Artykuł metodologiczny

Przewidywanie docelowego białka i walidacja związku małocząsteczkowego

3.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66564

⸱

23 lutego 2024

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Eksperyment wykorzystany tutaj pokazuje metodę molekularnego dokowania w połączeniu z testem przesunięcia termicznego komórkowego w celu przewidywania i walidacji interakcji między małymi cząsteczkami a celami białkowymi.

Streszczenie

Białka mają fundamentalne znaczenie dla fizjologii człowieka, a ich cele są kluczowe w badaniach i rozwoju leków. Identyfikacja i walidacja kluczowych celów białkowych stała się integralną częścią opracowywania leków. Dokowanie molekularne jest narzędziem obliczeniowym szeroko stosowanym do badania wiązania białka-liganda, zwłaszcza w kontekście interakcji docelowych leków i białek. Do eksperymentalnej weryfikacji wiązania i bezpośredniego dostępu do wiązania leku i jego celu stosuje się metodę komórkowego testu przesunięcia termicznego (CETSA). Badanie to miało na celu zintegrowanie dokowania molekularnego z CETSA w celu przewidywania i walidacji interakcji między lekami a ważnymi celami białkowymi. W szczególności przewidzieliśmy interakcję między ksantainą a białkiem Keap1, a także jej tryb wiązania poprzez analizę dokowania molekularnego, a następnie weryfikację interakcji za pomocą testu CETSA. Nasze wyniki wykazały, że ksantanina może tworzyć wiązania wodorowe ze specyficznymi resztami aminokwasowymi białka Keap1 i zmniejszać termostabilność białka Keap1, co wskazuje, że ksantanina może bezpośrednio oddziaływać z białkiem Keap1.

Wprowadzenie

Białka są bardzo ważnymi makrocząsteczkami w organizmach żywych i posiadają różnorodny zakres unikalnych funkcji w komórkach, takich jak skład błony, tworzenie cytoszkieletu, aktywność enzymów, transport, sygnalizacja komórkowa oraz udział w mechanizmach wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych1,2,3. Białka przejawiają swoje funkcje biologiczne przede wszystkim poprzez specyficzne interakcje z różnymi cząsteczkami, w tym innymi białkami, kwasami nukleinowymi, ligandami małocząsteczkowymi i jonami metali1,4. Ligandy to małe związki molekularne, które specyficznie wiążą się z białkami w organizmie. Interakcja między białkami i ligandami zachodzi w określonych miejscach białka, zwanych miejscami wiązania, znanymi również jako kieszenie wiążące5. W badaniach z zakresu chemii medycznej nacisk kładziony jest na identyfikację kluczowych białek, które są wyraźnie związane z chorobami, które służą jako cele dla leków6. W związku z tym dogłębne zrozumienie miejsc wiązania między białkami a ligandami ma ogromne znaczenie w promowaniu odkrywania, projektowania i badań leków7,8.

Dokowanie molekularne jest szeroko stosowanym narzędziem obliczeniowym do badania wiązania białko-ligand, które wykorzystuje trójwymiarowe struktury białek i ligandów do badania ich pierwotnych sposobów wiązania i powinowactwa podczas tworzenia stabilnych kompleksów9,10,11. Zastosowanie technologii dokowania molekularnego powstało w latach siedemdziesiątych XX wieku. Opierając się na zasadzie parowania zamka i klucza oraz wykorzystując algorytmy oprogramowania do dokowania molekularnego, można określić interakcję między związkami a celami molekularnymi, analizując wyniki dokowania. Takie podejście umożliwia przewidywanie aktywnych miejsc wiązania zarówno dla związku, jak i cząsteczki docelowej. W związku z tym ułatwia identyfikację optymalnej konformacji wiązania (zwanej tutaj modelem wiązania) dla interakcji ligand-receptor, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechaniki tych molekularnych zaangażowań12,13,14,15. Podczas gdy dokowanie molekularne dostarcza cennych prognoz komputerowych dotyczących interakcji ligand-receptor, ważne jest, aby pamiętać, że są to wstępne ustalenia. W związku z tym niezbędna jest dalsza weryfikacja eksperymentalna, aby potwierdzić te interakcje.

Test komórkowego przesunięcia termicznego (CETSA), początkowo zaproponowany przez zespół badawczy Pär Nordlund w 2013 roku, służy jako metoda walidacji interakcji białkowych lek-cel. Technika ta w szczególności testuje stabilność termiczną białek docelowych indukowaną wiązaniem leków, zapewniając praktyczne podejście do potwierdzania interakcji molekularnych16,17,18. Podejście to opiera się na podstawowej zasadzie, że wiązanie ligandów inicjuje przesunięcie termiczne w białkach docelowych i ma zastosowanie do szerokiej gamy próbek biologicznych, w tym lizatów komórkowych, nienaruszonych żywych komórek i tkanek19,20. CETSA wspiera bezpośrednie zaangażowanie małych cząsteczek w nienaruszone komórki poprzez wykrywanie termodynamicznej stabilizacji białek w wyniku wiązania ligandów i powiązanie obserwowanej odpowiedzi fenotypowej ze związkiem docelowym21,22. Spośród różnych metodologii wywodzących się z CETSA, Western Blot-CETSA (WB-CETSA) jest uważany za podejście klasyczne. Po przygotowaniu próbki przy użyciu metody CETSA, analiza western blot jest wykorzystywana do wykrycia zmian w stabilności termicznej białka docelowego. Pozwala to na precyzyjne określenie interakcji lek-białko w systemach komórkowych17,23.

