Artykuł metodologiczny

Składanie nukleosomów in situ do mikroskopii korelacyjnej i fluorescencyjnej pojedynczej cząsteczki

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66579

⸱

6 września 2024

 ,  ,  , 
1Laboratory of Nanoscale Biophysics and Biochemistry, The Rockefeller University, 2Tri-Institutional PhD Program in Chemical Biology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia szczegółową procedurę eksperymentalną odtwarzania nukleosomów DNA dla siły korelacji pojedynczej cząsteczki i mikroskopii fluorescencyjnej. Dalej opisano kilka dalszych eksperymentów, które można przeprowadzić w celu wizualizacji zachowania wiązania białek oddziałujących z chromatyną i analizy zmian właściwości fizycznych nukleosomów.

Streszczenie

Nukleosomy stanowią podstawową jednostkę chromatyny eukariotycznej i były przedmiotem licznych badań informacyjnych pojedynczych cząsteczek dotyczących ich właściwości biofizycznych i interakcji z białkami wiążącymi chromatynę. Rekonstytucja nukleosomów na DNA w tych badaniach zazwyczaj obejmuje procedurę dializy solnej, która zapewnia precyzyjną kontrolę nad rozmieszczeniem i liczbą nukleosomów utworzonych wzdłuż uwięzi DNA. Jednak protokół ten jest czasochłonny i wymaga znacznej ilości oktamerów DNA i histonów jako danych wejściowych. Aby zaoferować alternatywną strategię, opisano metodę rekonstytucji nukleosomów in situ dla mikroskopii siły pojedynczej cząsteczki i fluorescencji, która wykorzystuje histon opiekuńczy Nap1. Ta metoda umożliwia użytkownikom składanie nukleosomów na dowolnej matrycy DNA bez konieczności stosowania silnych sekwencji pozycjonowania nukleosomów, dostosowywanie gęstości nukleosomów na żądanie i używanie mniejszej liczby odczynników. Tworzenie nukleosomów in situ następuje w ciągu kilku sekund, co zapewnia prostszy przebieg eksperymentu i wygodne przejście do pomiarów pojedynczych cząsteczek. Dalej opisano przykłady dwóch dalszych testów do badania mechaniki nukleosomów i wizualizacji zachowania poszczególnych białek na chromatynie.

Wprowadzenie

Podstawową jednostką pakującą chromatyny eukariotycznej jest nukleosom, w którym ~147 par zasad (bps) DNA jest owiniętych wokół oktamera białek histonów rdzeniowych1,2. Oprócz pakowania genomu, architektura nukleosomów służy jako kolejna bogata warstwa regulacji biofizycznej, która może być wykorzystana przez białka wiążące chromatynę podczas wykonywania ich różnych funkcji3,4. Eksperymentalny dostęp i pomiar fizycznych cech nukleosomów był technicznie trudny, ponieważ jednostki te działają w maleńkich skalach (np. długości nanometrów, siły Piconwtona), a zatem ich sondowanie wymaga wystarczającej czułości i precyzji, aby sensownie informować o funkcji. Co więcej, białka wiążące chromatynę często wchodzą w interakcje ze swoimi substratami przejściowo, a większość podejść zespołowych nie ma odpowiedniej rozdzielczości czasowej, aby informować o kinetyce tych interakcji5. Na szczęście pojawienie się technik jednocząsteczkowych umożliwiło wizualizację i manipulowanie pojedynczymi białkami i ich interakcjami w czasie rzeczywistym, ujawniając mechanistyczne informacje o tych zdarzeniach molekularnych zachodzących w nanoskali6. W szczególności mikroskopia siły korelacyjnej i fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smCFFM) wykorzystuje zarówno narzędzia do wykrywania fluorescencji o wysokiej rozdzielczości, jak i manipulacji siłami, aby jednocześnie określić mechanikę, skład i koordynację chromatyny i kompleksów chromatyna-białko7,8.

W smCFFM, który wykorzystuje "pęsetę optyczną" jako metodę manipulacji siłą, ściśle zogniskowany laser jest używany do uwięzienia obiektu dielektrycznego, zazwyczaj plastikowego koralika o rozmiarach mikronów, w trzech wymiarach9. Biopolimer, taki jak fragment DNA, może być sprzężony z kulką (poprzez np. połączenie streptawidyna-biotyna, digoksygenina-przeciwciało anty-digoksygenina), a użytkownik może zarówno przyłożyć skalibrowaną siłę, jak i zmierzyć siłę/przemieszczenie generowane przez system10. Dodany moduł fluorescencji umożliwia jednoczesne wielokolorowe obrazowanie fluorescencyjne w celu śledzenia składu i zachowania białek.

Główna metoda odtwarzania szablonów nukleosomów dla smCFFM polega na składaniu nukleosomów na niestandardowych matrycach DNA za pomocą dializy solnej11,12,13. W tej procedurze oczyszczone oktamery histonowe są inkubowane z matrycami DNA w buforze o wysokiej zawartości soli (~1 M chlorek sodu), a gdy sól jest powoli dializowana, nukleosomy spontanicznie gromadzą się na DNA w sposób zależny od sekwencji14,15. W związku z tym zwyczajowo silne sekwencje pozycjonowania nukleosomów (np. Widom 60116, X. laevis 5S rDNA17) są włączane do matryc DNA w celu wygenerowania niestandardowych macierzy nukleosomów. Chociaż ta dobrze ugruntowana metoda oferuje precyzyjną kontrolę nad rozmieszczeniem i liczbą nukleosomów w DNA, ma kilka wad: (1) włączenie silnych sekwencji DNA do pozycjonowania nukleosomów może generować sztucznie stabilne nukleosomy, które wpływają na aktywność białek wiążących chromatynę, (2) proces dializy soli w celu wytworzenia nukleosomów wymaga dużych ilości DNA i oktamerów, oraz (3) procedura wymaga od jednego do kilku dni pracy, a także znacznego wysiłku, aby miareczkować prawidłowy stosunek DNA do oktamerów w celu uzyskania optymalnej gęstości macierzy nukleosomów.

