Tutaj prezentujemy protokół opisujący metody hodowli szczurów, procedury treningu pływackiego oraz protokoły opieki nad ciężarnymi szczurami po treningu. Protokół ten zapewnia model zwierzęcy do badania wpływu ćwiczeń matki w czasie ciąży na potomstwo i ich podstawowe mechanizmy.
Artykuł metodologiczny
Protokół ćwiczeń pływackich i metody pielęgnacji ciężarnych szczurów
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Koncepcja rozwojowego pochodzenia zdrowia i choroby podkreśla wpływ wczesnych środowisk na przewlekłe choroby niezakaźne, takie jak cukrzyca, choroby układu krążenia i nowotwory. Badania z wykorzystaniem modeli zwierzęcych sprawdzały, w jaki sposób czynniki matczyne, takie jak niedożywienie, przeżywienie, otyłość i narażenie na chemikalia lub niedotlenienie, wpływają na rozwój płodu i zdrowie potomstwa, prowadząc do problemów, takich jak niska masa urodzeniowa, wysokie ciśnienie krwi, dyslipidemia i insulinooporność. Biorąc pod uwagę rosnące rozpowszechnienie nadwagi i otyłości wśród kobiet w wieku rozrodczym, kluczowe znaczenie mają skuteczne interwencje. Ćwiczenia matki w czasie ciąży stały się kluczową interwencją, przynoszącą korzyści zarówno matce, jak i potomstwu oraz zmniejszającą ryzyko choroby. W tym badaniu porównano różnice między trzema modelami ćwiczeń na ciężarnych szczurach: dobrowolnym bieganiem na kołach, zmotoryzowanymi bieżniami i pływaniem. Pływanie jest najkorzystniejszą opcją ze względu na bezpieczny i kontrolowany poziom intensywności. Protokół ten szczegółowo opisuje metody hodowli szczurów, trening pływacki w czasie ciąży i protokoły pielęgniarskie po rozrodze. Ten model, odpowiedni dla różnych gatunków szczurów i myszy, jest przydatny do badania korzyści płynących z ćwiczeń matki dla zdrowia potomstwa i dobrego samopoczucia międzypokoleniowego.
Wprowadzenie
Koncepcja Rozwojowych Początków Zdrowia i Chorób (DOHaD) pojawiła się w ciągu ostatnich dwóch dekad, co pokazało, że wpływy środowiskowe we wczesnym okresie rozwoju wpływają na ryzyko późniejszych procesów patofizjologicznych związanych z przewlekłą chorobą niezakaźną (NCD), zwłaszcza cukrzycą, chorobami układu krążenia i niektórymi rodzajami raka1. Podczas najbardziej plastycznej fazy rozwoju płodu, gdy potomstwo jest narażone na działanie środowiska wewnątrzmacicznego, interakcja genu i środowiska oraz perfuzja maciczno-łożyskowa są kluczowymi czynnikami przeprogramowania płodu2. Wcześniejsze badania wykorzystywały głównie modele zwierzęce do zbadania szkodliwego wpływu, takiego jak niedożywienie matki, przeżywienie lub otyłość w czasie ciąży oraz prenatalne narażenie na chemikalia lub niedotlenienie, na rozwój płodu i długoterminowe skutki fenotypowe u potomstwa3. Spowodowało to niską masę urodzeniową i późniejszy wzrost oraz miało niekorzystny wpływ na potomstwo, w tym podwyższone ciśnienie krwi, dyslipidemię i insulinooporność4. Ponieważ wskaźnik nadwagi i otyłości gwałtownie rośnie wśród kobiet w wieku rozrodczym, pilnie potrzebne jest ustanowienie skutecznych interwencji zapobiegających międzypokoleniowemu przenoszeniu tych szkodliwych zaburzeń matczynych, co ma istotny wpływ na zdrowie populacji5,6.
Ćwiczenia od dawna są uznawane za ważny środek zapobiegawczy w leczeniu cukrzycy typu 2, nadciśnienia i kilku innych chorób7. Ćwiczenia w czasie ciąży mają korzystny wpływ na matkę i mają korzystny wpływ na potomstwo, zmniejszając w ten sposób przenoszenie chorób przez matkę na potomstwo8. Kilkuletnie badania wykazały bezpieczeństwo ćwiczeń i głębokie korzyści, w tym znaczne zmniejszenie częstych schorzeń ciążowych, takich jak cukrzyca ciążowa9,10. Jeśli chodzi o bezpieczeństwo matki i płodu, przeprowadzenie treningu fizycznego i protokołów po karmieniu piersią jest wyzwaniem.
