Izolacja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem za pomocą jednoetapowego i częściowo zautomatyzowanego protokołu chromatografii powinowactwa do heparyny

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół generowania i oczyszczania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem przy użyciu zoptymalizowanej metody chromatografii powinowactwa opartej na heparynie. Przedstawia proste, skalowalne i ekonomiczne podejście, eliminując potrzebę ultrawirowania. Otrzymane wektory wykazują wysoką czystość i aktywność biologiczną, co dowodzi ich wartości w badaniach przedklinicznych.

Streszczenie

Wirus związany z adenowirusem (AAV) stał się coraz cenniejszym wektorem do dostarczania genów in vivo i obecnie przechodzi badania kliniczne na ludziach. Jednak powszechnie stosowane metody oczyszczania AAV wykorzystują ultrawirowanie w gradiacji gęstości chlorku cezu lub jodiksanolu. Pomimo swoich zalet, metody te są czasochłonne, mają ograniczoną skalowalność i często skutkują wektorami o niskiej czystości. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, naukowcy zwracają uwagę na techniki chromatograficzne. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół chromatografii powinowactwa oparty na heparynie, który służy jako uniwersalny etap wychwytywania do oczyszczania AAV.

Ta metoda opiera się na wewnętrznym powinowactwie serotypu 2 AAV (AAV2) do proteoglikanów siarczanu heparanu. W szczególności protokół pociąga za sobą kotransfekcję plazmidów kodujących pożądane białka kapsydu AAV z białkami AAV2, dając mozaikowe wektory AAV, które łączą właściwości obu rodzicielskich serotypów. Krótko mówiąc, po lizie komórek produkcyjnych, mieszanina zawierająca cząstki AAV jest bezpośrednio oczyszczana zgodnie ze zoptymalizowanym jednoetapowym protokołem chromatografii powinowactwa heparyny przy użyciu standardowego systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC). Oczyszczone cząsteczki AAV są następnie zagęszczane i poddawane kompleksowej charakterystyce pod względem czystości i aktywności biologicznej. Protokół ten oferuje uproszczone i skalowalne podejście, które można wykonać bez konieczności ultrawirowania i gradientów, uzyskując czyste i wysokie miano wirusa.

Wprowadzenie

Wektor wirusa związanego z adenowirusem (AAV) podbija swoją drogę jako jeden z najbardziej obiecujących systemów dostarczania w obecnych badaniach nad terapią genową. Początkowo zidentyfikowany w 1965¹, AAV jest małym, bezotoczkowym wirusem, z dwudziestościennym kapsydem białkowym o średnicy około 25 nm, zawierającym jednoniciowy genom DNA. AAV należą do rodziny Parvoviridae i do rodzaju Dependoparvovirus ze względu na ich wyjątkową zależność od koinfekcji wirusem pomocniczym, takim jak wirus opryszczki pospolitej lub, częściej, adenowirus, w celu zakończenia cyklu litycznego^2,3.

Genom 4,7 kilozasady AAV składa się z dwóch otwartych ramek odczytu (ORF) otoczonych dwoma odwróconymi powtórzeniami końcowymi (ITR), które tworzą charakterystyczne końcówki spinki do włosów w kształcie litery T⁴. ITR są jedynymi elementami działającymi na cis, które mają kluczowe znaczenie dla pakowania, replikacji i integracji AAV, dlatego są jedynymi sekwencjami AAV zachowanymi w rekombinowanych wektorach AAV (rAAV). W tym systemie geny niezbędne do produkcji wektora są dostarczane oddzielnie, w trans, co pozwala na upakowanie interesującego genu w kapsydzie wirusa^5,6.

Każdy gen wirusa koduje różne białka za pomocą alternatywnych kodonów splicingu i startu. W Rep ORF kodowane są cztery białka niestrukturalne (Rep40, Rep52, Rep68 i Rep78), odgrywające kluczową rolę w replikacji, integracji specyficznej dla miejsca i enkapsydacji wirusowego DNA^7,8. Cap ORF służy jako matryca do ekspresji trzech białek strukturalnych różniących się od siebie na ich N-końcu (VP1, VP2 i VP3), które łączą się, tworząc 60-merowy kapsyd wirusa w stosunku 1:1:10^4,9. Dodatkowo, alternatywny ORF zagnieżdżony w genie Cap z niekonwencjonalnym kodonem start CUG koduje białko aktywujące montaż (AAP). Wykazano, że to białko jądrowe oddziałuje z nowo zsyntetyzowanymi białkami kapsydu VP1-3 i sprzyja składaniu kapsydu^10,11.

Różnice w sekwencji aminokwasów kapsydu odpowiadają za 11 naturalnie występujących serotypów AAV i ponad 100 wariantów wyizolowanych z tkanek naczelnych ludzi i innych niż ludzie^7,12,13. Różnice w konformacji strukturalnie zmiennych regionów regulują odrębne właściwości antygenowe i specyficzność wiązania receptorów kapsydów z różnych szczepów. Skutkuje to wyraźnymi tropizmami tkanek i wydajnością transdukcji w różnych narządach ssaków¹⁴.

Wczesne metody produkcji rAAV opierały się na infekcji adenowirusowej w celach pomocniczych^{15,16,17,18,19}. Pomimo tego, że jest wydajny i zwykle łatwy do wyprodukowania na dużą skalę, z tej infekcji wynika kilka problemów. Nawet po oczyszczeniu i etapie denaturacji termicznej w celu inaktywacji, cząsteczki adenowirusa mogą być nadal obecne w preparatach AAV, stanowiąc niepożądany problem bezpieczeństwa²⁰. Ponadto obecność denaturowanych białek adenowirusowych jest niedopuszczalna do stosowania klinicznego. Inne strategie produkcji wykorzystują rekombinowane szczepy wirusa opryszczki pospolitej zaprojektowane w celu wprowadzenia Rep/Cap i transgenu do komórek docelowych²¹ lub systemu komórkowego bakulowirusa-owada²². Chociaż systemy te oferują korzyści pod względem skalowalności i kompatybilności z GMP, nadal napotykają podobne problemy.

Metoda potrójnej transfekcji do produkcji rAAV została powszechnie przyjęta, aby łatwo przezwyciężyć te problemy. Krótko mówiąc, montaż rAAV opiera się na przejściowej transfekcji komórek z trzema plazmidami kodującymi: 1) kasetę ekspresji transgenu upakowaną między ITR z genomu AAV2 typu dzikiego (pITR); 2) sekwencje Rep/Cap niezbędne do replikacji i składania wirionów (pAAV-RC); oraz 3) minimalne białka adenowirusowe (E1A, E1B, E4 i E2A) wraz z RNA związanymi z wirusem adenowirusa wymaganymi do efektu pomocniczego (pHelper)^6,20,23. Podczas gdy metody transfekcji plazmidu zapewniają prostotę i elastyczność produkcji rAAV w badaniach przedklinicznych, procedury te mają ograniczenia pod względem skalowalności i odtwarzalności w przypadku stosowania do produkcji na dużą skalę. Alternatywnym podejściem jest produkcja rAAV może być osiągnięta poprzez wykorzystanie linii komórkowych producentów AAV (zarówno wzrostu adherentnego, jak i zawiesinowego), stabilnie eksprymujących geny AAV Rep / Cap lub Rep / Cap w połączeniu z konstruktami wektorowymi. W tych systemach geny pomocnicze adenowirusa są wprowadzane poprzez transfekcję plazmidu. Mimo że strategia ta poprawia skalowalność procesu hodowli komórkowej, jest technicznie złożona i czasochłonna^21,24,25.

W obu przypadkach komórki producenta są następnie poddawane lizie i poddawane jednemu lub wielu etapom oczyszczania. Obecnie główne metody oczyszczania rAAV obejmują stosowanie chlorku cezu (CsCl) lub ultraszybkiego wirowania w gradicynacji o bardzo wysokiej gęstości jodoksanolu, po którym następują lub nie techniki chromatograficzne²⁶. Pierwotny schemat oczyszczania do wytrącania wirusów wykorzystywał siarczan amonu, po którym następowały dwie lub trzy rundy ultrawirowania przez gradient CsCl. Do głównych zalet tego procesu należy możliwość oczyszczenia wszystkich serotypów oraz możliwość fizycznego oddzielenia pełnych cząstek od pustych kapsydów na podstawie ich różnej gęstości. Ta metoda jest jednak skomplikowana, czasochłonna i ma ograniczoną skalowalność, co często skutkuje niską wydajnością i niską jakością próbki^27,28,29,30. Ponadto dializa z użyciem buforu fizjologicznego jest często konieczna przed badaniami in vivo ze względu na toksyczne działanie, jakie CsCl może wywierać na ssaki.

Jodixanol był również używany jako alternatywny izo-osmotyczny gradient do oczyszczania wektorów rAAV, z przewagą nad CsCl zarówno z punktu widzenia bezpieczeństwa, jak i siły wektora. Jednak, podobnie jak CsCl, metoda jodiksanolu ma pewne wady związane ze zdolnością ładowania lizatu do hodowli komórkowych (a tym samym skalowalnością oczyszczania rAAV) i pozostaje metodą czasochłonną i kosztowną^30,31.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, badacze zwrócili uwagę na techniki chromatograficzne. W związku z tym opracowano kilka podejść do oczyszczania, które obejmują metody chromatografii powinowacej, hydrofobowej lub jonowymiennej. Metody te opierają się na właściwościach biochemicznych danego serotypu, w tym na ich naturalnych receptorach, lub charakterystyce ładunku cząsteczki wirusa³². Na przykład odkrycie, że AAV2, AAV3, AAV6 i AAV13 preferencyjnie wiążą się z proteoglikanami siarczanu heparanu (HSPG), otworzyło możliwość wykorzystania blisko spokrewnionej heparyny w oczyszczaniu metodą chromatografii powinowactwa. Jednak miejsca wiązania z HSPG mogą się różnić w zależności od serotypów, pośrednicząc w przyczepianiu AAV i infekcji komórek docelowych na różne sposoby^{2,33,34,35,36}. Z drugiej strony AAV1, AAV5 i AAV6 wiążą się z kwasem sjalowym (SA) sprzężonym z N, podczas gdy AAV4 używa SA^2,14,34. Kierując się tym samym rozumowaniem, opracowano również jednoetapowy protokół chromatografii powinowactwa do oczyszczania rAAV5 w oparciu o zastosowanie mucyny, białka ssaków wysoce wzbogaconego w SA³⁷. Podobnie jak w przypadku technik opartych na heparynie, oczyszczanie to jest również zależne od generowanego konkretnego serotypu. Oprócz heparyny i mucyny badano inne ligandy do chromatografii powinowactwa, takie jak przeciwciało monoklonalne A20 i przeciwciała jednodomenowe wielbłądowatych (AVB Sepharose i POROS CaptureSelect)^{22,23,38,39,40,41}. Inne innowacyjne strategie mające na celu ulepszenie wcześniej istniejących metod oczyszczania polegają na wprowadzeniu niewielkich modyfikacji kapsydu rAAV w celu uzyskania specyficznych epitopów wiążących. Na przykład rAAV znakowane heksa-histydyną lub biotynylowane można oczyszczać za pomocą ligandów, które celują w te epitopy (odpowiednio kwas niklowo-nitrylotryoctowy i żywice awidynowe)^42,43,44.