W tym manuskrypcie opisujemy alternatywną metodę tworzenia nukleosomów wzdłuż DNA in situ w mikroskopie siły korelacyjnej i fluorescencji pojedynczej cząsteczki przy użyciu rekombinowanego białka opiekuńczego histonów Nap1, który przypomina fizjologiczny szlak powstawania nukleosomów in vivo18,19,20,21,22. Ta metoda pozwala użytkownikom składać nukleosomy na niespecyficznych sekwencjach DNA, łatwo dostosowywać gęstość nukleosomów i zużywać znacznie mniej odczynników, a wszystko to w ciągu kilku minut. Ponadto tworzenie nukleosomalnych pęt DNA in situ umożliwia prostszy przebieg eksperymentów oraz wygodę wbudowanej wizualizacji i manipulacji pojedynczymi cząsteczkami. Tak więc, gdy jednolite i specyficzne pozycjonowanie nukleosomów nie jest koniecznością, protokół ten oferuje przydatną opcję do badania mechaniki nukleosomów lub zachowania białek na chromatynie, dla których opisujemy również przykładowe testy.

Protokół

Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie biotynylowanego DNA

  1. Przygotować reakcję objętościową o objętości 120 μl zawierającą 20 μg λ DNA, 33 μM biotyny-dCTP, 33 μM biotyny-dUTP, 33 μM biotyny-dATP, 33 μM dGTP, 10 jednostek enzymu Klenowa i 1x bufor NEB 2,
    UWAGA: Ta procedura w szczególności wykorzystuje liniowy, dwuniciowy, wolny od metylacji genomowy DNA bakteriofaga λ (48 502 bps), który zawiera 12-nukleotydowy (nt) 5' jednoniciowy (ss) nawis DNA23. Protokół można jednak dostosować do wykorzystania dowolnej długości lub sekwencji liniowego dsDNA, pod warunkiem, że zawiera on co najmniej kilka nt zwisów ss 5', przy czym długość i sekwencja nt dyktują liczbę biotynylowanych nt zainstalowanych na każdym końcu w celu dalszego wiązania między pułapkami optycznymi. Dodatkowo reakcję można zmniejszyć w dół. Na przykład 5 μg DNA można wykorzystać w reakcji objętościowej 30 μl. Dodatkowo wygenerowane w ten sposób substraty DNA nie są ograniczone skrętnie. Aby zapoznać się z protokołami tworzenia DNA ograniczonego skrętnie, zapoznaj się z wcześniej opublikowanymi raportami24,25.
  2. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  3. Dodać 10 mM EDTA i inkubować w temperaturze 75 °C przez 20 minut.
  4. Przeprowadzić wytrącanie etanolu, aby uzyskać biotynylowany produkt DNA.
    1. Dodaj 0,1x objętość 3 M octanu sodu i 3 razy objętość lodowatego 100% etanolu. Przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę do nocy. Wirować przy 13 500 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Ostrożnie usunąć sklarat nad osadem, nie naruszając osadu i dodać 1 ml 75% etanolu. Wirować przy 13 500 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.
    3. Powtórzyć etapy usuwania sklarowanego osadu, dodawania etanolu i wirowania.
    4. Ostrożnie usunąć cały sklarat nad osadem i pozostawić osad do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut. Rozpuścić osad w 100-200 μl buforu TE lub ddH2O (może być inkubowany w temperaturze 37 °C w celu ułatwienia rozpuszczenia). Zmierz stężenie za pomocą spektrofotometru Nanodrop.

2. Przygotowanie kanałów w komórce przepływowej

UWAGA: Ta procedura opiera się na dostępnym na rynku chipie mikroprzepływowym (patrz Tabela materiałów), ale może być dostosowana do dowolnego instrumentu smCFFM z wielokanałową komórką przepływową.

  1. Pasywuj kanały (ch.) 4 i 5 (lub dowolny kanał, który będzie zawierał białka) (patrz schemat kanałów w Rysunek 1A). Dodaj 500 μl 0,1% BSA do każdego kanału i przepływaj pod ciśnieniem 0,8 bara (~0,45 μl/s dla przewodów o średnicy wewnętrznej 0,010 cala) przez 8 minut. Usuń roztwór.
  2. Dodać 500 μl 0,05% Pluronic-F127 do każdego kanału i płynąć pod ciśnieniem 0,8 bara przez 8 minut. Usunąć roztwór i wypłukać strzykawki 1x PBS. Dodaj 2 ml 1x PBS do każdego kanału i płyń pod ciśnieniem 0,8 bara przez 27 minut.
  3. Zmieszaj roztwór podstawowy kulek pokrytych streptawidyną (w tej procedurze wykorzystuje się kulki o rozmiarze 3,13 μm) i dodaj 2,15 μl roztworu kulek do 1 ml 1x PBS. Dodać do kanału 1.
    UWAGA: Rozmiar i stężenie kulek pokrytych streptawidyną można dostosować zgodnie z preferencjami użytkownika.
  4. Dodaj 30-80 ng biotynylowanego λ DNA do 1 ml 1x PBS. Dodaj do kanału 2.
    UWAGA: Stężenie biotynylowanego DNA można dostosować do preferencji użytkownika. Większe ilości DNA zwiększą częstotliwość tworzenia się pęt DNA, ale także zwiększą częstotliwość wiązania wielu cząsteczek DNA jednocześnie, co może zwiększyć trudność eksperymentu.

