Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rola limfocytów T CD4 w rzutowo-remisyjnym eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia

841 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66553

⸱

19 stycznia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Basic Medicine, Ningxia Medical University, 2Preparation Center, General Hospital of Ningxia Medical University, 3Institute of Neurological Diseases, First People's Hospital of Shizuishan, 4Department of Neurology, Xianyang Hospital of Yan’an University, 5Department of Pharmacy, People’s Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, 6Department of Pharmacy, General Hospital of Ningxia Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Eksperymentalny model autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) u myszy został wykorzystany do zbadania roli limfocytów T CD4 w początkowym i nawrocie EAE z perspektywy fazy aktywacji i funkcji efektu immunologicznego.

Streszczenie

Stwardnienie rozsiane (MS) jest chorobą autoimmunologiczną charakteryzującą się infiltracją komórek odpornościowych i demielinizacją w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) służy jako prototypowy model zwierzęcy do badania stwardnienia rozsianego. W tym badaniu mieliśmy na celu zbadanie roli limfocytów T CD4 w inicjacji i nawrocie EAE, koncentrując się na fazie aktywacji i odpowiedzi immunologicznej. Aby stworzyć model myszy EAE, samice myszy immunizowano glikoproteiną mielinową oligodendrocytów (MOG) 35-55 emulgowaną pełnym adiuwantem Freunda (CFA). Wyniki kliniczne oceniano codziennie, a wyniki wykazały, że myszy w grupie EAE wykazywały klasyczny wzorzec rzutowo-remisyjny. Analiza barwienia hematoksyliną-eozyną (H&E) i szybkim błękitem luksolu (LFB) wykazała znaczny naciekanie komórek zapalnych w OUN i demielinizację u myszy EAE. Jeśli chodzi o fazę aktywacji, zarówno limfocyty T efektorowe CD4 + CD69 + (Teff), jak i limfocyty T (Tem) pamięci efektorowej CD4 + CD44 + CD62L- mogą przyczyniać się do inicjacji EAE, jednak etap nawrotu był prawdopodobnie zdominowany przez komórki Tem CD4 + CD44 + CD62L. Dodatkowo, jeśli chodzi o funkcję immunologiczną, pomocnicze limfocyty T (Th) 1 są przede wszystkim zaangażowane w inicjowanie EAE. Jednak zarówno komórki Th1, jak i Th17 przyczyniają się do etapu nawrotu, a funkcja immunosupresyjna regulatorowych komórek T (Treg) została zahamowana podczas procesu patologicznego EAE.

Wprowadzenie

Stwardnienie rozsiane (MS) jest chorobą autoimmunologiczną, która charakteryzuje się infiltracją ośrodkowego układu nerwowego (OUN) komórkami odpornościowymi i demielinizacją1,2. Niedawne badania wykazały, że jest to najczęstsza choroba powodująca niepełnosprawność dotykająca młodych ludzi, a jej częstość występowania stale rośnie na całym świecie3. Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) to prototypowy model zwierzęcy dla SM, który symuluje wiele aspektów fazy zapalnej ludzkiego MS4. Z punktu widzenia funkcji immunologicznych początkowe limfocyty T CD4, które nie napotkały jeszcze antygenów, są określane jako limfocyty pomocnicze T(Th)0. Komórki te przechodzą procesy dojrzewania i aktywacji, aby wykazywać różne funkcje. Limfocyty T CD4 można podzielić na kilka podzbiorów zgodnie z ich specyficznymi funkcjami, które obejmują Th1, Th2, T regulatorowy (Treg), komórki pomocnicze pęcherzykowe T (Tfh), Th17, Th9 i Th225. Panuje powszechna zgoda co do tego, że podtypy komórek Th1 i Th17 są kluczowymi czynnikami patogenezy EAE6. Komórki Th1 mogą wydzielać interferon γ (IFN-γ), a komórki Th17 wydzielają interleukinę (IL)-17 i inne czynniki zapalne, które mogą aktywować inne komórki odpornościowe, takie jak komórki mikrogleju i astrocyty. Komórki te wytwarzają cytokiny zapalne7, takie jak IL-18, IL-12, IL-23 i IL-1β, które mogą dodatkowo indukować odpowiedź immunologiczną komórek Th1/Th17, powodując postępującą demielinizację i uszkodzenie aksonów. Z perspektywy fazy aktywacji, limfocyty T CD4 mają z góry określone przeznaczenie do rozwoju w odrębne podzbiory komórek i zróżnicowane stany, w tym limfocyty T naiwne, efektorowe i pamięciowe8. Początkowe limfocyty T CD4 namnażają się i różnicują w różne podzbiory efektorów o różnych funkcjach w różnych środowiskach9. Większość komórek efektorowych jest krótkotrwała, a niewielka populacja limfocytów T przekształca się w limfocyty T pamięci, które wykazują szybkie funkcje efektorowe podczas ponownego napotkania tych samych antygenów i zapewniają gospodarzowi bardzo silną i długotrwałą ochronę10,11.

