basenik. W ten sposób powstaje sześć rozcieńczeń w zakresie od 10-1 do 10-5.
- Wybrać 4 współczynniki rozcieńczenia (np. 100, 101, 102 i 103) i umieścić 3 krople (20 μl) każdy na 4 ćwiartkach płytek agarowych YPD (trzykrotnie).
- Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C. Wybrać ćwiartki z 5-80 koloniami z wcześniej wybranych rozcieńczeń do barwienia chlorkiem trifenylotetrazolu (TTC) 11 (patrz krok 3). Skanuj płyty w rozdzielczości 1200 dpi za pomocą 48-bitowego, kolorowego skanera optycznego.
- Indukcja małych kolonii flukonazolu
UWAGA: Aby przyspieszyć ten proces, należy użyć komórek T3 (mieszanina normalnych i drobnych komórek uzyskanych po 3 zabiegach RB-PDT; patrz krok 2.3) do tworzenia drobnych kolonii indukowanych flukonazolem. Dzieje się tak, ponieważ standardowe leczenie zazwyczaj powoduje wolniejsze powstawanie.- Przygotować i dostosować zawiesinę komórek drożdży zgodnie z opisem w kroku 2.1.1.
- Inkubować przez noc (16-18 godzin) w temperaturze 25 °C. Ponownie ustawić OD600 na 0,1.
- Przenieść 1 ml dostosowanej zawiesiny do sterylnej probówki o pojemności 5 ml.
- Zanurz sterylny bawełniany wacik (o długości 15 cm, z końcówką o wymiarach 0.9 cm x 2.6 cm, patrz Tabela materiałów) w zawiesinie drożdży, upewniając się do kontaktu z dnem probówki i przekręcając w celu usunięcia nadmiaru płynu ze ścianki probówki.
- Przygotuj płytki w okapie za pomocą agaru Mueller-Hinton (patrz tabela materiałów).
- Przetrzyj bawełnę w przód iw tył na agarze , dwukrotnie obróć o 60°, a następnie przetrzyj obwód, aby uzyskać równomierne pokrycie.
- Sterylizuj kleszcze nad płomieniem przez 1-2 s, pozwalając im na chwilę ostygnąć, a następnie użyj ich do zebrania pustych krążków.
- Podziel płytkę na trzy równe sektory za pomocą markera. Umieść jeden pusty dysk na środku każdego sektora.
- Dodać 12,5 μl bulionu flukonazolu (2 mg/ml, patrz tabela materiałów) do każdego krążka (25 μg/krążek), dokładnie wymieszać, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20-24 godziny.
- Wykonaj barwienie TTC (patrz krok 3). Skanuj płyty w rozdzielczości 1200 dpi za pomocą 48-bitowego, kolorowego skanera optycznego.
- Indukcja małych kolonii PDT
UWAGA: Różne grzyby mogą wytwarzać różną liczbę drobnych kolonii po PDT. Niektóre szczepy mogą w ogóle ich nie produkować.- Przygotuj system aPDT.
UWAGA: Procedura konfiguracji urządzenia systemowego aPDT jest zgodna z metodą opisaną przez Hung et al12. Krótko mówiąc, system aPDT składa się z zielonej matrycy LED o wartości szczytowej 520 nm (patrz Tabela Materiałów), świecącej światłem od dołu z dobrym wyrównaniem z każdym dołkiem 96-dołkowej płytki. - Dostosuj zawiesinę komórek drożdży w pożywce YPD do OD600 0,65 (około 1 × 107 komórek/ml).
- Wymieszaj 1 ml zawiesiny drożdży ze 111 μl 2% różowego bengalu (RB, Rysunek 1) (patrz tabela materiałów) w okrągłej probówce, aby uzyskać końcowe stężenie RB 0,2%. Inkubować mieszaninę w temperaturze 25 °C przez 15 minut, obracając ją pod kątem 45° przy 155 obr./min.
