Artykuł metodologiczny

Test migracji in vitro w czasie rzeczywistym dla pierwotnych mysich limfocytów T CD8 +

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66580

⸱

24 maja 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester, 2David H. Smith Center for Vaccine Biology and Immunology, University of Rochester

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół zapewnia metodę pierwotnej izolacji mysich limfocytów T i mikroskopii poklatkowej migracji limfocytów T w określonych warunkach środowiskowych z analizą ilościową.

Streszczenie

Adaptacyjna odpowiedź immunologiczna zależy od zdolności limfocytów T do migracji przez krew, limfę i tkankę w odpowiedzi na patogeny i ciała obce. Migracja limfocytów T jest złożonym procesem, który wymaga koordynacji wielu sygnałów wejściowych ze środowiska i lokalnych komórek odpornościowych, w tym chemokin, receptorów chemokinowych i cząsteczek adhezyjnych. Ponadto na ruchliwość limfocytów T wpływają dynamiczne otaczające sygnały środowiskowe, które mogą zmieniać stan aktywacji, krajobraz transkrypcyjny, ekspresję cząsteczek adhezyjnych i inne. In vivo złożoność tych pozornie powiązanych ze sobą czynników utrudnia rozróżnienie poszczególnych sygnałów, które przyczyniają się do migracji limfocytów T. Protokół ten zapewnia szereg metod, od izolacji limfocytów T po analizę wspomaganą komputerowo w celu oceny migracji limfocytów T w czasie rzeczywistym w bardzo specyficznych warunkach środowiskowych. Warunki te mogą pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów regulujących migrację, poprawiając nasze zrozumienie kinetyki limfocytów T i dostarczając silnych dowodów mechanistycznych, które są trudne do uzyskania za pomocą eksperymentów na zwierzętach. Głębsze zrozumienie interakcji molekularnych, które wpływają na migrację komórek, jest ważne dla opracowania ulepszonych środków terapeutycznych.

Wprowadzenie

T limfocyty T są głównymi efektorami adaptacyjnej, specyficznej dla antygenu odpowiedzi immunologicznej. Na poziomie populacji limfocyty T są niejednorodne, składają się z podzbiorów komórkowych o odrębnych wyspecjalizowanych funkcjach. Co ważne, limfocyty T CD8+ są głównymi cytolitycznymi efektorami układu odpornościowego, które bezpośrednio eliminują zakażone lub dysfunkcyjne komórki1.

Dojrzałe limfocyty T CD8+ znajdują się w tkance i krążą we krwi i limfie w poszukiwaniu antygenów. Podczas infekcji limfocyty T mają antygeny we krwi lub tkance i szybko spływają do śledziony lub najbliższego drenującego węzła chłonnego, aby rozpocząć produktywną odpowiedź immunologiczną. W obu przypadkach limfocyty T zostają aktywowane, ulegają ekspansji klonalnej i opuszczają układ limfatyczny, aby dostać się do krwi, jeśli jeszcze tam nie są. Podczas tego procesu sygnalizacja wewnątrzkomórkowa zapewnia regulację w dół limfatycznych receptorów naprowadzających i regulację w górę licznych receptorów integryny i chemokin, niezbędnych do migracji specyficznej dla tkanki2. Ostatecznie ukierunkowana migracja limfocytów T do miejsc infekcji jest napędzana przez zbieżne sygnały środowiskowe, które obejmują sygnalizację integryny i chemokin.

Chemokiny można ogólnie podzielić na dwie główne klasy: (1) sygnały homeostatyczne, które są niezbędne do różnicowania, przeżycia i podstawowej funkcji, oraz (2) sygnały zapalne, takie jak CXCL9, CXCL10 i CCL3, które są wymagane do chemotaksji. Ogólnie rzecz biorąc, chemokiny tworzą gradient sygnału, który napędza migrację kierunkową, znaną jako chemotaksja, oprócz aktywacji wyrażenia integryny1. Chemotaksja jest precyzyjnie regulowana i bardzo wrażliwa, a limfocyty T są zdolne do reagowania na niewielkie zmiany gradientu, które mogą prowadzić je w określonym kierunku lub miejscu.

Oprócz tych czynników związanych z limfocytami T, na migrację wpływa również skład i gęstość macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). ECM składa się z gęstej sieci białek, w tym kolagenu i proteoglikanów, które stanowią rusztowanie dla adhezyjnych receptorów integrynowych na limfocytach T. Integryny to zróżnicowana rodzina białek transbłonowych, z których każde ma wysoce wyspecjalizowane domeny wiążące i dalsze efekty sygnalizacyjne. Dynamiczna ekspresja receptorów integrynowych na powierzchni limfocytu T umożliwia szybką adaptację do zmieniającego się środowiska3. Co ważne, integryny łączą ECM i wewnątrzkomórkowe sieci aktynowe cytoszkieletu, które współpracują ze sobą w celu wytworzenia siły napędowej wymaganej do ruchu limfocytów T.