Chociaż obecne badania sugerują, że limfocyty T CD4 odgrywają znaczącą rolę w rozwoju EAE, nadal nie jest jasne, jak różne podzbiory limfocytów T CD4, klasyfikowane na podstawie ich fazy aktywacji i funkcji efektu immunologicznego, przyczyniają się do inicjacji i nawrotu EAE. W niniejszym badaniu ustaliliśmy model EAE u myszy C57BL6 / J, immunizując peptyd glikoproteiny oligodendrocytów mieliny (MOG) 35-55 i zbadaliśmy inicjację i nawrót EAE, koncentrując się na fazie aktywacji i funkcji immunologicznej limfocytów T CD4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Łącznie 18 samic myszy C57BL/6J w wieku od sześciu do ośmiu tygodni zostało losowo podzielonych na grupę kontrolną (n = 6) i grupę EAE (n = 12) w tym badaniu. Myszy zakupiono w centrum zwierząt eksperymentalnych Uniwersytetu Medycznego Ningxia. Myszy trzymano w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze i wilgotności z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności oraz swobodnym dostępem do świeżej wody i pożywienia. Przed rozpoczęciem badania uzyskano zgodę na ocenę etyczną od Komisji Etyki Zwierząt Doświadczalnych Uniwersytetu Medycznego Ningxia.

1. Rozwój rzutowego, remisyjnego EAE u myszy C57BL/6

  1. Rozpuszczanie odczynnika
    1. Rozpuścić 5,4 mg MOG35-55 (tabela materiałów) w 1,8 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Odważyć 12,6 mg Mycobacterium tuberculosis H37RA (tabela materiałów) i dodać do 1,8 ml kompletnego roztworu adiuwanta Freunda (CFA) (tabela materiałów). Rozpuścić 360 μl toksyny krztuścowej (PTX; Tabela materiałów) do 7,2 ml PBS za pomocą pipety (tabela materiałów).
  2. Przygotowanie emulsji MOG35-55 i CFA
    1. Odpipetować roztwór MOG35-55 i roztwór CFA za pomocą dwóch strzykawek o pojemności 5 ml przygotowanych w kroku 1.1 i połączyć je z zaworem trójnikowym. Mieszać w sposób ciągły na lodzie przez 1 godzinę, aż do uzyskania mlecznej emulsji typu woda w oleju.
      UWAGA: Emulsję z powodzeniem przygotowuje się, gdy unosi się na powierzchni wody, nie rozpraszając się po wrzuceniu jej do wody.
  3. Znieczulenie myszy
    1. Odkręć korek uszczelki wlewu z przodu parownika aparatu do znieczulenia. Powoli wlej 20 ml izofluranu wzdłuż uszczelniającej pośrodku i zablokuj nakrętkę uszczelki napełniającej. Przełącz przełącznik zaworu trójnika, aby upewnić się, że przepływ powietrza z parownika aparatu anestezjologicznego jest komunikowany ze skrzynką indukcyjną znieczulenia (tabela materiałów).
    2. Podłącz zasilanie pompy powietrza, włącz przełącznik pompy powietrza, a następnie obróć i wyreguluj zawór źródła powietrza na przednim końcu przepływomierza tlenu tak, aby przepływ gazu wyjściowego wynosił 400 ml/min. Otwórz parownik, dostosuj stężenie indukcji do 3% i poczekaj, aż środek znieczulający wypełni skrzynkę indukcyjną.
    3. Około 1 minuty później włóż myszy do pudełka indukcyjnego, a następnie zamknij pudełko indukcyjne i poczekaj, aż myszy będą w głębokim śnie, rozluźnieniu mięśni i spokojnym oddechu; następnie myszy można określić jako idealny stan znieczulenia (Tabela materiałów).
      UWAGA: Przełącz przełącznik zaworu trójnika, aby upewnić się, że przepływ powietrza z parownika aparatu anestezjologicznego jest komunikowany z maską anestezjologiczną, dopóki myszy nie zostaną w pełni znieczulone.
  4. Szczepienia na myszach
    1. Podskórnie wstrzyknąć 200 μl emulsji przygotowanej w kroku 1.2 za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą w czterech miejscach na grzbiecie myszy, około 0,5 cm po obu stronach kręgosłupa w płaszczyźnie pachy i pachwiny12 u myszy z grupy EAE. Użyć 50 μl emulsji w każdym miejscu (tabela materiałów).
  5. Wtrysk PTX
    1. Wyjmij myszy z klatki, łapiąc ogon i umieść go na drucie klatki. Przytrzymaj ogon myszy 4. i 5. palcem i delikatnie pociągnij go do góry, aby utrzymać trend ciała i kończyn do przodu. Chwyć głowę myszy i chwyć skórę na grzbiecie myszy za pomocą palca środkowego i serdecznego.
    2. Po 0 godzinach i 48 godzinach od immunizacji w kroku 1.4 wstrzyknąć 200 μl PTX dootrzewnowo w miejscu 0,5 cm po obu stronach linii środkowej brzucha o głębokości penetracji 1-2 cm za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą (tabela materiałów).
      UWAGA: Przed wstrzyknięciem PTX po 48 godzinach od immunizacji MOG35-55 konieczne jest znieczulenie myszy przy użyciu procedur opisanych w kroku 1.3. Myszami należy się opiekować, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.
    3. W przypadku myszy w grupie kontrolnej należy leczyć solą fizjologiczną przy użyciu tej samej metody i codziennie oceniać wynik kliniczny.
      UWAGA: Myszy oceniano pod kątem oznak EAE według następującej skali13: 0 = brak objawów chorobowych, 1 = całkowity paraliż ogona, 2 = częściowy paraliż tylny/osłabienie, 3 = całkowity paraliż kończyn tylnych, 4 = paraliż kończyn przednich i tylnych oraz 5 = stan agonalny.