- Przenieść mieszaninę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 16 100 x g przez 2,5 minuty (w temperaturze pokojowej).
- Wyrzuć supernatant i delikatnie zeskrob probówkę pięć razy o podłogę okapu, aby ponownie zawiesić osad.
- Umyj zawiesinę 1x PBS cztery razy, aby usunąć cały RB. Po każdym przemyciu następuje ponowne zawieszenie granulki z krótkim wirowaniem lub pipetowaniem w celu dokładnego ponownego wymieszania.
- Po ostatnim umyciu dodaj 1000 μL PBS. Roztwór ma jasnoróżowy kolor. Przenieść 200 μl przemytej zawiesiny drożdży obciążonej RB do każdej z trzech studzienek na 96-dołkowej płytce (trzykrotnie).
- Umieść 96-dołkową płytkę na systemie światła fotodynamicznego z żarówkami LED świecącymi zielonym światłem od dołu. Wyłącz światła w pomieszczeniu, aby zapewnić równomierne oświetlenie i zapobiec zakłóceniom. Aktywuj system oświetlenia LED, aby dostarczyć dawkę PDT 4,38 J/cm2 w ciągu 2 minut; Upewnij się, że system jest prawidłowo wyrównany ze studzienkami.
- Po napromienieniu rozcieńczyć zawiesinę drożdży w 96-dołkowej płytce. Dodać 20 μl zawiesiny drożdży do studzienki zawierającej 180 μl PBS, tworząc 10-krotne rozcieńczenie. Powtórz dla pozostałych rozcieńczeń, aby uzyskać zakres od 10-1 do 10-5.
- Wybierz cztery współczynniki rozcieńczenia (np. 10-2 do 10-5) w oparciu o dostosowanie stężenia komórek drożdży.
- Dla każdego współczynnika rozcieńczenia, umieścić 3 krople (po 20 μl każda) na ćwiartkę na płytkach agarowych YPD.
- Po całkowitym wchłonięciu zawiesiny drożdży, około 10 minut przy płytkach agarowych, odwrócić i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
- Zdefiniuj T0 jako kontrolny rodzic C. glabrata bez leczenia PDT. Przygotować grzyby T0 w fazie wzrostu logarytmicznej, jak opisano powyżej, i wystawić je na działanie zielonego światła 4,38 J/cm2 w obecności 0,2% RB. Ten stan PDT konsekwentnie hamuje od 3 do 3,5 logarytmów wzrostu grzybów.
- Oznacz ocalałe grzyby jako T1 i ponownie poddaj je tej samej dawce PDT po ich ekspansji in vitro do fazy wzrostu logarytmicznej. Grzyby, które przeżyły po drugim PDT, są oznaczane jako T2 i tak dalej.
- Następnego dnia wybierz ćwiartki z liczbą kolonii od 5 do 80. Policz liczbę kolonii w każdym kwadrancie i oblicz miano za pomocą następującego wzoru: Jednostka tworząca kolonię (CFU)/ml = liczba kolonii (średnia z trzech części) × Współczynnik rozcieńczenia × 50.
- Wykonaj barwienie TTC (patrz krok 3). Zeskanuj płytkę zgodnie z wcześniejszym opisem (krok 2.2).
- Przygotuj system aPDT.
3. Analiza funkcji mitochondriów (test barwienia TCC)
UWAGA: TTC jest wskaźnikiem redoks i akceptorem elektronów. Zmienia kolor na czerwony, gdy białe związki są rozbijane przez elektrony11. Należy pamiętać, że nie wszystkie komórki muszą tworzyć widoczne kolonie w ciągu 24 godzin po hodowli na płytce agarowej. Kolonie z funkcjonalnymi mitochondriami zmieniają kolor na czerwony, podczas gdy te z niefunkcjonalnymi mitochondriami pozostają białe. Pozwala to na różnicowanie kolonii o różnej funkcjonalności mitochondriów.