W celu poszerzenia pożądanych cech rAAV, badacze przeprowadzili krzyżowy dressing wirionów, mieszając ich kapsydy. Osiąga się to poprzez dostarczanie genu kapsydu z dwóch różnych serotypów AAV w równomolowych lub różnych proporcjach podczas produkcji, co daje początek strukturze kapsydu złożonej z mieszaniny podjednostek kapsydu z różnych serotypów^{34,45,46,47,48,49,50}. Wcześniejsze badania dostarczają fizycznych dowodów na to, że jednoczesna ekspresja białek kapsydu z AAV2 z AAV1 (stosunek 1:1) i AAV2 z AAV9 (stosunek 1:1) powoduje generowanie mozaikowych wektorów rAAV1/2 i rAAV2/9, odpowiednio^45,46,48. Główną korzyścią płynącą z generowania mozaikowych rAAV jest zdolność do integracji korzystnych cech z różnych serotypów AAV, co skutkuje synergiczną poprawą ekspresji transgenu i tropizmu, przy jednoczesnym zachowaniu innych właściwości przydatnych podczas produkcji rAAV. Co ciekawe, niektóre warianty mozaiki wykazują nawet nowe właściwości różniące się od wirusa rodzicielskiego^46,47,49. Wykorzystując zdolność AAV2 do wiązania heparyny, mozaikowe wektory rAAV mogą być potencjalnie generowane i oczyszczane przez mieszanie AAV2 z innymi naturalnymi lub nowymi kapsydami AAV generowanymi przez ukierunkowaną ewolucję i / lub racjonalny projekt. Niemniej jednak wcześniejsze badania podkreśliły znaczenie kompatybilności podjednostek kapsydu podczas próby złożenia wektorów mozaikowych. Na przykład Rabinowitz i współpracownicy wykazali, że chociaż transkapsydacja AAV1, AAV2 i AAV3 doprowadziła do efektywnego współskładania kapsydów mozaiki, krzyżowanie tych serotypów z AAV4 utrudniało generowanie stabilnych wirionów^34,45,47. Ponadto AAV1, AAV2 i AAV3 wykazywały niską kompatybilność z AAV5, biorąc pod uwagę zmniejszone miana wirusa uzyskane podczas mieszania tych kapsydów w różnych proporcjach. Co ciekawe, mozaika rAAV2/5 wykazywała zmniejszone właściwości wiązania heparyny, przy jednoczesnym zachowaniu zdolności wiązania mucyny, jak w przypadku rodzicielskiego AAV5. Jednak rAAV3/5 w stosunku 3:1 zachowywał podwójne wiązanie z heparyną i mucyną. Ogólnie rzecz biorąc, generowanie nowych mozaikowych rAAV o wzmocnionej transdukcji, specyficznym tropizmie lub niskiej immunogenności może znacznie skorzystać na naszym zrozumieniu składania kapsydu i interakcji receptorów, przy czym konkretne kombinacje nadal wymagają dokładnych badań i optymalizacji.

W obecnej pracy opisujemy krok po kroku protokół produkcji i oczyszczania rAAV przy użyciu zoptymalizowanej metody chromatografii powinowactwa heparyny. rAAV są wytwarzane przez transfekcję przejściową i są oczyszczane za pomocą systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC). Po zagęszczeniu wybranych oczyszczonych frakcji, otrzymane szczepy wirusów są charakteryzowane pod względem miana, czystości, swoistych właściwości fizycznych oraz aktywności biologicznej in vitro i in vivo. Jako dowód słuszności koncepcji demonstrujemy ulepszenia i możliwość zastosowania tego protokołu do generowania mozaikowych wektorów rAAV1/2 i rAAV2/9. Wybór każdego serotypu opierał się na ich uderzająco różnych tropizmach, co potencjalnie nadawało ich unikalne cechy również wersjom mozaikowym. Serotyp 1 AAV, z ogólnym umiarkowanym tropizmem dla ośrodkowego układu nerwowego (OUN), ma zdolność do transdukcji neuronów i gleju (w mniejszym stopniu) oraz przechodzi transport aksonalny w kierunku następczym i wstecznym in vivo^2,7,8. Dodatkowo, serotyp 9 AAV został wybrany ze względu na jego naturalną zdolność do przekraczania bariery krew-mózg i celowania w OUN zarówno u noworodków, jak i dorosłych myszy^51,52. Ostatecznie wybrano serotyp 2 AAV ze względu na jego zdolność do wiązania się z heparyną, co pozwala na chromatografię powinowactwa³³. Oczyszczone cząstki rAAV1/2 i rAAV2/9 łączą w sobie właściwości obu rodzicielskich serotypów AAV i dlatego stanowią odpowiednie wektory do transdukcji CNS^45,46,48,49.

Protokół

UWAGA: Zobacz Rysunek 1 dla ilustracji podsumowującej protokół. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, przyrządów i odczynników użytych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów. Wszystkie prace związane z komórkami i wirusami powinny być wykonywane w dedykowanych komorach bezpieczeństwa biologicznego i inkubatorach, oddzielonych od tych, które są regularnie używane do utrzymania linii komórkowych. Sprzęt i odczynniki mające kontakt z hodowanymi komórkami i wirusami powinny być sterylne. Istotne jest, aby usuwanie niebezpiecznych odczynników i materiałów skażonych wirusami odbywało się zgodnie z kartami charakterystyki substancji niebezpiecznych oraz zgodnie z krajowymi przepisami i wytycznymi dostarczonymi przez biuro ds. ochrony środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa każdej instytucji. Od kwietnia 2019 r. wytyczne NIH dotyczące badań obejmujących rekombinowane lub syntetyczne cząsteczki kwasów nukleinowych klasyfikują jako czynniki grupy ryzyka 1 (niezwiązane z chorobą u zdrowych dorosłych ludzi) wszystkie serotypy AAV, a także rekombinowane lub syntetyczne konstrukty AAV. Klasyfikacja ta ma zastosowanie, gdy transgen nie koduje potencjalnie rakotwórczego produktu genowego lub toksyny, a konstrukty są wytwarzane bez wirusa pomocniczego.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z dyrektywą Unii Europejskiej (2010/63/UE) dotyczącą opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, transponowaną do prawa portugalskiego w 2013 roku (Dekret z mocą ustawy 113/2013). Dodatkowo procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Organizację Odpowiedzialną za Dobrostan Zwierząt Wydziału Lekarskiego oraz Centrum Neuronauki i Biologii Komórki Uniwersytetu w Coimbrze z licencją dla zwierząt. Naukowcy przeszli odpowiednie szkolenie (kurs certyfikowany przez FELASA) i certyfikat od władz portugalskich (Direcção Geral de Alimentação e Veterinária, Lizbona, Portugalia) w celu przeprowadzenia eksperymentów.

1. Konstrukcje plazmidowe

1. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi zestawu maxiprep wolnego od endotoksyn, aby wyizolować i oczyścić znaczne ilości DNA następujących plazmidów: i) pITR: wektor przenoszący będący przedmiotem zainteresowania; ii) plazmid pAAV-RC: pRV1, zawierający sekwencje AAV2 Rep i Cap ³⁶; iii) plazmid pAAV-RC: pH21, zawierający sekwencje AAV1 Rep i Cap ³⁶; iv) plazmid pAAV-RC: pAAV2/9n, zawierający sekwencje AAV2 Rep i AAV9 Cap; v) pHelper: pFdelta6, plazmid pomocnika adenowirusa³⁶.
2. Przeprowadź badanie przesiewowe integralności wygenerowanych plazmidów, wykonując zalecane ograniczenia enzymatyczne³⁶. Monitoruj integralność plazmidów pITR poprzez trawienie za pomocą SmaI, endonukleazy restrykcyjnej, która tnie dwukrotnie w niestabilnej części ITRs^53,54.
   UWAGA: Ponieważ ITR są wysoce niestabilne i podatne na delecje, zaleca się stosowanie nadkompetentnych komórek SURE 2 w celu zminimalizowania rekombinacji w tych miejscach.

2. Hodowla komórkowa

1. Hodowla ludzkiej nerki embrionalnej 293, stabilnie wykazującej ekspresję linii komórkowej dużego antygenu T (HEK293T) SV40 w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco, o wysokiej zawartości glukozy, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-streptomycyną, w temperaturze 37 °C, w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO_{2 ,} jako punkt wyjścia dla dalszych kroków.
2. Subhodowla komórek przy użyciu sterylnego 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), pH 7,4, w celu przemycia komórek przed dodaniem 0,05% kwasu trypsyna-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA).
   UWAGA: Unikaj wykorzystywania komórek, które przeszły nadmierną liczbę pasaży (maksymalnie 20). Regularnie testuj hodowle komórkowe pod kątem zanieczyszczenia mykoplazmą.

3. Produkcja rAAV przez transfekcję przejściową

1. Dzień 1: Posiewanie komórek
   1. Dla każdej produkcji wirusa HEK293T komórek na płytce 10 traktowanych szalek hodowlanych (średnica 15 cm) dzień przed transfekcją, o gęstości 10,5 × 10⁶ komórek na szalkę w 22 ml uzupełnionej pożywki hodowlanej i inkubować przez 24 godziny, aż komórki będą zlewające się w 70%-80% i gotowe do transfekcji.
2. Dzień 2: Transfekcja komórek przy użyciu polietyleniminy (PEI)
   1. Dla każdej produkcji wirusa (co odpowiada 10,5 szalce) należy umieścić następującą mieszaninę transfekcji w probówce mikrowirówkowej: 54,6 μg pITR; 45,675 μg pRV1; 45,675 μg pH21 lub pAAV2/9n; 109,2 μg pFdelta6. Wymieszaj, stukając.
   2. Dodać mieszaninę do 4,557 ml nieuzupełnionego DMEM w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Wymieszaj, stukając.
   3. Dodawać 1,365 ml sterylnego roztworu PEI o stężeniu 1 mg/ml (pH 7,4), kropla po kropli. Wymieszaj, stukając. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić tworzenie kompleksów DNA-PEI.
   4. Dodaj tę mieszaninę do 231 ml wstępnie podgrzanego suplementu DMEM. Zastąp całą pożywkę hodowlaną z każdej pożywki 22 ml tej mieszaniny transfekcyjnej. Inkubować komórki przez 48 godzin
      UWAGA: Ten krok należy wykonać ostrożnie, aby uniknąć oderwania komórek.
3. Dzień 4: Pobieranie komórek
   1. Gdy pITR zakoduje fluorescencyjny reporter, zwizualizuj transfekowane komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym.
   2. Zebrać pożywkę z każdej szalki do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i odwirować je pod ciśnieniem 800 × g przez 10 minut. Odrzucić supernatant.
      UWAGA: Ten krok jest opcjonalny i ma na celu odzyskanie transfekowanych komórek, które mogły się oderwać z powodu bardzo dużej konfluencji.
   3. Dodaj 10 ml podgrzanego PBS do każdej płytki. Delikatnie usunąć komórki za pomocą skrobaka do komórek i zebrać zawiesinę do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml z kroku 3.3.2.
   4. Umyć 5 naczyń na raz dodatkowymi 10 ml PBS i przenieść zawiesinę do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml z kroku 3.3.3. Osadzać komórki w masie 800 × g przez 10 minut i odrzucić supernatant.
   5. Zamrozić granulki komórek w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Granulki komórkowe mogą być przechowywane przez kilka miesięcy (punkt pauzy).

