Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Strategie mające na celu poprawę hodowli bakterii beztlenowych z przewodu pokarmowego kurczaka

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66570

⸱

10 maja 2024

 ,  ,  , 
1Institute of Animal Science, University of Hohenheim, 2HoLMiR - Hohenheim Center for Livestock Microbiome Research, University of Hohenheim

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół przedstawia dwie metodologie poprawy izolacji beztlenowych bakterii jelitowych. Pierwszy z nich koncentruje się na izolacji różnych bakterii przy użyciu różnych pożywek hodowlanych. Drugi koncentruje się na etapach uprawy określonej grupy drobnoustrojów, ewentualnie asymilując mio-inozytol, aby w pełni zrozumieć jego znaczenie ekologiczne.

Streszczenie

Przewód pokarmowy (GIT) kurczaka to złożony ekosystem zawierający biliony mikrobów, które odgrywają kluczową rolę w fizjologii gospodarza, trawieniu, wchłanianiu składników odżywczych, dojrzewaniu układu odpornościowego i zapobieganiu intruzji patogenów. Aby zapewnić optymalne zdrowie i produktywność zwierząt, konieczne jest scharakteryzowanie tych mikroorganizmów i zrozumienie ich roli. Podczas gdy przewód pokarmowy drobiu zawiera rezerwuar mikroorganizmów o potencjalnych zastosowaniach probiotycznych, większość różnorodności pozostaje niezbadana. Aby lepiej zrozumieć różnorodność mikroorganizmów niehodowanych, konieczne są wspólne wysiłki na rzecz wprowadzenia tych mikroorganizmów do hodowli. Izolacja i hodowla mikroorganizmów kolonizujących przewód pokarmowy pozwala uzyskać powtarzalny materiał, w tym komórki, DNA i metabolity, oferując nowy wgląd w procesy metaboliczne w środowisku. Bez hodowli rola tych organizmów w ich naturalnym środowisku pozostaje niejasna i ograniczona do poziomu opisowego. Naszym celem jest wdrożenie strategii hodowli mających na celu poprawę izolacji różnorodnych drobnoustrojów beztlenowych z przewodu pokarmowego kurcząt, wykorzystując multidyscyplinarną wiedzę z zakresu fizjologii zwierząt, żywienia zwierząt, metagenomiki, biochemii pasz i nowoczesnych strategii hodowli. Ponadto naszym celem jest wdrożenie odpowiednich praktyk w zakresie pobierania próbek, transportu i przygotowywania pożywek, o których wiadomo, że wpływają na powodzenie izolacji. Odpowiednie metodologie powinny zapewniać stałe środowisko beztlenowe, optymalne warunki atmosferyczne, odpowiednią temperaturę inkubacji gospodarza oraz zaspokojenie szczególnych wymagań żywieniowych zgodnie z jego specyficznymi potrzebami. Stosując te metodologie, hodowla nie tylko przyniesie powtarzalne wyniki izolacji, ale także ułatwi procedury izolacji, sprzyjając w ten sposób kompleksowemu zrozumieniu skomplikowanego ekosystemu mikrobiologicznego w przewodzie pokarmowym kurcząt.

Wprowadzenie

Odrodzenie hodowli w badaniu mikroorganizmów uzupełniło spostrzeżenia z badań metagenomicznych, dostarczając materiału do testowania hipotez metabolicznych, które wcześniej były tylko częściowo opisane i skwantyfikowane. Hodowla bakterii jelitowych dostarcza materiału do podtrzymania przyszłych badań nad interakcjami między mikroorganizmami a gospodarzem, ułatwia ukierunkowane badania kolonizacji i ulepsza badania interakcji molekularnych1,2,3. Zdobyta wiedza na temat mikroorganizmów przewodu pokarmowego przyczyniła się do poprawy żywienia i dobrostanu zwierząt, wpływając na formuły dietetyczne i zwiększając dostępność składników odżywczych4. Wiedza ta przyczyniła się do poprawy wydajności w zakresie wykorzystania interakcji prebiotycznych i probiotycznych. Potrzebne są jednak dogłębne badania, aby w pełni zrozumieć, w jaki sposób warunki biochemiczne i fizykochemiczne oddziałują na siebie i wpływają na profil mikrobiologiczny i jego strukturę. Aby osiągnąć ten cel, uprawa pozostaje niezbędna, służąc jako kluczowe narzędzie do zagłębienia się w skomplikowaną dynamikę społeczności drobnoustrojów w środowisku żołądkowo-jelitowym.