Podsumowując, wzorce migracji różnią się w zależności od fenotypu komórki odpornościowej lub sygnałów środowiskowych. Te złożone procesy biologiczne są ściśle regulowane przez ekspresję cytokin, chemokin i integryn na powierzchni limfocytów T, otaczających komórek i lokalnej, zakażonej tkance. In vivo te mechanizmy migracji mogą być złożone i mogą wynikać z kilku sygnałów addytywnych4. Ze względu na tę złożoność ustalenie związku przyczynowo-skutkowego między pozornie powiązanymi zmiennymi może być niemożliwe. Aby temu zaradzić, istnieje kilka podejść in vitro do badania określonych aspektów migracji limfocytów T, takich jak odpowiedź na określone sygnały chemokiny i interakcja między integrynami komórek T a białkami wiążącymi ECM. Protokół ten dotyczy metod izolacji i aktywacji mysich limfocytów T CD8 +, z testami migracji in vitro w przestrzeni dwuwymiarowej i narzędziami do analizy obliczeniowej do analizy migracji określonych limfocytów T. Metody te są korzystne dla użytkownika, ponieważ nie wymagają skomplikowanych materiałów ani urządzeń, jak w przypadku niektórych innych testów migracji komórek opisanych w literaturze. Dane dotyczące migracji komórek wygenerowane za pomocą tych metod mogą dostarczyć dowodów na odpowiedzi immunologiczne w uproszczony sposób, który umożliwia dalsze, świadome badania in vivo.

Protokół

Protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Uniwersytecki Komitet ds. Zasobów Zwierzęcych na Uniwersytecie w Rochester. Myszy w tym badaniu były trzymane w wolnej od patogenów przestrzeni w ośrodku dla zwierząt Uniwersytetu w Rochester. W niniejszym badaniu wykorzystano samce/samice myszy C57BL/6 w wieku 6-12 tygodni (15-30 g). Izolację tkanek myszy można przeprowadzić na blacie stołu w rękawiczkach zakrywających ręce i masce na twarz zakrywającej nos i usta lub w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Wszystkie hodowle komórkowe i przygotowanie płytek muszą być przeprowadzone w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Odczynniki i sprzęt używany w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Oczyszczanie i aktywacja limfocytów T CD8+