Xanthatin to bioaktywny związek wyizolowany z rośliny Xanthium L. o właściwościach takich jak przeciwzapalne, który był stosowany w tradycyjnej medycynie chińskiej do leczenia chorób takich jak zapalenie zatok nosowych i artretyzm24,25. Białko 1 związane z ECH podobne do kelcha (Keap1) jest składnikiem wielocząsteczkowego kompleksu białkowego ligazy ubikwityny Cullin-RING E3 opartego na Cullin3 i ważnym regulatorem wewnątrzkomórkowej homeostazy redoks, który wpływa na intensywność i czas trwania odpowiedzi zapalnej poprzez modulację wewnątrzkomórkowego stanu redoks26. W tym badaniu po raz pierwszy wykorzystaliśmy dokowanie molekularne do zbadania interakcji między ksantazyną (małą cząsteczką) a białkiem Keap1, mając na celu przewidzenie ich trybu wiązania. Następnie zastosowaliśmy metodę CETSA, aby zwalidować tę interakcję, oceniając wpływ ksantozyny na stabilność termiczną białka Keap1.

Protokół

1. Pobieranie struktur xanthatin i Keap1

  1. Otwórz bazę danych PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), wprowadź xanthatin (mała cząsteczka), a następnie naciśnij Szukaj i kliknij Pierwszy wynik. Kliknij Pobierz i kliknij Zapisz pod strukturą 2D, aby zapisać związek w formacie .sdf.
  2. Pobierz strukturę krystaliczną białka.
    1. Otwórz bazę danych UniProt (https://www.uniprot.org/), wprowadź Keap1 i kliknij Szukaj. Kliknij Człowiek pod popularnymi organizmami w lewej kolumnie, a następnie kliknij Pierwszy wpis o nazwie Q14145 w prawej kolumnie.
    2. Kliknij Struktura pod funkcją w lewej kolumnie, znajdź strukturę o identyfikatorze PDB: 2FLU i kliknij RCSB-PDB. Kliknij Pobierz pliki i wybierz Format PDB, aby pobrać strukturę krystaliczną białka Keap1.