3. Tworzenie nukleosomów in situ za pośrednictwem Nap1

  1. Dodać 500 μl bezbiałkowego bufora obrazu do kanału 3,
    UWAGA: Skład buforu w kan. 3 jest elastyczny i powinien być odpowiedni zarówno dla nukleosomów, jak i dla określonego białka (białek) będących przedmiotem zainteresowania. Opcjonalnie użytkownicy mogą zdecydować się na dodanie systemów oczyszczania tlenu w celu zmniejszenia fotowybielania fluoroforów i/lub DNA konkurencji w celu usunięcia oktamerów histonów, które nie są prawidłowo owinięte w nukleosomy.
  2. Dodaj 2 nM S. cerevisiae Nap1 i 2-5 nM oktamera histonu H4 znakowanego LD655 (HO) do 500 μl 1x buforu HR18. Dodaj do kanału 4.
    UWAGA: Oktamery histonów i Nap1 można kupić komercyjnie lub przygotować we własnym zakresie (patrz Tabela materiałów). Liczba nukleosomów, które mają powstać wzdłuż każdego uwięzionego DNA, zależy od stężenia oktamera, a także od czasu spędzonego w tym kanale. Pożądana przez użytkownika i przybliżona gęstość nukleosomów wzdłuż każdej cząsteczki DNA może być modulowana poprzez dostosowanie jednego lub obu tych parametrów. Dodatkowo użytkownik może zdecydować się na oznakowanie oktamerów histonów preferowanym fluoroforem.
  3. Opcjonalnie: Dodać białko wiążące chromatynę lub inne interesujące białko do kanału 5 w odpowiednim buforze.
  4. Przepłyń wszystkie kanały pod ciśnieniem 1,0 bara (~0,55 μl / s w obecnej konfiguracji eksperymentalnej) przez 30 sekund, aby przepłukać kanały komory przepływowej próbkami.
  5. Ustaw przepływ na 0,2 bara (~0,16 μl/s w obecnej konfiguracji eksperymentalnej). Przesuń pułapki optyczne (OT) do kanału 1 i złap odpowiednią parę kulek pokrytych streptawidyną.
  6. Przesuń OT do kanału 3, przeprowadź kalibrację siły dla pary koralików, włącz czerwony laser konfokalny (lub inną wybraną linię laserową) i skalibruj obszar obrazowania.
  7. Ustaw przepływ na 0,2 bara i przenieś OT do kanału 2. Złap biotynylowane DNA.
  8. Przenieś OT do kanału 3 i zatrzymaj przepływ. Zwiększ odległość między OT, aby rozciągnąć DNA i monitorować powiązaną krzywą siła-odległość (FD), aby potwierdzić obecność pojedynczej uwięzi DNA (w przeciwieństwie do wielu uwięzi). Krzywa powinna być zgodna z modelem łańcucha podobnego do robaka dla dsDNA przy danej długości konturu26.
  9. Dostosuj odległość między OT tak, aby napięcie DNA wynosiło około 1 pN.
    UWAGA: Napięcie 1 pN jest wystarczająco niskie, aby nukleosomy mogły pozostać owinięte przez DNA27, ale jest wystarczająco wysokie, aby umieścić całą cząsteczkę DNA w obrębie linii skanującej oś obrazowania.
  10. Włącz skanowanie liniowe, aby rozpocząć zbieranie kimografu z włączonym czerwonym laserem.
    UWAGA: Można uzyskać kimografy lub skany 2D DNA na uwięzi, zgodnie z preferencjami użytkownika.
  11. Przenieś OT do kanału 4 z wyłączonym przepływem. Ułatwione przez Nap1, HO są ładowane do DNA i owijane w celu utworzenia nukleosomów w czasie rzeczywistym. Obciążenie nukleosomami jest wizualizowane jako trajektorie fluorescencyjne pojawiające się na DNA w kimogramach. Jednocześnie tworzenie się nukleosomów na DNA może być monitorowane przez wzrost siły, ponieważ więcej HO jest ładowanych, gdy pozycje OT są utrzymywane na stałym poziomie.
    UWAGA: Laser wzbudzenia fluorescencji można wyłączyć na etapie tworzenia nukleosomów, aby uniknąć fotowybielania fluoroforów. Dodatkowo, przy użyciu tego protokołu może wystąpić niespecyficzne wiązanie oktamerów histonowych z DNA, w którym oktamery nie są owinięte w nukleosomy. Te zdarzenia wiązania nie wygenerują "rozdarcia", gdy DNA jest rozciągane, jak opisano w poniższym protokole Odwijanie nukleosomów (krok 4), a czasami mogą zostać zmyte przez delikatny przepływ bufora, szczególnie jeśli bufor zawiera wolne konkurencyjne DNA.
  12. Gdy utworzy się przybliżona pożądana liczba nukleosomów, zacznij zbierać dane.