  1. Przygotowanie materiałów
    1. W przypadku negatywnej selekcji limfocytów T CD8 +: Przygotuj pożywkę selekcyjną negatywną z supernatantu linii komórkowych hybrydoma przeciwciał GK1.5 i M5 / 114, które wytwarzają odpowiednio anty-CD4 i anty-MHCII. Wymieszać supernatant w stosunku 1:1, przefiltrować go i przechowywać w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości (>0,5 μg każdego przeciwciała/milion wszystkich komórek). Alternatywnie dostępne są komercyjne zestawy do izolacji limfocytów T CD8 +.
    2. Do aktywacji limfocytów T: Dodaj 500 μl przeciwciał CD3 (10 μg/ml) i CD28 (16 μg/ml) w 1x DPBS (bez wapnia i magnezu) do 24-dołkowej płytki potraktowanej kulturą nietkankową (TC) i przechowuj przez noc w temperaturze 4 °C, aby zapewnić wiązanie płytki.
      UWAGA: Przeciwciała i białka pokrywają płytki/szalki hodowlane niepoddane działaniu TC lepiej niż zwykłe płytki hodowlane poddane działaniu TC, dlatego do generowania limfocytów T stosuje się płytki hodowlane niepoddane działaniu TC.
  2. Przygotuj 10-centymetrowe naczynie hodowlane (lub jego odpowiednik), umieszczając w naczyniu sitko o wielkości 70 μm i dozuj 2 ml pożywki R9 do filtra (pożywka R9: RPMI 1640x uzupełniona 10% FBS, 1% antybiotykowo-przeciwgrzybiczy, 20 mM bufor HEPES, 1% aminokwasów endogennych MEM, 50 μM β-merkaptoetanolu).
  3. Uzyskaj mysz o odpowiednim tle genetycznym, płci, wieku i wadze, zgodnie z projektem eksperymentalnym.
  4. Poddać mysz eutanazji za pomocą CO2 , a następnie zwichnąć szyjkę macicy lub zastosować odpowiednie strategie eutanazji określone w lokalnych protokołach opieki i wykorzystania zwierząt i zatwierdzone przez instytucję.
  5. Umieść mysz w pozycji leżącej, rozciągnij wszystkie cztery kończyny prostopadle do ciała i przypnij podnóżki do deski sekcyjnej za pomocą kołków T do preparacji myszy lub ich odpowiednika. Wykonaj powierzchowne, centralne nacięcie przez warstwę skórną na brzusznej dolnej części brzucha za pomocą mysich nożyczek chirurgicznych do preparacji i wytnij prosto do podbródka (~8 cm). Oddziel skórę od wyściółki otrzewnej, aby odsłonić węzły chłonne. Rozciągnij skórę prostopadle od tułowia i przypnij ją5.
    1. Delikatnie wytnij węzły chłonne szyjne, osiowe, ramienne i pachwinowe obustronnie za pomocą kleszczy (lub preferowanego typu ze standardowego zestawu do chirurgicznego rozwarstwiania myszy). Przenieść do sitka do komórek przygotowanego w kroku 1.2.
    2. Otwórz otrzewną i usuń śledzionę. Przenieść do sitka do komórek przygotowanego w kroku 1.2.
    3. Tuszę myszy należy wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na zagrożenie biologiczne.
  6. Przygotować jednokomórkową zawiesinę wtórnych tkanek limfatycznych przez mechaniczne rozerwanie na sitku do komórek 70 μm z 2 ml pożywki R9 z kroku 1.2, przekręcając narzędzie do rozbijania tkanek o pół obrotu zgodnie z ruchem wskazówek zegara i wielokrotnie przeciwnie do ruchu wskazówek zegara.
    UWAGA: Końcówka tłoka strzykawki typu luer-lock, 3 ml lub 10 ml, dobrze sprawdza się w rozdrabnianiu i homogenizacji tkanki. Alternatywne materiały mogą być używane według uznania użytkownika.
  7. Umyj komórki, końcówkę strzykawki, sitko i naczynie hodowlane 7 ml pożywki, upewniając się, że sitko pozostaje w pozycji pionowej, aby zapobiec przenoszeniu większych kawałków tkanki lub agregatów komórkowych, które mogą być obecne w zawiesinie pojedynczej komórki.
  8. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  9. Osadzać komórki w temperaturze pokojowej (20 °C) przez 5 minut w temperaturze pokojowej (20 °C) i zdekantować supernatant.
  10. Dodaj 500 μl buforu lizującego przez 1 minutę w celu usunięcia czerwonych krwinek. Rozcieńczyć 9,5 ml pożywki R9 i wirować w temperaturze 270 x g (20 °C) przez 5 minut. Zdekantować supernatant.
  11. Zawiesić osad w 10 ml uprzednio przygotowanej pożywki selekcyjnej negatywnej zawierającej anty-MHCII i anty-CD4 (krok 1.1.1). Skała w temperaturze pokojowej (20 °C) przez 30 min.
  12. Osadzać komórki w masie 270 x g przez 5 minut i zdekantować supernatant. Przemyć 3x 10 ml podłoża R9.
  13. Jednocześnie w stożkowej probówce o pojemności 15 ml umyj 200 μl owczych kulek IgG przeciwko szczurom w 7 ml pożywki. Umieść rurkę na magnesie, usuń medium i powtórz krok prania dwukrotnie. Zawiesić kulki w 7 ml pożywki R9.
  14. Osadzać komórki w temperaturze 270 x g (20 °C) przez 5 minut, dekantować supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad w 7 ml zawiesiny kulek z kroku 1.13. Skała w temperaturze pokojowej (20 °C) przez 45 min.
  15. Wzbogać limfocyty T CD8 + poprzez zubożenie kulek magnetycznych. Umieść stożkową rurkę bezpośrednio na magnesie bez pokrywki na 3 minuty, aby usunąć przeciwciała/komórki związane z kulkami. Komórki CD8+ powinny zostać zachowane. Trzymając probówkę nadal w magnesie, zebrać zawiesinę komórek za pomocą pipety serologicznej lub równoważnej i przenieść ją do nowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować w temperaturze 270 x g (20 °C) przez 5 minut i przemyć 3x w pożywce.
  16. Umyć wstępnie pokrytą płytkę aktywacyjną (krok 1.1.2) dwukrotnie 1x DPBS bez bezpośredniego pipetowania na dolnej powierzchni płytki.
  17. Opcjonalnie: Wykonaj separację żywych/martwych limfocytów, aby usunąć martwe komórki.
    1. Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Delikatnie dodać 2 ml pożywki do separacji limfocytów na dno zawiesiny komórek. Wirować przy 900 x g przez 10 minut (w temperaturze pokojowej) przy niskim przyspieszaniu i zwalnianiu.
      UWAGA: Żywe komórki rozdzielą się na styku pożywki i mediów separacyjnych (środkowa biała warstwa). Martwe komórki będą osadzać się na dnie probówki i mogą zostać wyrzucone na końcu.
    2. Przenieść środkową warstwę zawierającą żywe limfocyty do nowej probówki i odwirować przy 270 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zdekantować supernatant.
  18. Zawiesić osad w 12 ml pożywki z 10 U/ml rekombinowanej myszy IL-2. Umieścić 1 ml na basenie w 24-dołkowej płytce niepoddanej działaniu TC i przenieść na noc do temperatury 37 °C.