2. Analiza barwienia histologicznego

  1. Kolekcja mózgów
    1. Znieczulij myszy zgodnie z krokiem 1.3. Poddaj myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy i otwórz klatkę piersiową, aby w pełni odsłonić serce. Przeciąć małżowinę uszną i powoli przelać wstępnie schłodzony roztwór soli fizjologicznej za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml z igłą w lewej komorze, aż wątroba stanie się szara i biała.
    2. Perfuzjuj powoli z 4% paraformaldehydem, aż końcówka ogona obróci się do góry, ciało stanie się sztywne, a wątroba stanie się twarda. Odetnij głowę, przetnij czaszkę, zbierz mózg za pomocą pęsety i utrwal go w 4% roztworze paraformaldehydu przez 24 godziny (Tabela materiałów).
  2. Przygotowanie skrawków parafinowych
    1. Odwodnienie gradientowe: Zanurz tkanki mózgowe z kroku 2.1 kolejno w 70% etanolu przez 1 godzinę, 80% etanolu przez 1 godzinę, 95% etanolu przez 1 godzinę, bezwodnym etanolu przez 1 godzinę, zastąp świeżym bezwodnym etanolem, kontynuuj zanurzanie przez 1 godzinę (Tabela materiałów).
    2. Przezroczystość: Zanurz tkanki mózgowe z kroku 2.2.1 w ksylenie na 30 minut, zastąp je świeżym ksylenem i kontynuuj zanurzanie, aż tkanki staną się przezroczyste (Tabela materiałów).
    3. Osadzanie: Zanurzyć tkanki mózgowe z kroku 2.2.2 w parafinie na 1 godzinę, zastąpić świeżą parafiną, kontynuować zatapianie przez 1 godzinę, pokroić w plastry 6 μm po zwolnieniu z formy, umieścić szkiełko w gorącej wodzie, wysuszyć w temperaturze 37 °C, przechowywać w temperaturze pokojowej (tabela materiałów).
    4. Odparafinowanie: Zanurzyć tkanki mózgowe z kroku 2.2.3 w ksylenie na 20 minut, zastąpić świeżym ksylenem, kontynuować zanurzanie przez 20 minut, umieścić w bezwodnym etanolu na 5 minut, zastąpić świeżym bezwodnym etanolem, zanurzyć na 5 minut, 75% etanolu na 5 minut, spłukać wodą z kranu (tabela materiałów).
    5. Barwienie hematoksyliną-eozyną (H&E): Barwienie tkanek z kroku 2.2.4 roztworem hematoksyliny przez 3-5 minut, a następnie spłukać wodą z kranu. Potraktuj tkanki roztworem różnicującym hematoksylinę, krótko i dokładnie spłucz wodą z kranu. Potraktuj tkanki roztworem do niebieszczenia z kranu Hematoxylin Scott i spłucz wodą z kranu. Zanurz w 85% etanolu na 5 minut i 95% etanolu na 5 minut, a stopnie zabarwić barwnikiem eozyny na 5 minut (Tabela materiałów).
    6. Odwodnić: Zanurzyć tkanki z kroku 2.2.5 kolejno w bezwodnym etanolu na 5 minut, zastąpić świeżym bezwodnym etanolem, kontynuować zanurzanie przez 5 minut, zastąpić świeżym bezwodnym etanolem, zanurzyć na 5 minut, ksylen na 5 minut, zastąpić świeżym ksylenem, zanurzyć na 5 minut, uszczelnić neutralną gumą (tabela materiałów).
    7. Obserwuj pod mikroskopem tkanki mózgowe i wykonaj akwizycję i analizę obrazu (tabela materiałów).