4. Rozpakowywanie nukleosomów

  1. Wykonaj kroki 2 i 3.
  2. Po utworzeniu uwięzi DNA zawierającej nukleosomy, przenieś OT do kanału 3.
  3. Przygotuj się do eksperymentów z odwijaniem nukleosomów, zmniejszając odległość między OT, aż siła będzie w przybliżeniu zerowa. Wyzeruj siłę.
  4. Rozpocznij odsuwanie OT 1 od OT 2 ze stałą prędkością 0,1 μm/s. Na kimografie koralik w OT 1 będzie wizualnie oddalał się od koralika w OT 2. Na krzywej FD siła będzie rosła wraz ze wzrostem odległości. W miarę rozwijania nukleosomów pojawią się "rozdarcia" lub przejścia w sile (~8-37 pN), które oznaczają rozplątanie wewnętrznego owinięcia poszczególnych nukleosomów27,28,29.
    UWAGA: Siła, przy której następuje odwijanie, zależy od szybkości ciągnięcia, która jest oczekiwana w przypadku procesów nierównowagowych. Czasami wiele nukleosomów rozwija się jednocześnie, powodując większą zmianę odległości w przejściu na krzywej FD. Dodatkowo, rozplątanie zewnętrznej warstwy nukleosomu nie jest łatwo widoczne w tym środowisku eksperymentalnym (patrz sekcja Dyskusja).

5. Wizualizacja wiązania białek z chromatyną

  1. Wykonaj kroki 2 i 3.
  2. Dodaj 10 nM znakowanego Cy3 histonu łącznikowego H1,4 do 500 μl bufora obrazu w kan. 5,
    UWAGA: Każde interesujące białko można dodać do kanału 5 w wybranym stężeniu (zwykle poniżej 100 nM w przypadku wizualizacji pojedynczej cząsteczki).
  3. Po utworzeniu uwięzi DNA zawierającej nukleosomy, włącz zielony laser oprócz czerwonego lasera i przesuń OT do kanału 5, aby obrazować w czasie rzeczywistym wiązanie H1 z chromatyną.
  4. Kontynuuj zbieranie kimografów lub skanów, aż zostaną osiągnięte wystarczające statystyki (co najmniej ~10-20 kimografów w zależności od częstotliwości zdarzeń i trudności eksperymentalnej).

Wyniki

Przy użyciu układu opisanego w kroku 3 (Rycina 1A), formowanie nukleosomów wzdłuż wiązania DNA wizualizowano jako pojawianie się czerwonych fluorescencyjnych ognisk w skanie 2D (Rycina 1B, lewo) lub trajektorii w czasie na kymografie (Rycina 1B, prawo). Prawidłowo owinięte nukleosomy generowały trajektorie fluorescencji, które pozostawały stacjonarne w czasie w obrębie limitu dyfrakcyjnego detekcji konfokalnej (~300 nm). Należy zauważyć, że wiele nukleosomów utworzonych blisko siebie, poniżej limitu dyfrakcyjnego, nie może zostać rozdzielonych przestrzennie i pojawia się jako jaśniejsze ogniska lub trajektorie. Niemniej jednak, przeanalizowano stopnie fotobleachingu poszczególnych trajektorii nukleosomalnych, które często wykazywały 1-stopniowe (Rycina 1C) lub 2-stopniowe (Rycina 1D) zdarzenia fotobleachingu, co wskazuje, że ogniska zawierały głównie mononukleosomy, biorąc pod uwagę około 70% stopień znakowania białka H4 w tej próbce. Ponadto, na podstawie średniej liczby fotonów dla pojedynczego fluoroforu LD655 w tych warunkach eksperymentalnych, oszacowano liczbę znakowanych kopii H4 w każdej trajektorii nukleosomu, co wykazało, że loci nukleosomów przeważnie (>75%) zawierały 1 lub 2 znakowane kopie H2A (Rycina 1E), co ponownie jest zgodne z założeniem, że były one ładowane głównie jako przestrzennie oddzielone mononukleosomy. Pozostałe jaśniejsze ogniska zawierały więcej niż 3 kopie znakowanego H4, co prawdopodobnie reprezentowało wiele nukleosomów w obrębie limitu dyfrakcyjnego.

Tworzenie nukleosomów monitorowano również poprzez wzrost naprężenia wzdłuż tethera, gdy pozycje OT pozostawały stałe, a większa ilość DNA owijała się wokół oktamerów histonowych (Rysunek 1B, dół). W przypadku braku Nap1 oktamery histonowe nadal mogą wiązać DNA, lecz pozostają w większości nieowinięte, co objawiało się stałym naprężeniem przy utrzymywaniu pozycji OT (Rysunek 1F). Jest możliwe, że niespecyficzne wiązanie oktamerów histonowych z DNA zachodzi nawet w obecności Nap1. W innym eksperymencie przeprowadzono ten sam protokół tworzenia nukleosomów zawierających H2A znakowane Cy3, co dało wyniki podobne do tych uzyskanych przy użyciu H4 znakowanych LD655 (Rysunek 1G), co wskazuje na montaż nienaruszonych oktamerów w nukleosomy.

Korzystając z układu opisanego w kroku 4 (Rysunek 2A), rozwijanie nukleosomów wizualizowano w czasie na kymografie wraz ze wzrostem odległości wiązania (Rysunek 2B). Wcześniej zgłaszano, że oktamery histonowe często pozostają związane z DNA po rozpleceniu30,31, w związku z czym trajektorie fluorescencyjne często utrzymują się nawet przy wysokim napięciu. Rozwijanie nukleosomów monitorowano również na powiązanej krzywej FD (Rysunek 2C). Mierzalne cechy krzywej FD obejmują siłę, przy której następuje rozplecenie nukleosomu(ów) (patrz „Transition F” na wstawce do Rysunku 2C), a także długość DNA uwolnionego z oktameru histonowego (patrz „ΔL” na wstawce do Rysunku 2C), która występuje w wielokrotnościach ~24 nm, co jest zgodne z niezależnym rozwijaniem wewnętrznych zwojów DNA poszczególnych nukleosomów27,30. Parametry te mogą być wykorzystane do oszacowania liczby nukleosomów utworzonych na każdym wiązaniu lub do dodatkowych analiz mechaniki nukleosomów. W ten sposób liczbę pęknięć zwojów wewnętrznych uzyskaną w eksperymentach z mechanicznym rozciąganiem porównano z szacowaną liczbą znakowanych kopii H4 w każdej trajektorii nukleosomu na podstawie intensywności monomeru, co wykazało, że wartości te są w dużej mierze spójne (przykłady przedstawiono na Rysunkach 2D-G). Zauważono jednak, że nie pokrywają się one idealnie ze względu na ok. 70% wydajność znakowania białka H4 w próbce oraz jakiekolwiek resztkowe wiązanie histonów z DNA niezależne od Nap1, jak pokazano na Rysunku 1F. Wreszcie, zgodnie z oczekiwaniami, rozciąganie gołych wiązań DNA związanych z Nap1 (bez histonów) nie generuje przejść indukowanych siłą (Rysunek 2H), co wskazuje, że samo Nap1 nie zniekształca znacząco DNA.