2. Podnoszenie aktywowanych limfocytów T CD8+

  1. Wizualizacja komórek za pomocą standardowego mikroskopu laboratoryjnego, przy użyciu obiektywu 4x lub 10x.
    UWAGA: Aktywowane limfocyty T będą wydawać się większe i okrągłe lub wydłużone w porównaniu z inaktywowanymi limfocytami T i powinny mieć gęste skupiska komórek w całej studzience.
  2. Aby podnieść aktywowane komórki, rozbij je pipetą o pojemności 1 ml, upewniając się, że dobrze wymieszały się na krawędziach płytki. Przenieś komórki do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml.
    UWAGA: Aktywowane komórki są bardziej lepkie i wymagają bardziej energicznego pipetowania.
  3. Umyj studzienki 1 ml pożywki R9, aby usunąć wszelkie pozostałe komórki. W razie potrzeby powtórz czynność jeszcze raz. Odwirować komórki w temperaturze 270 x g (20 °C) przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
  4. Wykonaj separację żywych/martwych limfocytów, aby usunąć martwe komórki, jak w krokach 1.17-1.18.
  5. Utrzymuj limfocyty T poprzez usuwanie żywych/martwych komórek co 3-4 dni w pożywce R9 z IL-2 na 6-dołkowej płytce innej niż TC.
    UWAGA: Limfocyty T rozmnażają się lepiej w studzienkach o małych rozmiarach podczas wczesnej aktywacji, prawdopodobnie ze względu na kontakty limfocytów T z komórkami T lub rozpuszczalne czynniki pochodzące z limfocytów T, które pomagają w ich aktywacji. Szybka proliferacja limfocytów T powoduje żółknięcie pożywki hodowlanej w ciągu 24-48 godzin po hodowli. W tym momencie podnieś komórki i przenieś je do większego dołka (niepowlekana, 6-dołkowa płytka bez TC) z wystarczającą ilością świeżej pożywki hodowlanej, aby nakarmić komórki (zwykle 5 ml na dołek). Zastąp zubożone podłoże świeżym, gdy wskazuje na to zmiana koloru żółtego podłoża lub co 3-4 dni.

3. Przygotowanie szklanego naczynia

  1. Przygotować komory lub płytki do migracji komórek szklanych, pokrywając 300 μl/cm2 białka A (0,1 mg/ml) przez noc w temperaturze 4 °C, przemyć dwukrotnie 1x DPBS, dozując na naczynie i dekantując przed przejściem do następnego kroku.
  2. Pokryj komorę migracyjną lub płytkę 300 μl/cm2 rekombinowaną chimerą ICAM-1 lub VCAM-1 Fc myszy (0,1-2,75 mg/ml) razem z rekombinowaną mysią chemokiną (0,1-10 μg/ml) przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej. Inne ligandy integrynowe, takie jak fibronektyna, kolagen myszy IV i mysia E-kadheryna, są wytapiane w celu bezpośredniego pokrycia komory w temperaturze 2,5-10 μg/ml przez noc w temperaturze 4 °C.
    1. Umyj komory dwukrotnie za pomocą 1x DPBS, dozując na naczynie i dekantując bezpośrednio po dodaniu komórek.
      UWAGA: Limfocyty T mogą migrować w różny sposób w różnych stężeniach ligandów i chemokin integrynowych, w zależności od stanu aktywacji, różnicowania, uczulenia i primingu. Zdecydowanie zaleca się oznaczanie migracji komórek w wielu różnych stężeniach.
  3. Umieść przylegające komórki na płytkach pokrytych szkłem na 24 godziny przed rozpoczęciem obrazowania, jeśli kohoduje się limfocyty T z innymi komórkami, takimi jak komórki rakowe, w celu zmierzenia zabijania komórek rakowych przez limfocyty T w czasie rzeczywistym.

4. Przygotowanie komórek

  1. Opcjonalnie: Limfocyty T i komórki adherentne barwione wybranym barwnikiem śledzącym komórki w ilości 1 μg/ml na 1 x 107 komórek w 1x DPBS przez 15 minut w temperaturze 37 °C lub zgodnie z protokołem producenta.
  2. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub jego odpowiednika.
  3. Płytka 1 x 105 limfocytów T CD8+ (lub pożądana ilość) w pożywce L-15 Leibovitz uzupełniona 1-5 g/L glukozy w komorze o temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Pożywka L-15 jest przeznaczona do stosowania bez systemu wodorowęglanu CO2-sodu. Jest buforowany przy użyciu wolnych aminokwasów zasadowych, fosforanowych i galaktozy w celu utrzymania poziomu pH.
  4. Opcjonalnie: Wykonaj blokowanie integryny.
    1. Preinkubować limfocyty T z przeciwciałem blokującym integrynę (1-10 μg/ml, anty-mysie CD11a (M17/4), anty-mysie CD18 (M18/2), anty-mysie VLA-4 (9C10) przez 10 minut i pozostawić do pełzania w obecności tego samego przeciwciała.