- Po zabiegu rozcieńczyć zawiesiny Candida na płytkach agarowych YPD zgodnie z pożądaną gęstością komórek, aby uzyskać wyraźne kolonie w celu łatwej wizualizacji i barwienia.
- Po 24 godzinach wzrostu w temperaturze 37 °C z pojedynczej komórki tworzą się widoczne kolonie. Odpipetować 20 μl 20% TTC bezpośrednio na środek każdej kolonii.
- Po całkowitym wchłonięciu, około 10 minut TTC przez kolonie, inkubować w temperaturze 37 °C przez 30-40 minut.
4. Kinetyka wzrostu C. glabrata normalna i drobna
UWAGA: Porównano trzy szczepy drożdży: C. glabrata C2-1000907 T0 (izolat kliniczny bez leczenia PDT), T3n (C. glabrata C2-1000907 po 3 kolejnych RB-PDT wykazujących kolonie o średniej średnicy 1,5 ± 0,8 mm podobne do komórek rodzicielskich) i T3p (małe kolonie C. glabrata C2-1000907 po 3 kolejnych RB-PDT).
- Dostosuj zawiesinę komórek drożdży w pożywce YPD do OD600 0,1 (5 × 106 komórek/ml) w probówce o pojemności 3 ml.
- Automatycznie mierz OD600 kultury statycznej co 20 minut za pomocą wielotrybowego czytnika mikropłytek (patrz tabela materiałów) przez 24 godziny.
Wyniki
Dane przedstawiono jako średnią z ± błędem standardowym, uzyskaną z trzech niezależnych eksperymentów, z co najmniej trzema powtórzeniami w każdej grupie. Dane eksperymentalne, w tym liczebność kolonii, pomiary OD600 oraz wyniki barwienia TTC, zostały przedstawione na wykresach i przeanalizowane statystycznie przy użyciu oprogramowania do tworzenia wykresów i analizy statystycznej (patrz Tabela materiałów). Do analizy danych zastosowano jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA) lub test t, a wartość p <0,05 uznano za istotną statystycznie. Skanowanie wykonano za pomocą 48-bitowego pełnokolorowego skanera optycznego przy rozdzielczości 1200 dpi, a następujące po nim pomiary średnic kolonii przeprowadzono z wykorzystaniem oprogramowania ImageJ.
Jak pokazują krzywe wzrostu na Rysunku 2, mutanty petite C. glabrata C2-1000907 (T3p) wykazywały wolniejszy wzrost w porównaniu z niepoddanymi działaniu grzybami rodzicielskimi o regularnym rozmiarze (T0). Po zmieszaniu C. glabrata z 0,2% RB przez 15 min i naświetleniu zielonym światłem o energii 4,38 J/cm2 (leczenie PDT), miano grzybów spadło z 107.5 CFU/mL do 104.5 CFU/mL (co najmniej o 3 logy, Rysunek 3) w porównaniu z grupą kontrolną (tylko RB), w której gęstość komórek wynosiła około 107 CFU/mL. Dodatkowo, po aPDTs zaobserwowano kolonie petite. Kolonie petite te miały średnią wielkość 0,4 mm ± 0,25 mm zamiast zwykłego rozmiaru 1,5 mm ± 0,8 mm (Rysunek 4A). Małe kolonie z dysfunkcją mitochondriów można zidentyfikować po ich wielkości i kolorze po barwieniu 20% TTC. Kolonie petite, które zachowały biały kolor (Rysunek 3B, białe strzałki), wykazywały dysfunkcję mitochondriów, podczas gdy niektóre mniejsze kolonie o czerwonym kolorze oraz kolonie o normalnym rozmiarze zachowały prawidłową funkcję mitochondriów (Rysunek 4B). Tradycyjny czynnik interkalujący DNA, bromek etydyny (Rysunek 4C), oraz flukonazol (Rysunek 4D) mogą skutecznie indukować mutanty petite Candida. Dyfuzja z krążków jest prostą metodą określania wrażliwości grzybów na leki. Na Rysunku 4D wokół krążka z flukonazolem zawierającego 25 µg flukonazolu w kulturze T0 (bez PDT) widoczna jest wyraźna okrągła strefa braku wzrostu, co wskazuje na mniejszą oporność na lek u tego grzyba rodzicielskiego. Niemniej jednak C. glabrata C2-1000907 jest nadal definiowana jako szczep oporny na podstawie minimalnego stężenia hamującego dla flukonazolu (dane niepoddane analizie) oraz średnicy strefy zahamowania. W kulturze T3 w pobliżu krążka utworzyło się wiele kolonii petite (strzałka, dolny panel), co sugeruje oporność na lek po trzech powtórzeniach zabiegów PDT.