David11 et al. opisali modele ćwiczeń na zwierzętach mające zastosowanie w badaniach nad zdrowiem układu krążenia. Trzy powszechnie używane modele ćwiczeń, dobrowolne bieganie na kołach, zmotoryzowane bieżnie i pływanie, mają zalety i wady. Dobrowolnie poruszające się koło ściśle naśladuje zachowanie lokomotoryczne szczurów, umożliwiając im poruszanie się zgodnie z ich rytmem okołodobowym. Jednak ten rodzaj ćwiczeń wymaga bardziej precyzyjnej regulacji intensywności i czasu trwania. Zmotoryzowana bieżnia może kontrolować intensywność, objętość i czas trwania ćwiczeń, ale czasami wymaga stymulacji elektrycznej, co może wywołać stres fizyczny i psychiczny u zwierząt. Pływanie jest szeroko stosowane w badaniach na gryzoniach ze względu na wrodzoną zdolność pływania szczurów, które mogą również uniknąć stymulacji elektrycznej lub mechanicznego uszkodzenia stóp i ogonów12. W badaniach nad modelami ćwiczeń prenatalnych13,14, pływanie jest powszechnie stosowaną metodą ćwiczeń. W miarę postępu ciąży i obrzęku brzucha szczura, ćwiczenia na bieżni i bieganiu na kółkach mogą powodować powtarzający się kontakt brzucha z twardymi powierzchniami. Natomiast środowisko wodne podczas pływania zapewnia wyporność, zmniejszając ryzyko urazów związanych z wysiłkiem fizycznym u ciężarnych zwierząt.
Ten protokół przedstawia metody hodowli szczurów, jak przeprowadzić trening pływacki podczas ciąży, oraz protokoły opieki nad ciężarnymi szczurami po treningu. Ten model treningu pływackiego w ciąży może być stosowany do szerokiej gamy gatunków szczurów i myszy, co może stanowić użyteczny model gryzoni do przyszłych badań z wykorzystaniem modeli zwierzęcych do badania mechanizmów regulujących korzystny wpływ ćwiczeń matki na zdrowie potomstwa i korzyści płynące z ćwiczeń w różnych pokoleniach.
Protokół
Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez komisję etyki zwierząt na Uniwersytecie Sportowym w Pekinie i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) oraz chińskimi przepisami o ochronie zwierząt i wytycznymi instytucjonalnymi.
1. Krycie i karmienie szczurów
- Kup 10-tygodniowe samice szczurów Wistar z oceną SPF i 11-tygodniowe samce szczurów Wistar.
- Wdrożenie żywienia adaptacyjnego: Karm szczury Wistar ad libitum standardową dietą dla gryzoni i zapewnij dostęp do wody z kranu przez tydzień w wyznaczonym ośrodku karmienia. Upewnij się, że wszystkie szczury są trzymane w 12-godzinnym cyklu jasno-ciemnym w stałej temperaturze 22 °C i wilgotności 45-55%.
- Zbadaj ruję samicy szczura.
- Przygotuj sprzęt i materiały, w tym czyste szklane szkiełka mikroskopowe, waciki o średnicy 2 mm, roztwór soli fizjologicznej (0,9% NaCl) i mikroskop.
- Oznacz każde szkiełko mikroskopowe datą i identyfikacją szczura.
- Między godziną 18 a 19, aby zminimalizować stres, delikatnie krępuj samicę szczura. Chwyć podstawę ogona kciukiem i palcem wskazującym, jednocześnie wywierając nacisk innymi palcami na kręg lędźwiowy szczura.
- Podnieś czubek ogona i odsłoń pochwę. Zwilż bawełniany wacik roztworem soli fizjologicznej, a następnie włóż końcówkę do pochwy i delikatnie zwiń końcówkę, aby zebrać wydzielinę z pochwy.
- Przetocz końcówkę wacika po szkiełku, unikając ponownego nałożenia na ten sam obszar.
- Zbadaj rozmaz pod mikroskopem i użyj obiektywu o małym powiększeniu (10x), aby zlokalizować i obserwować komórki.
UWAGA: Podczas rui wydzieliny z pochwy mają większe jądra nabłonka, które zniknęły, zastąpione przez płaskonabłonkowe złuszczone zrogowaciałe komórki nabłonka, które zgromadziły się w kopcu. - Zapisz etap cyklu rujowego dla każdego szczura.
- Między godziną 19 a 20 umieść samca i samicę szczura w klatce godowej.
UWAGA: Samice szczurów muszą znajdować się w rui lub rui do krycia. - Drugiego dnia, między 7 a 8 rano, sprawdź klatkę współpracującą pod kątem zatyczek kopulacyjnych. Jeśli u podstawy klatki kryjącej zostanie znaleziony czop kopulacyjny, przystąp do tworzenia rozmazu z pochwy dla samicy szczura, postępując tą samą metodą, jak opisano w krokach 1.3.4-1.3.6.
UWAGA: Korki kopulacyjne to mlecznobiałe lub żółtawe galaretowate materiały zbudowane z pęcherzyków nasiennych samców szczurów i wydzielin prostaty w połączeniu z wydzieliną z pochwy. - Potwierdź ciążę u samicy szczura: po znalezieniu czopów kopulacyjnych w klatce godowej obserwuj plemniki na rozmazie wydzieliny z pochwy. Oznacz ten dzień jako 1 dzień ciąży (GD1).
- Odizoluj ciężarną szczurkę w osobnej klatce.
UWAGA: W początkowych stadiach ciąży konieczne jest zapobieganie napotkaniu przez ciężarną szczur nieznanych męskich sygnałów chemicznych w swoim otoczeniu lub współżyciu z nieznanym samcem szczura. - Okres ciąży szczurów trwa zwykle 21-23 dni. Zmierz i zapisz masę ciała szczurów od GD1 do GD20.