2. Dokowanie molekularne

  1. Utwórz nowy folder o nazwie dokowanie molekularne na pulpicie i zapisz pobrane struktury xanthatiny (mała cząsteczka) i Keap1 (białko) w tym folderze.
    UWAGA: Nazwa folderu i ścieżka muszą być w języku angielskim.
  2. Otwórz oprogramowanie Maestro, kliknij Plik, wybierz Zmień katalog roboczy, kliknij Pulpit, kliknij dwukrotnie, aby wybrać nowo utworzony folder dokowania molekularnego i kliknij Wybierz opcje.
  3. Przetwarzanie małych cząsteczek
    1. Kliknij Plik i opcje importu struktur, kliknij Pulpit, kliknij dwukrotnie folder dokowania molekularnego, kliknij plik struktury xanthatin, a następnie kliknij Otwórz, aby zaimportować plik małych cząsteczek.
    2. Kliknij Zadania w prawym górnym rogu oprogramowania i wybierz opcję LigPrep. Używanie struktur z obszaru roboczego; pozostałe parametry są parametrami domyślnymi i kliknij przycisk Uruchom, aby przeprowadzić przetwarzanie małych cząsteczek.
  4. Przetwarzanie struktury białka
    1. Kliknij opcje File (Plik) i Import Structures (Importuj struktury), kliknij opcję Desktop (Pulpit), a następnie kliknij dwukrotnie folder Molecular Docking (Dokowanie molekularne). Kliknij plik struktury białka Keap1, a następnie kliknij przycisk Otwórz, aby zaimportować plik struktury białka.
    2. Kliknij Zadania w prawym górnym rogu oprogramowania i wybierz opcję Kreator przygotowania białka. Zaznacz pole Przed usunięciem wód powyżej 5 A z grup het i wprowadź pH 7,4 +/- 0,0. Kliknij pozycję Przetwarzanie wstępne, kliknij pozycję Uściślij, a następnie kliknij pozycję Optymalizuj > Usuń wody > Minimalizuj
      3. .
    3. Kliknij następne zadanie, gdy poprzednie zadanie zostanie zakończone. Kliknij Zadania i wybierz opcję Mapa witryny, użyj ustawień domyślnych dla wszystkich parametrów, a następnie kliknij Uruchom.
    4. Kliknij opcję File and Import Structures options, kliknij opcję Desktop, kliknij dwukrotnie folder dokowania molekularnego i otwórz folder o nazwie sitemap_1. Kliknij pierwszy plik o nazwie Sitemap_1_out.maegz, a następnie kliknij przycisk Otwórz.
    5. Kliknij dwukrotnie kropkę, aby wybrać sitemap_1_protein w obszarze roboczym, a następnie kliknij Sitemap_1_site_1, aby ją zaznaczyć. Kliknij przycisk Zadania i wybierz opcję Generowanie siatki receptorów.
      UWAGA: Miejsca białkowe przewidywane przez mapę witryny są uszeregowane zgodnie z punktacją, przy czym witryna z najwyższą oceną znajduje się na pierwszym miejscu.
    6. Należy wybrać opcję Wpis pod receptorem, z pozostałymi parametrami bez zmian. Kliknij na małą białą kulkę w strukturze białka, aby wygenerować skrzynkę dokującą o domyślnym rozmiarze i zmień nazwę zadania na glide-grid_2FLU. Kliknij przycisk Uruchom.
  5. Dokowanie molekularne
    1. Kliknij przycisk Tasks (Zadania) i wybierz opcję Ligand Docking (Dokowanie liganda). Wybierz z pliku opcję Receptor Grid As (Siatka receptorów jako) i kliknij przycisk Browse (Przeglądaj). Kliknij Pulpit, kliknij dwukrotnie folder dokowania molekularnego, kliknij dwukrotnie plik grid_2FLU glide, kliknij plik Glide-grid_2FLU.zip, a następnie kliknij Otwórz.
    2. Kliknij Użyj ligandów w plikach > przeglądaj > pulpicie. Kliknij dwukrotnie folder dokowania molekularnego, kliknij dwukrotnie plik ligprep_1, kliknij plik Ligprep_1-out.maegz, a następnie kliknij przycisk Otwórz.
    3. Kliknij Ustawienia i wybierz opcję Precyzja jako XP (dodatkowa precyzja), zmień nazwę zadania na dock_XP_2FLU ślizgu i kliknij przycisk Uruchom.
  6. Wyświetlanie wyników dokowania
    1. Kliknij opcję File and Import Structures (Opcje pliku i importu struktur), kliknij opcję Desktop (Pulpit), a następnie kliknij dwukrotnie folder Molecular Docking (Dokowanie molekularne). Kliknij dwukrotnie plik glide-dock_XP_2FLU, kliknij plik glide-dock_XP_1_pv.maegz, a następnie kliknij przycisk Otwórz.
    2. Kliknij dwukrotnie kropkę, aby wybrać ligand w obszarze roboczym, a następnie kliknij, aby wybrać sitemap_1_protein. Kliknij pozycję Tabela, przesuń palcem maksymalnie w prawo i wyświetl wynik w obszarze dokowanie wyniku.
  7. Wizualizacja wyników 2D
    1. Kliknij dwukrotnie kropkę, aby wybrać ligand w obszarze roboczym, a następnie kliknij, aby również wybrać sitemap_1_protein. Kliknij opcję Interakcja liganda > Widok i zaznacz pole Legenda LID.
    2. Kliknij Plik, wybierz Zapisz zrzut ekranu, wprowadź 6000 na szerokości, odznacz pole Przezroczyste tło i kliknij OK. Kliknij Pulpit, nazwij plik jako 2D-xanthatin-2FL i zapisz obraz.