Rysunek 1: Struktura molekularna bengkali różowej (RB). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Krzywe wzrostu C. glabrata C2-1000907 24 h po powtarzalnej RB-PDT. Porównano krzywe wzrostu dla trzech szczepów: C. glabrata C2-1000907 T0 (naiwne komórki macierzyste), T3n (kolonie o normalnej wielkości po 3 powtórzonych zabiegach) oraz T3p (kolonie petite po 3 powtórzonych zabiegach). W porównaniu do T0 i T3n, kolonie T3p wykazały znacznie wolniejszy tempo wzrostu (n = 3, p < 0,05). Wszystkie komórki hodowano w medium YPD. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Rysunek 3: Hamowanie wzrostu C. glabrata C2-1000907 po aPDT. Pojedyncza terapia aPDT z dawką światła 4,38 J/cm² i 0,2% RB znacząco zahamowała wzrost C. glabrata C2-1000907 o 3 logarytmy w porównaniu do kontroli naiwnej (p < 0,0001, nieparzysty t-test). Słupki błędów reprezentują średnią ± SEM, dane pochodzą z 3 niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 4: Analiza dysfunkcji mitochondriów z wykorzystaniem barwienia chlorkiem trifenylo-tetrazolium (TCC). (A) C. glabrata C2-1000907, 24 h po terapii aPDT (0,2% RB, 4,38 J/cm² światło zielone), wykazała bimodalny rozkład rozmiarów kolonii, z koloniami dużymi (1,5 mm ± 0,8 mm) i małymi (petite) (0,4 mm ± 0,25 mm). (B) Barwienie TCC wykazało, że kolonie duże były funkcjonalne, ponieważ przybrały czerwony kolor, podczas gdy kolonie petite były niefunkcjonalne, gdyż pozostały białe. (C) Kolonie petite zostały również indukowane przez bromek etydyny (100 µg/mL przez 30-40 min) oraz (D) terapię flukonazolem (25 µg/mL). Wyraźna, okrągła strefa zahamowania wzrostu otaczała dysk z flukonazolem zawierający 25 µg flukonazolu w kulturze T0 (bez PDT), co wskazuje na podatność. W kulturze T3 wiele kolonii petite powstało w pobliżu dysku (strzałka, dolny panel), co sugeruje oporność na lek po trzech powtórzonych terapiach PDT. Paski skali: 1 mm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Dyskusja
Badanie to ujawnia PDT jako pierwszą opisaną metodę indukowania tworzenia drobnych kolonii u Candida, przewyższając ustalone efekty bromku etydyny i flukonazolu. Ta nowatorska obserwacja wymaga dalszych badań, aby odkryć jej implikacje zarówno dla eliminacji grzybów poprzez zmniejszenie zjadliwości, jak i pojawienie się mechanizmów oporności.
PDT za pośrednictwem RB skutecznie hamuje wzrost C. glabrata, co sugeruje potencjalne alternatywne podejście do leczenia infekcji Candida. Jako fotouczulacz aktywowany światłem, RB wytwarza tlen singletowy i reaktywne formy tlenu (ROS) pod wpływem określonej długości fali. Ten stres oksydacyjny powoduje uszkodzenie podstawowych składników komórkowych, takich jak lipidy, białka i kwasy nukleinowe13, co prowadzi do dysfunkcji mitochondriów, jak wykazano w niniejszym badaniu. Utrudnia to Candida rozwój oporności poprzez konwencjonalne mechanizmy obserwowane w przypadku standardowych leków przeciwgrzybiczych.