- Na GD20 zastąp klatkę ciężarnej szczura czystą i umieść w niej medyczną bawełnę chłonną (podobną wielkością do szczura). Zapewnij wystarczającą ilość wody i pożywienia na przetrwanie przez siedem dni i umieść klatkę w cichym miejscu.
UWAGA: Nie zmieniaj klatki przez co najmniej 1 tydzień po porodzie szczura. Przechodząc na czystą klatkę, przenieś zużytą chłonną bawełnę z brudnej klatki do nowej, aby szczury mogły rozpoznać zapach swojego potomstwa. - W 21 dniu po porodzie oddziel potomstwo według płci i umieść je w dwóch klatkach.
UWAGA: Ze względu na mniejszy rozmiar 21-dniowego potomstwa, granulki twardej paszy należy umieścić w szklanej szalce Petriego wewnątrz klatki.
2. Prenatalny program treningu pływackiego
- Przeprowadź szkolenie adaptacyjne dla wszystkich doświadczalnych samic szczurów przez 5 dni.
- Przygotuj przezroczysty plastikowy pojemnik o wysokości co najmniej 20 cm i napełnij go 10 cm wodą o temperaturze 34 ± 1°C.
- Chwyć czubek ogona szczura i podnieś go, a następnie umieść szczura w wodzie.
- Podczas 15-minutowego treningu adaptacyjnego uważnie monitoruj temperaturę wody co 5 minut, dodając ciepłą wodę, aby utrzymać temperaturę.
- Po treningu przenieś szczura do czystej wody o temperaturze 34 ± 1°C, aby umyć jego sierść. Następnie przenieś szczura do klatki z ręcznikami i użyj suszarki do włosów, aby wysuszyć jego futro.
UWAGA: Hałas i gorące środowisko mogą powodować stres u szczurów. Dlatego zaleca się używanie cichej suszarki do włosów o regulowanej temperaturze. - Uprzejmie prosimy o powrót szczura do odpowiednich klatek.
- Kojarzenie szczurów (wykonaj kroki 1.3-1.6).
- Po kroku 1.7 losowo przypisz ciężarne szczury do grupy prowadzącej siedzący tryb życia (SED) i grupy ćwiczącej (EX).
- Waż szczura codziennie przed każdą sesją treningową.
UWAGA: Podczas treningu adaptacyjnego utrata masy ciała szczurów nie powinna przekraczać 3 g/dzień. Podczas treningu prenatalnego waga szczurów powinna stopniowo zwiększać. Jeśli szczury tracą więcej niż 3 g dziennie, skróć dzienny czas treningu o 50%, aby umożliwić regenerację. - Prowadź prenatalny trening pływacki dla EX od GD1 do GD20, 6 dni w tygodniu, od 8:00 do 9:00 rano.
- Przygotuj okrągłe wiadro na wodę o średnicy 50 cm i minimalnej wysokości 50 cm i napełnij je 40 cm wodą o temperaturze 34 ± 1°C.
- Od GD1 do GD5 początkowo wykonuj trening pływacki przez 20 minut dziennie i stopniowo zwiększaj do 60 minut dziennie.
- Od GD6 do GD20 kontynuuj trening fizyczny przez 60 minut dziennie przez 6 dni w tygodniu.
- Aby uzyskać informacje o opiece pooperacyjnej, zapoznaj się z krokami 2.1.4-2.1.5.
- Po wysiłku podaj szczurowi EX 5 g nasion słonecznika gryzoni, aby zapewnić wsparcie żywieniowe.
- Podczas codziennego treningu EX należy umieścić szczura SED w tym samym środowisku wodnym, w którym odbywa się trening adaptacyjny (krok 2.1.1). Niech szczur SED spędza tyle samo czasu w środowisku wodnym, co szczur EX. Po wysiłku fizycznym podaj szczurowi SED 5 g nasion słonecznika dla gryzoni, aby zapewnić mu wsparcie odżywcze i kojące emocje.
- Po każdym treningu pływackim wyczyść i zdezynfekuj cały sprzęt światłem ultrafioletowym, w tym wiadra z wodą i ręczniki.
3. Cechy fizyczne płodów
- Rankiem GD20.5 znieczulij samicę szczura 3% izofluranem i poddaj ją eutanazji w komorze CO2 .
- Użyj noża chirurgicznego, aby wykonać nacięcie w dolnej części brzucha szczura. Upewnij się, że nacięcie jest nachylone w obie strony brzucha, zapewniając całkowite odsłonięcie macicy.
- Ostrożnie otwórz macicę za pomocą kleszczy i nożyczek, aby odsłonić płody i łożyska. Delikatnie oddziel cienką owodnię otaczającą płody za pomocą kleszczy, aby uniknąć uszkodzenia płodów i łożysk spowodowanych nożyczkami.
- Oczyść ciała płodów za pomocą sterylnej gazy, aby usunąć krew i śluz. Kolejno oddziel płody i łożyska według ich anatomicznych pozycji, a następnie zważ je.
- Obserwuj odległość między odbytem a genitaliami, aby określić płeć płodów. Płody męskie mają większą odległość niż samice. Zapisz płeć i liczbę płodów do wykorzystania w przyszłości.