Wykorzystując układ opisany w kroku 5 (Rysunek 3A), wiązanie histony łączącej H1 z chromatyną zobrazowano jako pojawienie się zielonych fluorescencyjnych ognisk wzdłuż uwięzionej chromatyny (Rysunek 3B). Co istotne, nukleosomy związane z H1 generowały dwukolorowe trajektorie (patrz białe strzałki na Rysunku 3B), które w czasie wydawały się stacjonarne. Ponadto zaobserwowano trajektorie dyfundującej H1 w regionach DNA wolnych od nukleosomów (patrz zielone gwiazdki na Rysunku 3B).

Schemat konfokalnej fluorescencji w równowadze statycznej; układ pułapki optycznej do analizy DNA-nukleosomów.
Rycina 1: Formowanie nukleosomów in situ pośredniczone przez Nap1. (A) Schemat układu eksperymentalnego opisanego w protokole formowania nukleosomów in situ pośredniczonego przez Nap1 (krok 3). Para kulek została uwięziona optycznie w kanale 1, a pojedyncza cząsteczka λ DNA została przytwierdzona między kulkami poprzez wiązanie biotyna-streptawidyna w kanale 2. Następnie wiązanie przeniesiono do kanału 4, zawierającego oktamery histonowe znakowane LD655 (czerwony) oraz Nap1, w celu formowania nukleosomów w czasie rzeczywistym wzdłuż DNA. (B) Reprezentatywny skan 2D (lewo) i kymograf (prawo) wiązania DNA zawierającego nukleosom znakowany LD655-H4. Powiązany odczyt siły (dół) pokazuje wzrost siły natychmiast po przeniesieniu wiązania do kanału 4 przy stałych pozycjach pułapki optycznej, co wskazuje na owijanie nukleosomu. Jaśniejsze trajektorie oznaczają wiele sąsiednich nukleosomów znajdujących się w granicach dyfrakcji wynoszących ~300 nm. (C) Przykładowy kymograf pokazujący jednostopniowe zdarzenie fotowyblakania (biała strzałka) nukleosomu zawierającego LD655-H4. (D) Przykładowy kymograf pokazujący dwustopniowe zdarzenie fotowyblakania (białe strzałki) nukleosomu zawierającego LD655-H4. (E) Względna częstotliwość liczby znakowanych LD655 H4 na trajektorię, oszacowana na podstawie ich intensywności fluorescencji. (F) Reprezentatywny kymograf wiązania z przyłączonymi oktamerami histonowymi w obecności Nap1. Powiązany odczyt siły (dół) pozostaje niezmieniony, nawet gdy oktamery histonowe wiążą się z DNA. (G) Reprezentatywny kymograf wiązania DNA zawierającego nukleosom znakowany Cy3-H2A. Powiązany odczyt siły (dół) pokazuje wzrost siły natychmiast po przeniesieniu wiązania do kanału 4 (zawierającego oktamery i Nap1), ponieważ nukleosomy formują się przy stałych pozycjach pułapki optycznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Eksperyment z pułapką optyczną dotyczącą rozwijania nukleosomów; znakowanie LD655-H4; siła-odległość; analiza kymograficzna.
Rycina 2: Analiza rozwijania nukleosomów. (A) Schemat układu eksperymentalnego opisanego w protokole rozwijania nukleosomów (krok 4). DNA zakotwiczone, zawierające nukleosomy, przeniesiono do kanału 3 zawierającego bufor obrazujący wolny od białek, gdzie zwiększono odległość między koralikami, co doprowadziło do rozwijania nukleosomów. (B) Reprezentatywny kymograf zakotwiczonego DNA zawierającego nukleosomy, rozciąganego z dużymi siłami poprzez stopniowe zwiększanie odległości między koralikami. Spadek intensywności fluorescencji w stronę dolnego koralika wynikał prawdopodobnie z lekkiego odchylenia DNA poza płaszczyznę ogniskowania skanowania. (C) Powiązana krzywa FD przedstawiająca indukowane siłą przejścia rozwijania wewnętrznych zwojów zachodzące w zakresie 8-37 pN. Wstawka przedstawia powiększony widok przykładowego przejścia, dla którego można zarejestrować i dalej analizować odległość rozwijania (ΔL = ~24 nm dla wewnętrznego zwoju DNA poszczególnych nukleosomów) oraz siłę przejścia (Transition F). W przypadku tego zakotwiczenia rozwinięto 26 nukleosomów, a wiązanie pękło przy ~65 pN, co zaznaczono białą przerywaną linią na kymografie. (D,E) Przykład zakotwiczenia z nukleosomami znakowanymi LD655-H4 rozciąganego z dużymi siłami, gdzie liczbę H4 na trajektorię szacuje się poprzez intensywność fluorescencji (wskazana na kymografie, D), a liczbę zawiniętych nukleosomów szacuje się poprzez wielkość indukowanej siłą zmiany odległości (wskazana na powiązanej krzywej siła-odległość, E). (F,G) Kolejny przykład analogiczny do (D,E). (H) Zakotwiczone DNA (n = 5) rozciągane z dużymi siłami po inkubacji w kanale zawierającym wyłącznie Nap1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat oddziaływania histon-DNA z wykorzystaniem pułapki optycznej, fluorescencji konfokalnej, analiza nukleosomów.
Rysunek 3: Wizualizacja oddziaływania białko-chromatyna. (A) Schemat układu eksperymentalnego opisanego w protokole wizualizacji wiązania białek z chromatyną (krok 5). Przymocowany fragment DNA zawierający nukleosomy przeniesiono do kanału 5, zawierającego 10 nM histonu łączącego H1 znakowanego Cy3 (kolor zielony). (B) Reprezentatywny dwukolorowy kymograf wiązania H1 do przymocowanego fragmentu DNA zawierającego nukleosomy. Zdarzenia kolokalizacji H1 z nukleosomem zaznaczono białymi strzałkami. Trajektorię niezwiązanego nukleosomu zaznaczono purpurową strzałką. Cząsteczki H1 dyfundujące na gołym DNA zaznaczono zielonymi gwiazdkami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Opisany protokół zapewnia kilka korzyści w zakresie rekonstytucji nukleosomów, w tym minimalizację odczynników i czasu, a także umożliwia tworzenie nukleosomów zależnych od białka opiekuńczego wzdłuż dowolnej (potencjalnie natywnej) sekwencji DNA. Co więcej, metoda in situ pozwala na uproszczenie przebiegu eksperymentów i wygodne przejście do jednocząsteczkowych testów mechaniki nukleosomów i interakcji białko-chromatyna. Z drugiej strony, ograniczenia tego podejścia obejmują niemożność kierowania pozycjonowaniem nukleosomów wzdłuż DNA (nawet przy włączeniu silnych sekwencji pozycjonowania nukleosomów) i precyzyjnego kontrolowania liczby nukleosomów utworzonych na uwięzi DNA (chociaż można to empirycznie dostroić poprzez standaryzację eksperymentalnego przepływu pracy). W efekcie, ci, którzy wybierają tę metodę, handlują precyzyjną kontrolą położenia i gęstości nukleosomów, aby uzyskać większą łatwość pracy i niskie zapotrzebowanie na odczynniki, których wybór zależy od każdego konkretnego eksperymentu. Należy również zauważyć, że zewnętrzny zwój DNA nie jest rozwiązany w obecnym protokole ze względu na dużą długość uwięzi (~48,5 kb/s) i warunki buforowe32. Aby uzyskać informacje o zewnętrznym zwoju DNA, a także o układaniu międzynukleosomów, użytkownik może zdecydować się na skrócenie długości DNA i załadowanie większej gęstości nukleosomów do DNA i/lub użyć metody dializy solnej do umieszczenia nukleosomów na silnych sekwencjach pozycjonujących, które są oddzielone regularnymi długościami łącznika. Wreszcie, prawdopodobne jest niespecyficzne wiązanie oktamerów histonowych z DNA; Dlatego ważne jest, aby podczas interpretacji wyników wziąć pod uwagę zarówno sygnały fluorescencji, jak i siły.