  8. Wizualizacja wyników 3D
    1. Kliknij dwukrotnie kropkę, aby wybrać ligand w obszarze roboczym, a następnie kliknij, aby również wybrać sitemap_1_protein.
    2. Kliknij L w obszarze Szybki wybór, aby zaznaczyć małe cząsteczki, a następnie kliknij przycisk Styl. Kliknij drugą linię w stylu, aby zmienić rozmiar wiązania małej cząsteczki i kliknij atomy koloru, aby zmienić kolor małej cząsteczki.
    3. Zaznacz małą cząsteczkę na rysunku, kliknij prawym przyciskiem myszy, wybierz Rozwiń zaznaczenie i wybierz 4 A. Kliknij przycisk Zastosuj etykiety w stylu, aby wyświetlić etykiety.
    4. Kliknij drugą linię w stylu, aby zmienić rozmiar wiązań aminokwasowych i kliknij Kolorowe atomy, aby zmienić kolor aminokwasu.
    5. Kliknij Dalej > Odwróć, przytrzymaj Control i kliknij pierwszą pozycję oka w obszarze stylu, aby wyświetlić tylko aminokwasy z etykietami.
    6. Kliknij Styl wstążek >, aby wyświetlić białko jako styl wstążki, a następnie kliknij Edytuj wstążkę pod wstążkami, aby zmienić kolor wstążki.
    7. Kliknij Przełącz interakcje w prawym dolnym rogu ekranu, kliknij prawym przyciskiem myszy i odznacz kontakty/kolizje.
    8. Wyszukaj pomiar w zadaniach, wybierz Odległość i kliknij dwa atomy połączone żółtą przerywaną linią (wiązanie wodorowe) na ekranie, aby zmierzyć długości wiązań wodorowych.
    9. Naciśnij i przytrzymaj kółko myszy, aby obrócić białko, dostosuj białko do środka ekranu i upewnij się, że każda etykieta aminokwasu jest widoczna.
    10. Kliknij Przestrzeń robocza > Zapisz obraz jako i kliknij na pulpicie. Zapisz obraz domyślnie w rozdzielczości 600 dpi, nazwij plik jako 3D-xanthatin-2FLU, wybierz typ pliku jako format tiff i zapisz obraz.

3. Hodowla komórkowa i przygotowanie próbki CETSA

  1. Hodowla komórkowa
    1. Dodać 5 x 106 komórek RAW264,7 / ml do naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm i inkubować z 6 ml pożywki DMEM z 10% FBS i 1% roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym w temperaturze 37 °C, wilgotności 95% i 5% CO2 . Przygotuj trzy naczynia i przeprowadź eksperyment, gdy komórki osiągną 80% konfluencji.
  2. Przygotowanie próbki CETSA
    1. Odessać starą pożywkę, dodać 2 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) podgrzanej do temperatury pokojowej do każdego naczynia i umyć 2x.
    2. Dodaj 2 ml PBS do każdej płytki z komórkami, wymieszaj komórki i zbierz komórki do dwóch probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 377 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    3. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 2 ml PBS zawierającego 1% mieszanin inhibitorów proteazy o szerokim spektrum działania. Podzielić na pojedyncze probówki do mikrowirówek, w każdej znajduje się 1 ml zawiesiny komórek.
    4. Zamrozić probówki do mikrowirówek w ciekłym azocie do uzyskania białej wartości stałej, a następnie natychmiast rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i powtórzyć 3 razy. Wirować przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min.
    5. Wziąć dwie probówki do mikrowirówek, jedną ze 100 μM xantityną i jedną z równą objętością DMSO, i dodać 450 μl odwirowanego supernatantu do każdej probówki, inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    6. Dodać supernatant z dwóch probówek do mikrowirówek do 14 probówek do PCR o objętości 60 μl/probówkę i do probówek grzewczych jednocześnie w różnych temperaturach (45 °C, 48 °C, 51 °C, 54 °C, 57 °C, 60 °C i 63 °C) przez 3 minuty, z dwiema probówkami do PCR w każdej temperaturze, odpowiednio dla grup DMSO i xanthatin.
    7. W przypadku grupy nieogrzewanej należy pobrać supernatant z każdej z dwóch probówek mikrowirówek i dodać do 14 probówek PCR, 7 dla grupy DMSO i 7 dla grupy ksantacyny, w objętości 60 μl każda. Nie podgrzewaj próbek w tym miejscu.
    8. Schłodzić rurki w temperaturze pokojowej dla podgrzanej grupy. Odwirować wszystkie probówki (podgrzane i nieogrzewane) przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i pobrać 48 μl supernatantu z każdej probówki do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 12 μl buforu białkowego SDS-PAGE do każdej probówki, odwirować do dobrego wymieszania i podgrzewać w łaźni wodnej w temperaturze 100 °C przez 5 min.
      UWAGA: Przygotowane próbki CETSA muszą być przechowywane w temperaturze -80 °C i badane metodą western blot w ciągu 1 tygodnia.