- Zmierz długość płodu za pomocą suwmiarki, leżąc płasko. Ponieważ płody są nadal żywe, mogą zwinąć się w kłębek po sekcji, więc rozłóż ich ciała, aby dokonać pomiarów.
UWAGA: Aby zapewnić spójność wyników eksperymentalnych i metod pomiaru, ten sam eksperymentator utrzymuje te same standardy przez cały czas. Płody zostały poddane eutanazji zgodnie z wytycznymi zaleconymi przez instytucję, a próbki tkanek pobrano do dalszej analizy w razie potrzeby.
Wyniki
W sekcji dotyczącej metod hodowli szczurów (Rysunek 1) określamy cykl rujowy samic szczurów poprzez przygotowanie preparatów wydzieliny pochwowej w celu zwiększenia skuteczności rozrodu. Cykl rujowy szczurów trwa 4–5 dni i obejmuje proestrus, estrus, metestrus oraz diestrus. Samice szczurów w fazie metestrusu lub diestrusu wykazują takie zachowania jak dystansowanie się od samców. Jednocześnie samice w fazie estrusu są chętne do kopulacji, a owulacja u samic szczurów następuje najczęściej pod koniec estrusu. Podczas proestrusu próbki rozmazów pochwowych zawierają głównie jądrowe komórki nabłonka z okazjonalnie występującymi komórkami zrogowaciałymi. W fazie estrusu rozmaz pochwowy składa się przeważnie z zrogowaciałych płaskich komórek nabłonka zgromadzonych w skupiskach, przy jednoczesnym zaniku powiększonych jąder komórek nabłonka obserwowanych w metestrusie. W fazie metestrusu rozmaz pochwowy zawiera głównie leukocyty z nielicznymi zrogowaciałymi komórkami nabłonka. Stadium diestrusu charakteryzuje się przewagą leukocytów, z okazjonalnie występującymi jądrowymi i zrogowaciałymi komórkami nabłonka (Rysunek 1A).
Korek kopulacyjny to substancja o konsystencji żelu, składająca się z wydzielin pochwy i nasieniowych. Samica szczura tworzy korek kopulacyjny, aby zapobiec ponownemu kopulowaniu z innymi samcami, a jednocześnie blokując pochwę samicy, by zapobiec wypływaniu plemników samca. Obecność korka kopulacyjnego nie musi wskazywać na udaną rozprodukcję, a jedynie sygnalizuje wystąpienie zachowań kopulacyjnych. Dlatego konieczne jest ponowne wykonanie rozmazów z pochwy samicy rano po kopulacji. Obecność plemników w rozmazie pochwowym wskazuje na udaną rozprodukcję. Ważne jest monitorowanie masy ciała samic szczurów po tym dniu, aby sprawdzić, czy wzrasta ona stopniowo, co jest oznaką udanej ciąży. Jeśli w ciągu dwóch dni od kopulacji nie powstanie korek kopulacyjny lub jeśli korek powstanie, ale w rozmazie nie zaobserwowano plemników, zaleca się wymianę samca i ponowną próbę rozprodukcji. Poprzez badanie pod mikroskopem preparatów z wydzieliną pochwową określamy fazę cyklu rujowego u samic szczurów i do rozprodukcji wykorzystujemy osobniki w proestrusie i estrusie. Ciężarne szczury zostały losowo przydzielone do grupy siedzącej (SED) lub grupy ćwiczącej (EX), przy czym trening pływacki przeprowadzano od GD1 do GD20 (Rysunek 1B). Do obserwacji korków kopulacyjnych powstających po kopulacji szczurów używamy specjalnie zaprojektowanej klatki do rozprodukcji. Klatka ta składa się z tacy podstawowej, dna z drucianej siatki, ramy klatki bez dna oraz drucianej pokrywy klatki (Rysunek 1C).
Przed urodzeniem młodych, ciężarne szczury mogą przejawiać zachowania gniazdowania (Rysunek 1E), wykorzystując materiały z otoczenia do budowy przytulnego i ciepłego gniazda dla potomstwa. Zaleca się, aby podczas przenoszenia zwierząt do nowej, czystej klatki w dniu GD20, umieścić w niej ilość odtłuszczonej waty odpowiadającą wielkości ciężarnej szczurki. W celu badania młodych szczurów, muszą one zostać odchowane do określonego wieku. Szczury są odsadzane około 21 dni po urodzeniu. W związku z tym, w 21. dniu po urodzeniu, młode szczury są rozdzielane według płci (Rysunek 1F) w celu indywidualnego chowu. Metoda identyfikacji płci szczurów polega na obserwowaniu odległości między narządami płciowymi a odbytem. U samców odległość ta jest większa i posiadają one sierść pomiędzy narządami płciowymi a odbytem. Narządy płciowe samców są bardziej wyraźne i zaznaczone w porównaniu do samic. Samice szczurów mają bardziej widoczne sutki niż samce.