W przeciwieństwie do obszernych badań nad mikroorganizmami związanych z ludzkimi jelitami i klinicznych badań nad uprawą5, raporty o mikroorganizmach pochodzących od zwierząt gospodarskich wykorzystywały głównie ograniczony zakres pożywek do izolacji, potencjalnie ograniczając różnorodność izolatów2,3. Co więcej, ulepszenia w formułowaniu pożywek i badania nad interakcją fosforanów i soli z agarem, jak wyjaśnili Tanaka i wsp. oraz Kawasaki i wsp., nie zostały jeszcze wdrożone w badaniach mikrobiomu jelitowego6,7,8,9.

Uważany za substancję półpodstawkową, mio-inozytol (MI) odgrywa kluczową rolę w różnych procesach metabolicznych, fizjologicznych i regulacyjnych10,11. Obejmują one udział w mineralizacji kości, rozwoju mięśni piersiowych, sygnalizacji komórkowej, promowaniu owulacji i płodności, modulacji sygnalizacji neuronalnej oraz działanie jako regulator homeostazy glukozy i regulacji insuliny u drobiu10,11. MI odgrywa rolę prekursora poprzez jego wzajemną konwersję w kluczowych procesach biochemicznych, w tym w procesie glikolizy/glukoneogenezy, cyklu kwasu cytrynowego i szlaku pentozofosforanu. Dodatkowo służy również jako prekursor fosfatydyloinozytolu (PI), który jest dalej zaangażowany w metabolizm glicerofosfolipidów12. Niewiele badań wykazało, że metabolizowanie MI prowadzi do zmian w stabilności kości i wydajności zwierząt. Obejmuje to poprawę współczynnika wykorzystania paszy i przyrostu masy ciała, pokazując jej wpływ po wchłonięciu i wykorzystaniu w zwierzęciu13,14. Jednak szlak metabolizacji MI i jego wpływ na metabolizm drobiu pozostaje nieuchwytny15. Co więcej, niewiele badań sugeruje potencjalną rolę bakterii w wykorzystaniu MI, szczególnie w regionach o wysokiej aktywności metabolicznej, takich jak jelicie kręte16,17,18,19.

Wysiłki nad hodowlą bakterii z GIT zwierząt mają na celu ulepszenie genomicznych baz danych i rozszerzenie badań, weryfikację hipotez opartych na genomie i zrozumienie ekologicznego znaczenia tych zasobów20. Celem tej pracy jest ulepszenie strategii hodowli bakterii z przewodu pokarmowego kurczaka w celu zwiększenia różnorodności izolacji i ukierunkowanej izolacji grupy ekologicznej będącej przedmiotem zainteresowania, która asymiluje i metabolizuje mio-inozytol.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół jest podzielony na cztery części: pobieranie próbek, izolacja bakterii, identyfikacja i konserwacja uzyskanych mikroorganizmów. Zatwierdzone zezwolenia na wykorzystanie zwierząt zostały wydane przez komisję etyczną Regierungspräsidium Tübingen w Niemczech o numerach homologacji HOH50/17 TE i HOH67-21TE.