4. Ekstrakcja rAAV i oczyszczanie FPLC

1. Dzień 5: Przygotowanie lizatu komórkowego
   1. Rozmrozić granulki komórek w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki zebrane z 10 szalek w 100 ml sterylnego buforu zawierającego 150 mM chlorku sodu (NaCl) i 20 mM Tris, pH 8,0, w ultraczystej (typu I) wodzie. Wymieszać zawiesinę, pipetując w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę.
   2. Dodaj 12,5 ml świeżo przygotowanego sterylnego roztworu 10% deoksycholanu sodu do ultraczystej wody, aby wywołać lizę komórek. Mieszać pipetując w górę i w dół.
      UWAGA: Deoksycholan sodu, a także materiały mające z nim kontakt, należy utylizować zgodnie z kartą charakterystyki substancji niebezpiecznej oraz wytycznymi dostarczonymi przez biuro ds. zdrowia i bezpieczeństwa środowiskowego instytucji. Zaleca się również noszenie maski na twarz podczas obchodzenia się z tym proszkiem. Po wymieszaniu roztwór staje się bardzo lepki.
   3. Dodać 27 μl nukleazy benzonazy do poprzedniej mieszaniny. Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół, aż próbka przestanie być lepka. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, wykonując wir co 10 minut.
      UWAGA: Ta endonukleaza jest zdolna do wydajnej degradacji wszystkich form DNA i RNA bez wykazywania żadnej aktywności proteolitycznej.
   4. Usunąć resztki komórkowe przez odwirowanie mieszaniny w temperaturze 3 000 × g przez 60 minut w temperaturze 25 °C. Przefiltrować supernatant za pomocą sterylnego filtra strzykawkowego z polifluorku winylidenu (PVDF) o wielkości 0,45 μm i przenieść go do nowego sterylnego pojemnika.
      UWAGA: Ten ważny krok zapewnia usunięcie większości zanieczyszczeń komórkowych, zapobiegając w ten sposób zatykaniu się kolumn chromatograficznych. Zachować małą porcję tej mieszaniny do analizy (krok opcjonalny).
2. Dzień 5 (ciąg dalszy): Oczyszczanie kolumny heparynowej z rAAVs
   UWAGA: Aplikację próbki można wykonać za pomocą pompy do pobierania próbek lub superpętli o pojemności 50 ml lub 150 ml jako części systemu. Ponieważ w niższych temperaturach rozpuszcza się więcej powietrza, ważne jest, aby zapewnić i roztworom (zwykle przechowywanym w temperaturze 4 °C) wystarczająco dużo czasu na zaaklimatyzowanie się do temperatury pokojowej przed ich użyciem w systemie FPLC.
   1. Opcjonalnie: Jeśli system był przechowywany przez długi czas, napełnij system i wszystkie wloty świeżo przygotowanym roztworem do przechowywania (20% etanolu), korzystając z instrukcji ręcznych lub wstępnie zdefiniowanej metody czyszczenia systemu na miejscu (system).
   2. Całkowicie umyj ścieżkę przepływu cieczy sterylną ultraczystą wodą, korzystając z instrukcji ręcznych lub predefiniowanej metody systemu.
   3. Podłączyć 1 ml paczkowanej kolumny z heparyną, ustawić alarm ciśnienia i przemyć pięcioma objętościami kolumny (CV) ultraczystej wody o natężeniu przepływu 1 ml/min.
   4. Zamień roztwory na tacy buforowej z wody ultraczystej na bufor A (sterylny roztwór 100 mM NaCl i 20 mM Tris, pH 8, w wodzie ultraczystej) na wlocie A (pompa systemowa A) i na bufor B (sterylny roztwór 500 mM NaCl i 20 mM Tris, pH 8, w wodzie ultraczystej) na wlocie B (pompa systemowa B). Jeśli system jest wyposażony w pompę do pobierania próbek, należy umieścić wlot bufora zaworu wlotowego próbki w buforze A.
   5. Umyć pompę układu B buforem B i napełnić pozostałą część ścieżki przepływu cieczy buforem A.
      UWAGA: W razie potrzeby odłącz kolumnę od ścieżki przepływu, a następnie podłącz ją ponownie.
   6. Włożyć rurkę wlotową próbki z zaworu wlotowego próbki, na przykład S1, do pojemnika z preparatem wirusowym otrzymanym w kroku 4.1.4. (z przygotowania lizatu komórkowego). Roztwór próbki zalać ścieżką przepływu od wlotu próbki S1 do zaworu iniekcyjnego. Alternatywnie, napełnić superpętlę o pojemności 50 ml lub 150 ml próbką zawierającą rAAV za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml.
   7. Zrównoważyć kolumnę z całkowitą objętością pięciu CV, używając 12,5% buforu B z szybkością 1 ml/min.
   8. Nanieść całkowitą objętość próbki do kolumny za pomocą pompy do pobierania próbek (wybrać wstrzyknięcie całej próbki za pomocą czujnika powietrza) lub superloop z prędkością 0,5 ml/min i zebrać przepływ za pomocą portu wylotowego w nowym sterylnym pojemniku.
      UWAGA: Gdy włączona jest funkcja kontroli przepływu zapobiegająca nadciśnieniu, przepływ automatycznie zmniejszy się w przypadku zatkania kolumny. Jeśli natężenie przepływu spadnie znacznie poniżej 0,5 ml/min, należy przerwać aplikację próbki, przeprowadzić płukanie za pomocą 2-5 CV buforu A, a następnie wznowić aplikację próbki.
   9. Przemyć kolumnę z prędkością 1 ml/min 20 CV buforu A, zbierając przepływ za pomocą portu wylotowego.
   10. Eluować próbkę z prędkością 1 ml/min według następującego schematu: i) gradient liniowy z celem 50% buforu B dla pięciu CV; (ii) krok z docelowym poziomem 90 % bufora B podczas pięciu CV; (iii) krok z docelowym poziomem 100% bufora B podczas pięciu CV.
   11. Zebrać eluowaną próbkę we frakcjach o pojemności 1 ml za pomocą kolektora frakcji i probówek wirówek do mikrowirówek o niskiej retencji (2 ml) i przechowywać je w temperaturze -20 °C.
       UWAGA: Frakcje rAAV mogą być przechowywane przez kilka tygodni (punkt pauzy).
   12. Ponownie wyrównać kolumnę z prędkością 1 ml/min z 12,5% buforu B dla pięciu CV.
   13. Przełączyć wloty z roztworów buforowych na wodę ultraczystą i przemywać kolumnę z prędkością 1 ml/min przez pięć CV.
   14. Przełączyć wloty z wody ultraczystej na 20% etanol i myć kolumnę z prędkością 1 ml/min przez pięć CV. Odłączyć kolumnę i przechowywać ją w temperaturze 4 °C.
       UWAGA: Kolumny mogą być wielokrotnie używane bez żadnych innych poważnych procedur czyszczenia i odkażania, jeśli używany jest ten sam serotyp rAAV i transgen.
   15. Całkowicie umyj ścieżkę przepływu cieczy 20% etanolem, korzystając z instrukcji ręcznych lub predefiniowanej metody systemu.

5. Stężenie oczyszczonych rAAV

1. Dzień 6: Koncentracja Krok 1
   1. Zagęścić rAAV za pomocą 15 ml odśrodkowego zespołu filtrującego z odcięciem masy cząsteczkowej 100 kDa. Załaduj żądane frakcje zawierające rAAV (frakcje FPLC od 7 do 16) do 15 ml odśrodkowego zespołu filtrującego i odwiruj go przy 2 000 × g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że skoncentrowana objętość w jednostce filtrującej wynosi około 500 μl. Jeżeli stężona objętość znacznie przekracza 500 μl, należy powtarzać etapy wirowania w odstępach 1-minutowych, aż osiągnie pożądaną objętość.
2. Dzień 6 (ciąg dalszy): Wymiana bufora
   1. Dodać 1 ml sterylnego PBS do filtra odśrodkowego zawierającego rAAV. Ostrożnie pipetuj w górę i w dół, aby umyć filtr. Wirować przy 2 000 × g w odstępach 1-minutowych, aż do osiągnięcia końcowej objętości 500 μl.
3. Dzień 6 (ciąg dalszy): Koncentracja krok 2
   1. Przenieść 500 μl skoncentrowanych rAAV otrzymanych w poprzednim kroku do 0,5 ml odśrodkowego zespołu filtrującego z odciętą masą cząsteczkową 100 kDa i odwirować przy 6 000 × g przez 1 minutę. W razie potrzeby powtórzyć etap wirowania, aż do osiągnięcia końcowej objętości mniejszej niż 100 μl.
4. Dzień 6 (ciąg dalszy): Regeneracja
   1. Aby odzyskać skoncentrowany rAAV, umieść urządzenie filtrujące do góry nogami w nowej probówce zbiorczej mikrowirówki. Umieść probówkę w mikrowirówce z nasadką skierowaną do środka i wykonaj przedłużone wirowanie w komorze przepływowej, aby przenieść skoncentrowane rAAV z urządzenia do probówki mikrowirówki. Alternatywnie odwirować przy 1 000 × g przez 2 minuty.
   2. Suplement ze sterylnym Pluronic F-68 0,001% (opcjonalnie).
      UWAGA: Pluronic F-68 to niejonowy środek powierzchniowo czynny zatwierdzony do stosowania u ludzi przez Agencję ds. Żywności i Leków, który jest w stanie ograniczyć straty rAAV, zapobiegając ich interakcjom z powierzchniami materiałów (tworzyw sztucznych) używanych podczas przygotowywania rozcieńczania, ładowania strzykawki i sprzętu do podania^55,56.
   3. Porcje rAAV umieszcza się w probówkach wirówek do mikrowirówek o niskiej retencji i przechowuje w temperaturze -80 °C (punkt przerwy).

6. Kwantyfikacja oczyszczonych rAAV

1. Dzień 6 (ciąg dalszy): Określenie miana preparatów rAAV, wyrażonych w genomach wirusa/μL (vg/μL), za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) przy użyciu zestawu komercyjnego i zgodnie z instrukcjami producenta.
   1. Inkubować roztwór cząstek rAAV z DNazą I w temperaturze 37 °C przez 20 min.
      UWAGA: Ta procedura wspomaga trawienie wolnego genomowego DNA i plazmidowego DNA pochodzącego z komórek gospodarza, zapewniając w ten sposób, że zachowana jest tylko sekwencja kwasu nukleinowego wewnątrz nienaruszonych cząstek rAAV.
   2. Inaktywacja termiczna DNazy I w temperaturze 95 °C przez 10 min.
   3. Dodać bufor do lizy i inkubować przez 10 minut w temperaturze 70 °C, aby przyspieszyć denaturację termiczną białek cząstek rAAV.
   4. Otrzymany roztwór genomu rAAV rozcieńczyć w buforze rozcieńczającym przed przejściem do RT-qPCR. Przygotować zestaw seryjnie rozcieńczonych wzorców kontroli dodatniej (od 2 × 10⁷ vg/μL do 2 × 10² vg/μL) dostarczony wraz z zestawem.
   5. Wykonać mieszaninę reakcyjną zawierającą 12,5 μl mieszaniny Taq II, 0,5 μl rozcieńczonej mieszaniny starterów, 7 μl wody i 5 μl rozcieńczonego DNA rAAV (nieznana próbka AAV i wzorce z kroku 6.1.4.).
   6. Wykonaj RT-qPCR w systemie wykrywania PCR w czasie rzeczywistym, stosując następujący protokół: 1 cykl w temperaturze 95 °C przez 2 minuty (początkowa denaturacja) i 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 5 s (denaturacja) i 60 °C przez 30 s (wyżarzanie, rozciąganie i odczyt płytki), a następnie analiza krzywej topnienia.
   7. Obliczyć bezwzględne stężenie próbki na podstawie krzywej wzorcowej (linia regresji liniowej), biorąc pod uwagę współczynnik rozcieńczenia wynikający z przygotowania próbki rAAV.
      UWAGA: Kwantyfikacja liczby genomów wirusa uzyskuje się poprzez amplifikację sekwencji ITR AAV2 (sekwencja docelowa starterów dostarczonych przez zestaw).

