Rola limfocytów T CD4 w rzutowo-remisyjnym eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia

Podsumowanie

Eksperymentalny model autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) u myszy został wykorzystany do zbadania roli limfocytów T CD4 w początkowym i nawrocie EAE z perspektywy fazy aktywacji i funkcji efektu immunologicznego.

Streszczenie

Stwardnienie rozsiane (MS) jest chorobą autoimmunologiczną charakteryzującą się infiltracją komórek odpornościowych i demielinizacją w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) służy jako prototypowy model zwierzęcy do badania stwardnienia rozsianego. W tym badaniu mieliśmy na celu zbadanie roli limfocytów T CD4 w inicjacji i nawrocie EAE, koncentrując się na fazie aktywacji i odpowiedzi immunologicznej. Aby stworzyć model myszy EAE, samice myszy immunizowano glikoproteiną mielinową oligodendrocytów (MOG) 35-55 emulgowaną pełnym adiuwantem Freunda (CFA). Wyniki kliniczne oceniano codziennie, a wyniki wykazały, że myszy w grupie EAE wykazywały klasyczny wzorzec rzutowo-remisyjny. Analiza barwienia hematoksyliną-eozyną (H&E) i szybkim błękitem luksolu (LFB) wykazała znaczny naciekanie komórek zapalnych w OUN i demielinizację u myszy EAE. Jeśli chodzi o fazę aktywacji, zarówno limfocyty T efektorowe CD4 ⁺ CD69 ⁺ (Teff), jak i limfocyty T (Tem^{) pamięci} efektorowej CD4 ⁺ CD44 ⁺ CD62L- mogą przyczyniać się do inicjacji EAE, jednak etap nawrotu był prawdopodobnie zdominowany przez komórki Tem CD4 ⁺ CD44 ⁺ CD62L^. Dodatkowo, jeśli chodzi o funkcję immunologiczną, pomocnicze limfocyty T (Th) 1 są przede wszystkim zaangażowane w inicjowanie EAE. Jednak zarówno komórki Th1, jak i Th17 przyczyniają się do etapu nawrotu, a funkcja immunosupresyjna regulatorowych komórek T (Treg) została zahamowana podczas procesu patologicznego EAE.

Wprowadzenie

Stwardnienie rozsiane (MS) jest chorobą autoimmunologiczną, która charakteryzuje się infiltracją ośrodkowego układu nerwowego (OUN) komórkami odpornościowymi i demielinizacją^1,2. Niedawne badania wykazały, że jest to najczęstsza choroba powodująca niepełnosprawność dotykająca młodych ludzi, a jej częstość występowania stale rośnie na całym świecie³. Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) to prototypowy model zwierzęcy dla SM, który symuluje wiele aspektów fazy zapalnej ludzkiego MS⁴. Z punktu widzenia funkcji immunologicznych początkowe limfocyty T CD4, które nie napotkały jeszcze antygenów, są określane jako limfocyty pomocnicze T(Th)0. Komórki te przechodzą procesy dojrzewania i aktywacji, aby wykazywać różne funkcje. Limfocyty T CD4 można podzielić na kilka podzbiorów zgodnie z ich specyficznymi funkcjami, które obejmują Th1, Th2, T regulatorowy (Treg), komórki pomocnicze pęcherzykowe T (Tfh), Th17, Th9 i Th22⁵. Panuje powszechna zgoda co do tego, że podtypy komórek Th1 i Th17 są kluczowymi czynnikami patogenezy EAE⁶. Komórki Th1 mogą wydzielać interferon γ (IFN-γ), a komórki Th17 wydzielają interleukinę (IL)-17 i inne czynniki zapalne, które mogą aktywować inne komórki odpornościowe, takie jak komórki mikrogleju i astrocyty. Komórki te wytwarzają cytokiny zapalne⁷, takie jak IL-18, IL-12, IL-23 i IL-1β, które mogą dodatkowo indukować odpowiedź immunologiczną komórek Th1/Th17, powodując postępującą demielinizację i uszkodzenie aksonów. Z perspektywy fazy aktywacji, limfocyty T CD4 mają z góry określone przeznaczenie do rozwoju w odrębne podzbiory komórek i zróżnicowane stany, w tym limfocyty T naiwne, efektorowe i pamięciowe⁸. Początkowe limfocyty T CD4 namnażają się i różnicują w różne podzbiory efektorów o różnych funkcjach w różnych środowiskach⁹. Większość komórek efektorowych jest krótkotrwała, a niewielka populacja limfocytów T przekształca się w limfocyty T pamięci, które wykazują szybkie funkcje efektorowe podczas ponownego napotkania tych samych antygenów i zapewniają gospodarzowi bardzo silną i długotrwałą ochronę^10,11.

Chociaż obecne badania sugerują, że limfocyty T CD4 odgrywają znaczącą rolę w rozwoju EAE, nadal nie jest jasne, jak różne podzbiory limfocytów T CD4, klasyfikowane na podstawie ich fazy aktywacji i funkcji efektu immunologicznego, przyczyniają się do inicjacji i nawrotu EAE. W niniejszym badaniu ustaliliśmy model EAE u myszy C57BL6 / J, immunizując peptyd glikoproteiny oligodendrocytów mieliny (MOG) 35-55 i zbadaliśmy inicjację i nawrót EAE, koncentrując się na fazie aktywacji i funkcji immunologicznej limfocytów T CD4.