1. Pobieranie próbek do hodowli bakterii beztlenowych

  1. Utrzymanie zwierząt
    1. Utrzymywanie zwierząt na komercyjnej diecie opartej na kukurydzy ad libitum (Legehennen/ Junghennenfutter; patrz Tabela Materiałów) i trzymanie ich w domu w stacji doświadczalnej Uniwersytetu w Hohenheim.
  2. Przygotowanie rozwiązania transportowego
    1. Na 1-2 dni przed pobraniem próbki przygotuj roztwór transportowy zawierający 1,00 g/l tioglikolanu sodu, 0,10 g/l dwuwodnego chlorku wapnia (CaCl 2,2H2O) oraz 0,5% cysteiny21 i 0,1% roztworu rezazuryny sodu.
    2. Doprowadzić pH pożywki do 6,0 ± 0,2 w temperaturze 25 °C i w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut pod ciśnieniem 15 psi.
    3. Po ostygnięciu pożywki do temperatury około 50 °C, zastąpić nakrętkę butelki z pożywką sterylną nakrętką z otworem i gumowym korkiem. Włożyć dwie sterylne igły strzykawki do gumowego korka w różnych pozycjach i przymocować hydrofobowy filtr strzykawkowy (0,22 μm) do jednej z igieł.
      UWAGA: Wymiana nasadek oraz włożenie igieł i filtra powinno odbywać się wewnątrz laminarnego przepływu powietrza (LAF).
    4. Podłącz rurkę ze 100% azotem (N2) do filtra strzykawkowego i wlewaj gazN2 do butelki przez 10 minut przy 1 psi.
    5. Następnie przenieść butelkę z pożywką i sterylne probówki Hungate do stacji beztlenowej i aseptycznie przenieść pożywkę transportową do probówek Hungate. Całkowicie napełnij rurki Hungate do góry, upewniając się, że w środku nie ma powietrza.
  3. Ubój i pobieranie próbek
    1. Podczas procesu uboju należy utrzymywać warunki aksoniczne, aby uniknąć zakażenia, używając rękawiczek, maski, plastikowego fartucha laboratoryjnego i sterylnych narzędzi chirurgicznych przez cały czas trwania procedury. Ponadto należy odpowiednio zdezynfekować stół roboczy przy użyciu etanolu i chusteczek, aby utrzymać sterylne środowisko.
    2. W stacji doświadczalnej znieczulij 10, 50-tygodniowe kury nioski Lohmann za pomocą butelkowanej mieszaniny gazów składającej się z 35% N2, 35% CO2 i 30% O2 i natychmiast odetnij im głowy.
      UWAGA: Znieczulenie i poświęcenie powinno być przeprowadzone przez technika zwierząt laboratoryjnego dobrze zorientowanego w dobrostanie zwierząt i procedurach naukowych. Gwarantuje to, że procedura poświęcania jest zgodna z normami etycznymi, przepisami prawnymi i wytycznymi bezpieczeństwa.
    3. Przed przystąpieniem do sekcji przewodu pokarmowego należy zabezpieczyć wymagany odcinek jelita, a mianowicie plon, jelito kręte i jelito czcze, za pomocą sterylnego hemostatu Kelly'ego (znanego również jako zacisk Kelly'ego; Rysunek 1).
      UWAGA: Sekcja zwierzęcia powinna być wykonana przez lekarza weterynarii lub dobrze wyszkoloną osobę, która jest zaznajomiona z anatomią kurczaków.
    4. Przenieś każdą pojedynczą sekcję do osobnej rurki Hungate wypełnionej medium transportowym i prawidłowo zamknij pokrywę. W razie potrzeby dodaj dodatkowe medium transportowe do rury, aby wyprzeć pozostałe powietrze.
      UWAGA: Przeniesienie sekcji jest kluczowym krokiem i konieczne jest zminimalizowanie wszelkich opóźnień lub otwarcia sekcji, aby zapobiec długotrwałemu narażeniu na tlen
  4. Transport próbki
    1. Z transportem tub Hungate należy obchodzić się ostrożnie, umieszczając je w styropianowym pudełku, aby zapobiec ryzyku pęknięcia. W przypadku gdy temperatura zewnętrzna jest niższa niż 15 °C, należy utrzymać temperaturę próbki za pomocą ciepłych opakowań. Upewnij się, że czas transportu nie przekracza 4 godzin.
    2. Ostrożnie przenieś probówki do wnętrza stacji beztlenowej w celu dalszego procesu.