7. SDS-PAGE, niebieskie zabarwienie Coomassie i western blot

1. Denaturować 40 μl każdej próbki (każda frakcja FPLC; przepływ; próbki przedkolumnowe i łącznie 2,3 ×^{10 10} vg końcowego zagęszczonego produktu) przez dodanie 6 razy buforu próbki (0,5 M Tris-HCl/0,4% dodecylosiarczanu sodu (SDS) pH 6,8, 30% glicerolu, 10% SDS, 0,6 M ditiotreitolu (DTT), 0,012% błękitu bromofenolowego) i inkubację próbek przez 5 minut w temperaturze 95 °C.
2. Załadować zdenaturowane próbki (48 μl) do żelu poliakryloamidowego SDS (4% żelu piętrowego i 10% żelu rozdzielczego) i przeprowadzić separację elektroforetyczną pod napięciem 100 V przez 70 minut, w sąsiedztwie drabinki białkowej.
3. Analiza białka
   UWAGA: Można wykonać barwienie na niebiesko Coomassie lub western blot.
   1. Niebieskie barwienie Coomassie
      1. Aby uwidocznić pasma białkowe, zabarwiaj żel przez 10 minut 0,25% roztworem Coomassie blue G250 rozpuszczonym w 50% metanolu i 10% kwasie octowym lodowatym.
      2. Odbarwienie żelu należy wykonać, przemywając go kilkakrotnie roztworem zawierającym 25% metanolu i 5% kwasu octowego lodowacego, aż do wyświetlenia wyraźnych pasm o niskim tle.
      3. Rejestruj obrazy za pomocą odpowiedniego systemu obrazowania.
   2. Plama zachodnia
      1. Przenieś białka na membranę PVDF zgodnie ze standardowymi protokołami.
      2. Zablokować błonę przez inkubację w 5% beztłuszczowym mleku rozcieńczonym w TBS-T (0,1% Tween 20 w soli fizjologicznej buforowanej trisem) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      3. Do inkubacji przez noc w temperaturze 4 °C należy stosować następujące przeciwciała pierwszorzędowe (rozcieńczone w roztworze blokującym): mysie przeciwciało monoklonalne anty-AAV, VP1, VP2, VP3 (B1, 1:1,000) lub mysie przeciwciało monoklonalne anty-AAV, VP1, VP2 (A69, 1:1,000).
      4. Myć błony przez 3 x 15 minut w TBS-T i inkubować z kozim przeciwciałem drugorzędowym przeciwko mysim połączonym z fosfatazą alkaliczną (1:10 000) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
      5. Myć membrany przez 3 x 15 min w TBS-T. Dodaj ulepszony substrat chemifluorescencyjny (ECF) i wizualizuj prążki białkowe za pomocą obrazowania chemifluorescencyjnego.

8. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)

1. Umieść siatkę o oczkach 200 pokrytą węglem Formvar do góry nogami na kropli próbki rAAV i pozwól jej osiąść przez 1 minutę.
2. Umyj kratki w kropli wody, a nadmiar płynu osusz bibułą filtracyjną.
3. Ujemnie zabarwić siatki 1% roztworem octanu uranylu (pH 7) przez 1 minutę, aby utrwalić i skontrastować cząsteczki wirusa.
4. Umyj kratki w kropli wody, a nadmiar płynu osusz bibułą filtracyjną.
5. Zbadaj próbki w transmisyjnym mikroskopie elektronowym.
   UWAGA: Wysokie stężenia soli mogą bezpośrednio wpływać na wiązanie rAAV z siatką i prowadzić do wizualizacji struktur podobnych do kryształów.

9. Sekwencyjna absorpcja światła widzialnego ultrafioletowego, statyczne rozpraszanie światła i dynamiczna analiza rozpraszania światła

1. Na 96-dołkową płytkę do oznaczania ilościowego załadować 2 μl próbki rAAV i 2 μl PBS, które mają być użyte jako ślepa próba buforowa (wykonać to w dwóch egzemplarzach).
2. Użyj aplikacji AAV Quant w oprogramowaniu do analizy klienta, umieść nazwy próbek w odpowiednim miejscu płytki, wybierz serotyp AAV i kliknij przycisk Dalej.
3. Załaduj 96-dołkową płytkę do kwantyfikacji do dedykowanego sprzętu i przystąp do odczytu płytki w celu uzyskania danych.

10. Testy transdukcji in vitro

1. Różne linie komórkowe mogą być używane do szybkiej analizy wydajności transdukcji rAAV.
   1. Równomiernie wysiewaj komórki HEK293T na 24-dołkowych płytkach (o gęstości 137 500 komórek / studzienkę) i linii komórkowej mysiego nerwiaka zarodkowego-2A (Neuro2a) na 24-dołkowych płytkach (50 000 komórek / dołek) lub w 8-dołkowym szkiełku (27 000 komórek / studzienkę), używając DMEM o wysokiej zawartości glukozy, uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny-streptomycyny, jak opisano powyżej. Pozostawić komórki do przylegania przez noc w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO₂ .
   2. Zebrać kondycjonowane podłoże z każdej studzienki (250 μl z płytek 24-dołkowych i 50 μl z szkiełka 8-dołkowego) i przechowywać je w temperaturze 4 °C do późniejszego wykorzystania.
   3. Dodać następujące preparaty rAAV do każdego dołka i inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO₂ .
      1. Dodać 50 μl frakcji F2-F16 zebranych za pomocą FPLC i przepłynąć do HEK293T komórek posianych na płytkach 24-dołkowych.
      2. Dodać łącznie 5,5 × 10⁹ vg skoncentrowanych rAAV rozcieńczonych w 50 μl PBS do komórek Neuro2a posianych na płytkach 24-dołkowych (w tym basenie kontroli ujemnej, dodając 50 μl PBS do komórek).
      3. Dodać łącznie 2,75 × 10⁹ vg skoncentrowanych rAAV rozcieńczonych w 25 μl PBS do komórek Neuro2a posianych na 8-dołkowym szkiełku podstawowym (uwzględnić warunek kontroli ujemnej, dodając 50 μl PBS do komórek).
   4. Dodać uprzednio przechowywaną kondycjonowaną pożywkę (krok 10.1.2) do każdego dołka i inkubować przez 24 godziny.
   5. Wyrzuć pożywkę i umyj komórki 2x PBS.
   6. Dodać 4% roztwór paraformaldehydu (PFA), uzupełniony 4% sacharozą w PBS, wstępnie podgrzany do 37 °C, do każdego dołka i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
   7. Przemyć 2x PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu wykonania obrazowania (punkt pauzy).
   8. Uzyskuj obrazy za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw 10x/0,30 lub odwróconego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw 40x/1,4 Oil DIC.
2. Aby uzyskać bardziej odpowiedni i refleksyjny model środowiska in vivo, należy użyć pierwotnych kultur neuronalnych w następujący sposób:
   1. Przygotuj pierwotne kultury neuronów korowych, jak opisano wcześniej przez Santosa i wsp.⁵⁷. Krótko mówiąc, wysiewaj 200 000 komórek/ml na 12-dołkowych płytkach i utrzymuj je w hodowli do dnia in vitro 16.
   2. Zebrać kondycjonowane podłoże z każdej studzienki (100 μl) i przechowywać je w temperaturze 4 °C do późniejszego wykorzystania.
   3. Dodać rAAV do badania do każdego dołka: w sumie 2,75 ×^{10 9} vg stężonych rAAV rozcieńczonych w 25 μl PBS (w tym kontrola ujemna: 25 μl PBS). Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%_CO2
   .
   4. Dodać kondycjonowaną pożywkę wcześniej przechowywaną i inkubować przez 24 godziny.
   5. Wyrzuć pożywkę do każdej studzienki i przemyj 2x PBS.
   6. Napraw komórki za pomocą 4% PFA/4% sacharozy w PBS, jak opisano w kroku 10.1.6. Umyj 2x PBS.
   7. Inkubuj każdy dołek z 5 μg/ml aglutyniny z kiełków pszenicy (WGA) sprzężonej z Alexa Fluor 633 przez 10 minut w temperaturze pokojowej (krok opcjonalny: zamiast tego wykonaj immunocytochemię). Umyj 2x PBS.
   8. Inkubować w 0,25% Triton X-100 w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Umyć PBS.
   9. Inkubować z 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Umyj 2x PBS.
   10. Uzyskuj obrazy za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw 40x/0,95 lub odwróconego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw 40x/1,4 Oil DIC.

11. Eksperymenty in vivo

UWAGA: Zwierzęta były trzymane w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze, utrzymywanym w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność. Żywność i wodę dostarczano ad libitum. Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie zwierząt.