Protokół

Łącznie 18 samic myszy C57BL/6J w wieku od sześciu do ośmiu tygodni zostało losowo podzielonych na grupę kontrolną (n = 6) i grupę EAE (n = 12) w tym badaniu. Myszy zakupiono w centrum zwierząt eksperymentalnych Uniwersytetu Medycznego Ningxia. Myszy trzymano w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze i wilgotności z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności oraz swobodnym dostępem do świeżej wody i pożywienia. Przed rozpoczęciem badania uzyskano zgodę na ocenę etyczną od Komisji Etyki Zwierząt Doświadczalnych Uniwersytetu Medycznego Ningxia.

1. Rozwój rzutowego, remisyjnego EAE u myszy C57BL/6

1. Rozpuszczanie odczynnika
   1. Rozpuścić 5,4 mg MOG35-55 (tabela materiałów) w 1,8 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Odważyć 12,6 mg Mycobacterium tuberculosis H37RA (tabela materiałów) i dodać do 1,8 ml kompletnego roztworu adiuwanta Freunda (CFA) (tabela materiałów). Rozpuścić 360 μl toksyny krztuścowej (PTX; Tabela materiałów) do 7,2 ml PBS za pomocą pipety (tabela materiałów).
2. Przygotowanie emulsji MOG35-55 i CFA
   1. Odpipetować roztwór MOG35-55 i roztwór CFA za pomocą dwóch strzykawek o pojemności 5 ml przygotowanych w kroku 1.1 i połączyć je z zaworem trójnikowym. Mieszać w sposób ciągły na lodzie przez 1 godzinę, aż do uzyskania mlecznej emulsji typu woda w oleju.
      UWAGA: Emulsję z powodzeniem przygotowuje się, gdy unosi się na powierzchni wody, nie rozpraszając się po wrzuceniu jej do wody.
3. Znieczulenie myszy
   1. Odkręć korek uszczelki wlewu z przodu parownika aparatu do znieczulenia. Powoli wlej 20 ml izofluranu wzdłuż uszczelniającej pośrodku i zablokuj nakrętkę uszczelki napełniającej. Przełącz przełącznik zaworu trójnika, aby upewnić się, że przepływ powietrza z parownika aparatu anestezjologicznego jest komunikowany ze skrzynką indukcyjną znieczulenia (tabela materiałów).
   2. Podłącz zasilanie pompy powietrza, włącz przełącznik pompy powietrza, a następnie obróć i wyreguluj zawór źródła powietrza na przednim końcu przepływomierza tlenu tak, aby przepływ gazu wyjściowego wynosił 400 ml/min. Otwórz parownik, dostosuj stężenie indukcji do 3% i poczekaj, aż środek znieczulający wypełni skrzynkę indukcyjną.
   3. Około 1 minuty później włóż myszy do pudełka indukcyjnego, a następnie zamknij pudełko indukcyjne i poczekaj, aż myszy będą w głębokim śnie, rozluźnieniu mięśni i spokojnym oddechu; następnie myszy można określić jako idealny stan znieczulenia (Tabela materiałów).
      UWAGA: Przełącz przełącznik zaworu trójnika, aby upewnić się, że przepływ powietrza z parownika aparatu anestezjologicznego jest komunikowany z maską anestezjologiczną, dopóki myszy nie zostaną w pełni znieczulone.
4. Szczepienia na myszach
   1. Podskórnie wstrzyknąć 200 μl emulsji przygotowanej w kroku 1.2 za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą w czterech miejscach na grzbiecie myszy, około 0,5 cm po obu stronach kręgosłupa w płaszczyźnie pachy i pachwiny¹² u myszy z grupy EAE. Użyć 50 μl emulsji w każdym miejscu (tabela materiałów).
5. Wtrysk PTX
   1. Wyjmij myszy z klatki, łapiąc ogon i umieść go na drucie klatki. Przytrzymaj ogon myszy 4. i 5. palcem i delikatnie pociągnij go do góry, aby utrzymać trend ciała i kończyn do przodu. Chwyć głowę myszy i chwyć skórę na grzbiecie myszy za pomocą palca środkowego i serdecznego.
   2. Po 0 godzinach i 48 godzinach od immunizacji w kroku 1.4 wstrzyknąć 200 μl PTX dootrzewnowo w miejscu 0,5 cm po obu stronach linii środkowej brzucha o głębokości penetracji 1-2 cm za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą (tabela materiałów).
      UWAGA: Przed wstrzyknięciem PTX po 48 godzinach od immunizacji MOG35-55 konieczne jest znieczulenie myszy przy użyciu procedur opisanych w kroku 1.3. Myszami należy się opiekować, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.
   3. W przypadku myszy w grupie kontrolnej należy leczyć solą fizjologiczną przy użyciu tej samej metody i codziennie oceniać wynik kliniczny.
      UWAGA: Myszy oceniano pod kątem oznak EAE według następującej skali¹³: 0 = brak objawów chorobowych, 1 = całkowity paraliż ogona, 2 = częściowy paraliż tylny/osłabienie, 3 = całkowity paraliż kończyn tylnych, 4 = paraliż kończyn przednich i tylnych oraz 5 = stan agonalny.