Jednym z krytycznych aspektów obecnego protokołu jest zapewnienie, że użytkownik osiągnął wysoki wskaźnik znakowania fluorescencyjnego dla oktamerów histonowych (jeśli wymagana jest wizualizacja), tak aby większość, jeśli nie wszystkie, nukleosomy można było wykryć wizualnie. Kolejnym krytycznym aspektem jest potwierdzenie, że użytkownik wybrał odpowiedni bufor dla kanału obrazowania, który jest kompatybilny z nukleosomami i innymi interesującymi go białkami. Specyficzne dla użytkownika modyfikacje protokołu mogą obejmować koniugację fluoroforu z innym histonem (zob. raporty 33,34 dla przykładów użycia tej metody do tworzenia nukleosomów ze znakowanym H3 lub H2B), wybór alternatywnego fluoroforu, włączenie pęt DNA o różnych sekwencjach i długościach, dodanie systemu pochłaniania tlenu w celu przedłużenia żywotności fluoroforów, wybór innego rozmiaru kulek, i wykorzystując alternatywny system koniugacji DNA-kulka (np. połączenie przeciwciał digoksygenina-anty-digoksygenina).

Podsumowując, opisana metoda zapewnia smCFFM wygodne i wszechstronne podejście do generowania uwięzi zawierających nukleosomy, które można łatwo wykorzystać do badania szerokiego zakresu pytań dotyczących chromatyny w biologii. Odpowiednie obszary badawcze obejmują mechanikę chromatyny regulowaną przez warianty histonów i modyfikacje potranslacyjne, zaangażowanie biofizyczne i kinetykę białek wiążących chromatynę oraz procesy składania wyższego rzędu kierowane przez nukleosomy, takie jak kondensacja biomolekularna 35,36,37,38.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