1. Iniekcja stereotaktyczna w móżdżku
   1. Znieczulenie 9-tygodniowych zwierząt C57BL/6 poprzez inhalację 2% izofluranu w obecności tlenu (0,8 l/min) w komorze podłączonej do parownika.
   2. Umieścić znieczulone zwierzę w aparacie stereotaktycznym (na podkładce podgrzanej w temperaturze 35 °C) i umieścić maskę izofulanową w nosie zwierzęcia. Zmniejsz poziom izofluranu do 1,3-1,7%.
      UWAGA: Przed przystąpieniem do kontynuowania upewnij się, że zwierzę jest prawidłowo znieczulone (utrata odruchu zgięcia w obu kończynach tylnych).
   3. Nałóż smarującą maść do oczu, aby uniknąć wysuszenia rogówki i wstrzyknij zwierzęciu zatwierdzony środek przeciwbólowy.
      UWAGA: Wszystkie kolejne kroki muszą być wykonywane w sterylnych warunkach.
   4. Po ogoleniu sierści na głowie zwierzęcia i zdezynfekowaniu pola operacyjnego, należy odsłonić czaszkę i umieścić końcówkę igły iniekcyjnej o końcówce o sile 30 G, podłączonej do strzykawki Hamiltona o pojemności 10 μl, bezpośrednio nad bregmą (należy użyć bregma jako zera do obliczania współrzędnych stereotaktycznych).
   5. Przesuń igłę do zamierzonej współrzędnej i wywierć otwór w czaszce, w który wejdzie igła.
      UWAGA: W ramach tego badania wykonano pojedyncze wstrzyknięcie centralnie w móżdżek.
   6. Wstrzyknąć 4 μl roztworu rAAV zawierającego łącznie 8 ×^{10 9} vg, rozcieńczonego w PBS, z szybkością infuzji 0,5 μl/min, używając automatycznego wstrzykiwacza. Użyj następujących współrzędnych, obliczonych na podstawie bregma, aby wykonać pojedyncze wstrzyknięcie centralnie w móżdżek dorosłej myszy C57BL/6: przednio-tylna: -6,5 mm; boczny: 0 mm; brzuszne: -2,9 mm.
      UWAGA: Te współrzędne mogą się różnić w zależności od szczepu myszy, płci i wieku używanych zwierząt.
   7. Aby zminimalizować przepływ wsteczny i umożliwić dyfuzję wektora wirusowego, po zakończeniu infuzji pozostaw igłę strzykawki w tych współrzędnych na 3 minuty, a następnie powoli wycofaj ją o 0,3 mm i pozwól jej pozostać na miejscu przez dodatkowe 2 minuty przed całkowitym usunięciem z mózgu myszy.
   8. Zamknij nacięcie i oczyść je środkiem dezynfekującym (np. 10% jodowidonu).
   9. Pozwól zwierzętom dojść do siebie po znieczuleniu przed powrotem do ich domowych klatek.
2. Pobieranie i przygotowanie tkanek
   UWAGA: W tym eksperymencie poziomy transdukcji obserwowano 12 tygodni po wstrzyknięciu, ale tę samą procedurę można było ocenić już 4 tygodnie po wstrzyknięciu.
   1. Znieczulić zwierzęta w sposób końcowy poprzez dootrzewnowe podanie przedawkowania ksylazyny/ketaminy (8/160 mg/kg masy ciała).
   2. Perfuzja przezsercowa zwierząt za pomocą lodowatego PBS przez 6 minut z szybkością 2,5 ml/min, a następnie perfuzja ze świeżo przygotowanym lodowatym 4% roztworem PFA przez 10 minut z tą samą szybkością.
   3. Wycięte mózgi należy umieścić w 4% PFA przez noc w temperaturze pokojowej, a następnie przenieść je do 25% roztworu sacharozy/PBS w celu krioprotekcji. Gdy mózg opadnie (około 48 godzin później), przechowuj go w temperaturze -80 °C.
   4. Ciąć szeregowe odcinki strzałkowe o grubości 30 μm za pomocą kriostatu w temperaturze -21 °C. Dla każdego zwierzęcia zbierz 96 strzałkowych odcinków półkuli mózgu w seriach anatomicznych jako swobodnie pływające sekcje w PBS uzupełnione 0,05% azydkiem sodu. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszej obróbki.
3. Standardowa immunohistochemia fluorescencji
   1. Wybierz osiem odcinków strzałkowych na zwierzę, w odległości 240 μm od siebie.
   2. Inkubować swobodnie pływające sekcje w roztworze blokującym/przepuszczalnym (0,1% Triton X-100 zawierający 10% normalnej surowicy koziej (NGS) w PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   3. Skrawki inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z pierwszorzędowym przeciwciałem poliklonalnym anty-GFP kurczaka (1:1 000).
   4. Myć przez 3 x 15 minut w PBS i inkubować skrawki przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z przeciwciałem drugorzędowym poliklonalnym przeciwko kurczakom przeciwciałem kozim sprzężonym z fluoroforem Alexa Fluor 488 (1:200).
   5. Prać przez 3 x 15 min w PBS. Inkubować z DAPI przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   6. Prać przez 3 x 15 min w PBS. Umieścić skrawki w szkiełkach pokrytych żelatyną i szkiełku nakrywkowym z fluorescencyjnym medium montażowym.
   7. Rejestruj obrazy na mikroskopie fluorescencyjnym ze skanerem do slajdów wyposażonym w obiektyw 20x/0,8.

Wyniki

W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowy protokół produkcji, oczyszczania i charakterystyki mozaikowych rAAV (podsumowany na Ryc. 1), które mają potencjał do celowania i transdukcji OUN (np. AAV1 i AAV9), będąc jednocześnie odpowiednimi do oczyszczania za pomocą chromatografii powinowactwa do heparyny (AAV2). W tym celu do opracowania wektorów mozaikowych rAAV1/2 oraz rAAV2/9 wykorzystano kapsydy naturalnych serotypów AAV 1, 2 i 9.

Przed rozpoczęciem prac przeprowadzono analizę preparatów plazmidów w celu sprawdzenia ich integralności strukturalnej. Oprócz trawień niezbędnych do walidacji prawidłowej insercji fragmentów klonowanych, konieczne jest systematyczne badanie plazmidów pITR w celu wykrycia potencjalnych delecji lub insercji w obrębie ITR. Przykładowo, integralność ITR w różnych klonach plazmidu pITR monitorowano po trawieniu plazmidu enzymem restrykcyjnym SmaI (Rycina uzupełniająca S1).

Oba typy wektorów mozaikowych generowano poprzez ko-transfekcję odpowiednich plazmidów kapsydu AAV w stosunku 1:1, zgodnie ze standardowymi metodami transfekcji⁶. W skrócie, komórki HEK293T transfektowano i) plazmidem zawierającym interesujący transgen umieszczony pomiędzy sekwencjami ITR (pITR), ii) plazmidem zawierającym genom AAV typu dzikiego z otwartymi ramkami odczytu (ORF) Rep i Cap AAV2 oraz AAV1 lub AAV9 (plazmidy pAAV-RC) oraz iii) plazmidem kodującym białka adenowirusowe (E1A, E1B, E4 i E2A) oraz RNA związane z wirusem adenowirusa, niezbędne do funkcji pomocniczych (pHelper). Po czterdziestu ośmiu godzinach zebrano komórki^6,36, a rAAV oczyszczono z homogenatu komórkowego za pomocą chromatografii powinowactwa z wykorzystaniem systemu FPLC. Jak przedstawiono na Rysunku 2A, po wyrównaniu kolumny (etap wyrównywania), lizat komórkowy zawierający rAAV naniesiono na kolumnę (ładowanie próbki). Ze względu na naturalne powinowactwo rAAV2 do heparyny³³, cząstki rAAV związały się z żywicą kolumny, podczas gdy pozostałe składniki zostały wyniesione z buforem dopływowym i wykryte przez monitor UV (przepływ), co spowodowało wzrost absorbancji. Następnie kolumnę przemyto (etap płukania), a rAAV ostatecznie eluoowano poprzez zwiększenie stężenia NaCl (etap elucji). Eluowane wirusy zostały wykryte przez monitor UV i zebrane w frakcjach po 1 mL.

Reprezentatywny profil piku elucji dla rAAV1/2 i rAAV2/9 przedstawiono odpowiednio na Rysunku 2B oraz Rysunku uzupełniającym S2A, przy czym różne serie wirusów konsekwentnie wykazywały pojedynczy pik rozpoczynający się od frakcji F7 do F16. Wysokość piku jest zmienna w zależności od produkcji rAAV, a wyższe piki zazwyczaj prowadzą do uzyskania większych wydajności rAAV. Każda frakcja otrzymanego rAAV1/2 i rAAV2/9 została następnie scharakteryzowana za pomocą RT-qPCR w celu oceny miana wirusa (Rysunek 2C oraz Rysunek uzupełniający S2B).

Aby scharakteryzować czystość eluegowanego materiału, 40 µL każdej frakcji oraz odpowiedniego przełomu poddano analizie za pomocą elektroforezy w 10% żelu poliakrylamidowym z SDS (Rysunek 2D dla rAAV1/2 oraz Rysunek dodatkowy S2C dla rAAV2/9). Barwienie błękitem Coomassie ujawniło trzy główne prążki w frakcjach F7-F16, o masach cząsteczkowych odpowiadających białkom kapsydu AAV: VP1 (87 kDa), VP2 (72 kDa) i VP3 (62 kDa) w odpowiednich stosunkach 1:1:10, jak wcześniej opisano w pracy Van Vlieta i współpracowników¹⁴. W obu przypadkach, w oparciu o absorbancję UV, RT-qPCR oraz intensywność prążków w żelu, wyraźnie widać, że większość mozaikowych rAAV znajduje się we frakcjach F7 i F8, a ich ilość stopniowo spada w frakcjach F9-F16. Oprócz trzech wirusowych białek kapsydu, w frakcjach F8-F16 wykryto inne białko (lub białka) o wielkości około 17 kDa.

Aby wyeliminować współoczyszczone białko(a), frakcje F7-16 poddano następnie filtracji i zagęszczaniu przy użyciu jednostek filtrujących do wirowania 100 KDa, a końcowy miano rAAV wyznaczono za pomocą RT-qPCR (jak pokazano na Rysunku 3A,B dla rAAV1/2). Końcowa wydajność produkcji rAAV zależy od długości i złożoności pITR, integralności sekwencji ITR, warunków hodowli komórkowej (np. liczby pasaży komórek) oraz wydajności transfekcji^{24,58,59,60,61}. Niemniej jednak końcowe miano można dostosować, wykonując wielokrotne wirowanie preparatu rAAV przy użyciu jednostek filtrujących do wirowania 0,5 mL (etap zagęszczania 2). Po zastosowaniu tego protokołu, dla objętości końcowej w zakresie od 50 do 100 µL, stężenia zazwyczaj mieszczą się w przedziale od 2 × 10⁹ do 5 × 10¹⁰ vg/µL (ilościowe oznaczenie wykonano przy użyciu wspomnianego zestawu do miareczkowania).

Czystość końcowych preparatów rAAV oceniono następnie na 10% żelu SDS-polinekramydowym. Jak pokazano na Rysunku 3C, w przypadku preparatu rAAV1/2 zaobserwowano jedynie trzy prążki odpowiadające białkom kapsydu rAAV i nie zidentyfikowano żadnych wykrywalnych współoczyszczonych białek. Wyniki te były spójne z uzyskanymi dla rAAV2/9 (Rysunek uzupełniający S2C). Aby potwierdzić tożsamość i dalej scharakteryzować czystość wektorów rAAV1/2 oraz rAAV2/9, frakcje wirusowe i skoncentrowane zapasy przeanalizowano za pomocą western blot, wykorzystując specyficzne przeciwciała B1 (Rysunek uzupełniający S3A i Rysunek uzupełniający S4A) oraz A69 (Rysunek uzupełniający S3B i Rysunek uzupełniający S4B). Podczas gdy przeciwciało B1 rozpoznaje epitop C-końcowy wspólny dla wszystkich białek VP większości serotypów AAV⁶², klon A69 rozpoznaje epitopy wyłącznie białek VP1 i VP2⁶³. Niemniej jednak, po znakowaniu B1 i A69 można wykryć również niektóre słabe prążki o masach cząsteczkowych niższych niż VP3 (<62 kDa).

W celu scharakteryzowania morfologii strukturalnej i dalszej oceny czystości rAAV, cząstki wirusowe poddano bezpośredniej wizualizacji za pomocą TEM. Technika ta stanowi standardową procedurę oceny integralności i czystości próbek wirusowych, ponieważ umożliwia ilościowe określenie liczby pustych i pełnych cząstek rAAV, a także ocenę poziomu zanieczyszczeń w próbce^{29,64,65,66,67}. Jak pokazano na Rysunku 3D, na czystym tle można było zaobserwować dużą ilość cząstek rAAV o średnicy ~25 nm. W całym polu widzenia próbki widoczne były zarówno cząstki puste (czarna strzałka) z elektronowo gęstym centrum, jak i wektory pełne (biała strzałka).