2. Analiza barwienia histologicznego

1. Kolekcja mózgów
   1. Znieczulij myszy zgodnie z krokiem 1.3. Poddaj myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy i otwórz klatkę piersiową, aby w pełni odsłonić serce. Przeciąć małżowinę uszną i powoli przelać wstępnie schłodzony roztwór soli fizjologicznej za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml z igłą w lewej komorze, aż wątroba stanie się szara i biała.
   2. Perfuzjuj powoli z 4% paraformaldehydem, aż końcówka ogona obróci się do góry, ciało stanie się sztywne, a wątroba stanie się twarda. Odetnij głowę, przetnij czaszkę, zbierz mózg za pomocą pęsety i utrwal go w 4% roztworze paraformaldehydu przez 24 godziny (Tabela materiałów).
2. Przygotowanie skrawków parafinowych
   1. Odwodnienie gradientowe: Zanurz tkanki mózgowe z kroku 2.1 kolejno w 70% etanolu przez 1 godzinę, 80% etanolu przez 1 godzinę, 95% etanolu przez 1 godzinę, bezwodnym etanolu przez 1 godzinę, zastąp świeżym bezwodnym etanolem, kontynuuj zanurzanie przez 1 godzinę (Tabela materiałów).
   2. Przezroczystość: Zanurz tkanki mózgowe z kroku 2.2.1 w ksylenie na 30 minut, zastąp je świeżym ksylenem i kontynuuj zanurzanie, aż tkanki staną się przezroczyste (Tabela materiałów).
   3. Osadzanie: Zanurzyć tkanki mózgowe z kroku 2.2.2 w parafinie na 1 godzinę, zastąpić świeżą parafiną, kontynuować zatapianie przez 1 godzinę, pokroić w plastry 6 μm po zwolnieniu z formy, umieścić szkiełko w gorącej wodzie, wysuszyć w temperaturze 37 °C, przechowywać w temperaturze pokojowej (tabela materiałów).
   4. Odparafinowanie: Zanurzyć tkanki mózgowe z kroku 2.2.3 w ksylenie na 20 minut, zastąpić świeżym ksylenem, kontynuować zanurzanie przez 20 minut, umieścić w bezwodnym etanolu na 5 minut, zastąpić świeżym bezwodnym etanolem, zanurzyć na 5 minut, 75% etanolu na 5 minut, spłukać wodą z kranu (tabela materiałów).
   5. Barwienie hematoksyliną-eozyną (H&E): Barwienie tkanek z kroku 2.2.4 roztworem hematoksyliny przez 3-5 minut, a następnie spłukać wodą z kranu. Potraktuj tkanki roztworem różnicującym hematoksylinę, krótko i dokładnie spłucz wodą z kranu. Potraktuj tkanki roztworem do niebieszczenia z kranu Hematoxylin Scott i spłucz wodą z kranu. Zanurz w 85% etanolu na 5 minut i 95% etanolu na 5 minut, a stopnie zabarwić barwnikiem eozyny na 5 minut (Tabela materiałów).
   6. Odwodnić: Zanurzyć tkanki z kroku 2.2.5 kolejno w bezwodnym etanolu na 5 minut, zastąpić świeżym bezwodnym etanolem, kontynuować zanurzanie przez 5 minut, zastąpić świeżym bezwodnym etanolem, zanurzyć na 5 minut, ksylen na 5 minut, zastąpić świeżym ksylenem, zanurzyć na 5 minut, uszczelnić neutralną gumą (tabela materiałów).
   7. Obserwuj pod mikroskopem tkanki mózgowe i wykonaj akwizycję i analizę obrazu (tabela materiałów).

3. Analiza barwienia LFB

1. Zbieranie osłonki mielinowej: Przetnij kręgosłup myszy od końcówki głowy o 2 segmenty w górę do zakończenia ogonowego o 2 segmenty, wydmuchaj rdzeń kręgowy do końca ogonowego i przymocuj rdzeń kręgowy w 4% roztworze paraformaldehydu przez 24 godziny
   UWAGA: Osłonka mielinowa została pobrana od tych samych myszy w kroku 2.1, a kroki perfuzji serca są takie same jak w kroku 2.1.
2. Sekcje parafinowe deparafiniacja i ponowne nawodnienie: Preparaty z kroku 3.1 włożyć kolejno do ksylenu na 20 min, zastąpić świeżym ksylenem, kontynuować zanurzanie na 20 min, etanol bezwodny na 5 min, zastąpić świeżym bezwodnym etanolem, zanurzyć na 5 min, 75% alkoholu na 5 min, zmyć wodą z kranu.
3. Szybkie barwienie na niebiesko: Umieść roztwór A do szybkiego barwienia na niebiesko luxol w piekarniku o temperaturze 60 °C i podgrzewaj przez 30 minut. Umieść szkiełka z kroku 3.2 w roztworze A i przykryj je plastikową membraną na 1 godzinę, aby zapobiec wysychaniu plastrów, a następnie wyjmij szkiełka i szybko umyj je wodą z kranu.
4. Różnicowanie tła: Umieść szkiełka z kroku 3.3 w roztworze B do szybkiego barwienia na niebiesko luxol na 2 s (gdy barwnik jest gorący) i bezpośrednio zanurz w roztworze C do szybkiego barwienia na niebiesko luxol w celu różnicowania na 15 s, przemyj wodą, aż osłonka mielinowa stanie się niebieska, a tło będzie prawie bezbarwne.
5. Barwienie licznikiem Eosin: Włóż szkiełka z kroku 3.4 do piekarnika w temperaturze 65 °C w celu wysuszenia. Po zakończeniu wyjmij je z piekarnika i pozwól im ostygnąć. Umieść szkiełka w 95% etanolu i eozynie, przeciwbarwiąc na 1 min.
6. Odwodnienie i uszczelnienie: Umieścić szkiełka z kroku 3.5 kolejno w bezwodnym etanolu po 5 minut, zastąpić świeżym bezwodnym etanolem, kontynuować zanurzanie przez 5 minut, ponownie zastąpić świeżym bezwodnym etanolem, kontynuować zanurzanie przez 5 minut, ksylen 5 minut, zastąpić świeżym ksylenem, zanurzyć na 5 minut. Umyć i osuszyć próbki i uszczelnić je neutralną gumą.
7. Badanie mikroskopowe: Zbieraj i analizuj obrazy za pomocą pionowego mikroskopu optycznego (tabela materiałów).