3. Analiza barwienia LFB

  1. Zbieranie osłonki mielinowej: Przetnij kręgosłup myszy od końcówki głowy o 2 segmenty w górę do zakończenia ogonowego o 2 segmenty, wydmuchaj rdzeń kręgowy do końca ogonowego i przymocuj rdzeń kręgowy w 4% roztworze paraformaldehydu przez 24 godziny
    UWAGA: Osłonka mielinowa została pobrana od tych samych myszy w kroku 2.1, a kroki perfuzji serca są takie same jak w kroku 2.1.
  2. Sekcje parafinowe deparafiniacja i ponowne nawodnienie: Preparaty z kroku 3.1 włożyć kolejno do ksylenu na 20 min, zastąpić świeżym ksylenem, kontynuować zanurzanie na 20 min, etanol bezwodny na 5 min, zastąpić świeżym bezwodnym etanolem, zanurzyć na 5 min, 75% alkoholu na 5 min, zmyć wodą z kranu.
  3. Szybkie barwienie na niebiesko: Umieść roztwór A do szybkiego barwienia na niebiesko luxol w piekarniku o temperaturze 60 °C i podgrzewaj przez 30 minut. Umieść szkiełka z kroku 3.2 w roztworze A i przykryj je plastikową membraną na 1 godzinę, aby zapobiec wysychaniu plastrów, a następnie wyjmij szkiełka i szybko umyj je wodą z kranu.
  4. Różnicowanie tła: Umieść szkiełka z kroku 3.3 w roztworze B do szybkiego barwienia na niebiesko luxol na 2 s (gdy barwnik jest gorący) i bezpośrednio zanurz w roztworze C do szybkiego barwienia na niebiesko luxol w celu różnicowania na 15 s, przemyj wodą, aż osłonka mielinowa stanie się niebieska, a tło będzie prawie bezbarwne.
  5. Barwienie licznikiem Eosin: Włóż szkiełka z kroku 3.4 do piekarnika w temperaturze 65 °C w celu wysuszenia. Po zakończeniu wyjmij je z piekarnika i pozwól im ostygnąć. Umieść szkiełka w 95% etanolu i eozynie, przeciwbarwiąc na 1 min.
  6. Odwodnienie i uszczelnienie: Umieścić szkiełka z kroku 3.5 kolejno w bezwodnym etanolu po 5 minut, zastąpić świeżym bezwodnym etanolem, kontynuować zanurzanie przez 5 minut, ponownie zastąpić świeżym bezwodnym etanolem, kontynuować zanurzanie przez 5 minut, ksylen 5 minut, zastąpić świeżym ksylenem, zanurzyć na 5 minut. Umyć i osuszyć próbki i uszczelnić je neutralną gumą.
  7. Badanie mikroskopowe: Zbieraj i analizuj obrazy za pomocą pionowego mikroskopu optycznego (tabela materiałów).