Zaleca się codzienne ważenie i zapisywanie masy ciała od GD1 do GD20 w trakcie ciąży u szczurów (Rysunek 2). Masa ciała szczurów powinna stopniowo wzrastać w trakcie ciąży (Rysunek 2A), a codzienne pomiary należy porównywać z masą z dnia poprzedniego. Jest to kluczowe, ponieważ szczury mają tendencję do zjadania embrionów po poronieniu, co utrudnia wykrycie tego zjawiska za pomocą samej obserwacji. Ponadto monitorowanie masy ciała szczurów może pomóc w zidentyfikowaniu nadmiernego wysiłku fizycznego. Jeśli masa ciała szczura spadnie o więcej niż 3 g, należy skrócić czas treningu fizycznego w tym dniu o 50%. W dniu GD20.5 przeprowadza się sekcję ciężarnych szczurów w celu pobrania płodów i łożysk, a stosunek masy płodu do masy łożyska definiuje się jako wydajność łożyska (Rysunek 2B). Za pomocą linijki mierzy się długość płodu od czubka głowy do dołu tylnej części ciała w pozycji bocznej, aby określić długość ciała płodu (Rysunek 1G i 2C).
Rysunek 1: Model ciąży u szczurów. (A) Wyniki rozmazów pochwy w różnych fazach cyklu rujowego, zdjęcia korków kopulacyjnych u szczurów oraz obecność plemników w rozmazach pochwy w drugim dniu po kopulacji. (B) Schemat przedstawiający program prenatalnego treningu pływania. (C) Widoki ogólne klatki kopulacyjnej dla szczurów. (D) Zdjęcie treningu pływania u ciężarnych szczurów obrazujące średnicę użytego wiadra z wodą. (E) Zachowanie szczurów podczas budowania gniazda. (F) Różnice w wyglądzie narządów rozrodczych u samców i samic szczurów w 21. dniu życia. (G) Wygląd płodów i łożysk oraz schematyczna reprezentacja metody pomiaru długości ciała płodu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Masa ciała ciężarnych szczurek oraz cechy fizyczne płodów. (A) Zmiany masy ciała ciężarnych szczurek od GD1 do GD20 w grupach SED i EX (n = 9 w każdej grupie). (B) Różnica w efektywności łożyska między dwiema grupami. (C) Zmienność długości ciała płodów między grupami SED i EX. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Rysunek 3: Porównanie różnych metod ćwiczeń dla ciężarnych szczurzyc. Zalety i wady różnych metod ćwiczeń dla ciężarnych szczurzyc: dobrowolnego biegania w kołowrotku (VWR), zmotoryzowanej bieżni (MT) oraz pływania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 4: Program ćwiczeń z pływania. (A) Cały proces kojarzenia, ciąży, ćwiczeń z pływania, porodu i laktacji opisany w krokach protokołu 1.1-1.10 z wykorzystaniem samic szczurów Wistar. (B) Proces treningu pływania podczas ciąży opisany w krokach protokołu 2.1-2.6, obejmujący trening adaptacyjny i właściwy trening. Temperatura wody jest utrzymywana przez cały proces na poziomie 34 ± 1 °C. Podczas treningu adaptacyjnego głębokość wody wynosi 10 cm, natomiast podczas właściwego treningu wynosi ona 10 cm dla grupy SED i 40 cm dla grupy EX. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Tabela 1: Potencjalne problemy podczas ćwiczeń z pływaniem i opieki poporodowej u ciężarnych szczurów oraz ich rozwiązania. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Tabela 2: Analiza porównawcza programów ćwiczeń u ciężarnych samic oraz samców szczurów lub myszy.MT: bieżnia motorowa; VWR: dobrowolne bieganie w kołowrotku; MLC: test maksymalnej wydolności obciążeniowej. Aby pobrać tę tabelę, kliknij tutaj.
Dyskusja
Badanie to ma na celu ustalenie wykonalnego programu ćwiczeń dla ciężarnych szczurów, w tym szczegółowych metod kojarzenia szczurów, protokołów treningu pływackiego oraz metod badawczych do oceny wskaźników fizjologicznych u płodów. Opracowaliśmy prenatalny model treningu pływackiego poprzez praktykę, z odpowiednimi rozwiązaniami potencjalnych problemów, które mogą pojawić się w protokole (Tabela 1). Protokół ten sprawi, że będzie on bardziej praktyczny i pomoże naukowcom w tworzeniu modeli ćwiczeń prenatalnych.