2. Izolacja bakterii beztlenowych

  1. Przygotowanie pożywek hodowlanych
    UWAGA: Przedstawiona metoda przedstawia różne rozważania dotyczące przygotowania pożywek hodowlanych. Tabela 1 ilustruje przykładowy podział roztworów do różnorodnej izolacji mikroorganizmów.
    1. Składniki preparatu pożywki, który ma być użyty, podzielić na cztery grupy roztworów: źródło węgla, źródło azotu, agar i źródło mineralne. W przypadku multimediów, takich jak infuzja mózg-serce (BHI), separacja nie zawsze jest możliwa (patrz przykład pożywki 2 w tabeli 1). W takich przypadkach należy zapewnić oddzielne przygotowanie i autoklawowanie agaru lub dodatkowych roztworów.
    2. Przygotować roztwór węglowodanowy w 1/4 końcowej wymaganej objętości pożywki, np. w 250 ml na całkowitą objętość 1 litra pożywki. Postępując zgodnie z przykładem pożywki 1 w tabeli 1, rozpuścić 2 g dekstrozy i 0,5 g skrobi w 250 ml wody destylowanej.
    3. Przygotować roztwór białkowy w 1/4 końcowej wymaganej objętości pożywki, np. w 250 ml na całkowitą objętość 1 litra pożywki. Postępując zgodnie z przykładem pożywki 1 w tabeli 1, rozpuścić 10 g peptonu w 250 ml wody destylowanej.
    4. Przygotować roztwór agaru w 45% do 48% końcowej objętości pożywki, np. w 450 do 480 ml na całkowitą objętość 1 l pożywki. Postępując zgodnie z przykładem mediu 1 w tabeli 1, rozpuść 15 g agaru w 450 do 480 ml wody destylowanej.
    5. Przygotować roztwór mineralny w lewej objętości pożywki wynoszącej od 20 do 50 ml, gdy końcowa objętość pożywki wynosi 1 l. Postępując zgodnie z przykładem pożywki 1 w tabeli 1, rozpuścić 0,5 gK2HPO4 w 20 do 50 ml wody destylowanej.
    6. Roztwór białkowy, roztwór agaru i roztwory mineralne należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut pod ciśnieniem 21 psi. Roztwór węglowodanowy należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 110 °C przez 30 minut przy ciśnieniu 5 psi.
    7. Gdy wszystkie roztwory są sterylne, schłodzić je do temperatury 50 °C i wymieszać w sterylnych warunkach do odpowiedniej szklanej butelki z autoklawizowanym kremem z nakrętką z otworem i gumowym korkiem. Następnie wykonaj kroki 1.2.3 i 1.2.4.
      UWAGA: Mieszanie roztworów powinno odbywać się wewnątrz LAF.
    8. Po wymieszaniu i odgazowaniu pożywki przelać do sterylnych szalek Petriego lub probówek wewnątrz stacji beztlenowej.
  2. Izolacja bakterii beztlenowych
    UWAGA: Poniższa metodologia wyjaśnia strategię izolacji w celu hodowli szerokiej gamy bakterii beztlenowych, które zamieszkują przewód pokarmowy kurczaków.
    1. Przenieść próbki do stacji beztlenowej zawierającej mieszaninę gazów w butlach składającą się z 80% N2 (poziom jakości 5,0), 15 % CO2 (poziom jakości 3,0) i 5 % H2 (poziom jakości 5,0) dostarczonej przez komercyjnego dostawcę (patrz tabela materiałów).
    2. Wewnątrz stacji beztlenowej przenieś wycinek z probówki do zawiesiny na sterylną szalkę Petriego za pomocą autoklawowanych kleszczy.
    3. Ostrożnie rozciąć skrawek za pomocą sterylnych nożyczek i za pomocą sterylnej szpatułki wyekstrahować około 1 g zawartości trawionej z odcinka jelitowego.
      UWAGA: Po pobraniu 1 g zawartości trawienia, złomować i przenieść pozostały train do odpowiedniej probówki z pożywką transportową w celu docelowej izolacji.
    4. Wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenie przy użyciu sterylnego roztworu fizjologicznego (0,85% NaCl).
    5. Dozować 0,1 ml próbki z rozcieńczeń 10−4 do 10−7 do sterylnych i odpowiednio oznakowanych szalek Petriego, pożywek i rozprowadzić sterylną szpatelką Drigalskiego.
    6. Inkubować płytki wewnątrz stacji beztlenowej przez 24–48 godzin w temperaturze 39 °C.
      UWAGA: Podczas inkubacji w inkubatorze należy przenieść szalki Petriego do hermetycznego pudełka przed wyjęciem szalek Petriego ze stacji beztlenowej.
  3. Ukierunkowana izolacja określonej grupy bakterii.
    UWAGA: Poniższa metodologia wyjaśnia strategię izolacji bakterii beztlenowych, które mogą potencjalnie asymilować MI.
    1. W celu przygotowania podłoża wzbogacającego, minimalnej pożywki agarowej i minimalnej pożywki bulionowej, należy postępować zgodnie ze składem określonym w Tabeli 2 i Tabeli 3, przestrzegając wytycznych przedstawionych w kroku 2.1. Dodać 0,2 ml/l filtracyjno-sterylnej mieszaniny witamin (zgodnie z opisem w kompozycji) do minimalnej ilości podłoża agarowego i minimalnej ilości bulionu po procesie autoklawowania.
    2. Homogenizować początkową próbkę za pomocą mieszalnika wirowego przez 10-15 s. Następnie przenieść homogenizowaną próbkę do probówki zawierającej pożywkę wzbogacającą z szybkością 5% (np. jeśli objętość pożywki wzbogacającej wynosi 10 ml, zaszczepić 0,5 ml homogenizowanej próbki) za pomocą pipety. Świeżo zaszczepioną próbkę inkubować przez 24 godziny w temperaturze 39 °C w stacji beztlenowej.
    3. Po inkubacji dokładnie wymieszać wzbogaconą probówkę, używając mieszadła wirowego przez 10-15 s lub pipetując. Następnie przenieść wymieszaną próbkę do sterylnego minimalnego podłoża bulionowego z szybkością 5%, a następnie inkubować przez 24 godziny w temperaturze 39 °C.
    4. Próbki należy seryjnie rozcieńczyć w sterylnym roztworze soli fizjologicznej (tj. 0,85% NaCl), zaczynając od rozcieńczenia w stosunku 1:10 i kontynuując do rozcieńczenia w stosunku 1:1000. Po każdym rozcieńczeniu należy dokładnie homogenizować próbkę w temperaturze pokojowej, używając mieszalnika wirowego przez 10-15 s lub pipetując.
    5. W sterylnych i beztlenowych warunkach przenieść 1 ml rozcieńczonej próbki na szalkę Petriego. Wlej około 15-20 ml stopionego minimalnego podłoża agarowego na szalkę Petriego i delikatnie obracaj poziomo, aby uzyskać równomierne wymieszanie.
      UWAGA: Temperatura agaru powinna wynosić około 45 °C, aby nie było żadnych grudek i aby zapobiec zabiciu próbki przez ciepło. Nalewanie podłoża powinno odbywać się w warunkach beztlenowych.
    6. Po zestaleniu agaru inkubować szalki Petriego przez 24 godziny w temperaturze 39 °C w pozycji odwróconej w stacji beztlenowej lub w inkubatorze. Po 24 godzinach inkubacji kolonie bakterii pojawiają się jako wyraźne, małe kropki osadzone w pożywce.
      UWAGA: Podczas inkubacji szalki Petriego w inkubatorze, przed wyjęciem ich ze stacji beztlenowej przenieś płytki do hermetycznego pudełka.
    7. Używając sterylnej pętli zaszczepiającej, ostrożnie wybierz pojedynczą kolonię bakteryjną i przenieś ją do oddzielnych probówek z minimalną ilością bulionu.
    8. Po przeniesieniu kolonii do pojedynczych probówek, zaszczepione probówki inkubować beztlenowo w temperaturze 39 °C przez 24 godziny. Po inkubacji zwiększone zmętnienie pożywki będzie wskazywać na wzrost bakterii.
      UWAGA: Za każdym razem przed przeniesieniem butelek z pożywką do stacji beztlenowej należy je odgazować, jak wspomniano wcześniej w kroku 2.1.7. Kroki 2-8 należy wykonać wewnątrz stacji beztlenowej.