Przeprowadziliśmy również kontrolę jakości oczyszczonych rAAV przy użyciu Stunner, platformy łączącej spektroskopię w zakresie ultrafioletu i światła widzialnego (UV-Vis), statyczne rozpraszanie światła (SLS) oraz dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)⁶⁸. Dla każdej próbki za pomocą spektroskopii UV-Vis zmierzono całkowitą ilość białka i ssDNA, a także zanieczyszczenia absorbujące i mętność tła (Rycina 3E oraz Rycina uzupełniająca S5A). Następnie zastosowano SLS i DLS w celu oceny właściwości rozpraszania światła przez kapsydy rAAV. Biorąc pod uwagę, że AAV mają średnicę średnią 25 nm, cząstki w zakresie średnic od 15-45 nm uznaje się za nienaruszone. Większe cząstki zazwyczaj reprezentują agregaty wirusowe, natomiast wszystko, co mniejsze, stanowi najprawdopodobniej małe cząstki, w tym niezmontowane białka kapsydu⁶⁸. W przypadku rAAV1/2 zaobserwowano pojedynczy piki odpowiadający nienaruszonym cząstkom kapsydu przy 30 nm (Rycina 3F), przy 0% intensywności agregatów i 0% intensywności małych cząstek. W preparacie rAAV2/9 wykryto również piki przy 30 nm, reprezentujący 78% intensywności kapsydu (Rycina uzupełniająca S5B). Mimo że intensywność małych cząstek wynosiła 0%, w tej próbce zmierzono intensywność agregatów na poziomie 22% (przedstawioną w kolorze szarym), przy czym główny wkład (19,9%) pochodził z dużych agregatów o średniej średnicy 620 nm (Rycina uzupełniająca S5B). Dzięki połączeniu spektroskopii UV-Vis z informacjami z SLS i DLS, system Stunner określił całkowity miano kapsydów, miano pełnych kapsydów, ilość wolnego i zagregowanego białka, a także wolnego i zagregowanego ssDNA dla obu preparatów wirusowych, co przedstawiono na Rycini 3G oraz Rycini uzupełniającej S5C (konkretne wartości podano w opisach poszczególnych rycin).

Równolegle, aby ocenić aktywność biologiczną opracowanych mozaikowych wektorów AAV, komórki HEK293T zainfekowano 50 µL każdej frakcji (F2-F16) uzyskanej za pomocą FPLC z preparatu rAAV1/2 lub rAAV2/9. Ponieważ wektor rAAV1/2 koduje jednoniciowy zielony białko fluorescencyjne (GFP), pod kontrolą promotora CMV (pAAV-CMV-ssGFP), a wektor rAAV2/9 koduje samouzupełniające się GFP, pod kontrolą promotora CMV (pAAV-CMV-scGFP⁵³), bezpośrednią fluorescencję GFP badano w tych komórkach 48 godzin po infekcji (Rycina uzupełniająca S6 i Rycina uzupełniająca S7). Zgodnie z poprzednimi obserwacjami dla RT-qPCR, barwienia błękitem Coomassie oraz western blot, najwyższy poziom zakaźności osiągnięto dla frakcji wirusowych F7 i F8, z stopniowym spadkiem w frakcjach od F9 do F16.

Aby potwierdzić, czy aktywność biologiczna rAAV została zachowana po etapach ultrafiltracji i zagęszczania, komórki Neuro2A, wysiane zarówno na płytkach 24-dołkowych, jak i na szkiełku przedmiotowym z 8 komorami, zainfekowano zagęszczonym wektorem rAAV1/2 kodującym scGFP pod kontrolą promotora CMV (pAAV-CMV-scGFP⁵³). Obrazy w polu jasnym i fluorescencyjne uzyskano 48 h po infekcji (Rysunek 4A,B w celu uzyskania obrazów o wyższej rozdzielczości).

W celu zbadania zdolności infekcyjnej otrzymanych rAAV w bardziej odpowiednim i reprezentatywnym modelu komórkowym, półgęste pierwotne hodowle neuronów kory mózgu wysiano na płytkę 12-dołkową i zainfekowano wcześniej zastosowanym rAAV1/2 - CMV-scGFP. Czterdzieści osiem godzin po infekcji komórki utrwalono i znakowano DAPI oraz WGA sprzężonym z Alexa Fluor 633, lektyną powszechnie stosowaną do znakowania utrwalonych komórek. Obrazy przedstawione na Rysunku 4C,D uzyskano za pomocą mikroskopu Zeiss Axio Observer Z1 oraz konfokalnego mikroskopu Zeiss LSM 710. Jak pokazano na tych rysunkach poprzez bezpośrednią fluorescencję GFP, skoncentrowane wirusy mozaikowe zachowują właściwości transferu genów do komórek neuronów.

Po scharakteryzowaniu mozaikowych rAAV pod kątem czystości, właściwości fizycznych i funkcjonalności in vitro, oceniliśmy możliwość wykorzystania oczyszczonych mozaikowych wektorów rAAV1/2 do transdukcji móżdżku myszy C57BL/6. W tym celu wykonano wstrzyknięcie stereotaksyczne u 9-tygodniowych myszy, a ekspresję GFP oceniono 12 tygodni później. Zgodnie z przewidywaniami, zwierzęta wstrzyknięte z PBS nie wykazały fluorescencji podczas immunoznakowania GFP. Obrazy z mikroskopu epifluorescencyjnego u myszy wstrzykniętych wektorami rAAV1/2 kodującymi GFP pod kontrolą promotora synapsyny 1 (rAAV1/2 - Syn-ssGFP) wykazały, że wektory rAAV1/2 skutecznie przetransdukowały kilka obszarów móżdżku, mianowicie obszar głębokich jąder móżdżku (DCN), a także poszczególne listki móżdżku (Rycyna 5). Wyniki te demonstrują przedłużoną ekspresję transgenu w mózgu ssaków (12 tygodni).

Rysunek 1: Schematyczny przedstawienie protokołu produkcji i oczyszczania rAAV. rAAV są produkowane poprzez przejściową transfekcję komórek HEK293T z wykorzystaniem polietylenoiminy (PEI). Następnie komórki są zbierane i lizowane, a rAAV są oczyszczane z homogenatu komórkowego za pomocą chromatografii powinowactwa. Zebrane frakcje zawierające rAAV są następnie zagęszczane, a końcowe zapasy wirusów są charakteryzowane pod kątem miana, czystości, cech morfologicznych oraz aktywności biologicznej. Skróty: rAAV = rekombinowany wirus towarzyszący adenowirusom; PEI = polietylenoimina; RT-qPCR = ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją; SDS-PAGE = elektroforeza w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Rysunek 2: Protokół oczyszczania FPLC i reprezentatywny profil elucji rAAV1/2. (A) Schematyczny przedstawienie pełnego profilu chromatogramu, ukazujące poszczególne etapy procesu oczyszczania rAAV. Po etapie równoważenia kolumny nanoszona jest próbka. Następnie kolumna jest płukana, a elucja przeprowadzana jest przy użyciu zwiększających się stężeń NaCl. Materiał nieprzypisany (przepływowy) oraz frakcje 1 mL eluowanych wirusów są zbierane do analizy. Absorbancja przy 280 nm jest wyrażona w mAU, a oś x wskazuje objętość w mL. (B) Powiększony fragment chromatogramu pokazujący pik elucji rAAV1/2 (na czarno), z odpowiadającymi mu numerami frakcji (F2-F16) i odpadem (oznaczonym na czerwono). Podane stężenie buforu B oraz przewodność (wyrażona w mS/cm) są również pokazane odpowiednio na zielono i fioletowo. (C) RT-qPCR każdej frakcji zebranej podczas oczyszczania powinowactwem (F2-F16) oraz przepływu. Miano w vg/µL jest przedstawione w skali logarytmicznej. (D) Analiza SDS-PAGE zebranych frakcji wirusowych. Równe objętości (40 µL) każdej frakcji z etapu elucji (F2-F16) oraz odpowiedniego przepływu zostały naniesione i rozdzielone na 10% żelu SDS-poliakrylamidowym. Prążki białkowe zwizualizowano za pomocą barwienia błękitem Coomassie. Wskazano prążki odpowiadające białkom kapsydu AAV VP1, VP2 i VP3. Standardowa drabinka wielkości białek oznaczona jest jako (L), a obok podano odpowiadające im masy cząsteczkowe. Skróty: rAAV = rekombinowany wirus towarzyszący adenowirusom; RT-qPCR = ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym; SDS-PAGE = elektroforeza żelowa w obecności dodecylsiarczanu sodu i poliakryloamidu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Charakterystyka skoncentrowanych wektorów rAAV1/2. (A) Krzywe amplifikacji skoncentrowanej próbki rAAV1/2 (na niebiesko), szeregowo rozcieńczonych standardów od 2 × 10⁷ vg/µL do 2 × 10² vg/µL (na czarno) oraz kontroli bez matrycy (na zielono), uzyskane podczas RT-qPCR. (B) Krzywa standardowa (regresja liniowa) do oznaczania miana próbki rAAV w vg/µL. (C) Analiza SDS-PAGE skoncentrowanych cząsteczek wirusowych. Na żel naniesiono łącznie 2,3 × 10¹⁰ vg ze skoncentrowanego zapasu. (D) Obraz z transmisyjnego mikroskopu elektronowego cząsteczek rAAV1/2 o średnicy ~25-30 nm. Puste cząsteczki z elektron적으로 gęstym centrum (oznaczone czarnymi strzałkami) można odróżnić od pełnych kapsydów (oznaczonych białymi strzałkami). Pasek skali = 100 nm. (E) Widmo absorbancji preparatu rAAV1/2 zmierzone za pomocą Stunner (na czarno). Przedstawiono również udział białek (na niebiesko), ssDNA (na zielono), innych związków absorbujących UV lub zanieczyszczeń (na fioletowo) oraz mętności tła (na szaro). (F) Rozkład intensywności DLS dla rAAV1/2 z pojedynczym pikiem przy 30 nm, zmierzony za pomocą Stunner. Intensywność rozpraszania kapsydów na poziomie 100% określono poprzez pomiar pola pod krzywą od 15 do 45 nm (zakres zaznaczony na zielono). (G) Analiza Stunner preparatu wektora rAAV1/2 wykazująca całkowite miano kapsydów 1,19 × 10¹⁴ cp/mL (ciemnoniebieski) i miano pełnych kapsydów 1,73 × 10¹³ vg/mL (ciemnozielony). Zmierzono również wolne i zagregowane białko w ilości równoważnej 7,16 × 10¹² cp/mL (jasnoniebieski), a także wolny i zagregowany ssDNA w ilości równoważnej 1,04 × 10¹² vg/mL (jasnozielony). Skróty: rAAV = rekombinowany wirus towarzyszący adenowirusom; RT-qPCR = ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym; SDS-PAGE = elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu; ssDNA = jednoniciowe DNA; DLS = dynamiczne rozpraszanie światła. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 4: Ocena zakaźności in vitro skoncentrowanej próbki rAAV1/2.(A) Komórki Neuro2A zostały zainfekowane rAAV1/2 - CMV-scGFP lub inkubowane z równoważną objętością PBS jako kontrolą negatywną. Obrazy komórek w jasnym polu i obrazowanie fluorescencyjne wykonane 48 h po infekcji. Obrazy pozyskano przy użyciu mikroskopu Zeiss Axio Observer Z1 (obiektyw 10x). Paski skali = 100 µm. (B) Szczegółowe obrazy komórek Neuro2A 48 h po infekcji rAAV1/2 - CMV-scGFP. Obrazy pozyskano przy użyciu mikroskopu Zeiss LSM 710 (obiektyw 40x). Paski skali = 20 µm. (C) Półgęste pierwotne hodowle neuronalne zainfekowane rAAV1/2 - CMV-scGFP lub inkubowane z równoważną objętością PBS, służącą jako kontrola negatywna. Komórki zostały oznakowane barwnikiem jądrowym (DAPI w kolorze niebieskim) i barwnikiem błonowym (WGA w kolorze białym). Obrazy pozyskano przy użyciu mikroskopu Zeiss Axio Observer Z1 (obiektyw 40x). Paski skali = 20 µm. (D) Szczegółowe obrazy półgęstych pierwotnych hodowli neuronalnych 48 h po infekcji rAAV1/2 - CMV-scGFP. Obrazy pozyskano przy użyciu mikroskopu Zeiss LSM 710 (obiektyw 40x). Paski skali = 20 µm. Skróty: rAAV = rekombinowany wirus towarzyszący adenowirusom; CMV = cytomegalowirus; scGFP = samouzupełniające zielone białko fluorescencyjne; PBS = sól fizjologiczna buforowana fosforanowo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol; WGA = aglutynina z zarodków pszenicy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 5: Wydajność transdukcji rAAV1/2 in vivo po wstrzyknięciu doparenchymalnym. Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne pokazujące rozległą ekspresję GFP (na zielono) w całym móżdżku po centralnym wstrzyknięciu rAAV1/2 - Syn-ssGFP do móżdżku. Jądra komórkowe barwiono DAPI (na niebiesko). Paski skali = 500 µm. Skróty: rAAV = rekombinowany wirus towarzyszący adenowirusom; Syn = Synapsina 1; ssGFP = jednoniciowe zielone białko fluorescencyjne; DAPI = 4',6-diamidyno-2-fenyloindol; PBS = sól fizjologiczna buforowana fosforanem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina uzupełniająca S1: Analiza żelu agarozy plazmidu wektora rAAV po trawieniu enzymem SmaI. Sześć klonów (C1-C6) pITR poddano trawieniu enzymem restrykcyjnym SmaI (ścieżki 2, 4, 6, 8, 10 i 12), który przecina każdą odwróconą powtórkę końcową dwukrotnie. W tym przypadku oczekiwano, że całkowite trawienie pITR wygeneruje dwa prążki (3 796 bp i 3 013 bp). W udanych preparacjach (C1, C3, C4 i C5) wciąż widoczny jest prążek o rozmiarze 6809 bp, wynikający z niepełnego trawienia (~5% całości). W preparacjach z rekombinacją ITR proporcje są odwrócone (C2) lub trawienie nie nastąpiło (C6). Przedstawiono również odpowiednie klony nietrawione (ścieżki 3, 5, 7, 9, 11, 13). Skróty: rAAV = rekombinowany wirus towarzyszący adenowirusom; ITR = odwrócona powtórka końcowa. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca S2: Oczyszczanie rAAV2/9 za pomocą chromatografii powinowactwa z heparyną. (A) Profil elucji rAAV2/9 wykazujący pojedynczy pik (na czarno), po zwiększeniu stężenia NaCl. Zebrane frakcje są oznaczone numerami (2-16) na czerwono na dole wykresu; absorbancja przy 280 nm jest wyrażona w mAU, przewodność w mS/cm, a oś x wskazuje objętość w mL. (B) Miana rAAV określone za pomocą RT-qPCR dla każdej połączonej frakcji (F2-F16) oraz dla części niezatrzymanej (flowthrough). Wartości przedstawiono w skali logarytmicznej. (C) Analiza czystości metodą SDS-PAGE z barwieniem błękitem Coomassie. Równe objętości (40 µL) każdej frakcji (F2-F16) oraz odpowiednio części niezatrzymanej zostały nałożone i rozdzielone w 10% żelu SDS-PAGE. Skoncentrowany roztwór zapasowy został zmierzony za pomocą RT-qPCR; 2,3 × 10¹⁰ vg rozcieńczono w 40 µL PBS i naniesiono na żel. Prążki białkowe wizualizowano barwieniem błękitem Coomassie. Wskazano białka kapsydu AAV (VP1, VP2 i VP3). Standardowy marker wielkości białek oznaczono symbolem (L), wskazując również odpowiadające im masy cząsteczkowe. Skróty: rAAV = rekombinowany wirus towarzyszący adenowirusom; RT-qPCR = ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym; SDS-PAGE = elektroforeza żelowa z dodecylosiarczanem sodu i poliakryloamidem. Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