4. Analiza cytometrii przepływowej

1. Otwórz jamę brzuszną myszy. Usuń śledzionę za pomocą pęsety i zmiel nożyczkami na małe kawałki 1,5-2,5 cm w PBS na lodzie. Zmielić śledzionę w 10 ml RPMI-1640 zawierającego 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 2,5 ml i przepchnąć ją przez sitko do komórek o pojemności 70 μm, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową (tabela materiałów).
   UWAGA: Śledziony pobrano od tych samych myszy w kroku 2.1.
2. Przenieść zawiesinę otrzymaną w kroku 4.1 do probówek o pojemności 15 ml i poddać lizie przy użyciu 5 ml buforu do lizy czerwonych krwinek na lodzie przez 10 minut. Przemyć RPMI-1640 zawierającym 2% FBS, odwirować przy 350 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą RPMI-1640 zawierającego 2% FBS.
3. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek (tabela materiałów) i dostosuj stężenie do 1 x 10⁶ komórek/ml.
4. Odpipetować 100 μl zawiesiny komórek do probówek o pojemności 1,5 ml i inkubować z 1 μl przeciwciała anty-mysiego CD16/32¹⁴ (0,5 mg/ml) przez 30 minut, aby zablokować niespecyficzne barwienie. Przemyć RPMI-1640 i odwirować przy 350 x g przez 5 minut, wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl RPMI-1640 zawierającym 2% FBS.
5. Barwienie przeciwciałami specyficznymi dla CD45 (Alexa Fluor 700), CD3 (FITC), CD4 (APC) i CD69 (BV674) dla komórek Teff¹⁵ przez 30 min, 2 μL dla każdego przeciwciała. Barwienie przeciwciałami specyficznymi dla CD45 (Alexa Fluor 700), CD3 (FITC), CD4 (APC), CD44 (BV421) i CD62L (PE) dla komórek Tem¹⁶ przez 30 min, 2 μL dla każdego przeciwciała. Przemyć RPMI-1640 i odwirować przy 350 x g przez 5 min, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 350 μl PBS. Analizuj proporcje komórek za pomocą cytometru przepływowego i odpowiedniego oprogramowania (Tabela materiałów).

5. Analiza cytokin za pomocą cytometrycznej matrycy kulkowej

1. Użyj cytometrycznej tablicy kulek (tabela materiałów) do pomiaru IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, czynnika martwicy nowotworu (TNF)-α i IFN-γ w mózgach myszy, metody opisane poniżej.
2. Zbierz mózg myszy zgodnie z opisem w kroku 2.1.
3. Ekstrakcja białka całkowitego: Wytnij i zważ 50 mg tkanki mózgowej (trzy mózgi w grupie kontrolnej, grupa EAE w fazie szczytowej i grupa RR). Umieść mózgi w probówkach o pojemności 1,5 ml i dodaj 500 μl buforu do lizy zawierającego PMSF, inhibitor proteazy i inhibitory fosfatazy.
4. Pociąć mózgi na małe kawałki o wielkości około 1 mm³, ekstrahować za pomocą homogenizatora ultradźwiękowego o mocy 400 W, 5 s włączania i 5 s wyłączania; powtórzyć 5 razy. Umieścić probówkę na lodzie na 10 minut, wirować przy 12000 x g przez 5 minut i zebrać supernatant (tabela materiałów).
5. Przygotuj mysie wzorce cytokin Th1/Th2/Th17 zgodnie z poniższym opisem.
   1. Otwórz fiolkę z liofilizowanymi wzorcami myszy Th1/Th2/Th17. Przenieść wzorce do stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml. Oznacz górną część rurki jako standardową.
   2. Rozpuść wzorce w 2,0 ml rozcieńczalnika do oznaczania. Pozostawić odtworzony wzorzec do zrównoważenia przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie wymieszać rozpuszczone białko przez pipetowanie.
   3. Oznaczyć probówki o wymiarach 12 mm x 75 mm i ułożyć je w następującej kolejności rozcieńczenia: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 i 1:256. Odpipetować 300 μl rozcieńczalnika do oznaczania w każdej oznakowanej probówce.
   4. Wykonać seryjne rozcieńczenia: Przenieść 300 μl górnego wzorca do probówki rozcieńczającej w stosunku 1:2 i dokładnie wymieszać przez pipetowanie. Kontynuuj seryjne rozcieńczenia, przenosząc 300 μl z probówki 1:2 do probówki 1:4 i tak dalej, aż do probówki 1:256. Przygotować probówkę o wymiarach 12 mm x 75 mm zawierającą tylko rozcieńczalnik do oznaczania, która posłuży jako kontrola ujemna 0 pg/mL.
      UWAGA: Dokładnie wymieszać pipetując. Nie wirować, aby zapobiec wypadnięciu sprzężenia przeciwciał na mikrokulkach.
   5. Aby wymieszać mysie kulki wychwytujące cytokiny Th1/Th2/Th17, przygotuj 19 probówek, w tym wzorce z 3 próbkami w każdej grupie (grupa kontrolna, grupa EAE w fazie piku i grupa RR) do eksperymentu. Energicznie wirować zawiesinę kulki wychwytującej przez 5 sekund przed zmieszaniem. Dodaj 190 μl każdego koralika do jednej probówki i oznacz je jako mieszane kulki wychwytujące. Dokładnie wymieszaj mieszaninę kulek.
      UWAGA: Koraliki sprzężone z przeciwciałami z czasem wyjdą z zawiesiny. Konieczne jest zawirowanie fiolki przed przyjęciem podwielokrotności zawiesiny z kulkami.
   6. Aby wykonać test, należy wymieszać kulki wychwytujące mieszankę. Dodać 50 μl kulek do wszystkich probówek. Dodać 50 μl mysich rozcieńczeń wzorcowych cytokin Th1/Th2/Th17 do probówek kontrolnych, jak w Tabeli 1.
   7. Dodać 50 μl mysiego odczynnika do wykrywania PE Th1/Th2/Th17 do wszystkich probówek. Inkubować probówki przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i chronić je przed światłem. Dodać 1 ml buforu do przemywania do każdej probówki testowej i odwirowywać przy 200 x g przez 5 minut. Ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant z każdej probówki testowej.
   8. Dodać 300 μl buforu do przemywania do każdej probówki testowej, aby ponownie zawiesić granulkę kulki. Analizuj dane dotyczące cytokin Th1/Th2/Th17 myszy za pomocą oprogramowania FCAP Array (tabela materiałów).