3. Identyfikacja bakterii beztlenowych

  1. Ekstrahuj DNA z kultur o czasie inkubacji od 24 godzin do 48 godzin, zgodnie z protokołem lizy enzymatycznej22.
  2. Odwirować kulturę przy 3000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant za pomocą pipety.
  3. Przemyć osad 2x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), zawieszając w 2 ml PBS. Homogenizować próbkę za pomocą mieszalnika wirowego przez 10-15 s. Powtórzyć etap wirowania przy 3000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie usunąć sklarowany osad.
  4. Zawiesić osad komórkowy w 0,2 ml PBS o pH 7,4 i inkubować w temperaturze 50 °C z 1 U lizozymu i 1 U rekombinowanej mutanolizyny przez 30 minut, a następnie inkubować przez 30 minut w temperaturze 56 °C z 5 μl proteinazy K.
  5. Dodać 4 μl jednostki RNAseA do każdej probówki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min. Probówki wirować przy 21168 x g przez 1 min. Odzyskać supernatant i oczyścić za pomocą kulek magnetycznych.
  6. Przeprowadzić kwantyfikację DNA metodą fluorometryczną zgodnie z instrukcjami producenta zestawu do kwantyfikacji dsDNA (wymienionego w Tabeli Materiałów).
    UWAGA: Wyekstrahowane DNA można przechowywać w temperaturze -20 °C.
  7. Użyj próbek DNA jako matryc do amplifikacji PCR przy użyciu starterów 27f i 1492r23 zgodnie z warunkami przedstawionymi w Tabeli 4. Aby upewnić się, że reakcja PCR zakończyła się sukcesem, należy wykonać elektroforezę w żelu agarozowym zgodnie ze standardową metodą elektroforezy w żelu agarozowym przy użyciu buforu 1X TAE i 1% agarozy.
  8. Oczyść produkt PCR za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania PCR, aby pozbyć się starterów, nukleotydów i innych zanieczyszczeń.
  9. Wyślij produkt PCR do sekwencjonowania Sangera do odpowiedniego dostawcy usług sekwencjonowania.
    UWAGA: Wraz z sekwencjonowaniem usługodawcy mogą również świadczyć usługi obejmujące oczyszczanie produktu PCR za dodatkową opłatą. Produkty PCR mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C lub -20 °C.
  10. Po otrzymaniu wyników sekwencjonowania w formacie FASTA wraz z plikiem chromatogramu (zwykle w formacie ABI lub SCF), należy przeanalizować sekwencje za pomocą narzędzi bioinformatycznych. Użyj oprogramowania do analizy sekwencji, aby otworzyć i zobrazować plik chromatogramu.
    UWAGA: Ogólna jakość chromatogramu została sprawdzona w oparciu o wyraźne i wyraźne piki bez nadmiernego szumu
  11. Porównaj amplikony i dopasuj do blisko spokrewnionych gatunków w nieredundantnej bazie danych rybosomalnego RNA GenBank 16S z National Center for Biotechnology Information (NCBI) za pomocą narzędzia Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 24 i bazy danych genomu Refseq.
    UWAGA: Korzystając z NCBI BLAST, skopiuj całą sekwencję FASTA w pasku wyszukiwania.