4. Analiza cytometrii przepływowej

  1. Otwórz jamę brzuszną myszy. Usuń śledzionę za pomocą pęsety i zmiel nożyczkami na małe kawałki 1,5-2,5 cm w PBS na lodzie. Zmielić śledzionę w 10 ml RPMI-1640 zawierającego 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 2,5 ml i przepchnąć ją przez sitko do komórek o pojemności 70 μm, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową (tabela materiałów).
    UWAGA: Śledziony pobrano od tych samych myszy w kroku 2.1.
  2. Przenieść zawiesinę otrzymaną w kroku 4.1 do probówek o pojemności 15 ml i poddać lizie przy użyciu 5 ml buforu do lizy czerwonych krwinek na lodzie przez 10 minut. Przemyć RPMI-1640 zawierającym 2% FBS, odwirować przy 350 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą RPMI-1640 zawierającego 2% FBS.
  3. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek (tabela materiałów) i dostosuj stężenie do 1 x 106 komórek/ml.
  4. Odpipetować 100 μl zawiesiny komórek do probówek o pojemności 1,5 ml i inkubować z 1 μl przeciwciała anty-mysiego CD16/3214 (0,5 mg/ml) przez 30 minut, aby zablokować niespecyficzne barwienie. Przemyć RPMI-1640 i odwirować przy 350 x g przez 5 minut, wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl RPMI-1640 zawierającym 2% FBS.
  5. Barwienie przeciwciałami specyficznymi dla CD45 (Alexa Fluor 700), CD3 (FITC), CD4 (APC) i CD69 (BV674) dla komórek Teff15 przez 30 min, 2 μL dla każdego przeciwciała. Barwienie przeciwciałami specyficznymi dla CD45 (Alexa Fluor 700), CD3 (FITC), CD4 (APC), CD44 (BV421) i CD62L (PE) dla komórek Tem16 przez 30 min, 2 μL dla każdego przeciwciała. Przemyć RPMI-1640 i odwirować przy 350 x g przez 5 min, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 350 μl PBS. Analizuj proporcje komórek za pomocą cytometru przepływowego i odpowiedniego oprogramowania (Tabela materiałów).