Wyniki

Ocena wyników klinicznych
Jak pokazano na Rysunek 1, myszy w grupie kontrolnej nie wykazywały żadnych objawów klinicznych. Myszy z grupy EAE, które zostały zaszczepione MOG35-55, wykazywały paraliż ogona około 12 dni po szczepieniu. Do 16 dnia objawy osiągnęły całkowity paraliż kończyn tylnych (zdefiniowany jako faza szczytowa, szczyt). Następnie objawy stopniowo ustępowały. Objawy kliniczne myszy pogorszyły się około 25 dnia i osiągnęły całkowity paraliż kończyn tylnych około 30 dnia (zdefiniowane jako stadium nawrotowe, RR). Warto zauważyć, że objawy trwały dłużej niż poprzednim razem, co spowodowało rozwój klasycznej cechy rzutowo-remisyjnej. Głównym objawem rzutowo-remisyjnych myszy EAE są różne etapy wybuchu, remisji i nawrotu w trakcie postępu choroby, które mają pewną okresowość i wahania.

Analiza histologiczna
Myszy z grupy kontrolnej wykazywały nienaruszoną strukturę tkanki mózgowej z równomiernie rozmieszczonymi i wyraźnie zaznaczonymi naczyniami krwionośnymi, bez naciekania komórek zapalnych. (Rysunek 2A). W szczytowym stadium myszy z grupy EAE zaobserwowano znaczny naciek komórek zapalnych w mózgu (Ryc. 2B), tworząc zmiany przypominające mankiety wokół naczyń krwionośnych (oznaczone czerwoną strzałką). Podobnie, u myszy z grupy EAE w stadium RR stwierdzono wyraźną infiltrację komórek zapalnych (Figura 2C), z dominującą agregacją wokół naczyń krwionośnych (oznaczoną czerwoną strzałką).

Analiza barwienia LFB
W grupie kontrolnej osłonka mielinowa istoty białej rdzenia wydawała się niebieska, co wskazuje, że jej struktura była nienaruszona i ciasno upakowana (Figura 3A). W szczytowym stadium grupy EAE rdzeniowa istota biała wykazywała jasnoniebieski lub biały kolor; struktura wydawała się być luźna i nieciągła, ze znaczną obecnością zwyrodnień wakuolarnych oznaczonych czerwoną strzałką (Ryc. 3B). W stadium RR w grupie modelowej EAE zaobserwowano rozległy ubytek mieliny istoty białej w rdzeniu kręgowym. Struktura wydawała się być luźna i można było zaobserwować znaczną liczbę zwyrodnień wakuolarnych (oznaczonych czerwonymi strzałkami; Rysunek 3C).

Test cytometrii przepływowej
Wyniki przedstawione w Rysunek 4A,B wykazały znaczny wzrost proporcji komórek Teff CD4 ⁺ CD69 ⁺ u myszy EAE w fazie szczytu w porównaniu z grupą kontrolną (P < 0,0001). Dodatkowo udział tych komórek również zwiększył się w fazie RR, chociaż różnica nie była istotna statystycznie (P > 0,05). Rysunek 4C,D ujawnił znaczny wzrost odsetka komórek Tem CD4⁺CD44⁺CD62L^- u myszy EAE zarówno w fazie szczytowej, jak i RR, w porównaniu z grupą kontrolną (P < 0,0001).