Rycina uzupełniająca S3: Analiza Western blot wektorów rAAV1/2 oczyszczonych za pomocą FPLC. (A) Zebrane frakcje i skoncentrowane wektory rAAV1/2 rozdzielono w żelu SDS-PAGE i poddano analizie z użyciem mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-AAV (B1), które rozpoznaje białka kapsydu VP1, VP2 i VP3. (B) Zebrane frakcje i skoncentrowane wektory rAAV1/2 rozdzielono w żelu SDS-PAGE i poddano analizie z użyciem mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-AAV (A69), które rozpoznaje białka kapsydu VP1 i VP2. Skróty: rAAV = rekombinowany wirus towarzyszący adenowirusom; FPLC = szybka cieczowa chromatografia białek; SDS-PAGE = elektroforeza żelowa w obecności dodecylu sodu i poliakryloamidu; L = standardowa drabina wielkości białek. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S4: Analiza Western blot wektorów rAAV2/9 oczyszczonych za pomocą FPLC. (A) Zebrane frakcje i skoncentrowane wektory rAAV2/9 rozdzielono w żelu SDS-PAGE i poddano analizie z użyciem mysiego monoklonalnego przeciwciała anty-AAV (B1), które rozpoznaje białka kapsydu VP1, VP2 i VP3. (B) Zebrane frakcje i skoncentrowane wektory rAAV2/9 rozdzielono w żelu SDS-PAGE i poddano analizie z użyciem mysiego monoklonalnego przeciwciała anty-AAV (A69), które rozpoznaje białka kapsydu VP1 i VP2. Skróty: rAAV = rekombinowany wirus towarzyszący adenowirusom; FPLC = szybka chromatografia cieczowa białek; SDS-PAGE = elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu; L = standardowa drabinka mas białek. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina dodatkowa S5: Ilościowe oznaczenie i charakterystyka wektora rAAV2/9 za pomocą urządzenia Stunner. (A) Widmo absorbancji (czarne) wektora rAAV2/9 zmierzone urządzeniem Stunner. Przedstawiono również wkład białek (niebieski), ssDNA (zielony), innych związków absorbujących UV lub zanieczyszczeń (fioletowy) oraz mętność tła (szary). (B) Rozkład intensywności DLS dla rAAV2/9 z głównym pikiem przy 30 nm, odpowiadającym intensywności rozpraszania kapsydu na poziomie 78%, co określono poprzez pomiar pola pod krzywą w zakresie od 15 do 45 nm (cienie zielone). Zmierzono również całkowitą intensywność agregatów na poziomie 22% (cienie szare), z głównym udziałem dużych agregatów (19,9%) o średniej średnicy 620 nm. (C) Analiza preparatu wektora rAAV2/9 za pomocą urządzenia Stunner, wykazująca całkowity miano kapsydów wynoszące 2,18 × 10¹⁴ cp/mL (ciemnoniebieski) oraz miano pełnych kapsydów wynoszące 2,35 × 10¹³ vg/mL (ciemnozielony). W tym preparacie zmierzono również wolne i zagregowane białka w ilości równoważnej 2,92 × 10¹³ cp/mL (jasnoniebieski) oraz wolne i zagregowane ssDNA w ilości równoważnej 3,14 × 10¹² vg/mL (jasnozielony). Skróty: rAAV = rekombinowany wirus towarzyszący adenowirusom; ssDNA = jednoniciowy DNA; DLS = dynamiczne rozpraszanie światła. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S6: Wydajność transdukcji in vitro i żywotność oczyszczonych frakcji rAAV1/2. Komórki HEK293T wykazujące ekspresję GFP (fluorescencja bezpośrednia) 48 h po transdukcji 50 µL frakcji FPLC wektora rAAV1/2 kodującego ssGFP (rAAV1/2 - CMV-ssGFP). Paski skali = 100 µm. Skróty: rAAV = rekombinowany wirus towarzyszący adenowirusom; FPLC = szybka chromatografia cieczowa białek; ssGFP = jednoniciowe zielone białko fluorescencyjne. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca S7: Efektywność transdukcji in vitro i żywotność oczyszczonych frakcji rAAV2/9. Komórki HEK293T zainfekowano 50 µL każdej frakcji FPLC (F2-F16) lub przesączem wektora rAAV2/9 kodującego scGFP pod kontrolą promotora CMV. Komórki wykazujące ekspresję GFP zobrazowano 48 h po infekcji. Paski skali = 100 µm. Skróty: rAAV = rekombinowany wirus towarzyszący adenowirusom; FPLC = szybka chromatografia cieczowa białek; scGFP = samouzupełniające zielone białko fluorescencyjne; CMV = cytomegalowirus. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Szybko rozwijający się zestaw narzędzi wektorowych AAV stał się jednym z najbardziej obiecujących systemów dostarczania genów dla szerokiego zakresu typów komórek różnymi drogami podawania. W niniejszej pracy naszym celem było opracowanie ulepszonego protokołu wytwarzania, oczyszczania i charakterystyki mozaikowych wektorów rAAV, które mogłyby udowodnić swoją wartość w badaniach przedklinicznych. W tym celu opisano tutaj generowanie wektorów mozaiki rAAV1/2 i rAAV2/9, ale procedurę można również zastosować do oczyszczania standardowych wektorów rAAV2 (dane nie pokazane).

Mozaikowe rAAV wyprodukowano przy użyciu zoptymalizowanej metody transfekcji przy użyciu PEI jako odczynnika do transfekcji. Metoda transfekcji przejściowej została wybrana ze względu na jej większą elastyczność i szybkość, co stanowi znaczne zalety we wczesnych fazach badań przedklinicznych. Po walidacji konkretnego transgenu i serotypu system produkcji można dostroić w celu osiągnięcia lepszej skalowalności i opłacalności poprzez ustanowienie stabilnej transfekowanej linii komórkowej, która wyraża podzbiór specyficznych genów Rep/Cap , z dodatkowymi genami dostarczonymi w procesie infekcji²⁴. W porównaniu z transfekcją wapniowo-fosforanową, PEI ma kilka zalet. Jest to stabilny i ekonomiczny odczynnik do transfekcji, który działa skutecznie w szerszym zakresie pH. Dodatkowo eliminuje konieczność wymiany pożywki komórkowej po transfekcji, co skutkuje znacznym zmniejszeniem zarówno kosztów, jak i nakładu pracy⁶⁹.