4. Western blot

  1. Przygotowanie żelu SDS-PAGE
    1. Opłucz jedną długą i jedną krótką szklaną płytkę ultraczystą wodą. Umieść płytki w szczelinie zaciskowej, a następnie na przezroczystej płycie. Dodaj ultraczystą wodę i sprawdzaj szczelność przez 10 minut.
    2. Dodać 8 ml dolnego roztworu żelu i 8 ml dolnego buforu żelowego do kolby stożkowej i wymieszać, delikatnie wstrząsając. Dodać 160 μl promotora koagulantu do roztworu żelu i dobrze wymieszać.
      UWAGA: Objętość dolnej warstwy kleju nie powinna przekraczać zielonej linii na szczelinie zaciskowej.
    3. Spuść ultraczystą wodę z płytek i osusz je bibułą filtracyjną. Dodaj przygotowany dolny roztwór żelu. Dodaj 2 ml alkoholu izopropylowego i odczekaj 20 minut do zestalenia.
    4. Pobrać 2 ml górnego roztworu żelu i 2 ml górnego buforu żelowego do kolby stożkowej i wymieszać, delikatnie potrząsając kolbą.
    5. Usuń alkohol izopropylowy z warstwy żelu i osusz nadmiar alkoholu izopropylowego bibułą filtracyjną.
    6. Dodać 40 μl promotora koagulantu do wymieszanego górnego roztworu żelu, dobrze wymieszać, następnie dodać między długie i krótkie szklane płytki i włożyć grzebień 1,5 mm z 15 otworami, odczekać 20 min.
      UWAGA: Grzebień należy wkładać prostopadle do górnej warstwy, bez pęcherzyków powietrza między grzebieniem a roztworem.
  2. Elektroforezy
    1. Dodać 1 l ultraczystej wody do zlewki, dodać saszetkę proszku buforowego SDS-PAGE, dobrze wymieszać szklaną pałeczką i dodać przygotowany żel do jednostki do elektroforezy. Umieść urządzenie w pudełku i wyciągnij grzebień.
    2. Rozmrozić marker i próbki CETSA w temperaturze pokojowej, odwirować i odwirować. Dodać 2,5 μl markera do pierwszego dołka i 20 μl próbek CETSA do każdego z pozostałych dołków zgodnie z wcześniej ustaloną kolejnością.
      UWAGA: Próbki CETSA dodawano kolejno zgodnie z obróbką termiczną opisaną w kroku 3.2.6 od 45 °C do 63 °C; najpierw dodano grupę DMSO, a następnie grupę xanthatin (Rysunek 1).
    3. Dodaj pozostały roztwór do elektroforezy do jednostki elektroforetycznej, zamknij pokrywę i włóż elektrodę, biegun dodatni do bieguna dodatniego, biegun ujemny do bieguna ujemnego.
    4. Włącz wyłącznik zasilania i ustaw przełącznik napięcia na 80 V, aby rozpocząć elektroforezę.
  3. Przenieś na membranę
    1. Dodać 850 ml ultraczystej wody, 100 ml bezwodnego etanolu i 50 ml buforu do szybkiego przenoszenia do zlewki i dobrze wymieszać. Przygotuj płytę piankową, plastikowe noże, pęsetę, tace i urządzenia do przenoszenia membrany.
    2. Przetnij membranę PVDF zgodnie z rozmiarem żelu, oznacz ją i zanurz w metanolu na 30 sekund, aby ją aktywować.
    3. Wlej roztwór transferowy do tacy, umieść i otwórz zaciski transferowe, a następnie umieść gąbkę i trzy warstwy bibuły filtracyjnej.
    4. Przerwij elektroforezę, a następnie otwórz pokrywę pojemnika do elektroforezy. Weź urządzenie do elektroforezy, wylej roztwór do elektroforezy i wyjmij płytkę. Umieść płytkę na płycie piankowej, delikatnie podważ ją plastikowym nożem i przetnij żel, aby wyraźnie uwidocznić marker białkowy i białka docelowe.
    5. Przytrzymaj jedną stronę markera pęsetą, umyj ją na tacy zawierającej roztwór transbłonowy i połóż płasko na bibule filtracyjnej. Zanurz aktywowaną membranę PVDF w roztworze transferowym, przytrzymaj oznaczoną stronę pęsetą i przykryj żel stroną zadrukowaną do dołu.
      UWAGA: Membrana PVDF oznaczona jest stroną przednią i należy zwrócić uwagę na fakt, że podczas procesu umieszczania nie powstają pęcherzyki powietrza.
    6. Umieść dwie warstwy bibuły filtracyjnej i jedną warstwę podkładki gąbkowej na membranie PVDF, przykryj i zaciśnij klipsy transferowe, a następnie włóż je do zbiornika transferowego.
      UWAGA: kolor klipsa transferowego na kolor szczeliny transferowej.
    7. Dodać pozostały roztwór transbłonowy do kasety transbłonowej, przykryć pokrywką, dodatni do dodatniego, ujemny do ujemnego.
    8. Dostosuj prąd do 400 mA, czas do 30 minut, a następnie naciśnij Uruchom, aby rozpocząć przenoszenie membrany w temperaturze pokojowej.
  4. Blokowanie
    1. Dodaj 2 litry ultraczystej wody do szklanej fiolki, dodaj saszetkę proszku TBS, a następnie dodaj 2 ml Tween do uzyskania roztworu TBST. Zważyć proszek BSA, aby przygotować 5% roztwór BSA z TBST i dodać 6 ml roztworu BSA do pudełka inkubacyjnego.
    2. Zatrzymaj przenoszenie membrany, a następnie otwórz zacisk transferowy. Zacisnąć stronę znacznika membrany PVDF i umieścić ją w komorze inkubacyjnej. Umieść pudełko inkubacyjne na wytrząsarce i blokuj przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.
  5. Inkubacja przeciwciała pierwszorzędowego
    1. Przygotować przeciwciało pierwszorzędowe (szczegółowe informacje znajduje się w Tabeli materiałów) z 5% roztworem BSA w stosunku 1:1000, roztwór BSA poddać recyklingowi w pudełku inkubatora i dodać 6 ml przeciwciała pierwszorzędowego do pudełka do inkubacji. Umieść pudełko inkubacyjne w piankowym pudełku z okładami z lodu i trzymaj je na shakerze przez noc.
  6. Inkubacja przeciwciał drugorzędowych
    1. Następnego dnia zbierz przeciwciało pierwszorzędowe w pudełku do inkubacji, a następnie dodaj 6 ml roztworu TBST i umieść je na shakerze do mycia przez 5 minut.
    2. Odlewać przemyty roztwór TBST i dodawać świeży do mycia; powtórzyć 5x i przygotować przeciwciało drugorzędowe z 5% roztworem BSA w stosunku 1:5000.
    3. Odlewać roztwór TBST i dodać 6 ml przeciwciała drugorzędowego do pudełka inkubacyjnego. Umieścić pudełko inkubacyjne na wytrząsarce i inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.
    4. Zebrać przeciwciało drugorzędowe (szczegóły w Tabeli Materiałów), następnie dodać 6 ml roztworu TBST i umieścić go na shakerze do mycia przez 5 minut. Odleć umyty roztwór TBST i dodać świeży do mycia; powtórzyć 5 razy.
  7. Odsłanianie pasków
    1. Roztwór TBST należy zachować na koniec ostatniego prania. Weź równe objętości odczynników chemiluminescencyjnych A i B, wstrząśnij i dobrze wymieszaj. Osłoń roztwór przed światłem.
    2. Otwórz system obrazowania żelu, kliknij Próbki, sprawdź kalibrację, poczekaj na zakończenie kalibracji, a następnie kliknij Marker, sprawdź kalibrację.
    3. Podnieś stronę markera paska za pomocą pęsety i całkowicie zanurz w roztworze odczynnika chemiluminescencyjnego. Clamp jedną stronę markera, aby umieścić pasek stroną zadrukowaną do dołu w imagerze, zamknij pokrywę imagera, kliknij Exposure (Ekspozycja) i ustaw czas ekspozycji na 1 s.
      UWAGA: Deweloper musi całkowicie zakryć pasek, a rozwój powinien znajdować się w ciemnym otoczeniu.
    4. Kliknij przycisk Zapisz, nazwij obraz i zapisz go jako plik .tif. Przeanalizuj gęstość optyczną western blot. Wartości szarości każdej temperatury w grupie DMSO porównano z wartościami szarości wynoszącymi 45 °C, a wartości szarości każdej temperatury w grupie ksantozyny porównano z wartościami szarości ksantozyny w temperaturze 45 °C.

Wyniki

Analiza dokowania molekularnego przewidziała interakcję między ksantatyną a białkiem Keap1. Rysunek 2 przedstawia tworzenie wiązań wodorowych między ksantatyną a resztami aminokwasowymi Gly-367 i Val-606 białka Keap1, przy długości wiązania wodorowego 2,17 Å dla Gly-367 i 2,13 Å dla Val-606. Ponadto obliczona wartość energii dokowania wynosząca -5,69 kcal/mol wskazuje na dobre powinowactwo wiązania między ksantatyną a białkiem Keap1.

Metoda CETSA wykazała, że wiązanie ksantatyny zmieniło stabilność termiczną białka Keap1, co potwierdziło oddziaływanie między ksantatyną a białkiem Keap121. Rysunek 3 wskazuje, że ksantatyna znacząco zmienia stabilność termiczną białka Keap1 w zakresie temperatur od 48 °C do 57 °C w porównaniu z grupą DMSO. Aby zapewnić równy ładunek próbek, w pierwszej kolejności zachowano jednakową gęstość wysiewu komórek w przeprowadzonych eksperymentach; po drugie, próbki komórek z grupy DMSO oraz grupy ksantatyny dokładnie wymieszano w naczyniach hodowlanych, a następnie równomiernie rozdzielono do dwóch probówek do mikrocentryfugi, co zapewniło stałą ilość próbek komórkowych; dodatkowo objętość supernatantu dodanego do każdej probówki PCR wynosiła 60 µL; na koniec objętość każdej próbki naniesionej na Western blot wynosiła 20 µL, co zapewniło równy ładunek próbek poddanych ogrzewaniu. Degradacja białek w próbkach w temperaturze około 51 °C wynika głównie ze zmian w strukturze białka i przyspieszenia reakcji chemicznych spowodowanych wysoką temperaturą. Powyższe wyniki dowodzą, że ksantatyna może bezpośrednio wiązać się z białkiem Keap1.