Cytokina mierzona za pomocą cytometrycznej tablicy kulek
Wyniki przedstawione w Rysunek 5 pokazują, że w porównaniu z grupą kontrolną, poziomy IL-4 (P < 0,0001), IL-6 (P < 0,001), IFN-γ (P < 0,0001) i TNF-α (P < 0,0001) były znacznie podwyższone w grupie EAE w szczytowym stadium. Chociaż ekspresja IL-17A również wzrosła, różnica nie była istotna statystycznie (P > 0,05). Co więcej, poziom IL-2 nie wykazywał żadnych zmian w szczytowym stadium myszy EAE (P > 0,05); jednak znacznie wzrosła w fazie RR (P < 0,01). Ponadto ekspresje zarówno TNF-α (P < 0,001), jak i IL-17A (P < 0,01) w fazie RR były istotnie wyższe niż obserwowane w grupie kontrolnej. I odwrotnie, ekspresja IL-10 w grupie EAE była znacznie niższa niż w grupie kontrolnej, zarówno w fazie szczytu, jak i RR (P < 0,0001).

Rysunek 1: Ocena wyniku klinicznego. Wynik kliniczny był oceniany codziennie i pokazuje, że myszy rozwinęły klasyczne rzutowo-remisyjne EAE immunizowane MOG35-55. (A) Diagram progresji objawów u myszy EAE. (B) Ocena myszy EAE na podstawie średnich wyników klinicznych. Dane są wyrażone jako średnia ± SEM, n = 6. Dane analizowano przy użyciu jednoczynnikowej ANOVA z porównaniami post-hoc w celu oceny statystycznie istotnych różnic. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Mikroskopowa mapa barwienia mózgu metodą H&E. (A) Mózg myszy w grupie kontrolnej. (B) Mózg myszy EAE w szczytowej fazie. Komórki zapalne zostały naciekane w mózgu w szczytowym stadium u myszy z grupy EAE i rozprowadzone wokół naczyń krwionośnych, tworząc zmianę przypominającą mankiet (czerwona strzałka). (C) Mózg myszy EAE w stadium RR. Komórki zapalne u myszy z grupy EAE w stadium RR skupione wokół naczyń krwionośnych (czerwona strzałka). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Mikroskopowa mapa barwienia LFB osłonki mielinowej. (A) Osłonka mielinowa myszy w grupie kontrolnej. (B) Osłonka mielinowa myszy EAE w szczytowej fazie. Istota biała kręgosłupa była jasnoniebieska lub biała, struktura była luźna i nieciągła, pojawiła się duża liczba zwyrodnień wakuolarnych (czerwona strzałka). (C) Osłonka mielinowa myszy EAE w stadium RR. Mielina istoty białej rdzenia kręgowego została szeroko utracona, struktura była luźna i pojawiła się duża liczba zwyrodnień wakuolarnych (czerwona strzałka). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Immunizacja przez MOG35-55 indukowała regulację w górę proporcji komórek Teff i Tem CD4 zarówno w fazie szczytowej, jak i RR u myszy EAE. (A) Ilustracyjny wykres przepływu przedstawiający barwienie immunologiczne komórek CD4⁺CD69⁺. (B) Procent komórek Teff CD4 ⁺ CD69 ⁺. (C) Ilustracyjny wykres przepływu przedstawiający barwienie immunologiczne komórek CD44 ⁺ CD62L ⁺ (brama na limfocytach T CD4). (D) Procent komórek Tm CD44 ⁺ CD62L ⁺. Dane są wyrażone jako średnia ± SEM, n = 5. Dane analizowano przy użyciu jednoczynnikowej ANOVA z porównaniami post-hoc w celu oceny statystycznie istotnych różnic. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Poziom cytokin w mózgu myszy analizowany za pomocą cytometrycznej matrycy kulek. Dane są wyrażone jako średnia ± SEM, n = 3. Dane analizowano przy użyciu jednoczynnikowej ANOVA z porównaniami post-hoc w celu oceny statystycznie istotnych różnic. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

jedn. TGL szt. szt. szt. szt.

Etykieta na tubę	Stężenie (pg / ml)	Cytokina Standardowe rozcieńczenie
1	0 (kontrola ujemna)	brak standardowego rozcieńczenia (tylko rozcieńczalnik do oznaczania)
cyfra arabska	20	1:256
3	Rozdział 40	1:128
4	Rozdział 80	Godzina 1:64
5	Rozdział 156	1:32
6	312,6	Godzina 1:16
7	625	1:8
8	1250	1:4
9	2500	1:2
10	5000	Najwyższy standard

Tabela 1: Lista rozcieńczeń wzorca cytokin do probówek kontrolnych.

Dyskusja

Stwardnienie rozsiane jest najbardziej rozpowszechnioną autoimmunologiczną chorobą demielinizacyjną OUN, która dotyka miliony ludzi na całym świecie¹⁷. EAE jest typowym modelem zwierzęcym do symulacji klinicznych cech patologicznych SM¹⁸. Badania wykazały, że osoby ze stwardnieniem rozsianym doświadczają upośledzenia funkcji poznawczych i innych niepełnosprawności spowodowanych zwyrodnieniem aksonów i neuronów w OUN 19,20,21. W szczytowym i RR stadium modelu EAE myszy wykazywały paraliż ogonów i kończyn tylnych. Ponadto zaobserwowano, że komórki zapalne przenikają do OUN, co prowadzi do różnego stopnia utraty osłonki mielinowej. Wyniki te wskazują na pomyślne ustanowienie modelu EAE w tym eksperymencie.

Proces emulgowania MOG35-55 i CFA musi być prowadzony na lodzie, aby zapobiec degradacji MOG35-55 spowodowanej wytwarzaniem ciepła podczas procesu homogenizacji. PTX podaje się dootrzewnowo w celu zwiększenia przepuszczalności naczyń krwionośnych, umożliwiając limfocytom T łatwe przekroczenie bariery krew-mózg i dotarcie do osłonki mielinowej otaczającej neurony²². Szczególną uwagę należy zwrócić na to, że w przypadkach, gdy myszy zostają sparaliżowane i nie mogą samodzielnie jeść ani pić, ważne jest, aby w klatce umieścić tace z jedzeniem i wodą lub karmić je ręcznie, aby zapobiec nadmiernemu pragnieniu i głodowi.