5. Analiza cytokin za pomocą cytometrycznej matrycy kulkowej

  1. Użyj cytometrycznej tablicy kulek (tabela materiałów) do pomiaru IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, czynnika martwicy nowotworu (TNF)-α i IFN-γ w mózgach myszy, metody opisane poniżej.
  2. Zbierz mózg myszy zgodnie z opisem w kroku 2.1.
  3. Ekstrakcja białka całkowitego: Wytnij i zważ 50 mg tkanki mózgowej (trzy mózgi w grupie kontrolnej, grupa EAE w fazie szczytowej i grupa RR). Umieść mózgi w probówkach o pojemności 1,5 ml i dodaj 500 μl buforu do lizy zawierającego PMSF, inhibitor proteazy i inhibitory fosfatazy.
  4. Pociąć mózgi na małe kawałki o wielkości około 1 mm3, ekstrahować za pomocą homogenizatora ultradźwiękowego o mocy 400 W, 5 s włączania i 5 s wyłączania; powtórzyć 5 razy. Umieścić probówkę na lodzie na 10 minut, wirować przy 12000 x g przez 5 minut i zebrać supernatant (tabela materiałów).
  5. Przygotuj mysie wzorce cytokin Th1/Th2/Th17 zgodnie z poniższym opisem.
    1. Otwórz fiolkę z liofilizowanymi wzorcami myszy Th1/Th2/Th17. Przenieść wzorce do stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml. Oznacz górną część rurki jako standardową.
    2. Rozpuść wzorce w 2,0 ml rozcieńczalnika do oznaczania. Pozostawić odtworzony wzorzec do zrównoważenia przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie wymieszać rozpuszczone białko przez pipetowanie.
    3. Oznaczyć probówki o wymiarach 12 mm x 75 mm i ułożyć je w następującej kolejności rozcieńczenia: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 i 1:256. Odpipetować 300 μl rozcieńczalnika do oznaczania w każdej oznakowanej probówce.
    4. Wykonać seryjne rozcieńczenia: Przenieść 300 μl górnego wzorca do probówki rozcieńczającej w stosunku 1:2 i dokładnie wymieszać przez pipetowanie. Kontynuuj seryjne rozcieńczenia, przenosząc 300 μl z probówki 1:2 do probówki 1:4 i tak dalej, aż do probówki 1:256. Przygotować probówkę o wymiarach 12 mm x 75 mm zawierającą tylko rozcieńczalnik do oznaczania, która posłuży jako kontrola ujemna 0 pg/mL.
      UWAGA: Dokładnie wymieszać pipetując. Nie wirować, aby zapobiec wypadnięciu sprzężenia przeciwciał na mikrokulkach.
    5. Aby wymieszać mysie kulki wychwytujące cytokiny Th1/Th2/Th17, przygotuj 19 probówek, w tym wzorce z 3 próbkami w każdej grupie (grupa kontrolna, grupa EAE w fazie piku i grupa RR) do eksperymentu. Energicznie wirować zawiesinę kulki wychwytującej przez 5 sekund przed zmieszaniem. Dodaj 190 μl każdego koralika do jednej probówki i oznacz je jako mieszane kulki wychwytujące. Dokładnie wymieszaj mieszaninę kulek.
      UWAGA: Koraliki sprzężone z przeciwciałami z czasem wyjdą z zawiesiny. Konieczne jest zawirowanie fiolki przed przyjęciem podwielokrotności zawiesiny z kulkami.
    6. Aby wykonać test, należy wymieszać kulki wychwytujące mieszankę. Dodać 50 μl kulek do wszystkich probówek. Dodać 50 μl mysich rozcieńczeń wzorcowych cytokin Th1/Th2/Th17 do probówek kontrolnych, jak w Tabeli 1.
    7. Dodać 50 μl mysiego odczynnika do wykrywania PE Th1/Th2/Th17 do wszystkich probówek. Inkubować probówki przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i chronić je przed światłem. Dodać 1 ml buforu do przemywania do każdej probówki testowej i odwirowywać przy 200 x g przez 5 minut. Ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant z każdej probówki testowej.
    8. Dodać 300 μl buforu do przemywania do każdej probówki testowej, aby ponownie zawiesić granulkę kulki. Analizuj dane dotyczące cytokin Th1/Th2/Th17 myszy za pomocą oprogramowania FCAP Array (tabela materiałów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ocena wyników klinicznych