Wyniki naszych badań wskazują, że korzystanie z opracowanego przez nas programu treningu pływackiego dla szczurów w ciąży nie zakłóca normalnego procesu ciąży szczurów i nie prowadzi do niekorzystnych wyników ciąży. Wpływ ćwiczeń prenatalnych na wyniki ciąży u szczurów oceniano, mierząc wskaźniki poronień i wielkość miotu. W badaniu stwierdzono, że ćwiczenia prenatalne nie wpłynęły znacząco na te czynniki15,16. Aby zbadać płody, naukowcy przeprowadzają sekcję ciężarnych szczurów na GD20.5 w celu uzyskania próbek płodu. Podczas sekcji pobierane są płody i łożyska, a śledzenie liczby potomstwa w miocie ma kluczowe znaczenie dla określenia wyników ciąży, co wymaga zliczania liczby płodów i długości ciała płodu. Ponadto sprawność łożyska to stosunek masy płodu do masy łożyska, co wymaga pomiarów masy zarówno płodu, jak i łożyska. Nasze wcześniejsze odkrycia wskazywały, że ćwiczenia prenatalne nie wpłynęły znacząco na długość ciała płodu, ale znacznie poprawiły wydajność łożyska w grupie ćwiczącej z nadciśnieniem w porównaniu z grupą kontrolną z nadciśnieniem15. Zachowanie matki13,17 może służyć jako wskaźnik do oceny wpływu ćwiczeń w czasie ciąży na matkę. Dlatego wskaźniki takie jak wskaźnik poronień, wielkość miotu, długość i waga ciała płodu, sprawność łożyska i zachowanie matki mogą być wykorzystane do oceny wpływu ćwiczeń ciążowych na wyniki płodu. Dlatego zalecamy stosowanie naszego protokołu eksperymentalnego podczas kształtowania modeli ćwiczeń ciążowych, aby uniknąć niepotrzebnych szkód dla zwierząt doświadczalnych.
Od czasu opracowania teorii Departamentu Zdrowia położono większy nacisk na badanie wpływu zmiennych środowiskowych we wczesnym okresie życia na zdrowie jednostki18. Przeprowadzono liczne badania w celu zbadania przypuszczalnych szlaków patofizjologicznych w zaburzeniach pochodzenia płodowego przy użyciu modeli zwierzęcych19. Ponieważ modele gryzoni, które obejmują ćwiczenia w czasie ciąży, mogą z powodzeniem naśladować ten proces, różne rodzaje ćwiczeń są badane na modelach zwierzęcych z różnymi chorobami pochodzenia płodowego20. Autonomiczne koła do biegania, platformy do biegania, sprzęt wspinaczkowy do przenoszenia ciężarów i protokoły pływania to przykłady typowych technik treningowych. Otyłość, cukrzyca i nadciśnienie to typowe modele zwierzęce21. Widzimy, że różne procedury ćwiczeń mają wyraźne zalety i wady wynikające z klasyfikowania i porównywania metod ćwiczeń stosowanych w różnych badaniach naukowych 15,16,21,22,23,24 (Rysunek 3 i Tabela 2).
Oferujemy szczegółowe wyjaśnienie kontroli ciąży szczurów, wykonywania rutynowych ćwiczeń pływackich oraz oceny płodów i potomstwa w tym protokole. Dzięki dokładnemu kontrolowaniu zachowań godowych szczurów możliwe było dokładniejsze oszacowanie, jak długo trwa ciąża. Umożliwiło to interwencje ruchowe w czasie ciąży i stworzyło model do badania ćwiczeń prenatalnych. W 21 dniu ciąży próbki płodu i łożyska można poddać sekcji w celu oceny międzypokoleniowego wpływu aktywności matki w czasie ciąży na funkcję łożyska i rozwój płodu. Co więcej, potomstwo szczurów wykonujących ćwiczenia w ciąży było karmione aż do dorosłości, a nawet starości, w celu zbadania długoterminowych procesów fizjologicznych i patologicznych leżących u podstaw tych efektów.
Tworząc program treningu pływackiego dla szczurów, należy wziąć pod uwagę, że mogą one próbować unikać pływania, chowając się w kątach, wychodząc z basenu, trzymając się innych szczurów, a nawet unosząc się na pęcherzykach powietrza w ich futrze. Aby temu zapobiec, basen powinien być wykonany z tworzywa sztucznego i być cylindryczny. Woda w basenie powinna być głębsza niż 1,5 raza długość szczura, mierzona od nosa do końca ogona. Głębokość wody powinna wynosić przede wszystkim ponad 50 cm, a powierzchnia powinna być na tyle duża, aby umożliwić nieograniczone pływanie. Ważne jest zapewnienie szczurom minimalnej przestrzeni do pływania 1000 cm2 11. Dlatego zaprojektowaliśmy przyrząd do treningu pływania, który składa się z wiadra o wysokości 55 cm i średnicy 50 cm. Podczas treningu pływackiego poziom wody powinien wynosić 40 cm, a średnica lustra wody powinna wynosić 45 cm. Dodatkowo ważne jest, aby utrzymać temperaturę wody na poziomie 34 ± 1°C. To urządzenie jest odpowiednie dla jednego szczura do treningu na raz. Ważne jest, aby stopniowo zwiększać intensywność treningu pływackiego dla ciężarnych szczurów. Dzięki temu mogą przystosować się do ćwiczeń i środowiska wodnego. Nagłe zmiany intensywności mogą powodować reakcje stresowe, które mogą zwiększać ryzyko poronienia. Zaleca się również co najmniej jeden dzień odpoczynku w tygodniu, aby zapobiec zmęczeniu wywołanemu wysiłkiem fizycznym.