Do analizy proporcji komórek Teff CD4 ⁺ CD69 + CD69 ⁺ i komórek Tem CD4 ⁺ CD44 ⁺ CD62L^- zastosowano cytometrię przepływową. Proporcja komórek Teff CD4 ⁺ CD69 ⁺ w śledzionie myszy EAE była znacznie zwiększona w szczytowej fazie. Dodatkowo była ona wyższa niż w grupie kontrolnej w fazie nawrotu, choć różnica ta nie osiągnęła istotności statystycznej. Z drugiej strony, odsetek komórek Tem CD4 ⁺ CD44 ⁺ CD62L-Tem był znacznie wyższy u myszy EAE w porównaniu z grupą kontrolną zarówno w fazie szczytu, jak i RR. Sugeruje to, że inicjacja EAE może obejmować zarówno komórki Teff CD4 ⁺ CD69 ⁺ i CD4 ⁺ CD44 ⁺ CD62L^- Tem w fazie szczytowej, podczas gdy etap RR jest prawdopodobnie głównie zdominowany przez komórki Tem CD4 ⁺ CD44 ⁺ CD62L^. CD69 jest najwcześniejszą cząsteczką powierzchniową błony ulegającą ekspresji podczas aktywacji limfocytów. Odgrywa kluczową rolę w modulowaniu adhezji i migracji limfocytów T, pomagając w ten sposób komórkom odpornościowym w identyfikacji i lokalizacji miejsc infekcji lub stanu zapalnego w organizmie²³. Spoczynkowe limfocyty T nie wyrażają CD69, ale gdy są stymulowane i aktywowane przez anty-CD3 / TCR, aktywatory mogą ulegać ekspresji indukcyjnej²⁴. Po etapie efektorowym znaczna część limfocytów T ulega apoptozie, ponieważ nie są one w stanie dalej się różnicować. To zmniejszenie liczby jest spowodowane przede wszystkim brakiem cytokin sprzyjających przeżyciu, w tym IL-2, które są wytwarzane podczas stymulacji antygenowej. Dodatkowo, regulacja w dół receptorów dla tych cytokin dodatkowo przyczynia się do tego klonalnego zjawiska skurczu²⁵. Ponadto klirens czynnika zakaźnego poprzez adaptacyjną odpowiedź immunologiczną prowadzi do klonalnego skurczu limfocytów T, ostatecznie pozostawiając mniej długowiecznych komórek pamięci, które zapewniają odpowiedź immunologiczną gospodarzowi w przypadku ponownego zakażenia patogenem²⁶. W niniejszym badaniu odsetek limfocytów T CD4 ⁺ CD69 ⁺ był znacznie podwyższony w szczytowym stadium, jednak zmniejszył się w fazie RR, co wskazało, że komórki Teff CD4 nie są w stanie przetrwać przez pewien czas i ostatecznie ulegają apoptozie, tylko niewielka część limfocytów T specyficznych dla antygenu przekształca się w długowieczne limfocyty T pamięci. Komórki Tem mają niską ekspresję CD62L. Są jednak zdolne do ekspresji niektórych receptorów chemokinowych i cząsteczek adhezyjnych, które ułatwiają ich migrację do tkanek objętych stanem zapalnym. Po reaktywacji antygenu tempo proliferacji jest stosunkowo powolne, ale cytokiny są szybko uwalniane, aby zainicjować funkcję efektorową²⁷. W niniejszym badaniu antygeny u myszy uwolniły się z emulsji i ponownie zaatakowały układ odpornościowy, komórki Tem mogą zostać reaktywowane i uwolnić dużą liczbę cytokin, takich jak IL-6 i IFN-γ, co może spowodować nawrót myszy EAE.

Głównymi prozapalnymi populacjami limfocytów T CD4 związanymi z chorobami autoimmunologicznymi (w tym stwardnieniem rozsianym) są komórki Th1, które wydzielają IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α i komórki Th17, które wydzielają IL-17. Wykazano, że IFN-γ związany z komórkami Th1 może mieć bezpośredni szkodliwy wpływ na oligodendrocyty, powodując uszkodzenie neuronów OUN pacjenta²⁸. Komórki Th17 odgrywają również znaczącą rolę w kilku chorobach autoimmunologicznych, w tym w SM. W badaniach zaobserwowano podwyższony poziom komórek Th17 i mRNA IL-17 w uszkodzeniach mózgu pacjentów ze stwardnieniem rozsianym w porównaniu z osobami bez tej choroby²⁹. Limfocyty Treg, które charakteryzują się wytwarzaniem IL-10 i TGF-β³⁰, mają działanie immunosupresyjne i odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu tolerancji układu odpornościowego na własne składniki, umożliwiając w ten sposób organizmowi utrzymanie homeostazy immunologicznej. Tutaj zaobserwowaliśmy znaczącą regulację w górę ekspresji IL-4, IL-6, IFN-γ i TNF-α w grupie EAE w szczytowym stadium. Dodatkowo ekspresja IL-17A również była zwiększona, choć nie było to istotne. Natomiast poziomy ekspresji TNF-α i IL-17A w fazie RR były znacznie wyższe w porównaniu z grupą kontrolną. Sugeruje to, że szczytowe stadium EAE jest napędzane głównie przez komórki Th1, a nie komórki Th17, podczas gdy etap RR EAE został zainicjowany zarówno przez komórki Th1, jak i Th17. Warto zauważyć, że ekspresja IL-10 w grupie EAE zarówno w okresie szczytu, jak i RR była znacznie niższa niż w grupie kontrolnej, co sugeruje, że funkcja immunosupresyjna komórek Treg była utrudniona podczas patologicznego korowódki EAE.