5. Mikroskopia poklatkowa

  1. Wykonaj mikroskopię wideo.
  2. W przypadku limfocytów T uzyskuj obrazy w jasnym polu i fluorescencyjne co 10-60 s przez 10-60 minut lub żądane ustawienia akwizycji.
    UWAGA: Migracja limfocytów T jest wrażliwa na temperaturę, a optymalna temperatura dla migracji mysich limfocytów T wynosi 37 °C. System kontroli temperatury, z którego korzysta ten protokół, składa się z zamkniętego i izolowanego pokładu mikroskopu z dołączonym systemem grzewczym. Komora obrazowania znajduje się na puli obrazowej. Na obwodzie tej komory znajduje się studnia wypełniona wodą destylowaną, która umożliwia stałe ciepło i wilgotność podczas obrazowania. Mikrostudzienka jest umieszczona w środku komory obrazowania.

6. Wspomagana programowo analiza migracji limfocytów T

  1. Użyj oprogramowania Volocity, aby ocenić migrację limfocytów T.
    1. Otwórz Volocity i utwórz nową sekwencję obrazów.
    2. Wybierz i przenieś wszystkie filmy z mikroskopii poklatkowej do niebieskiego obszaru w Volocity.
    3. Dostosuj jasność i kontrast za pomocą narzędzia do poprawy kontrastu do żądanych ustawień badacza.
    4. Sprawdź rozmiary obrazu: 0,325 μm dla 20x, 0,65 μm dla 10x.
    5. Sekwencja: ustaw punkty czasowe (np. 81 zdjęć w przypadku robienia zdjęcia co 15 s przez 20 minut, 4 na minutę).
    6. Odznacz wszystkie punkty czasowe w zakładce pomiaru.
    7. Znajdź obiekty za pomocą intensywności - przesuń pasek tak, aby znalazł się dokładnie po prawej stronie szczytu.
    8. Wyklucz obiekty według rozmiaru: wszystkie komórki, które mają średnicę mniejszą niż 10 μm i większą niż 100 μm, aby wykluczyć resztki komórek lub cząstki niekomórkowe. Wyklucz limfocyty T, które migrują przez mniej niż 20% czasu nagrywania (który może się różnić w zależności od definicji każdego badacza).
    9. Ignoruj obiekty statyczne (pole wyboru).
    10. Automatycznie łącz uszkodzone traktaty (pole wyboru).
    11. Ustaw najkrótszą ścieżkę na nie więcej niż 20 μm.
    12. Ścieżka migracji komórki to linia łącząca lokalizację tej samej komórki w czasie. Upewnij się, że algorytm śledzenia śledzi, wykrywając, gdzie poszczególne obiekty są wykrywane przez segmentację w każdej klatce, a obiekty są dopasowywane między klatkami.
    13. Zapisz nowy protokół, wybierając opcję Measurements (Pomiary) > Save Protocol (Zapisz protokół> nazwij nowy protokół.
    14. Kliknij zmierz wszystkie punkty czasowe w zakładce pomiaru.
    15. Sortuj utwory według przedziału czasu, od najwyższego do najniższego.
    16. Zapisz numery identyfikacyjne ścieżek dla wszystkich komórek z dobrymi ścieżkami, zgodnie z definicją badacza. Po automatycznym śledzeniu komórek konieczna jest ręczna ocena każdej ścieżki komórki, aby wykluczyć błędnie zidentyfikowane lub uszkodzone ścieżki. Wyklucz komórki z nieprawidłowymi ścieżkami.
    17. Wyeksportuj plik jako tekst oddzielony przecinkami i przenieś dane do żądanego oprogramowania analitycznego.
      UWAGA: Podstawowe parametry: prędkość (μm/min), przemieszczenie (ruch netto, μm), długość toru (całkowita długość drogi, μm) oraz wskaźnik meandrowania (MI; przemieszczenie netto/długość toru. MI = 1 oznacza całkowicie prosty tor liniowy).
  2. Wykonaj śledzenie ręczne za pomocą obrazu J.
    1. Otwórz wtyczki i wybierz śledzenie i śledzenie ręczne. Ustaw parametry - przedziały czasowe, kalibrację x/y (rozmiar piksela) i kalibrację z (w trybie śledzenia ręcznego). Rozpocznij śledzenie poszczególnych komórek, klikając dodaj ścieżkę, zaznaczając jedną komórkę w pierwszym punkcie czasowym i kontynuując je przez wszystkie punkty czasowe. Następnie kliknij Zakończ ścieżkę. Powtórz tę czynność dla wszystkich interesujących Cię komórek.
      UWAGA: Trackmate, kolejne narzędzie do śledzenia komórek, to oprogramowanie do automatycznego śledzenia dostępne za pośrednictwem wtyczki ImageJ.

Wyniki

Potwierdzenie aktywacji limfocytów T można przeprowadzić za pomocą cytometrii przepływowej, analizując zwiększoną ekspresję CD69 i CD44, które są kanonicznymi markerami aktywacji w mysich limfocytach T6. Dodatkowo, czystość populacji limfocytów T można określić za pomocą cytometrii przepływowej dla limfocytów T CD3+ CD8+. Metoda ta pozwala uzyskać populację limfocytów T CD8+ na poziomie >90 %.