G. N. L. C. dziękuje za wsparcie od Narodowego Instytutu Zdrowia Psychicznego Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) pod numerem nagrody F31MH132306. S. L. jest wspierane przez Fundację Robertsona, Międzynarodową Fundację Zespołu Retta oraz NIH (numer nagrody R01GM149862).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1x bufor HRnie30 mM  tris  octan pH 7,5, 20 mM octan magnezu, 50 mM chlorek potasu, 0,1 mg/ml BSA 
1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)N/AN/D137 mM chlorek sodu, 2,7 mM chlorek potasu, 10 mM fosforan sodu dwuzasadowy, 1,8 mM fosforan potasu jednozasadowy 
Kwas octowy, lodowatyMillipore SigmaAX0074-6Służy do wytwarzania octanu tris
Biotyna-11-dUTPJena BioscienceNU-803-BIOX-S
Biotyna-14-dATPJena BioscienceNU-835-BIO14-S
Biotyna-14-dCTPJena BioscienceNU-956-BIO14-S
Albumina surowicy bydlęcejMillipore SigmaA9418-50GRozpuszczanie w H2O i przepuścić przez filtr 0,22 um
Cy3 Maleimid Mono-Reaktywny barwnikCytivaPA23031Maleimidowy funkcjonalizowany fluorofor Cy3
dGTPNew England BiolabsN0442S
Wirówka Eppendorf 5425 RFisher Scientific05-414-051Wirówka stołowa z chłodzeniem
Alkohol etylowy, czystyMillipore Sigma459844
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Milipor SigmaE9884Rozpuścić w H2O do 0,5 M
Ludzki oktamer histonowy (H4, L50C; H2A, K119C) N/AN/ARekombinowane białka histonowe i te zawierające mutacje znakujące zostały oczyszczone we własnym zakresie, jak opisano wcześniej (patrz odnośniki 33, 34, 35, 36). Krótko mówiąc, rekombinowane histony ulegały ekspresji w komórkach BL21 (De3) pLySS (Promega). Ciała inkluzyjne wyizolowano po sonikacji, a histony wyekstrahowano w warunkach denaturacji. Histony dializowano do buforu A (7 M mocznika, 10 mM trichlorowodorku o pH 8,0, 100 mM chlorku sodu, 1 mM EDTA i 5 mM 2-merkaptoetanolu), a roztwór dodano do kolumny grawitacyjnej załadowanej Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). Przepływ został następnie dodany do kolumny grawitacyjnej załadowanej SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), a histony zostały wymyte z kolumny przez dodanie buforu A uzupełnionego 600 mM chlorku sodu. Histony zawierające mutacje znakujące (H4, L50C; H2A, K119C) oczyszczono, a następnie sprzężono z pożądanym fluoroforem za pomocą barwników funkcjonalizowanych maleimidem (Cytiva, Lumidyne) przy użyciu stosunku molowego barwnika do białka 20:1 (patrz odnośniki 33, 34). Oktamery histonów łączono przez dodanie równego stosunku molowego każdego histonu typu dzikiego lub znakowanego fluoroforem w warunkach denaturacji, dializowano do buforu o wysokiej zawartości soli zawierającego 2 M chlorek sodu, a następnie oczyszczano za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar, jak opisano wcześniej (patrz odnośniki 36, 37). Alternatywnie, pojedyncze białka histonowe i gotowe oktamery histonowe można kupić na rynku (np. Epicypher). 
Bufor obrazuN/AN/A20 mM chlorowodorek tris pH 8,0, 100 mM chlorek sodu
Fragment Klenowa (egzo-3 'do 5'New England BiolabsM0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)Thermo Fisher ScientificSD0021Bez metylacji λ DNA
LD655-MALLumidyne Technologies9Funkcjonalizowany maleimidem fluorofor LD655
Łącznik histon H1.4 (A4C)N/AN/AOczyszczone białko rekombinowane wykonane we własnym zakresie (patrz ref. 38)
LUMICKS C-Trap DymoLUMICKSN/AKonfiguracja podwójnej pułapki; standardowe materiały do instrumentu dostarczone przez producenta
Roztwór octanu magnezuMillipore Sigma63052-100MLSłuży do wytwarzania buforu HR
NEBuffer 2New England BiolabsB7002SW zestawie Klenow Zestaw fragmentów
Pluronic F-127Millipore SigmaP2443-250GRozpuszczaj się w H2O i przepuszczaj przez filtr 0,22 um
Chlorek potasuMillipore SigmaP3911Służy do wytwarzania PBS i buforu HR
Fosforan potasu jednozasadowyMillipore SigmaP0662Służy do wytwarzania PBS
em>S. cerevisiae Nap1N/A/ANap1 został oczyszczony we własnym zakresie, jak opisano wcześniej (patrz odnośniki 33, 34). Alternatywnie Nap1 można kupić komercyjnie (np. Active Motif).
Octan soduMillipore Sigma 241245Rozpuścić w H2O do 3 M
Chlorek soduMillipore SigmaS9888Służy do wytwarzania PBS i bufora obrazu
Fosforan sodu dwuzasadowyMilipore SigmaS9763Służy do wytwarzania
cząstek powlekanych biotyną PBS SPHERO (3,0-3,4 i mikro; m)SpherotechTP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c SpektrofotometrFisher ScientificND2000NanoDrop Spektrofotometr
Tris Base FisherScientificBP152-500Rozpuścić w H2O i dostosować do odpowiedniego pH; Użyj do wykonania bufora obrazu i octanu tris
dotyczy ) < N