4. Zachowanie czystych kultur bakteryjnych

  1. Zebrać komórki bakteryjne z dobrze wyhodowanej kultury trwającej od 24 godzin do 48 godzin przez odwirowanie (3000 x g przez 10 minut) lub pobranie biomasy z kultury aksenicznej na płytce.
  2. Zawiesić kulturę bakteryjną w odpowiednim sterylnym roztworze izotonicznym (NaCl 0,85%) i przemyć przez odwirowanie roztworu bakteryjnego o sile 3000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad bakteryjny w małej objętości sterylnego roztworu izotonicznego (0,5 ml). Aby zapewnić usunięcie wszelkich pozostałości podłoża wzrostowego, powtórz 1x.
  4. Zawiesić osad w 0,8 ml do 1 ml sterylnego koncentratu pożywki hodowlanej i homogenizować za pomocą mieszalnika wirowego przez 5-10 s lub delikatnie pipetując.
  5. Przenieś 0,5 ml zawiesiny komórkowej do sterylnego i odpowiednio oznakowanego kriowialnego o pojemności 1 ml i dodaj 0,5 ml autoklawowanego 50% roztworu glicerolu. Homogenizuj kriowial za pomocą mieszalnika wirowego i przechowuj w zamrażarce w temperaturze -80 °C (Rysunek 3).
    UWAGA: Wszystkie czynności przed przeniesieniem kriowiali do temperatury -80 °C należy wykonać wewnątrz stacji beztlenowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Monitorowanie warunków beztlenowych podczas transportu
Ze względu na dodatek rezazuryny sodowej, zmiana barwy roztworu transportowego na różową przed przeniesieniem próbki do probówki wskazuje na zaburzenie lub utratę warunków beztlenowych. W związku z tym probówki wykazujące zmianę barwy nie były wykorzystywane podczas transportu; używano wyłącznie probówek bez zmiany barwy, co przedstawiono na Rysunku 2.

Analiza wyników sekwencjonowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Celem tej metodologii jest poprawa hodowli beztlenowych bakterii jelitowych poprzez poprawę jakości warunków pobierania próbek, przetwarzania próbek oraz formułowania i przygotowania pożywek. Warunki fizykochemiczne próbek (pH, dostępność węgla, azotu i kofaktorów) muszą być brane pod uwagę przy formułowaniu pożywek hodowlanych. W porównaniu z kolekcjami kultur bakteryjnych uzyskanymi od świń, ludzi lub myszy 1,26,27 raport na t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych lub osobistych związanych z pracą opisaną w niniejszym skrypcie.