Jak pokazano na Rysunek 1, myszy w grupie kontrolnej nie wykazywały żadnych objawów klinicznych. Myszy z grupy EAE, które zostały zaszczepione MOG35-55, wykazywały paraliż ogona około 12 dni po szczepieniu. Do 16 dnia objawy osiągnęły całkowity paraliż kończyn tylnych (zdefiniowany jako faza szczytowa, szczyt). Następnie objawy stopniowo ustępowały. Objawy kliniczne myszy pogorszyły się około 25 dnia i osiągnęły całkowity paraliż kończyn tylnych około 30 ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Stwardnienie rozsiane jest najbardziej rozpowszechnioną autoimmunologiczną chorobą demielinizacyjną OUN, która dotyka miliony ludzi na całym świecie17. EAE jest typowym modelem zwierzęcym do symulacji klinicznych cech patologicznych SM18. Badania wykazały, że osoby ze stwardnieniem rozsianym doświadczają upośledzenia funkcji poznawczych i innych niepełnosprawności spowodowanych zwyrodnieniem aksonów i neuronów w OUN 19,20,21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Fundację Nauk Przyrodniczych Ningxia (2022AAC03601 i 2023AAC02087) oraz Fundację Badawczą Uniwersytetu Medycznego Ningxia (XM2019052). Dziękujemy za wsparcie Centrum Badań Nauk i Technologii Medycznych Uniwersytetu Medycznego Ningxia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Parownik do anestezjologiiNorvap20-17368
  IsofluraneSigma-Aldrich (Szanghaj) Co.Ltd.
70 μ m filtr siatkowykomórek XIYAN Co., Ltd.15-1070
Alexa Fluor 700 Przeciwciało anty-mysie CD45Biolegend103128
APC anty-mysie przeciwciało CD4Biolegend100616
Automatyczny licznik komórekJiangsu JIMBIO technology Co., LTDJIMBIO iCyta S2
BD* Cytometryczna tablica kulkowa (CBA) Mysz Th1/Th2/Th17 Zestaw CBABD Biosciences560485
Biotyna przeciwciało anty-mysie CD16/32Biolegend101303
Brilliant Violet 510 anty-mysie przeciwciało CD69Biolegend104532
BV786 Szczur Anty-mysz CD62L(MEL-14)BD Pharmingen563109
kolumna Tkanka & Zestaw do ekstrakcji białek komórkowychShanghai Epizyme Biomedical Technology Co., LtdPC201Plus
Kompletny adiuwant FreundaSigma-Aldrich (Szanghaj) Trading Co.Ltd. 
OdwadniaczDIAPATHDonatello
Jednorazowa sterylizowana strzykawka (1 ml)Yikang Group210820
Jednorazowa sterylizowana strzykawka (2,5 ml)Yikang Group210820
Jednorazowa sterylizowana strzykawka (5 ml)Yikang Group210820
FarbiarkaDIAPATHGiotto
Maszyna do zatapianiaWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-P5
EtanolSCRC100092683
Płodowa surowica bydlęcaProcell Life Science& Technologia Co., Sp. z o.o.FSP500
FITC Chomik Anty-Mysz CD3e(145-2C11)BD Pharmingen553062
Cytometr przepływowyBecton,Dickinson and CompanyFACSCelesta
Cytometr przepływowyBecton,Dickinson and CompanyAccuri C6
Flow Jo oprogramowanieBD Biosciences10.8.1
Zamrożona platformaWuhan Junjie Electronics Co., Sp. z o.o. JB-L5
Szkiełko szklaneServicebioG6004
Zestaw roztworów do barwienia HEServicebioG1003
Roztwór hematoksyliny-eozynyServicebioG1002
Wirówka z chłodzeniem o dużej prędkościThermo Fisher ScientificMogafugo8R
System obrazowaniaNikonNIKON DS-U3
Zestaw do szybkiego barwienia na niebieskoLuxol ServicebioG1030
Ms CD44 BV421 IM7BD Pharmingen564970
Mycobacterium tuberculosis H37RABD Pharmingen231141
Glikoproteina oligodendrocytów mielinowych (MOG35-55)AnaSpecAS-60130-1
Guma neutralnaSCRC10004160
OrganizerKEDEEKD-P
OvenLaboteryGFL-230
Krajalnica do patologiiLeicaRM2016
Toksyna krztuścowa z Bordetella pertussisSigma-Aldrich (Szanghaj) Trading Co.Ltd.P7208
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiServicebioG4202
Pipeta 0,5-10 μ LDLAB Scientific7010101004
Pipeta 100-1000 μ LDLAB Scientific7010101014
Pipeta 20-200 μ LDLAB Scientific7010101009
RPMI-1640Procell Nauki przyrodnicze& Technologia Co., Sp. z o.o.
Zawór trójnikowyGuangdong Kanghua Medical Co., LTDA06
Rozsiewacz tkanekZhejiang Kehua Instrument Co., LtdKD-P
Pionowy mikroskop optycznyNikonNIKON ECLIPSE E100
KsylenSCRC10023418
792632 SLCH4887 PM150110