Próbując obejść niektóre ograniczenia narzucone przez gradienty CsCl lub jodiksanolu, wytworzone rAAV zebrano i oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa. Strategia ta oferuje uproszczone i skalowalne podejście, które można wykonać bez konieczności ultrawirowania i gradientów, uzyskując czyste i wysokie miano wirusa. Rzeczywiście, techniki chromatograficzne wykorzystujące system FPLC można zautomatyzować i zwiększyć poprzez upakowanie większej objętości żywicy w kolumnie o większej wysokości łoża. Opisany tutaj protokół można łatwo dostosować do włączenia kolumn HP HiTrap Heparin o pojemności 5 ml (dane nie pokazane). Dodatkowo, kolumny z heparyną mogą być wielokrotnie używane, co przyczynia się do opłacalności tej metody.

Oczyszczone rAAV scharakteryzowano następnie pod względem miana, czystości, cech morfologicznych i aktywności biologicznej. Co ciekawe, w barwieniu Coomassie na niebiesko wykryto prążek o około 17 kDa we frakcjach F8-F16 oprócz trzech typowych białek kapsydu wirusa. Jednak pasmo to nie jest już obecne po etapie koncentracji rAAV. Co więcej, niektóre słabe prążki o masie cząsteczkowej mniejszej niż VP3 (<62 kDa) można również wykryć po znakowaniu B1 i A69, co sugeruje, że mogą to być fragmenty białek kapsydu VP1, VP2 i VP3⁷⁰. Inną możliwością jest to, że są to w rzeczywistości inne białka kooczyszczające, takie jak ferrytyna lub inne białka komórkowe z polipeptydami, które mają podobne odciski palców białkowych z białkami kapsydu AAV i mogą być zaangażowane w biologię AAV, jak wcześniej sugerowano 26,71,72.

Analiza TEM i ogłuszacza ujawniła również obecność pustych cząstek na różnych poziomach w różnych produkcjach. Podobnie, inne wcześniejsze badania donosiły o wytwarzaniu zmiennych i wysokich poziomów (>65%) pustych kapsydów dla rAAV przygotowanych metodami transfekcji lub infekcji^24,73. Mechanizm stojący za generowaniem rAAV rozpoczyna się od szybkiego tworzenia pustych kapsydów z nowo zsyntetyzowanych białek VP, po którym następuje powolny etap ograniczania szybkości pakowania genomu do wstępnie uformowanych kapsydów, w którym pośredniczą białka Rep^74,75. Dlatego puste kapsydy są generowane w produkcji rAAV, chociaż proporcja pustych i pełnych kapsydów może się różnić w zależności od wielkości i sekwencji transgenu będącego przedmiotem zainteresowania oraz warunków hodowli komórkowej^58,73. Puste kapsydy budzą pewne obawy, ponieważ ze względu na brak interesującego ich genomu nie są w stanie zapewnić efektu terapeutycznego, a także mogą potencjalnie zwiększać wrodzoną lub nabytą odpowiedź immunologiczną. Jednak niektóre doniesienia wykazały również, że poprzez dostosowanie ich stosunku, puste kapsydy AAV mogą służyć jako wysoce skuteczne wabiki dla przeciwciał neutralizujących specyficznych dla AAV, a tym samym zwiększać skuteczność transdukcji 60,76,77^. Jeśli obecność pustych kapsydów jest krytycznie szkodliwa i biorąc pod uwagę nieco mniej anionowy charakter pustych cząstek w porównaniu z pełnymi wektorami, potencjalnym rozwiązaniem może być przeprowadzenie drugiego etapu oczyszczania polerowania przy użyciu technik chromatografii anionowymiennej⁶⁴.

Badanie to dostarcza również przekonujących dowodów na to, że wygenerowane mozaikowe rAAV są w stanie skutecznie transdukować nie tylko hodowle neuronów in vitro , ale także OUN po wewnątrzczaszkowym wstrzyknięciu rAAV1/2. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te sugerują, że opisany protokół produkcji i oczyszczania sprawia, że wysoce czyste i biologicznie aktywne rAAV są gotowe do użycia w ciągu 6 dni, prezentując się jako wszechstronna i opłacalna metoda wytwarzania rAAV w badaniach przedklinicznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10% powidon-jod	Medline	MDS093943
12-dołkowe płytki	Thermo Scientific	11889684
24-dołkowe VWR		734-2325
4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)	Invitrogen	D1306
96-dołkowa płytka ogłuszająca	Unchained Labs	701-2025	96-dołkowa płytka do dalszej absorpcji światła widzialnego w ultrafiolecie, statycznego rozpraszania światła i dynamicznej analizy rozpraszania światła próbek rAAV
Zestaw do miareczkowania AAVpro (do PCR w czasie rzeczywistym) Ver.2	Takara	6233	Do oznaczania miana AAV za pomocą RT-qPCR. Ten zestaw zawiera DNazę I, bufor do lizy, bufor rozcieńczający, kontrolę pozytywną, mieszaninę Taq II, starter do przodu, odwrócony starter, wodę
Glacier Fisher	Chemical	A/0360/PB17
Ä System KTA pure 25	Cytiva	29018224	FPLC sterowany przez oprogramowanie UNICORN, wersja 6.3
Przeciw mysim kozom połączonym z fosfatazą alkaliczną	Invitrogen	31328
Filtr odśrodkowy Amicon ultra-0,5 Filtr odśrodkowy	Merck Millipore	UFC5100
Filtr odśrodkowy Amicon ultra-15	Merck Millipore	UFC9100
Nukleaza benzonazy	Merck Millipore	E1014
Błękit bromofenolowy	Sigma-Aldrich	B0126
System wykrywania PCR w czasie rzeczywistym CFX96	Biorad	184-5096
System obrazowania dotykowego ChemiDoc	Bio-Rad Laboratories	1708370
Kurczak poliklonalne przeciwciało pierwszorzędowe anty-GFP	Abcam	ab13970
Coomassie Blue G250	Fisher Chemical	C/P541/46
Ditiothreitol (DTT)	Odczynniki	Fisher
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
ECF Podłoże do Western Blotting	Cytiva	RPN5785
FastDigest SmaI	Thermo Scientific	FD0663
FEI-Tecnai G2 Spirit Biotwin	FEI		Biotwin Transmisyjny mikroskop elektronowy
Płodowa surowica bydlęca	Biowest	S1810
Fluorescencyjny nośnik montażowy	Dako	S3023
Siatka 200 mesh powlekana węglem Formvar	Sprzęt do laboratoriów TAAB	F077/025
Aparat do odprowadzania gazów	RWD	R546W
Glicerol	Fisher BioReagents	10021083
Przeciwciało poliklonalne przeciwko kurczakom Goat, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11039
Igła Hamilton 30G, Igła Small Hub RN, 25 mm, PST3	Hamilton	7803-07
Hamilton strzykawka (10 &mikro; L)	Hamilton	7653-01
HEK293T	American Type Culture Collection	CRL-11268
HiTrap Heparin HP 1 x 5 mL	Cytiva	17040701	Fabrycznie zapakowana kolumna heparyny
HiTrap Heparyna HP 5 x 1 ml	Cytiva	17040601	Fabrycznie pakowana kolumna heparyny
Immobilon-P PVDF Membrana	Merck Millipore	IPVH00010
Izofluran	Braun	469860
Ketamina	Dechra Pharmaceuticals	N/A	Nimatek
Probówki wirówkowe do mikrowirówek o niskiej retencji (2 ml)	Fisher Scientific	11906965
Lunatic & Oprogramowanie klienckie Stunner	, Unchained Labs,	N/A	Oprogramowanie do analizy klienta w wersji 8.0.1.235. Oprogramowanie do sekwencyjnej absorpcji światła ultrafioletowego i widzialnego, statycznego rozpraszania światła i dynamicznej analizy rozpraszania światła próbek rAAV
Metanol	Fisher Chemical	M/4000/FP21
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-AAV, VP1, VP2 (A69)	American Research Products	03-61057
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-AAV, VP1, VP2, VP3 (B1)	American Research Products	03-61058
Neuro2a	American Type Culture Collection	CCL-131
Normalna surowica kozia	Gibco	16210064
NucleoBond Xtra Maxi EF	Macherey-Nagel	12738422
NZYColour Protein Marker II	NZYtech	MB09002
pAAV-CMV-scGFP	Addgene	32396	Addgene plazmid # 32396; http://n2t.net/addgene:32396; RRID:Addgene_32396
pAAV-CMV-ssGFP	Addgene	105530	Plazmid Addgene # 105530; http://n2t.net/addgene:105530; RRID:Addgene_105530
pAAV2/9n	Addgene	112865	Addgene plazmid # 112865; http://n2t.net/addgene:112865; RRID:Addgene_112865
Paraformaldehyd	Acros Organics	10342243
PBS	Fisher BioReagents	BP2438
Penicylina-streptomycyna	Gibco	15140-122
Pluronic F-68 Niejonowy środek powierzchniowo czynny (100x)	Gibco	24040032
Polietylenimina MAX, MW 40 000	Polysciences Europe	24765
Kompaktowa maszyna do znieczulania małych zwierząt serii R500 - Isoflurane	RWD	N/A
Zawór wlotowy próbki V9-IS	Cytiva	29027746
Pompa do próbek P9-S	Cytiva	29027745
Azydek sodu	Sigma-Aldrich	S2002
Chlorek sodu	Fisher Scientific	10428420
Deoksycholan sodu	Sigma-Aldrich	D6750
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	Fisher Bioreagents	BP166
Sterylny filtr strzykawkowy PVDF	Fisher Scientific	15191499
Stunner Platform	Unchained Labs	700-2002	Sprzęt do sekwencyjnej absorpcji światła ultrafioletowo-widzialnego, statycznego rozpraszania światła i dynamicznej analizy rozpraszania światła próbek rAAV
Superloop 150 ml	Cytiva	18-1023-85
Superloop 50 ml	Cytiva	18-1113-82
SURE 2 superkompetentne komórki	Stratagene, Agilent Technologies	HPA200152
Naczynia hodowlane poddane działaniu	Corning	734-1711
Baza Tris	Fisher BioReagents	BP152
Chlorowodorek	TrisFisher BioReagents	BP153
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Trypsyna-EDTA	Gibco	25200-072
Agglutynina z kiełków pszenicy (WGA) sprzężona z Alexa Fluor 633	Invitrogen	W21404
Xylazine	Dechra Pharmaceuticals	N/A	Sedaxylan
Zeiss Axio Observer Z1	Carl Zeiss Mikroskopia GmbH	N/A	Odwrócony mikroskop fluorescencyjny wyposażony w obiektyw EC Plan-Neofluar 10x/0,30 oraz obiektyw Plan-Apochromat 40x/0,95
Zeiss Axio Scan.Z1	Carl Zeiss Microscopy GmbH	N/A	Skaner slajdów mikroskop fluorescencyjny wyposażony w obiektyw Plan-Apochromat 20x/0,8
Zeiss LSM 710	Carl Zeiss Microscopy GmbH	N/A	Odwrócony mikroskop konfokalny wyposażony w Plan-Apochromat 40x/1,4 Oil DIC obiektyw
i mikro szkiełko 8-dołkowe Ibidi	Ibidi	80826	8-dołkowe szkiełko

BP17225 środka