Podziękowania

Autorzy doceniają program partnerski Rehovot-Hohenheim oraz Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SE 2059/7-2. Projekt ten został opracowany w ramach jednostki badawczej P-FOWL (FOR 2601).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowyVWR20104.334
AgarVWR97064-332
Chlorek amonuCarl RothP726.1
Stacja beztlenowaDon Whitley ScientificA35 HEPA
Kwas masłowyMerck8.0045.1000
Chlorek wapnia dwuwodny VWR97061-904
WirówkaEppendorf5424R
Lizozym kurczaka (Muramidaza)VWR1.05281.0010
CysteinaVWR97061-204
DekstrozaVWR90000-908
Wodorofosforan dipotasuCarl RothP749.1
EDTACarl Roth8043.2
Legehennen/ JunghennenfutterDeutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Dü sseldorf,Niemcy-MagAttract
HMW DNA KitQiagen67563
Chlorek magnezuCarl Roth2189.1
Mieszanina gazów (80% N2 (poziom jakości 5.0), 15% CO2 (poziom jakości 3.0) i 5% H2 (poziom jakości 5.0))Westfalen Gase GmbH,Niemcy-Mutanolysin
, rekombinowany (liofilizat)A& A Biotechnologia1017-10L
Myo-inozytolCarl Roth4191.2
PBS 1XChemSolute8418.01
Diwodorofosforan potasuCarl Roth3904.2
Kwas propionowyCarl Roth6026.1
QuantiFluor dsDNA SystemPromegaE2671
RNAza A QIAGEN Rybonukleaza A (RNaza A) 19101
Chlorek soduVWR27800.291
Rezazuryna sodowaVWR85019-296
Tioglikolan soduSigma-Aldrich102933
Pepton sojowy, wolny od GMO, wolny od zwierzątVWR97064-186
TermocyklerBio-RadT100
TryptonCarl Roth8952.1
Tween80Carl Roth9139.2
Mieszanka witamin (suplement)VWR968290NL
VortexStar Lab07127/92930
Ekstrakt z drożdżyCarl Roth9257.05
β-D-fruktozaVWR53188-23-1