Trzy szczepy drożdży użyte w tym badaniu, T0, T3n i T3p, wykazują wyraźne wzorce wzrostu. T0 pozostaje nieleczona, podczas gdy T3n i T3p przechodzą RB-PDT trzykrotnie. T3n wykazuje kolonie o normalnej wielkości, podczas gdy T3p wykazuje małe kolonie. Wolniejszy wzrost drobnych kolonii może wskazywać na zmiany w energii komórkowej i metabolizmie. Drobny fenotyp, często związany z dysfunkcją mitochondriów4, może prowadzić do upośledzenia oddychania tlenowego, co w konsekwencji wpływa na ogólną kinetykę wzrostu. Upośledzone oddychanie tlenowe w małych koloniach może wpływać na ich zjadliwość, wrażliwość na leki lub zdolność do przetrwania w różnych środowiskach. Związek ten niesie ze sobą potencjalne implikacje kliniczne i wyznacza kierunki przyszłych kierunków badań.
Bromek etydyny, czynnik interkalujący DNA, hamuje syntezę mitochondrialnego DNA i degraduje istniejące mitochondrialne DNA, przekształcając Candida w drobne kolonie z dysfunkcją mitochondriów14. Flukonazol, powszechnie stosowany w leczeniu zakażeń Candida, może indukować oporność na leki i rozwój drobnych kolonii u C. glabrata6. Drobne mutanty mogą wykazywać oporność na leki azolowe poprzez aktywację czynnika transkrypcyjnego PDR1 i jego regulację genów CDR1 i CDR215. Co więcej, z powodu częściowej lub całkowitej utraty mitochondrialnego DNA, funkcja mitochondriów jest zagrożona16.
PDT wykazała skuteczność w zmniejszaniu zjadliwości bakterii17, indukowaniu wrażliwości na antybiotyki18 i zmniejszaniu tworzenia biofilmu19 u bakterii. Badania nad PDT przeciwko infekcjom grzybiczym są ograniczone20. Odkrycie to rodzi intrygujące pytania o to, w jaki sposób RB-PDT wpływa na mitochondria C. glabrata. Aby w pełni zrozumieć, w jaki sposób RB-PDT wpływa na komórki drożdży, kluczowe jest zrozumienie mechanizmów molekularnych powodujących zmiany wzrostu. Jednak drobne mutanty indukowane przez PDT są obecnie niedostatecznie zbadane, a ich szczegółowe podstawy mechanistyczne pozostają niejasne. Potrzebne są dalsze badania, aby ustalić, czy istnieją jakiekolwiek różnice między małymi koloniami stworzonymi różnymi metodami. Zrozumienie, w jaki sposób tworzą się drobne u gatunków Candida, jest ważne dla badania związku między funkcją mitochondriów a patogennością. Co więcej, drobne mutanty mogą służyć jako model do badania mechanizmów oporności na leki przeciwgrzybicze.
Obecne badanie, choć dostarcza cennych informacji na temat wpływu PDT za pośrednictwem RB na C. glabrata i pojawienie się drobnych kolonii, ma pewne ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę. Po pierwsze, badanie koncentrowało się przede wszystkim na eksperymentach in vitro, a przełożenie tych wyników na warunki kliniczne uzasadnia dalsze badania. Ponadto bardziej dogłębnych badań wymagają specyficzne mechanizmy molekularne leżące u podstaw powstawania małych kolonii po RB-PDT oraz ich potencjalne implikacje dla oporności na leki przeciwgrzybicze. Co więcej, podczas gdy w badaniu porównano wzorce wzrostu różnych szczepów drożdży, dodatkowe analizy molekularne i genetyczne mogą zapewnić głębsze zrozumienie zmian metabolicznych i genetycznych związanych z tworzeniem drobnych kolonii.
