Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Strategie mające na celu poprawę hodowli bakterii beztlenowych z przewodu pokarmowego kurczaka

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66570

⸱

10 maja 2024

 ,  ,  , 

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół przedstawia dwie metodologie poprawy izolacji beztlenowych bakterii jelitowych. Pierwszy z nich koncentruje się na izolacji różnych bakterii przy użyciu różnych pożywek hodowlanych. Drugi koncentruje się na etapach uprawy określonej grupy drobnoustrojów, ewentualnie asymilując mio-inozytol, aby w pełni zrozumieć jego znaczenie ekologiczne.

Streszczenie

Przewód pokarmowy (GIT) kurczaka to złożony ekosystem zawierający biliony mikrobów, które odgrywają kluczową rolę w fizjologii gospodarza, trawieniu, wchłanianiu składników odżywczych, dojrzewaniu układu odpornościowego i zapobieganiu intruzji patogenów. Aby zapewnić optymalne zdrowie i produktywność zwierząt, konieczne jest scharakteryzowanie tych mikroorganizmów i zrozumienie ich roli. Podczas gdy przewód pokarmowy drobiu zawiera rezerwuar mikroorganizmów o potencjalnych zastosowaniach probiotycznych, większość różnorodności pozostaje niezbadana. Aby lepiej zrozumieć różnorodność mikroorganizmów niehodowanych, konieczne są wspólne wysiłki na rzecz wprowadzenia tych mikroorganizmów do hodowli. Izolacja i hodowla mikroorganizmów kolonizujących przewód pokarmowy pozwala uzyskać powtarzalny materiał, w tym komórki, DNA i metabolity, oferując nowy wgląd w procesy metaboliczne w środowisku. Bez hodowli rola tych organizmów w ich naturalnym środowisku pozostaje niejasna i ograniczona do poziomu opisowego. Naszym celem jest wdrożenie strategii hodowli mających na celu poprawę izolacji różnorodnych drobnoustrojów beztlenowych z przewodu pokarmowego kurcząt, wykorzystując multidyscyplinarną wiedzę z zakresu fizjologii zwierząt, żywienia zwierząt, metagenomiki, biochemii pasz i nowoczesnych strategii hodowli. Ponadto naszym celem jest wdrożenie odpowiednich praktyk w zakresie pobierania próbek, transportu i przygotowywania pożywek, o których wiadomo, że wpływają na powodzenie izolacji. Odpowiednie metodologie powinny zapewniać stałe środowisko beztlenowe, optymalne warunki atmosferyczne, odpowiednią temperaturę inkubacji gospodarza oraz zaspokojenie szczególnych wymagań żywieniowych zgodnie z jego specyficznymi potrzebami. Stosując te metodologie, hodowla nie tylko przyniesie powtarzalne wyniki izolacji, ale także ułatwi procedury izolacji, sprzyjając w ten sposób kompleksowemu zrozumieniu skomplikowanego ekosystemu mikrobiologicznego w przewodzie pokarmowym kurcząt.

Wprowadzenie

Odrodzenie hodowli w badaniu mikroorganizmów uzupełniło spostrzeżenia z badań metagenomicznych, dostarczając materiału do testowania hipotez metabolicznych, które wcześniej były tylko częściowo opisane i skwantyfikowane. Hodowla bakterii jelitowych dostarcza materiału do podtrzymania przyszłych badań nad interakcjami między mikroorganizmami a gospodarzem, ułatwia ukierunkowane badania kolonizacji i ulepsza badania interakcji molekularnych1,2,3. Zdobyta wiedza na temat mikroorganizmów przewodu pokarmowego przyczyniła się do poprawy żywienia i dobrostanu zwierząt, wpływając na ....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół jest podzielony na cztery części: pobieranie próbek, izolacja bakterii, identyfikacja i konserwacja uzyskanych mikroorganizmów. Zatwierdzone zezwolenia na wykorzystanie zwierząt zostały wydane przez komisję etyczną Regierungspräsidium Tübingen w Niemczech o numerach homologacji HOH50/17 TE i HOH67-21TE.