Ustawienie elektroforezy z gradientem temperatury do analizy białek; widoczne kolorowe prążki w żelu.
Rysunek 1: Kolejność nakładania próbek w western blot. Temperatury w kolejności od lewej do prawej wynosiły 45 °C, 48 °C, 51 °C, 54 °C, 57 °C, 60 °C oraz 63 °C. W pierwszej ścieżce naniesiono marker; dla każdej temperatury wykorzystano dwie ścieżki: pierwsza ścieżka stanowiła grupę DMSO, a druga ścieżka grupę ksantatyny. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat oddziaływań molekularnych i trójwymiarowa struktura wiązania białko-ligand dla analizy lek-cel.
Rysunek 2: Oddziaływanie między ksantyną a białkiem Keap1 (PDB: 2FLU). (A) Dwuwymiarowa reprezentacja wiązania ksantyny z Keap1. (B) Trójwymiarowa wizualizacja ksantyny i białka Keap1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza stabilności Keap1; żel SDS-PAGE i wykres przedstawiające ekspresję białka w różnych temperaturach.
Rycina 3: Wpływ ksantatyny na stabilność termiczną białka Keap1. (A) Wpływ ksantatyny na stabilność termiczną Keap1 wykryto metodą CETSA. (B) Gęstości optyczne Keap1 znormalizowano względem wartości uzyskanych w 45 °C. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (one-way ANOVA). n = 3. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Identyfikacja celów choroby oraz odkrywanie i opracowywanie leków są ze sobą ściśle powiązane27. Dzięki precyzyjnemu ukierunkowaniu na konkretne cele, można opracować kandydatów na leki, aby skuteczniej leczyć określone choroby, jednocześnie minimalizując skutki uboczne związane z lekami28,29. Najczęściej stosowanymi celami są cele białkowe30. Jednak identyfikacja specjalnych celów białkowych stanowi ogromne wyzwanie ze względu na dużą różnorodność białek w komórkach30,31. W tym artykule przyjęliśmy podejście, które łączy dokowanie molekularne z CETSA w celu identyfikacji i walidacji celów białkowych. Wyniki ujawniły bezpośrednią interakcję między ksantainą a białkiem Keap1. Integracja technologii komputerowej i eksperymentów biologicznych może być również wykorzystana w badaniu innych leków i celów białkowych w celu ustalenia obecności bezpośredniej interakcji między lekiem a celem. Takie podejście, które łączy predykcję z weryfikacją, skutecznie redukuje zarówno czasochłonność, jak i koszty ekonomiczne. Ponadto eksperymentalne instrumenty i materiały są łatwe do zdobycia, a proces obsługi nie jest skomplikowany. Wreszcie, próbki CETSA są łatwe do przygotowania i przetestowania metodą western blot, co zapewnia odtwarzalność próbek.

Z naszego doświadczenia wynika, że istnieje kilka krytycznych aspektów, które wymagają szczególnej uwagi podczas procedur eksperymentalnych. Po pierwsze, ważne jest, aby wybrać strukturę krystaliczną białka rozwiązywaną przez analizę rentgenowską przy wyborze struktury białka przed dokowaniem molekularnym. Po drugie, gęstość komórek i czas zamrażania/rozmrażania są kluczowymi czynnikami w eksperymentach CETSA. Komórki w logarytmicznej fazie wzrostu powinny być wybierane do eksperymentów CETSA, ponieważ ich stan wzrostu jest stabilny i ma minimalny wpływ na wyniki eksperymentalne. Podczas wielokrotnego zamrażania i rozmrażania komórek czas powinien być dobrze kontrolowany za pomocą ciekłego azotu używanego do zamrażania do uzyskania białej postaci stałej, a następnie natychmiastowego rozmrażania w temperaturze pokojowej przed kolejnymi cyklami zamrażania. Wreszcie, eksperymenty z Western blot muszą zostać zakończone niezwłocznie po przygotowaniu próbek CETSA, aby zapobiec degradacji białka.

Dokowanie molekularne i CETSA to sprawdzone techniki, które odgrywają kluczową rolę w dziedzinie opracowywania leków. Dokowanie molekularne odgrywa zasadniczą rolę w przewidywaniu interakcji na poziomie molekularnym między związkami a ich celami, oferując cenne informacje na temat potencjalnych sposobów wiązania10,11. Z kolei CETSA koncentruje się na ocenie wpływu leków na stabilność termiczną białek i służy jako narzędzie do walidacji interakcji lek-białko17. Chociaż CETSA jest stosunkowo prostą metodą weryfikacji, jest to również metoda o niskiej przepustowości dzięki wykorzystaniu western blot do badania przesunięcia termicznego kompleksu lek-białko i nie powinna być jedyną techniką, na której się opiera. Ponadto etapy CETSA są skomplikowane, a wszelkie błędy krokowe podczas operacji mogą mieć duży wpływ na wyniki. Ponadto metoda CETSA nie może określić specyficznego miejsca wiązania i trybu wiązania związku z docelowym białkiem i nie może wskazać, czy wiązanie jest kowalencyjne, czy niekowalencyjne 17,18,23. Poza testem przesunięcia termicznego, inne rodzaje testów energetycznych, takie jak wytrącanie białek zależne od pH (pHDPP), mogą być również stosowane do badania interakcji ligand-białko32. Co więcej, termiczne profilowanie proteomu jest opartą na energii metodą ujawniania interakcji ligand-białko, umożliwiającą wysokoprzepustową, wielkoskalową analizę interakcji białko-lek poprzez połączenie proteomiki z CETSA33.

