Korzystając z układu opisanego w kroku 3 (Rysunek 1A), tworzenie nukleosomów wzdłuż wiązania DNA wizualizowano jako pojawianie się czerwonych fluorescencyjnych ognisk na skanie 2D (Rysunek 1B, lewo) lub trajektorii w czasie na kymografie (Rysunek 1B, prawo). Prawidłowo owinięte nukleosomy generowały trajektorie fluorescencji, które pozostawały stacjonarne w czasie w granicach limitu dyfrakcji detekcji konfokalnej (~300 nm). Należy zauważyć, że wiele nukleosomów utworzonych blisko siebie poniżej limitu dyfrakcji nie może zostać rozdzielonych przestrzennie i pojawiają się one jako jaśniejsze ogniska lub trajektorie. Niemniej jednak, przeanalizowano stopnie fotoblaknięcia poszczególnych trajektorii nukleosomowych, które często wykazywały 1-stopniowe (Rysunek 1C) lub 2-stopniowe (Rysunek 1D) zdarzenia fotoblaknięcia, co wskazuje, że ogniska zawierały głównie mononukleosomy, biorąc pod uwagę około 70% stopień znakowania białka H4 w tej próbce. Co więcej, na podstawie średniej liczby fotonów dla pojedynczego fluoroforu LD655 w tych warunkach eksperymentalnych, oszacowano liczbę znakowanych kopii H4 w każdej trajektorii nukleosomowej, co wykazało, że loci nukleosomowe przeważnie (>75%) zawierały 1 lub 2 znakowane kopie H2A (Rysunek 1E), co ponownie jest zgodne z tezą, że były one ładowane głównie jako przestrzennie oddzielone mononukleosomy. Pozostałe jaśniejsze ogniska zawierały więcej niż 3 kopie znakowanego H4, co prawdopodobnie reprezentowało wiele nukleosomów w obrębie limitu dyfrakcji.
Tworzenie nukleosomów monitorowano również poprzez wzrost napięcia wzdłuż wiązania, gdy pozycje OT pozostawały stałe, a większa ilość DNA owijała się wokół oktamerów histonowych (Rycina 1B, dół). W przypadku braku Nap1 oktamery histonowe nadal mogą wiązać DNA, lecz pozostają w większości nieowinięte, ponieważ napięcie towarzyszące utrzymaniu pozycji OT pozostało stałe (Rycina 1F). Możliwe jest, że niespecyficzne wiązanie oktamerów histonowych z DNA zachodzi nawet w obecności Nap1. W innym eksperymencie przeprowadzono ten sam protokół tworzenia nukleosomów zawierających oznakowane Cy3 H2A, co dało wyniki podobne do tych uzyskanych dla oznakowanego LD655 H4 (Rycina 1G), co wskazuje na montaż nienaruszonych oktamerów w nukleosomy.
Przy użyciu układu opisanego w kroku 4 (Rysunek 2A), rozwijanie nukleosomów wizualizowano w czasie na kymografie wraz ze zwiększaniem odległości między punktami mocowania (Rysunek 2B). Wcześniej zgłaszano, że oktamery histonowe często pozostają związane z DNA po rozpleceniu30,31, w związku z czym trajektorie fluorescencyjne często utrzymują się nawet przy wysokim napięciu. Rozwijanie nukleosomów monitorowano również na powiązanej krzywej FD (Rysunek 2C). Do mierzalnych cech krzywej FD należą siła, przy której następuje rozwijanie nukleosomu(ów) (patrz „Transition F” na wstawce do Rysunku 2C), a także długość DNA uwolnionego z oktameru histonowego (patrz „ΔL” na wstawce do Rysunku 2C), która występuje w wielokrotnościach ~24 nm, co jest zgodne z niezależnym rozwijaniem wewnętrznych zwojów DNA poszczególnych nukleosomów27,30. Parametry te mogą być wykorzystane do oszacowania liczby nukleosomów utworzonych na każdym punkcie mocowania lub do dalszej analizy mechaniki nukleosomów. W ten sposób liczbę zerwań zwojów wewnętrznych uzyskaną z eksperymentów z mechanicznym rozciąganiem porównano z szacowaną liczbą znakowanych kopii H4 przy każdej trajektorii nukleosomu na podstawie intensywności monomeru, co wykazało, że wartości te są w dużej mierze spójne (przykłady przedstawiono na Rysunkach 2D-G). Zauważono jednak, że nie pokrywają się one idealnie ze względu na ~70% wydajność znakowania białka H4 w próbce oraz ewentualne resztkowe wiązanie histonów z DNA niezależne od Nap1, co pokazano na Rysunku 1F. Wreszcie, zgodnie z oczekiwaniami, rozciąganie gołych nici DNA związanych z Nap1 (bez histonów) nie generuje przejść indukowanych siłą (Rysunek 2H), co wskazuje, że samo Nap1 nie zniekształca znacząco DNA.
Wykorzystując układ opisany w kroku 5 (Ryc. 3A), wiązanie histony łączącej H1 z chromatyną wizualizowano jako pojawienie się zielonych fluorescencyjnych punktów wzdłuż zakotwiczonej chromatyny (Ryc. 3B). Co istotne, nukleosomy związane z H1 generowały dwukolorowe trajektorie (patrz białe strzałki na Ryc. 3B), które w czasie wydawały się stacjonarne. Dodatkowo zaobserwowano trajektorie dyfuzji H1 w obszarach DNA wolnych od nukleosomów (patrz zielone gwiazdki na Ryc. 3B).