Co więcej, potencjalna zmienność odpowiedzi na RB-PDT między różnymi klinicznymi izolatami C. glabrata nie została uwzględniona w tym badaniu, co podkreśla potrzebę szerszych badań specyficznych dla szczepu. Przyszłe badania dotyczące tych ograniczeń będą miały kluczowe znaczenie dla bardziej wszechstronnego zrozumienia implikacji PDT za pośrednictwem RB i pojawiania się małych kolonii w kontekście strategii leczenia przeciwgrzybiczego.
Podsumowując, badanie to ujawnia, że aPDT indukuje C. glabrata (C2-1000907) drobne mutanty z upośledzoną funkcją mitochondriów. Ten unikalny mechanizm może stanowić nową metodę badań nad lekami przeciwgrzybiczymi. Dokładny mechanizm działania leżący u podstaw małych kolonii indukowanych przez PDT pozostaje do wyjaśnienia, a zbadanie potencjalnych różnic w stosunku do innych metod będzie miało kluczowe znaczenie dla optymalizacji strategii terapeutycznych.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez Ministerstwo Nauki i Technologii Tajwanu [MOST 110-2314-B-006-086-MY3], National Cheng Kung University University [K111-B094], [K111-B095], National Cheng Kung University Hospital, Taiwan [NCKUH-11204031], [NCKUMCS2022057].
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,22 &m; m filtr | Merck, Tajpej, Tajwan | Millex, SLGVR33RS | |
| 1,5 ml probówka do mikrofuge | Neptun, San Diego, USA# | 3745 | |
| 20% chlorek trifenylotetrazolu (TTC) | Sigma-Aldrich, MO, USA | T8877 | |
| ml polipropylenowa rurka z okrągłym dnem | Corning, AZ, USA | 352059 | |
| 5 ml probówka okrągłodenna z nasadką sitka do komórek | Corning, AZ, Stany Zjednoczone | Falcon, #352235 | |
| 96-dołkowa płytka | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Tajwan | 16196 | |
| Agar | BRS, Tainan, Tajwan | AG012 | |
| Czysty dysk | Advantec, Tokio, Japonia | 49005040 | |
| Wirówka | Eppendorf, Wielka Brytania | 5415R | |
| Roztwór bromku etydyny | Sigma-Aldrich, MO, USA | E1510 | |
| Flukonazol, 2 mg / ml | Pfizer, Nowy Jork, Stany Zjednoczone | BC18790248 | |
| GraphPad Prism | Oprogramowanie GraphPad | w wersji 7.0 | |
| Taśma z diodą elektroluminescencyjną (LED) | Nanyi electronics Co., Ltd, Tainan, Tajwan | 5050 | Fala wzbudzenia: 500 ~ 550 nm |
| Niska temperatura. Inkubatory wstrząsowe | Yihder, Tajpej, Tajwan | LM-570D (R) | |
| Waciki | bawełniane do pielęgnacji jamy ustnejGood Verita Enterprise, Tajpej, Tajwan | 161357 | |
| Müller Hinton II agar | BD biosciences, Kalifornia, USA | 211438 | |
| Wielomodowy czytnik mikropłytek | Urządzenia molekularne | SpectraMax i3x | |
| spektrofotometr OD600 | Biochrom, Londyn, Wielka Brytania | Ultrospec 10 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone | 330000 | stężenie podstawowe 40 mg/ml = 4%, przygotować w PBS, przechowywać w temperaturze 4 & st.; C |
| Sterylizowana szklana rurka | Sunmei, Tainan, Tajwan | AK45048-16100 | |
| Ekstrakt drożdżowy Pepton Dekstroza Pożywka | HIMEDIA, Indie | M1363 |
Bibliografia
- Soriano, A., et al. Invasive candidiasis: current clinical challenges and unmet needs in adult populations. J Antimicrob Chemother. 78 (7), 1569-1585 (2023).