Modele zwierzęce użyte w naszych poprzednich badaniach25 dotyczących ćwiczeń w czasie ciąży obejmowały szczury z samoistnym nadciśnieniem tętniczym (SHR) i normotensyjne szczury Wistar Kyoto (WKY), co sprawia, że rutyna ćwiczeń tego protokołu jest równie odpowiednia dla szczurów z nadciśnieniem tętniczym lub innych modeli choroby. Nasze badanie wykazało już, że ćwiczenia w czasie ciąży znacznie obniżyły ciśnienie krwi u 3-miesięcznego potomstwa z nadciśnieniem tętniczym, a ćwiczenia prenatalne miały istotny wpływ na zmniejszeniereaktywności sercowo-naczyniowej. Odkryto również, że ćwiczenia matki indukują epigenetyczne modyfikacje genu kanału Ca2 + α1C (Cacna1c) kanału α1C (Cacna1c) typu L, genu receptora angiotensyny II typu 1 (Agtr1a) i genu oksydazy NADPH-4 (Nox4) w celu poprawy funkcji naczyniowej u potomstwa z nadciśnieniem 14,25,26.
Na proces rozrodczy u szczurów może wpływać wiele czynników. Wiek szczura, stan zdrowia, ruchliwość plemników, ruję samic, temperatura, wilgotność i zmiany światła w środowisku lęgowym wpływają na krycie. Ponadto hałas i wibracje w pomieszczeniach podczas hodowli mogą powodować pobudzenie u szczurów z nadciśnieniem, prowadzić do poronienia lub odrzucenia karmienia poporodowego. Dźwiękoszczelna bawełna pokrywa klatki dla zwierząt podczas hodowli, aby zmniejszyć ten wpływ.
W tym protokole oferujemy obszerny przewodnik po metodach krycia szczurów, program ćwiczeń pływackich dla ciężarnych szczurów, opiekę poporodową dla ciężarnych szczurów, metody wychowywania potomstwa szczurów oraz techniki obserwacyjne do pomiaru cech fizycznych płodów. Wyniki naszych badań przyczyniają się do badania międzypokoleniowego dziedziczenia ćwiczeń przez matkę oraz pokazują racjonalne i skuteczne podejście badawcze. Naszym celem jest stworzenie skutecznego modelu ćwiczeń pływackich dla kobiet w ciąży w dziedzinie fizjologii wysiłku fizycznego, który pomoże w przyszłych badaniach w tej dziedzinie.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32071174, 32200941, 32371183 i 31771312).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Suwmiarka | Mitutoyo Przyrządy pomiarowe (Shanghai) Co., Ltd | 530-101 N15 | Sekcja płodu |
| Okrągłe wiadro na wodę | Naliya | N/A Szczur | pływający |
| Eksperymentalny instrument chirurgiczny | Shenzhen RWD Life Technology Co., LTD | SP0001-G | Szklane |
| preparaty mikroskopowe | Jiangsu Shitai sprzęt eksperymentalny Co., LTD | 80312-3161 | Wymaz z pochwy |
| Szklana szalka Petriego | Merck Life Technologies | BR455751-10EA | Suszarka do włosów do hodowli potomstwa |
| Panasonic | EH-WNE5H | do pielęgnacji po pływaniu | |
| Zhongke Nauki przyrodnicze | SS3 | Kojarzenie szczurów | |
| Izofluran | Shenzhen RWD Life Technology Co., LTD | R510-22-10 | Sekcja płodu |
| Mikroskop świetlny | Olympus | IX71-F22PH | Wymaz z pochwy |
| Klatka godowa | Zhongke Life Science | SS3 | Krycie szczurów |
| Medyczna chłonna bawełna | Hongxiang Sanitary Materials Co., Ltd | N/A | Ciężarne szczury są przewidywanie porodu |
| Maszyna do znieczulenia gryzoni, znieczulenie gazowe | Shenzhen RWD Life Technology Co., LTD | R500IE | Sekcja płodu |
| Pasza hodowlana dla gryzoni | Beijing Huafukang Biotechnology Co., LTD | 1032 | Karmienie ciężarnych szczurów |
| Karma dla gryzoni | Beijing Huafukang Biotechnology Co., LTD | 1022 | Hodowla potomstwa Nasiona |
| słonecznika dla gryzoni | Jolly | JP241 | Suplement diety |
| Dźwiękoszczelny bawełniany | instrument medyczny Kufu | Nie dotyczy | Ciężarne szczury oczekują porodu |
| Sterylny wacik bawełniany (średnica 2 mm) | Instrument medyczny Kufu | Nie dotyczy | Wymaz z pochwy |
| Sterylna gaza | Instrument medyczny Kufu | Nie dotyczy | sekcji płodu |
| Udar fizjologiczny roztwór soli fizjologicznej (0,9% NaCl) | Shandong Hualu Pharmaceutical Co., LTD | N/A | Wymaz z pochwy |
| Termometr | Organizm Beekmana | N/A | Monitorowanie pływania szczurów |
| Ręczniki | Grace | N/A | Pielęgnacja po pływaniu |
| Przezroczysty plastikowy pojemnik | Naliya | N/A | Pływanie Trening adaptacyjny |
| Światło ultrafioletowe | Merck Life Technologies | Z169633-1EA | Pielęgnacja po pływaniu |
| Podgrzewacz wody | Haier | EC6001-Q6S | Waga do pływania dla szczurów |
| Electronlc Acale | JM. A10001 | Pomiar masy ciała | |
| Wistar Rats | Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd | Eksperyment N/A |
Bibliografia
- Hanson, M. A., Gluckman, P. D. Early developmental conditioning of later health and disease: Physiology or pathophysiology. Physiol Rev. 94 (4), 1027-1076 (2014).