Podsumowując, nasze badania sugerują pomyślne ustanowienie modelu EAE z rzutowo-remisyjnym skutkiem u myszy poprzez immunizację peptydem MOG35-55. Z punktu widzenia fazy aktywnej, szczytowe stadium EAE zostało prawdopodobnie zainicjowane przez komórki Teff CD4⁺CD69⁺ i CD4⁺CD44+CD62L^- Tem, podczas gdy nawrót stadium EAE RR może być zdominowany głównie przez komórki Tem CD4⁺CD44⁺CD62L-Tem. Z punktu widzenia funkcji efektu immunologicznego, szczytowe stadium EAE było inicjowane głównie nie przez komórki Th17, ale przez komórki Th1. Jednak etap RR EAE został zainicjowany przez komórki Th1 i Th17. Funkcja immunosupresyjna limfocytów Treg została zahamowana podczas procesu patologicznego EAE. Niemniej jednak mechanizmy molekularne leżące u podstaw aktywacji komórek Th1 / Th17 i supresji komórek Treg wymagają dalszych badań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Parownik do anestezjologii	Norvap	20-17368
Isoflurane	Sigma-Aldrich (Szanghaj) Co.Ltd.
70 μ m filtr siatkowy	komórek XIYAN Co., Ltd.	15-1070
Alexa Fluor 700 Przeciwciało anty-mysie CD45	Biolegend	103128
APC anty-mysie przeciwciało CD4	Biolegend	100616
Automatyczny licznik komórek	Jiangsu JIMBIO technology Co., LTD	JIMBIO iCyta S2
BD* Cytometryczna tablica kulkowa (CBA) Mysz Th1/Th2/Th17 Zestaw CBA	BD Biosciences	560485
Biotyna przeciwciało anty-mysie CD16/32	Biolegend	101303
Brilliant Violet 510 anty-mysie przeciwciało CD69	Biolegend	104532
BV786 Szczur Anty-mysz CD62L(MEL-14)	BD Pharmingen	563109
kolumna Tkanka & Zestaw do ekstrakcji białek komórkowych	Shanghai Epizyme Biomedical Technology Co., Ltd	PC201Plus
Kompletny adiuwant Freunda	Sigma-Aldrich (Szanghaj) Trading Co.Ltd.
Odwadniacz	DIAPATH	Donatello
Jednorazowa sterylizowana strzykawka (1 ml)	Yikang Group	210820
Jednorazowa sterylizowana strzykawka (2,5 ml)	Yikang Group	210820
Jednorazowa sterylizowana strzykawka (5 ml)	Yikang Group	210820
Farbiarka	DIAPATH	Giotto
Maszyna do zatapiania	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-P5
Etanol	SCRC	100092683
Płodowa surowica bydlęca	Procell Life Science& Technologia Co., Sp. z o.o.	FSP500
FITC Chomik Anty-Mysz CD3e(145-2C11)	BD Pharmingen	553062
Cytometr przepływowy	Becton,Dickinson and Company	FACSCelesta
Cytometr przepływowy	Becton,Dickinson and Company	Accuri C6
Flow Jo oprogramowanie	BD Biosciences	10.8.1
Zamrożona platforma	Wuhan Junjie Electronics Co., Sp. z o.o.	JB-L5
Szkiełko szklane	Servicebio	G6004
Zestaw roztworów do barwienia HE	Servicebio	G1003
Roztwór hematoksyliny-eozyny	Servicebio	G1002
Wirówka z chłodzeniem o dużej prędkości	Thermo Fisher Scientific	Mogafugo8R
System obrazowania	Nikon	NIKON DS-U3
Zestaw do szybkiego barwienia na niebiesko	Luxol Servicebio	G1030
Ms CD44 BV421 IM7	BD Pharmingen	564970
Mycobacterium tuberculosis H37RA	BD Pharmingen	231141
Glikoproteina oligodendrocytów mielinowych (MOG35-55)	AnaSpec	AS-60130-1
Guma neutralna	SCRC	10004160
Organizer	KEDEE	KD-P
Oven	Labotery	GFL-230
Krajalnica do patologii	Leica	RM2016
Toksyna krztuścowa z Bordetella pertussis	Sigma-Aldrich (Szanghaj) Trading Co.Ltd.	P7208
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Servicebio	G4202
Pipeta 0,5-10 μ L	DLAB Scientific	7010101004
Pipeta 100-1000 μ L	DLAB Scientific	7010101014
Pipeta 20-200 μ L	DLAB Scientific	7010101009
RPMI-1640	Procell Nauki przyrodnicze& Technologia Co., Sp. z o.o.
Zawór trójnikowy	Guangdong Kanghua Medical Co., LTD	A06
Rozsiewacz tkanek	Zhejiang Kehua Instrument Co., Ltd	KD-P
Pionowy mikroskop optyczny	Nikon	NIKON ECLIPSE E100
Ksylen	SCRC	10023418