- Pappas, P. G., Lionakis, M. S., Arendrup, M. C., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nat Rev Dis Primers. 4, 18026(2018).
- Meyahnwi, D., Siraw, B. B., Reingold, A. Epidemiologic features, clinical characteristics, and predictors of mortality in patients with candidemia in Alameda County, California; a 2017-2020 retrospective analysis. BMC Infect Dis. 22 (1), 843(2022).
- Whittaker, P. A. The petite mutation in yeast. Subcell Biochem. 6, 175-232 (1979).
- Hatab, M. A., Whittaker, P. A. Isolation and characterization of respiration-deficient mutants from the pathogenic yeast Candida albicans. Antonie Van Leeuwenhoek. 61 (3), 207-219 (1992).
- Defontaine, A., et al. In-vitro resistance to azoles associated with mitochondrial DNA deficiency in Candida glabrata. J Med Microbiol. 48 (7), 663-670 (1999).
- Brun, S., et al. Relationships between respiration and susceptibility to azole antifungals in Candida glabrata. Antimicrob Agents Chemother. 47 (3), 847-853 (2003).
- Bouchara, J. P., et al. In-vivo selection of an azole-resistant petite mutant of Candida glabrata. J Med Microbiol. 49 (11), 977-984 (2000).
- Badrane, H., et al. Genotypic diversity and unrecognized antifungal resistance among populations of Candida glabrata from positive blood cultures. Nat Commun. 14 (1), 5918(2023).
- Shantal, C. -J. N., Juan, C. -C., Lizbeth, B. -U. S., Carlos, H. -G. J., Estela, G. -P. B. Candida glabrata is a successful pathogen: An artist manipulating the immune response. Microbiol Res. 260, 127038(2022).
- Gamarra, S., Mancilla, E., Dudiuk, C., Garcia-Effron, G. Candida dubliniensis and Candida albicans differentiation by colony morphotype in Sabouraud-triphenyltetrazolium agar. Rev Iberoam Micol. 32 (2), 126-128 (2015).
- Hung, J. H., et al. Rose bengal-mediated photodynamic therapy to inhibit Candida albicans. J Vis Exp. (181), e63558(2022).
- Cardoso, D. R., Franco, D. W., Olsen, K., Andersen, M. L., Skibsted, L. H. Reactivity of bovine whey proteins, peptides, and amino acids toward triplet riboflavin as studied by laser flash photolysis. J Agric Food Chem. 52 (21), 6602-6606 (2004).
- Hall, R. M., Trembath, M. K., Linnane, A. W., Wheelis, L., Criddle, R. S. Factors affecting petite induction and the recovery of respiratory competence in yeast cells exposed to ethidium bromide. Mol Gen Genet. 144 (3), 253-262 (1976).
- Chen, X. J., Clark-Walker, G. D. The petite mutation in yeasts: 50 years on. Int Rev Cytol. 194, 197-238 (2000).
- Piskur, J. Inheritance of the yeast mitochondrial genome. Plasmid. 31 (3), 229-241 (1994).
- Wong, T. W., Wang, Y. Y., Sheu, H. M., Chuang, Y. C. Bactericidal effects of toluidine blue-mediated photodynamic action on Vibrio vulnificus. Antimicrob Agents Chemother. 49 (3), 895-902 (2005).
- Wong, T. W., et al. Indocyanine green-mediated photodynamic therapy reduces methicillin-resistant Staphylococcus aureus drug resistance. J Clin Med. 8 (3), 411(2019).
- Warrier, A., Mazumder, N., Prabhu, S., Satyamoorthy, K., Murali, T. S. Photodynamic therapy to control microbial biofilms. Photodiagnosis Photodyn Ther. 33, 102090(2021).
- Hung, J. H., et al. Recent advances in photodynamic therapy against fungal keratitis. Pharmaceutics. 13 (12), 2011(2021).
Przedruki i uprawnienia