Migrację limfocytów T można oceniać za pomocą programów do śledzenia komórek wspomaganych oprogramowaniem, które są zarówno powtarzalne, jak i konfigurowalne zgodnie z potrzebami badacza. Niektóre podstawowe parametry wykorzystywane do określania efektów eksperymentalnych obejmują prędkość komórki (długość migracji w określonym czasie, aby określić, jak szybko porusza się komórka), przemieszczenie (odległość migracji w linii prostej od punktu startowego do końcowego, aby określić, jak daleko migruje komórka), długość ścieżki (odległość migracji, całkowita długość drogi migracji, aby określić, jak daleko migruje komórka) oraz indeks meandrowania (MI przyjmuje wartości od 0 do 1 i określa stopień liniowości migracji, gdzie 1 = linia prosta). Parametry te są stosowane do oceny różnic w migracji naiwnych i aktywowanych limfocytów CD8+ T pełzających po szkle powleczonym ICAM-1 w obecności CXCL12 (Rysunek 1). W aktywowanych limfocytach CD8+ T zaobserwowano zwiększoną średnią prędkość, przemieszczenie oraz indeks meandrowania w porównaniu z komórkami naiwnymi, co wskazuje na zwiększoną zdolność migracyjną aktywowanych limfocytów T. Podobnie, za pomocą tych metod można wyjaśnić wpływ różnych chemokin na wzorce migracji komórkowej. Na przykład aktywowane limfocyty CD8+ T wykazują zwiększoną migrację w obecności CXCL12, ale nie w obecności CCL2 lub CCL22, a migracja wzrasta w sposób zależny od dawki aż do stężenia nasycenia (Rysunek 2). Ponadto wspomagane oprogramowaniem śledzenie komórek umożliwia charakterystykę migracji poszczególnych komórek, co pozwala na zrozumienie wpływu pojedynczych ligandów na zachowanie limfocytów T. Reprezentatywne ścieżki komórek przedstawiono na Rysunku 3.

Wzięte razem, dane te potwierdzają skuteczność obecnych metod, wykazując, że możliwe jest (1) śledzenie migracji komórek na poziomie pojedynczej komórki oraz (2) rozróżnienie różnic w migracji CD8+ limfocyty T w zależności od stanu aktywacji oraz w obecności różnych chemokin i cząsteczek adhezyjnych. Analiza ta jest krytycznym krokiem w rozpracowywaniu złożonych mechanizmów sygnalizacyjnych i dostarczaniu informacji dla ukierunkowanych in vivo eksperymenty, które mogą w dalszym stopniu wyjaśnić biologiczny wkład konkretnych sygnałów w sposób specyficzny dla danego typu komórek.

Wykres pudełkowy porównujący naiwne i aktywowane limfocyty T CD8+: prędkość, przemieszczenie, indeks meandrowania.
Rysunek 1: Analizy in vitro migracji naiwnych i aktywowanych limfocytów T CD8+ . Naiwne lub aktywowane CD3/CD28 mysie limfocyty T CD8+ migrowały na podłożu z ICAM-1 oraz CXCL12 przez 10 min. Prędkość, przemieszczenie i indeks meandrowania migracji komórek przeanalizowano za pomocą mikroskopii time-lapse oraz programu Volocity. Każda grupa obejmuje 36 pojedynczych limfocytów T (średnia ± SEM). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Migracja komórek indukowana chemokinami; wykres; pokazuje wpływ CXCL12, CCL2 i CCL22 na szybkość migracji komórek.
Rycina 2: Testy in vitro migracji aktywowanych limfocytów T CD8+ zależnej od chemokin. Aktywowane CD3/CD28 mysie limfocyty T CD8+ poddano migracji na ICAM-1 w obecności wskazanych chemokin. W polu widzenia określono stosunek liczby komórek przemieszczających się na odległość ponad 50 µm w ciągu 20 min (procent całkowitej liczby komórek). W pojedynczym teście przeanalizowano >10 komórek (n = 3 testy na grupę, średnia ± SEM). Nieparzysty t-test, *p< 0.05 w porównaniu z kontrolą. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Test motywności bakterii, obraz mikroskopowy, śledzenie kolorowych ścieżek, skala 20 μm.
Rysunek 3: Ścieżki migracji aktywowanych limfocytów T CD8+ na ICAM-1 oraz CXCL12 przez 20 min. Każda kolorowa linia wskazuje ścieżkę migracji poszczególnych limfocytów T w kierunku od punktu wyjścia komórki do punktu przeciwległego. W tym konkretnym teście 24 z 38 komórek przemieściły się na znaczącym dystansie (przynajmniej na odległość równą szerokości komórki według naszej definicji). Limfocyty T migrowały na różne odległości, co wskazuje, że każda komórka znajdowała się w innym stanie aktywacji lub primingu. Wszystkie migrujące komórki poruszały się w różnych kierunkach przy założeniu, że powierzchnia była pokryta jednorodnie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Zrozumienie biologicznego wpływu zbieżnych sygnałów in vivo jest trudne i niełatwe do zinterpretowania. Przedstawione w niniejszym dokumencie protokoły zapewniają rozsądną metodę zrozumienia migracji limfocytów T w ściśle określonych i biologicznie istotnych warunkach. Warunki te można określić według uznania badacza, a protokoły można modyfikować w celu dopasowania do potrzeb różnych populacji limfocytów T, statusu aktywacji i fenotypu komórki. Co więcej, wiele ligandów i receptorów można badać za pomocą tych zdefiniowanych procedur blokujących przeciwciała 7,8 i szkła powlekanego ligandem 8,9,10. Technika ta była również kluczową platformą do opracowania zmodyfikowanych komórek odpornościowych11,12.