- Calkins, K., Devaskar, S. U. Fetal origins of adult disease. Curr Probl Pediatr Adolesc Health Care. 41 (6), 158-176 (2011).
- Chavatte-Palmer, P., Tarrade, A., Rousseau-Ralliard, D. Diet before and during pregnancy and offspring health: The importance of animal models and what can be learned from them. Int J Environ Res Public Health. 13 (6), 586(2016).
- Lapehn, S., Paquette, A. G. The placental epigenome as a molecular link between prenatal exposures and fetal health outcomes through the dohad hypothesis. Curr Environ Health Rep. 9 (3), 490-501 (2022).
- Shrestha, A., Prowak, M., Berlandi-Short, V. M., Garay, J., Ramalingam, L. Maternal obesity: A focus on maternal interventions to improve health of offspring. Front Cardiovasc Med. 8, 696812(2021).
- Haire-Joshu, D., Tabak, R. Preventing obesity across generations: Evidence for early life intervention. Annu Rev Public Health. 37, 253-271 (2016).
- Kusuyama, J., Alves-Wagner, A. B., Makarewicz, N. S., Goodyear, L. J. Effects of maternal and paternal exercise on offspring metabolism. Nat Metab. 2 (9), 858-872 (2020).
- Blaize, A. N., Pearson, K. J., Newcomer, S. C. Impact of maternal exercise during pregnancy on offspring chronic disease susceptibility. Exerc Sport Sci Rev. 43 (4), 198-203 (2015).
- Hinman, S. K., Smith, K. B., Quillen, D. M., Smith, M. S. Exercise in pregnancy: A clinical review. Sports Health. 7 (6), 527-531 (2015).
- Acog committee. Physical activity and exercise during pregnancy and the postpartum period: Acog committee opinion, number 804. Obstet Gynecol. 135 (4), e178-e188 (2020).
- Poole, D. C., et al. Guidelines for animal exercise and training protocols for cardiovascular studies. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 318 (5), H1100-H1138 (2020).
- Beleza, J., et al. Self-paced free-running wheel mimics high-intensity interval training impact on rats' functional, physiological, biochemical, and morphological features. Front Physiol. 10, 593(2019).
- August, P. M., Rodrigues, K. D. S., Klein, C. P., Dos Santos, B. G., Matté, C. Influence of gestational exercise practice and litter size reduction on maternal care. Neurosci Lett. 741, 135454(2021).
- Li, S., et al. Prenatal exercise reprograms the development of hypertension progress and improves vascular health in shr offspring. Vascul Pharmacol. 139, 106885(2021).
- Li, S., et al. Exercise during pregnancy enhances vascular function via epigenetic repression of ca(v)1.2 channel in offspring of hypertensive rats. Life Sci. 231, 116576(2019).
- Musial, B., et al. Exercise alters the molecular pathways of insulin signaling and lipid handling in maternal tissues of obese pregnant mice. Physiol Rep. 7 (16), e14202(2019).
- Dos Santos, A. S., et al. Resistance exercise was safe for the pregnancy and offspring's development and partially protected rats against early life stress-induced effects. Behav Brain Res. 445, 114362(2023).
- Barnes, M. D., Heaton, T. L., Goates, M. C., Packer, J. M. Intersystem implications of the developmental origins of health and disease: Advancing health promotion in the 21st century. Healthcare. 4 (3), 45(2016).
- Bakrania, B. A., George, E. M., Granger, J. P. Animal models of preeclampsia: Investigating pathophysiology and therapeutic targets. Am J Obstet Gynecol. 226, S973-S987 (2022).
- Ferrari, N., et al. Exercise during pregnancy and its impact on mothers and offspring in humans and mice. J Dev Orig Health Dis. 9 (1), 63-76 (2018).
- Lerman, L. O., et al. Animal models of hypertension: A scientific statement from the american heart association. Hypertension. 73 (6), e87-e120 (2019).
- Mangwiro, Y. T. M., et al. Exercise initiated during pregnancy in rats born growth restricted alters placental mtor and nutrient transporter expression. J Physiol. 597 (7), 1905-1918 (2019).
- Kim, H., Lee, S. H., Kim, S. S., Yoo, J. H., Kim, C. J. The influence of maternal treadmill running during pregnancy on short-term memory and hippocampal cell survival in rat pups. Int J Dev Neurosci. 25 (4), 243-249 (2007).
- Harris, J. E., et al. Exercise-induced 3'-sialyllactose in breast milk is a critical mediator to improve metabolic health and cardiac function in mouse offspring. Nat Metab. 2 (8), 678-687 (2020).
- Zhang, Y., et al. Maternal exercise represses nox4 via sirt1 to prevent vascular oxidative stress and endothelial dysfunction in shr offspring. Front Endocrinol. 14, 1219194(2023).
- Shan, M., et al. Maternal exercise upregulates the DNA methylation of agtr1a to enhance vascular function in offspring of hypertensive rats. Hypertens Res. 46 (3), 654-666 (2023).
Przedruki i uprawnienia