Bibliografia

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: A repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  3. Zhou, K., Gaullier, G., Luger, K. Nucleosome structure and dynamics are coming of age. Nat Struct Mol Biol. 26, 3-13 (2019).
  4. McGinty, R. K., Tan, S. Principles of nucleosome recognition by chromatin factors and enzymes. Curr Opin Struct Biol. 71, 16-26 (2021).
  5. Fierz, B., Poirier, M. G. Biophysics of chromatin dynamics. Annu Rev Biophys. 48, 321-345 (2019).
  6. Single-molecule techniques: A laboratory manual. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  7. Chua, G. N. L., Liu, S. When force met fluorescence: Single-molecule manipulation and visualization of protein-DNA interactions. Annu Rev Biophys. , (2024).
  8. Hashemi Shabestari, M., Meijering, A. E. C., Roos, W. H., Wuite, G. J. L., Peterman, E. J. G. Recent Advances in biological single-molecule applications of optical tweezers and fluorescence microscopy. Methods Enzymol. 582, 85-119 (2017).
  9. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Opt Lett. 11, 288(1986).
  10. Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
  11. Hansen, J. C., van Holde, K. E., Lohr, D. The mechanism of nucleosome assembly onto oligomers of the sea urchin 5 S DNA positioning sequence. J Biol Chem. 266, 4276-4282 (1991).
  12. Salt Peterson, C. L. gradient dialysis reconstitution of nucleosomes. CSH Protoc. 2008, 5113(2008).
  13. Leicher, R., Liu, S. Probing the interaction between chromatin and chromatin-associated complexes with optical tweezers. Methods Mol Biol. 2478, 313-327 (2022).
  14. Segal, E., et al. A genomic code for nucleosome positioning. Nature. 442, 772-778 (2006).
  15. Ioshikhes, I. P., Albert, I., Zanton, S. J., Pugh, B. F. Nucleosome positions predicted through comparative genomics. Nat Genet. 38, 1210-1215 (2006).
  16. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J Mol Biol. 276, 19-42 (1998).
  17. Chipev, C. C., Wolffe, A. P. Chromosomal organization of Xenopus laevis oocyte and somatic 5S rRNA genes in vivo. Mol Cell Biol. 12, 45-55 (1992).
  18. Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination. Cell. 181, 1380-1394 (2020).
  19. Vlijm, R., et al. Comparing the assembly and handedness dynamics of (H3.3-H4)2 tetrasomes to canonical tetrasomes. PLoS One. 10, e0141267(2015).
  20. Mazurkiewicz, J., Kepert, J. F., Rippe, K. On the mechanism of nucleosome assembly by histone chaperone NAP1. J Biol Chem. 281, 16462-16472 (2006).
  21. Nakagawa, T., Bulger, M., Muramatsu, M., Ito, T. Multistep chromatin assembly on supercoiled plasmid DNA by nucleosome assembly protein-1 and ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor. J Biol Chem. 276, 27384-27391 (2001).
  22. Andrews, A. J., Chen, X., Zevin, A., Stargell, L. A., Luger, K. The histone chaperone Nap1 promotes nucleosome assembly by eliminating nonnucleosomal histone DNA interactions. Mol Cell. 37, 834-842 (2010).
  23. Wu, R., Taylor, E. Nucleotide sequence analysis of DNA. II. Complete nucleotide sequence of the cohesive ends of bacteriophage lambda DNA. J Mol Biol. 57, 491-511 (1971).
  24. King, G. A., Peterman, E. J., Wuite, G. J. Unravelling the structural plasticity of stretched DNA under torsional constraint. Nat Commun. 7, 11810(2016).
  25. Paik, D. H., Roskens, V. A., Perkins, T. T. Torsionally constrained DNA for single-molecule assays: An efficient, ligation-free method. Nucleic Acids Res. 41, e179(2013).
  26. Bustamante, C. J., Chemla, Y. R., Liu, S., Wang, M. D. Optical tweezers in single-molecule biophysics. Nat Rev Methods Primers. 1, 25(2021).
  27. Diaz-Celis, C., et al. Assignment of structural transitions during mechanical unwrapping of nucleosomes and their disassembly products. Proc Natl Acad Sci USA. 119, e2206513119(2022).
  28. Leicher, R., et al. Single-molecule and in silico dissection of the interaction between Polycomb repressive complex 2 and chromatin. Proc Natl Acad Sci USA. 117, 30465-30475 (2020).
  29. Chua, G. N. L., et al. Differential dynamics specify MeCP2 function at methylated DNA and nucleosomes. bioRxiv. , (2023).
  30. Brower-Toland, B. D., et al. Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA. Proc Natl Acad Sci USA. 99, 1960-1965 (2002).
  31. McCauley, M. J., et al. Human FACT subunits coordinate to catalyze both disassembly and reassembly of nucleosomes. Cell Rep. 41, 111858(2022).
  32. Mihardja, S., Spakowitz, A. J., Zhang, Y., Bustamante, C. Effect of force on mononucleosomal dynamics. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15871-15876 (2006).
  33. Li, S., et al. Nucleosome-directed replication origin licensing independent of a consensus DNA sequence. Nat Commun. 13, 4947(2022).
  34. Li, S., et al. Origin recognition complex harbors an intrinsic nucleosome remodeling activity. Proc Natl Acad Sci USA. 119, e2211568119(2022).
  35. Harada, B. T., et al. Stepwise nucleosome translocation by RSC remodeling complexes. Elife. 5, e10051(2016).
  36. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution. Methods Mol Biol. 119, 1-16 (1999).
  37. Rogge, R. A., et al. Assembly of nucleosomal arrays from recombinant core histones and nucleosome positioning DNA. J Vis Exp. (79), e50354(2013).
  38. Leicher, R., et al. Single-stranded nucleic acid binding and coacervation by linker histone H1. Nat Struct Mol Biol. 29, 463-471 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rekonstytucja in situmikroskopia pojedynczych cz steczekmikroskopia si owamechanika chromatynychaperon histonowy Nap1kotwica DNArozwijanie nukleosomuwi zanie histon w cznikowych

Powiązane artykuły