Ważne kroki w protokole obejmują izolację wtórnej tkanki limfatycznej, aktywację limfocytów T, powlekanie szklanych naczyń obrazowych i analizę danych. Dla niedoświadczonego oka węzły chłonne osadzone w tkance mogą być trudne do zidentyfikowania i usunięcia. Można to przezwyciężyć dzięki praktyce. Po wyizolowaniu i oczyszczeniu limfocytów T, etap aktywacji powoduje powstawanie lepkich komórek, które, jeśli nie są odpowiednio podniesione, mogą skutkować niską wydajnością. Można tego uniknąć dzięki obfitemu i starannemu myciu studni. Szklane naczynia muszą być odpowiednio pokryte interesującym ligandem i umyte przed dodaniem komórek. Zapewni to dostęp do solidnej warstwy białka, do której komórki będą mogły przylegać, a jednocześnie zapewni, że nadmiar odczynnika nie zakłóci biologii. Wiązanie powierzchniowe białka A-szkła i wiązanie białka Fc-A w fizjologicznym pH i stężeniu soli są wystarczająco silne, aby oprzeć się zmywaniu podczas delikatnego nalewania i dekantacji buforu. Białka resztkowe, jeśli występują, w pożywce nie powodują żadnej toksyczności, mimo że mogą zakłócać interakcję komórek ze związanymi ligandami, jeśli niezwiązane ligandy są w wysokich stężeniach. Wykluczamy taką możliwość, kilkakrotnie spłukując powlekane szkło. Wreszcie, istnieje wiele przyjaznych dla użytkownika komercyjnych i niekomercyjnych programów, które pozwalają naukowcom wykryć nawet subtelne różnice w zachowaniach i morfologiach komórek. Nie można przecenić znaczenia ręcznego upewniania się o analizowanych wynikach w celu wykluczenia błędów, które może popełnić oprogramowanie.

Metody oczyszczania i aktywacji limfocytów T mogą być modyfikowane w celu dopasowania do potrzeb badacza w celu uzyskania właściwego stanu komórki i fenotypu do podsumowania obserwacji in vivo. Różne typy i stany komórek mogą być wykorzystywane do rozwiązywania różnych mechanizmów infekcji i odpowiedzi immunologicznej 7,8,9,10,11,13, w tym do rozwiązywania problemów z zachowaniem naiwnych i pamięciowych limfocytów T oraz różnych aspektów odpowiedzi pamięciowej, takich jak torowanie i rekrutacja, w warunkach specyficznych dla tkanek 14. Metoda ta może być stosowana do kohodowli z różnymi typami komórek, aby lepiej zrozumieć interakcje komórkowe, w tym czasy i czas trwania kontaktu komórka-komórka 7,9, prezentację antygenu 9,13 i zabijanie komórek docelowych6. Dodatkowe reportery i znaczniki mogą być używane do oceny struktur subkomórkowych7, granulek15, apoptozy6 i innych.

Protokół jest doskonałym narzędziem do prowadzenia dodatkowych eksperymentów in vivo opartych na obserwacjach w uproszczonych i wysoce zdefiniowanych warunkach. Chociaż ocena ruchliwości komórek in vitro może być wysoce redukcyjna, jest to ważny krok w rozbijaniu złożonych aktywności biologicznych. Dzięki wynikom tych eksperymentów badacze mogą podejść do pracy in vivo w bardziej fizjologicznie istotny i ukierunkowany sposób.