Bibliografia

  1. Wylensek, D., et al. A collection of bacterial isolates from the pig intestine reveals functional and taxonomic diversity. Nat Comm. 11 (1), 6389(2020).
  2. Medvecky, M., et al. Whole genome sequencing and function prediction of 133 gut anaerobes isolated from chicken caecum in pure cultures. BMC Geno. 19 (1), 561(2018).
  3. Zenner, C., et al. Early-life immune system maturation in chickens using a synthetic community of cultured gut bacteria. mSystems. 6 (3), 1110-1128 (2021).
  4. Borda-Molina, D., et al. Effects on the ileal microbiota of phosphorus and calcium utilization, bird performance, and gender in japanese quail. Animals. 10 (5), 885(2020).
  5. Bonnet, M., Lagier, J. C., Raoult, D., Khelaifia, S. Bacterial culture through selective and non-selective conditions: The evolution of culture media in clinical microbiology. New Micro New Infect. 34, 100622(2020).
  6. Tanaka, T., et al. A hidden pitfall in the preparation of agar media undermines microorganism cultivability. Appl Environ Microbiol. 80 (24), 7659-7666 (2014).
  7. Kawasaki, K., Kamagata, Y. Phosphate-catalyzed hydrogen peroxide formation from agar, gellan, and κ-carrageenan and recovery of microbial cultivability via catalase and pyruvate. Appl Environ Microbiol. 83 (21), e01366-e01417 (2017).
  8. Kato, S., et al. Isolation of previously uncultured slow-growing bacteria by using a simple modification in the preparation of agar media. Appl Environ Microbiol. 84 (19), e00807-e00818 (2018).
  9. Lewis, W. H., Tahon, G., Geesink, P., Sousa, D. Z., Ettema, T. J. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nat Rev Microbiol. 19 (4), 225-240 (2021).
  10. Su, X. B., Ko, A. L. A., Saiardi, A. Regulations of myo-inositol homeostasis: Mechanisms, implications, and perspectives. Adv Biol Regul. 87, 2212-4926 (2023).
  11. Monastra, G., Dinicola, S., Unfer, V. Physiological and pathophysiological roles of inositols in A clinical guide to inositols. , Elsevier. (2023).
  12. Kanehisa, M. Toward understanding the origin and evolution of cellular organisms. Prot Sci. 28 (11), 1947-1951 (2019).
  13. Lee, S. A., Nagalakshmi, D., Raju, M. V., Rao, S. V. R., Bedford, M. R. Effect of phytase superdosing, myo-inositol and available phosphorus concentrations on performance and bone mineralisation in broilers. Animal Nutri. 3 (3), 247-251 (2017).
  14. Farhadi, D., Karimi, A., Sadeghi, G., Rostamzadeh, J., Bedford, M. Effects of a high dose of microbial phytase and myo-inositol supplementation on growth performance, tibia mineralization, nutrient digestibility, litter moisture content, and foot problems in broiler chickens fed phosphorus-deficient diets. Poultry Sci. 96 (10), 3664-3675 (2017).
  15. Weber, M., Fuchs, T. M. Metabolism in the niche: A large-scale genome-based survey reveals inositol utilization to be widespread among soil, commensal, and pathogenic bacteria. Microbio Spect. 10 (4), e02013-e02022 (2022).
  16. Kawsar, H. I., Ohtani, K., Okumura, K., Hayashi, H., Shimizu, T. Organization and transcriptional regulation of myo-inositol operon in Clostridium perfringens. FEMS Microbiol Lett. 235 (2), 289-295 (2004).
  17. Hellinckx, J., Heermann, R., Felsl, A., Fuchs, T. M. High binding affinity of repressor IolR avoids costs of untimely induction of myo-inositol utilization by Salmonella Typhimurium. Sci Rep. 7 (1), 44362(2017).
  18. Yebra, M. J., et al. Identification of a gene cluster enabling Lactobacillus casei BL23 to utilize myo-inositol. Appl Environ Microbiol. 73 (12), 3850-3858 (2007).
  19. Zhang, W. Y., et al. Comparative analysis of iol clusters in Lactobacillus casei strains. World J Microbiol Biotechnol. 26, 1949-1955 (2010).
  20. Labeda, D. P. Bergey's manual of systematic bacteriology. , Springer. (2001).
  21. Peterson, L. R. Effect of media on transport and recovery of anaerobic bacteria. Clin Infect Dis. 25, 134-136 (1997).
  22. Ulrich, R. L., Hughes, T. A. A rapid procedure for isolating chromosomal DNA from Lactobacillus species and other Gram-positive bacteria. Lett Appl Microbiol. 32 (1), 52-56 (2008).
  23. Relman, D. Universal bacterial 16s rRNA amplification and sequencing. Diag Mol Microbiol. , 489-495 (1993).
  24. Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: A new generation of protein database search programs. Nuc Acid Res. 25 (17), 3389-3402 (1997).
  25. Rios-Galicia, B., et al. Novel taxonomic and functional diversity of eight bacteria from the upper digestive tract of chicken. Int J Syst Evol Microbiol. 74 (1), 006210(2024).
  26. Lagier, J. C., et al. Microbial culturomics: Paradigm shift in the human gut microbiome study. Clin Microbiol Infect. 18 (12), 1185-1193 (2012).
  27. Lagkouvardos, I., et al. The mouse intestinal bacterial collection (mibc) provides host-specific insight into cultured diversity and functional potential of the gut microbiota. Nat Microbiol. 1 (10), 1-15 (2016).
  28. Gilroy, R., et al. Extensive microbial diversity within the chicken gut microbiome revealed by metagenomics and culture. PeerJ. 9, e10941(2021).
  29. Huang, P., et al. The chicken gut metagenome and the modulatory effects of plant-derived benzylisoquinoline alkaloids. Microbiome. 6 (1), 1-17 (2018).
  30. Zhang, Y., et al. Improved microbial genomes and gene catalog of the chicken gut from metagenomic sequencing of high-fidelity long reads. GigaScience. 11, 116(2022).
  31. Segura-Wang, M., Grabner, N., Koestelbauer, A., Klose, V., Ghanbari, M. Genome-resolved metagenomics of the chicken gut microbiome. Front Microbiol. 12, 726923(2021).
  32. Borrelli, R. C., Fogliano, V., Monti, S. M., Ames, J. M. Characterization of melanoidins from a glucose-glycine model system. Euro Food Res Technol. 215, 210-215 (2002).
  33. Ferrario, C., et al. Untangling the cecal microbiota of feral chickens by culturomic and metagenomic analyses. Environ Microbiol. 19 (11), 4771-4783 (2017).
  34. Crhanova, M., et al. Systematic culturomics shows that half of chicken caecal microbiota members can be grown in vitro except for two lineages of clostridiales and a single lineage of bacteroidetes. Microorganisms. 7 (11), 496(2019).
  35. Rubio, L., et al. Lactobacilli counts in crop, ileum and caecum of growing broiler chickens fed on practical diets containing whole or dehulled sweet lupin (lupinus angustifolius) seed meal. British Poult Sci. 39 (3), 354-359 (1998).
  36. Bjerrum, L., et al. Microbial community composition of the ileum and cecum of broiler chickens as revealed by molecular and culture-based techniques. Poult Sci. 85 (7), 1151-1164 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Mikrobiota jelitowa kurcząthodowla bakteriiizolacja drobnoustrojówrozcieńczanie seryjnestacja beztlenowametabolizm mio-inozytoluminimalne podłoże agaroweizolacja kolonii bakteryjnych
Strategie mające na celu poprawę hodowli bakterii beztlenowych z przewodu pokarmowego kurczaka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.