Bibliografia

  1. Swanberg, K., et al. Multiple sclerosis diagnosis and phenotype identification by multivariate classification of in vivo frontal cortex metabolite profiles. Sci Rep. 12 (1), 13888(2022).
  2. Zahoor, I., et al. An emerging potential of metabolomics in multiple sclerosis: a comprehensive overview. Cell Mol Life Sci. 78 (7), 3181-3203 (2021).
  3. Vitturi, B., et al. Spatial and temporal distribution of the prevalence of unemployment and early retirement in people with multiple sclerosis: A systematic review with meta-analysis. PloS one. 17 (7), 0272156(2022).
  4. Brambilla, R. The contribution of astrocytes to the neuroinflammatory response in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Acta neuropathologica. 137 (5), 757-783 (2019).
  5. Niedźwiedzka-Rystwej, P., Tokarz-Deptuła, B., Deptuła, W. Characteristics of T lymphocyte subpopulations. Postepy Hig Med Dosw. 67, 371-379 (2013).
  6. Loos, J., et al. Functional characteristics of Th1, Th17, and ex-Th17 cells in EAE revealed by intravital two-photon microscopy. J neuroinflammation. 17 (1), 357(2020).
  7. Prajeeth, C., et al. Effectors of Th1 and Th17 cells act on astrocytes and augment their neuroinflammatory properties. J neuroinflammation. 14 (1), 204(2017).
  8. Nielsen Birgitte, R., et al. Characterization of naïve, memory and effector T cells in progressive multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 310, 17-25 (2017).
  9. Xie, L., et al. The role of CD4+ T cells in tumor and chronic viral immune responses. Med Comm. 4 (5), e390(2023).
  10. Sun, L., et al. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
  11. Kawabe, T., et al. Memory-phenotype CD4+ T cells spontaneously generated under steady-state conditions exert innate TH1-like effector function. Sci Immunol. 2 (12), (2017).
  12. Moon, J., et al. A study of experimental autoimmune encephalomyelitis in dogs as a disease model for canine necrotizing encephalitis. J Vet Sci. 16 (2), 203-211 (2015).
  13. Pérez-Nievas, B., et al. Chronic immobilisation stress ameliorates clinical score and neuroinflammation in a MOG-induced EAE in Dark Agouti rats: mechanisms implicated. J neuroinflammation. 7, 60(2010).
  14. Zheng, J., et al. Prostaglandin D2 signaling in dendritic cells is critical for the development of EAE. J Autoimmun. 114, 102508(2020).
  15. Adamczyk, M., et al. The expression of activation markers CD25 and CD69 increases during biologic treatment of Psoriasis. J Clin Med. 12 (20), 6573(2023).
  16. Meng, R., et al. Echinococcus multilocularisIndoleamine 2,3-dioxygenase 1 signaling orchestrates immune tolerance in -infected mice. Front Immunol. 13, 1032280(2022).
  17. Sheinin, M., et al. Suppression of experimental autoimmune Encephalomyelitis in mice by β-Hydroxy β-Methylbutyrate, a body-building supplement in humans. J Immunol. 211 (2), 187-198 (2023).
  18. Ghareghani, M., et al. Hormones in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) animal models. Transl Neurosci. 12 (1), 164-189 (2021).
  19. Pérez-Miralles, F., et al. Clinical impact of early brain atrophy in clinically isolated syndromes. Mult Scler. 19 (14), 1878-1886 (2013).
  20. Nygaard, G., et al. Cortical thickness and surface area relate to specific symptoms in early relapsing-remitting multiple sclerosis. Mult Scler. 21 (4), 402-414 (2015).
  21. Biberacher, V., et al. Atrophy and structural variability of the upper cervical cord in early multiple sclerosis. Mult Scler. 21 (7), 875-884 (2015).
  22. Ma, Y., et al. Epsilon toxin-producing Clostridium perfringens colonize the multiple sclerosis gut microbiome overcoming CNS immune privilege. J Clin Invest. 133 (9), e163239(2023).
  23. Cibrián, D., Sánchez, M. CD69: from activation marker to metabolic gatekeeper. Eur J Immunol. 47 (6), 946-953 (2017).
  24. Clarkson Benjamin, D., et al. Preservation of antigen-specific responses in cryopreserved CD4 and CD8 T cells expanded with IL-2 and IL-7. J Transl Autoimmun. 5, 100173(2022).
  25. Raeber Miro, E., et al. The role of cytokines in T-cell memory in health and disease. Immunol Rev. 283 (1), 176-193 (2018).
  26. Ville, S., et al. Co-stimulatory blockade of the CD28/CD80-86/CTLA-4 balance in transplantation: Impact on memory T cells. Front Immunol. 6, 411(2015).
  27. Natalini, A., et al. OMIP-079: Cell cycle of CD4+ and CD8+ naïve/memory T cell subsets, and of Treg cells from mouse spleen. Cytometry A. 99 (12), 1171-1175 (2021).
  28. Joffre, O., et al. Cross-presentation by dendritic cells. Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).
  29. Montes, M., et al. Oligoclonal myelin-reactive T-cell infiltrates derived from multiple sclerosis lesions are enriched in Th17 cells. Clin Immunol. 130 (2), 133-144 (2009).
  30. Feruglio, S., Kvale, D., Dyrhol, R. T. Cell responses and regulation and the impact of in vitro IL-10 and TGF-β modulation during treatment of active tuberculosis. Scand J Immunol. 85 (2), 138-146 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

limfocyty T CD4+model stwardnienia rozsianegonawracająco-remisyjne EAEinfiltracja komórek odpornościowychośrodkowy układ nerwowyanaliza demielinizacjiefektorowe limfocyty T pamięcikomórki Th1 Th17limfocyty T regulatorowe

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.