Rycina 1: Nap1-zależna formacja nukleosomów in situ. (A) Schemat układu doświadczalnego opisanego w protokole Nap1-zależnej formacji nukleosomów in situ (krok 3). Para kulek została uwięziona optycznie w kanale 1, a pojedyncza cząsteczka λ DNA została przywiązana między kulkami za pomocą wiązania biotyna-streptawidyna w kanale 2. Następnie wiązanie przeniesiono do kanału 4, zawierającego znakowane LD655 oktamery histonów (czerwone) oraz Nap1, w celu obserwacji formacji nukleosomów w czasie rzeczywistym wzdłuż nici DNA. (B) Reprezentatywny skan 2D (lewo) i kymograf (prawo) wiązania DNA zawierającego nukleosom znakowany LD655-H4. Powiązany odczyt siły (dół) wykazuje wzrost siły natychmiast po przeniesieniu wiązania do kanału 4 przy stałych pozycjach pułapek optycznych, co wskazuje na owijanie nukleosomu. Jaśniejsze trajektorie oznaczają wiele sąsiednich nukleosomów znajdujących się w granicach dyfrakcji wynoszących ~300 nm. (C) Przykładowy kymograf pokazujący jednoetapowe zdarzenie fotobleachingu (biała strzałka) nukleosomu zawierającego LD655-H4. (D) Przykładowy kymograf pokazujący dwuetapowe zdarzenie fotobleachingu (białe strzałki) nukleosomu zawierającego LD655-H4. (E) Względna częstość występowania liczby znakowanych LD655 H4 na trajektorię, oszacowana na podstawie ich intensywności fluorescencji. (F) Reprezentatywny kymograf wiązania z przyłączonymi oktamerami histonów w obecności Nap1. Powiązany odczyt siły (dół) pozostaje niezmieniony, nawet gdy oktamery histonów wiążą się z DNA. (G) Reprezentatywny kymograf wiązania DNA zawierającego nukleosom znakowany Cy3-H2A. Powiązany odczyt siły (dół) wykazuje wzrost siły natychmiast po przeniesieniu wiązania do kanału 4 (zawierającego oktamery i Nap1), w miarę formowania się nukleosomów przy stałych pozycjach pułapek optycznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 2: Test rozwijania nukleosomów. (A) Schemat układu eksperymentalnego opisanego w protokole rozwijania nukleosomów (krok 4). Przymocowany DNA zawierający nukleosomy przeniesiono do kanału 3 zawierającego bufor obrazujący wolny od białek, w którym zwiększono odległość między koralikami, co doprowadziło do rozwijania nukleosomów. (B) Reprezentatywny kymograf przymocowanego DNA zawierającego nukleosomy, rozciąganego z dużymi siłami poprzez stopniowe zwiększanie odległości między koralikami. Spadek intensywności fluorescencji w kierunku dolnego koralika wynikał prawdopodobnie z lekkiego odchylenia DNA poza płaszczyznę ogniskowania skanowania. (C) Powiązana krzywa FD przedstawiająca indukowane siłą przejścia rozwijania wewnętrznego zwoju zachodzące w zakresie 8-37 pN. Wstawka przedstawia powiększony widok przykładowego przejścia, dla którego można zarejestrować i dalej analizować odległość rozwijania (ΔL = ~24 nm dla wewnętrznego zwoju DNA pojedynczych nukleosomów) oraz siłę przejścia (Transition F). W przypadku tej nici rozwindingowano 26 nukleosomów, a nić pękła przy ~65 pN, co zaznaczono białą linią przerywaną na kymografie. (D,E) Przykład przymocowanego DNA zawierającego nukleosomy LD655-H4 rozciąganego z dużymi siłami, gdzie liczbę H4 na trajektorię szacuje się poprzez intensywność fluorescencji (wskazana na kymografie, D), a liczbę owiniętych nukleosomów szacuje się poprzez wielkość indukowanej siłą zmiany odległości (wskazana na powiązanej krzywej siła-odległość, E). (F,G) Inny przykład, analogiczny do (D,E). (H) Przymocowane DNA (n = 5) rozciągane z dużymi siłami po inkubacji w kanale zawierającym wyłącznie Nap1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 3: Wizualizacja oddziaływania białko-chromatyna. (A) Schemat układu eksperymentalnego opisanego w protokole wizualizacji wiązania białek z chromatyną (krok 5). Tether DNA zawierający nukleosomy został przeniesiony do kanału 5, zawierającego 10 nM histony łączącej H1 znakowanej Cy3 (kolor zielony). (B) Reprezentatywny dwukolorowy kymograf wiązania H1 do tethera DNA zawierającego nukleosomy. Zdarzenia kolokalizacji H1 z nukleosomem oznaczono białymi strzałkami. Trajektorię niezmodyfikowanego nukleosomu oznaczono różową strzałką. Cząsteczki H1 dyfundujące na gołym DNA oznaczono zielonymi gwiazdkami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.