Ponadto zlokalizowany powierzchniowy rezonans plazmonowy (LSPR) może dostarczyć dalszych analiz jakościowych i ilościowych34,35. Nie tylko określa istnienie interakcji między lekiem a jego celem, ale także mierzy parametry powinowactwa i parametry kinetyczne tych interakcji międzycząsteczkowych, oferując bardziej wszechstronne zrozumienie.

Poza testem przesunięcia termicznego, wytrącanie białek zależne od pH (pHDPP) może być również stosowane do badania interakcji ligand-białko32. Dokowanie molekularne to oparta na fizyczno-mechanice metoda symulacyjna służąca do przewidywania interakcji między małymi cząsteczkami a biomolekułami. Metoda ta ma na celu osiągnięcie wiązania poprzez optymalizację konformacji i orientacji małych cząsteczek w celu uzyskania najlepszej komplementarności między nimi a biomolekułami. Przewidywanie celów wykorzystuje techniki sztucznej inteligencji do przewidywania miejsc wiązania między małymi cząsteczkami a biomolekułami. Te dwa podejścia mają kluczowe różnice w zastosowaniu metody i dokładności przewidywania. Zastosowanie metody: dokowanie molekularne jest wykorzystywane głównie do projektowania i optymalizacji leków, zapewniając teoretyczne podstawy do odkrywania nowych leków. Przewidywanie celów, z pomocą bardziej zaawansowanej sztucznej inteligencji, jest częściej stosowane do wysokoprzepustowych badań przesiewowych i szybkiego odkrywania związków ołowiu w celu poprawy efektywności odkrywania leków. Dokładność przewidywania: Ponieważ dokowanie molekularne opiera się na symulacjach fizycznych, jego dokładność przewidywania jest wyższa, ale koszt obliczeniowy jest również stosunkowo wysoki. Chociaż przewidywanie celów ma niższy koszt obliczeniowy, dokładność przewidywania zależy od obfitości danych treningowych i wyboru modelu.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82004031) oraz Sichuan Science and Technology Program (2022NSFSC1303). Wyrażamy naszą wielką wdzięczność Jiayi Sun z Innowacyjnego Instytutu Medycyny Chińskiej i Farmacji Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Chengdu za pomoc w leczeniu western blot.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,45 μ m Membrana z polifluorku winylidenuMilliporePR05509
Bezwodny etanolChemikalia Chron64-17-5
Albumina surowicy bydlęcejBioFroxx4240GR100
Mieszaniny inhibitorów proteazy o szerokim spektrum działaniaBoster Biological Technology Co., LtdAR1193
DMSOBoster Biological Technology Co., LtdPYG0040
Ulepszony odczynnik chemiluminescencyjnyBeyotime Biotechnology Co., LtdP0018S Przeciwciało
GAPDHProteinTech Group Co., Ltd10494-1-AP
Żelowy instrument do obrazowaniaE-BLOTTouch Imager Pro
Gradientowy instrument PCRBiometra TADVANCEDBiometra Tadvanced 96SG
Szybkoobrotowawirówka do zamrażaniaBeckman CoulterAllegra X-30R
Affini sprzężone z peroksydazą chrzanowąCzyste przeciwciało kozieProteinTech Group Co., LtdSA00001-2
Alkohol izopropylowy Chron chemicals67-63-0
Przeciwciało Keap1Zen BioScience Co., LtdR26935
Kąpiel metalowaAnalytik JenaTSC
MetanolChemikalia Chron67-56-1
Bufor szybkiego transferu Ncmblot (20 razy;)NCM Biotech Co., LtdWB4600
Omni-Easy OneStep PAGE żel szybkie przygotowanie kieEpizyme Biotech Co., LtdPG212
Bufor fosforanowy sól fizjologicznaBoster Biological Technology Co., LtdPYG0021
Marker białka barwionegoBiosharp BL741A
System do elektroforezy białkówBio-RadMiniPROTEANÒ Tetra Cell
RAW264.7 cellBeyotime Biotechnology Co., LtdC7505
RAW264.7 medium specyficzne dla komórekProcell Life Science& Technology Co., LtdCM-0597
SDS-PAGE bufor ładujący białkoBoster Biological Technology Co., LtdAR1112-10
SDS-PAGE bufor do biegania w proszkuServicebioG2018
Tris buforowany proszek soli fizjologicznejServicebioG0001
Tween 20BioFroxx1247ML100
Kąpiel wodnaMemmertWNE10
Oczyszczacz wodyMilliporeMilli- IQ 7005
XanthatinChemConst Biotechnology Co., LtdCONST210706