1. Pobieranie próbek do hodowli bakterii beztlenowych

  1. Utrzymanie zwierząt
    1. Utrzymywanie zwierząt na komercyjnej diecie opartej na kukurydzy ad libitum (Legehennen/ Junghennenfutter; patrz Tabela Materiałów) i trzymanie ich w domu w stacji doświadczalnej Uniwersytetu w....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Monitorowanie warunków beztlenowych podczas transportu
Ze względu na dodatek rezazuryny sodowej, zmiana barwy roztworu transportowego na różową przed przeniesieniem próbki do probówki wskazuje na zaburzenie lub utratę warunków beztlenowych. W związku z tym probówki wykazujące zmianę barwy nie były wykorzystywane podczas transportu; używano wyłącznie probówek bez zmiany barwy, co przedstawiono na Rysunku 2.

Analiza wyników sekwencjonowa.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Celem tej metodologii jest poprawa hodowli beztlenowych bakterii jelitowych poprzez poprawę jakości warunków pobierania próbek, przetwarzania próbek oraz formułowania i przygotowania pożywek. Warunki fizykochemiczne próbek (pH, dostępność węgla, azotu i kofaktorów) muszą być brane pod uwagę przy formułowaniu pożywek hodowlanych. W porównaniu z kolekcjami kultur bakteryjnych uzyskanymi od świń, ludzi lub myszy 1,26,27 raport na t.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych lub osobistych związanych z pracą opisaną w niniejszym skrypcie.

Podziękowania

Autorzy doceniają program partnerski Rehovot-Hohenheim oraz Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SE 2059/7-2. Projekt ten został opracowany w ramach jednostki badawczej P-FOWL (FOR 2601).

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowyVWR20104.334
AgarVWR97064-332
Chlorek amonuCarl RothP726.1
Stacja beztlenowaDon Whitley ScientificA35 HEPA
Kwas masłowyMerck8.0045.1000
Chlorek wapnia dwuwodny VWR97061-904
WirówkaEppendorf5424R
Lizozym kurczaka (Muramidaza)VWR1.05281.0010
CysteinaVWR97061-204
DekstrozaVWR90000-908
Wodorofosforan dipotasuCarl RothP749.1
EDTACarl Roth8043.2
Legehennen/ JunghennenfutterDeutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Dü sseldorf,Niemcy-MagAttract
HMW DNA KitQiagen67563
Chlorek magnezuCarl Roth2189.1
Mieszanina gazów (80% N2 (poziom jakości 5.0), 15% CO2 (poziom jakości 3.0) i 5% H2 (poziom jakości 5.0))Westfalen Gase GmbH,Niemcy-Mutanolysin
, rekombinowany (liofilizat)A& A Biotechnologia1017-10L
Myo-inozytolCarl Roth4191.2
PBS 1XChemSolute8418.01
Diwodorofosforan potasuCarl Roth3904.2
Kwas propionowyCarl Roth6026.1
QuantiFluor dsDNA SystemPromegaE2671
RNAza A QIAGEN Rybonukleaza A (RNaza A) 19101
Chlorek soduVWR27800.291
Rezazuryna sodowaVWR85019-296
Tioglikolan soduSigma-Aldrich102933
Pepton sojowy, wolny od GMO, wolny od zwierzątVWR97064-186
TermocyklerBio-RadT100
TryptonCarl Roth8952.1
Tween80Carl Roth9139.2
Mieszanka witamin (suplement)VWR968290NL
VortexStar Lab07127/92930
Ekstrakt z drożdżyCarl Roth9257.05
β-D-fruktozaVWR53188-23-1

Bibliografia

  1. Wylensek, D., et al. A collection of bacterial isolates from the pig intestine reveals functional and taxonomic diversity. Nat Comm. 11 (1), 6389(2020).
  2. Medvecky, M., et al. Whole genome sequen....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Mikrobiota jelitowa kurcząthodowla bakteriiizolacja drobnoustrojówrozcieńczanie seryjnestacja beztlenowametabolizm mio-inozytoluminimalne podłoże agaroweizolacja kolonii bakteryjnych