Bibliografia

  1. Soleymani, F., Paquet, E., Viktor, H., Michalowski, W., Spinello, D. Protein-protein interaction prediction with deep learning: A comprehensive review. Computat Struct Biotechnol J. 20, 5316-5341 (2022).
  2. Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. Int J Mol Sci. 17 (2), 144(2016).
  3. Wu, Q., Peng, Z., Zhang, Y., Yang, J. COACH-D: improved protein-ligand binding sites prediction with refined ligand-binding poses through molecular docking. Nucleic Acids Res. 46, W438-W442 (2018).
  4. Zhang, F., et al. PROBselect: accurate prediction of protein-binding residues from proteins sequences via dynamic predictor selection. Bioinfo. 36, i735-i744 (2020).
  5. Kandel, J., Tayara, H., Chong, K. T. PUResNet: prediction of protein-ligand binding sites using deep residual neural network. J Cheminfo. 13 (1), 65(2021).
  6. Dhakal, A., Mckay, C., Tanner, J. J., Cheng, J. Artificial intelligence in the prediction of protein-ligand interactions: recent advances and future directions. Brief Bioinform. 23 (1), 476(2022).
  7. Hatty, C. R., Banati, R. B. Protein-ligand and membrane-ligand interactions in pharmacology: the case of the translocator protein (TSPO). Pharmacol Res. 100, 58-63 (2015).
  8. Chaires, J. B. Calorimetry and thermodynamics in drug design. Ann Rev Biophys. 37, 135-151 (2008).
  9. Huang, S. Y., Zou, X. Advances and challenges in protein-ligand docking. Int J Mo Sci. 11 (8), 3016-3034 (2010).
  10. Li, J., Fu, A., Zhang, L. An overview of scoring functions used for protein-ligand interactions in molecular docking. Interdiscip Sci. 11 (2), 320-328 (2019).
  11. Crampon, K., Giorkallos, A., Deldossi, M., Baud, S., Steffenel, L. A. Machine-learning methods for ligand-protein molecular docking. Drug Discov Today. 27 (1), 151-164 (2022).
  12. Pinzi, L., Rastelli, G. Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery. Int J Mol Sci. 20 (18), 4331(2019).
  13. Abdolmaleki, A., Ghasemi, F., Ghasemi, J. B. Computer-aided drug design to explore cyclodextrin therapeutics and biomedical applications. Chem Biol Drug Des. 89 (2), 257-268 (2017).
  14. Chen, G., Seukep, A. J., Guo, M. Recent advances in molecular docking for the research and discovery of potential marine drugs. Mar Drugs. 18 (11), 545(2020).
  15. Li, T., Guo, R., Zong, Q., Ling, G. Application of molecular docking in elaborating molecular mechanisms and interactions of supramolecular cyclodextrin. Carbohydr Polym. 276, 118644(2022).
  16. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  17. Tu, Y., Tan, L., Tao, H., Li, Y., Liu, H. CETSA and thermal proteome profiling strategies for target identification and drug discovery of natural products. Phytomedicine. 116, 154862(2023).
  18. Dai, L., et al. Horizontal cell biology: Monitoring global changes of protein interaction states with the proteome-wide cellular thermal shift assay (CETSA). Annu Rev Biochem. 88, 383-408 (2019).
  19. Lade, D. M., Nicoletti, R., Mersch, J., Agazie, Y. M. Design and synthesis of improved active-site SHP2 inhibitors with anti-breast cancer cell effects. Eur J Med Chem. 247, 115017(2023).
  20. Jiang, X., et al. Novel chemical-structure TPOR agonist, TMEA, promotes megakaryocytes differentiation and thrombopoiesis via mTOR and ERK signalings. Phytomedicine. 110, 154637(2023).
  21. Mateus, A., et al. Thermal proteome profiling for interrogating protein interactions. Mol Syst Biol. 16 (3), 9232(2020).
  22. Sanchez, T. W., et al. Real-time cellular thermal shift assay to monitor target engagement. ACS Chem Biol. 17 (9), 2471-2482 (2022).
  23. Tolvanen, T. A. Current advances in CETSA. Front Mol Biosci. 9, 866764(2022).
  24. Liu, M., et al. Xanthatin inhibits STAT3 and NF-κB signalling by covalently binding to JAK and IKK kinases. J Cell Mol Med. 23 (6), 4301-4312 (2019).
  25. Liu, Y., Chen, W., Zheng, F., Yu, H., Wei, K. Xanthatin alleviates LPS-Induced inflammatory response in RAW264.7 macrophages by Inhibiting NF-κB, MAPK and STATs activation. Molecules. 27 (14), 4603(2022).
  26. Dinkova-Kostova, A. T., Kostov, R. V., Canning, P. Keap1, the cysteine-based mammalian intracellular sensor for electrophiles and oxidants. Arch Biochem Biophys. 617, 84-93 (2017).
  27. Tabana, Y., Babu, D., Fahlman, R., Siraki, A. G., Barakat, K. Target identification of small molecules: An overview of the current applications in drug discovery. BMC Biotechnol. 23 (1), 44(2023).
  28. Schenone, M., Dančík, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
  29. Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
  30. Chakraborty, C., et al. SARS-CoV-2 protein drug targets landscape: A potential pharmacological insight view for the new drug development. Expert Rev Clin Pharmacol. 14 (2), 225-238 (2021).
  31. Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. Target identification for small bioactive molecules: Finding the needle in the haystack. Angew Chem Int Ed Engl. 52 (10), 2744-2792 (2013).
  32. Zhang, X., et al. Highly effective identification of drug targets at the proteome level by pH-dependent protein precipitation. Chem Sci. 13 (42), 12403-12418 (2022).
  33. Zhang, X., et al. A simplified thermal proteome profiling approach to screen protein targets of a ligand. Proteomics. 20, 1900372(2020).
  34. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2022).
  35. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiolacrenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Dokowanie molekularnekom rkowy przesuni cie termicznetest CETSAwi zanie bia ko ligandbia ko Keap1walidacja ma ych cz steczekSDS PAGEdetekcja chemiluminescencyjnainterakcja lek cel terapeutyczny
Przewidywanie docelowego białka i walidacja związku małocząsteczkowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.