Prostota tej metody stanowi również jej główne ograniczenie; Chociaż wszystkie wyniki są reprezentatywne dla działań in vivo, można je dodatkowo potwierdzić, na przykład za pomocą mikroskopii wielofotonowej w obrębie układu przyżyciowego. Opisana w niniejszym dokumencie metoda jest jedną z najprostszych, która jest w pełni dostępna dla laboratoriów badawczych z mikroskopem jasnego pola i/lub mikroskopem epifluorescencyjnym z kamerą cyfrową zintegrowaną z systemem mikroskopu lub oddzielnie umieszczoną na obiektywie lunety. Z drugiej strony, istnieje więcej możliwości zaawansowanej analizy migracji komórek odpornościowych in vitro. Po pierwsze, komórki odpornościowe są często napędzane przez gradienty chemokiny w systemie biologicznym. Analizę zachowań komórek odpornościowych w gradientach chemokiny można przeprowadzić na kilka sposobów. Jedną z prostych metod jest użycie specjalnie zaprojektowanego szkiełka (patrz Tabela materiałów). Ten system studni kanałowej, którego dno pokryte jest ligandami integryny, umożliwia analizę migracji komórek odpornościowych w statycznym gradiencie chemokin. Inne proste testy chemotaksji komórek odpornościowych obejmują mikroskopię poklatkową migracji komórek do końcówki mikropipety, która uwalnia chemokiny16, w teście agarozy17 i komorze Zigmonda18. Do bardziej wyrafinowanego testu migracji w kontrolowanych gradientach chemokiny wymagane są niestandardowe szkiełka z mikroprzepływowymi generatorami gradientu19,20. Po drugie, komórki odpornościowe mogą migrować w unikalnych warunkach fizycznych przy użyciu różnych mechanizmów, czasami bez stosowania zależnej od integryny adhezji do ligandów. Test migracji in vitro w jednym wymiarze może być wykonany z powłoką liganda integryny lub bez niej i odtwarza ruchliwość komórek odpornościowych w naczyniach włosowatych21,22. Inną opcją jest test migracji komórek w przestrzeni trójwymiarowej23,24 w celu zbadania mechanizmów leżących u podstaw migracji śródmiąższowej komórek25,26. Ogólnie rzecz biorąc, przedstawiliśmy proste, powtarzalne i wiarygodne metody badania dynamicznych zdarzeń migracji komórkowej.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że wszystkie badania i przygotowanie manuskryptu zostały przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

Dziękujemy byłym i obecnym członkom Kim Lab, którzy przyczynili się do rozwoju tych protokołów na przestrzeni czasu. Reprezentatywne dane były możliwe dzięki P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/Stany Zjednoczone oraz P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/Stany Zjednoczone. Publikacja ta była możliwa częściowo dzięki grantowi o numerze T32 GM135134 przyznanemu przez Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Award.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Naczynie 10 cmCorning353003lub odpowiednik
15 ml rurka stożkowaThermoFisher339650lub odpowiednik
1x DPBSGibco14190144bez wapnia i bez magnezu
6-dołkowa płytka bez powłoki TCCorning3736lub odpowiednik
70 &mikro; m sitko do komórekFisherScientific352350lub równoważny
bufor lizujący ACKThermoFisherA1049201lub równoważny
Wirówka Allegra 6KRThermoScientificsorvall 16R z wirnikiem tx400 3655 i wiadremlub odpowiednik
Beta merkaptoetanolSigmaM3148lub równoważny
CellTrace VioletThermoFisherC34571Lub równoważna
WirówkaThermoScientificSorvall ST 16Rlub równoważna
Kolagen (IV)Corning354233lub równoważna
Naczynie do hodowli DeltaT o grubości 17 mm szkło przezroczysteBioptechs04200417C
Dynabeads Sheep anty-Rat IgGInvitrogen11035
DynaMag 15 MagnetThermoFisher Scientific12301Dlub odpowiednik
Zestaw do izolacji limfocytów T myszy Easy sepKomórka macierzysta19851
FBSSigmaAldrichF2442-500MLlub odpowiednik
FibronectinSigmaAldrich10838039001lub odpowiednik
Fidżihttp://fiji.sc/weblink
Kostki filtracyjneNikon lub Olympus
GK1.5ATCCTIB-207
HEPESThermoFisher15630080lub równoważna
kamera CCD HQCoolSNAPlub odpowiednik
ImageJhttp://imagej.nih.gov/ij/hweblink
Wtyczka automatycznego śledzenia ImageJ http://imagej.net/TrackMateweblink
ImageJ ręczne śledzenie https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.htmlweblink
L-15RóżneZobacz materiałyMedium Przepis: Leibovitz' s L-15 pożywka bez czerwieni fenolowej (Gibco) uzupełniona 1-5 g/L glukozy
Pożywka L-15 firmy Liebovitz, bez czerwieni fenolowejJednorazowa
Luer LokFisher Scientific14-955-459lub równoważna
Pożywka do separacji limfocytówCorning25-072-CIlub równoważna
M5/114ATCCTIB-120
MEM Aminokwasy endogenneThermoFisher11140050lub odpowiednik
System ogrzewania mikroskopuOkolabokolab.comDostępne niestandardowe wzory
Suwak Millicell EZMilliporeC86024
Mysz Mojosort CD8+ Naï Zestaw do izolacji limfocytów TBiolegend480043
Mouse E-kadherynaR& Systemy D8875-EC-050lub równoważne
Zestaw do chirurgicznego rozwarstwiania myszyFisher Scientific13-820-096lub równoważne
elementy NISOprogramowanie firmy Nikon
non-TC 24wpCorning353047lub równoważne
Penicylina-streptomycynaThermoFisher15140122lub równoważne
Białko AThermoFisher Scientificlub równoważny
R9VariousSee MaterialsMedium Receptura: RPMI 1640x uzupełniony o 10% FBS, 1% antybiotykowo-przeciwgrzybicze (Gibco), 20 mM bufor HEPES (Gibco), 1% MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 μ M β-merkaptoetanol (Sigma-Aldrich)
Rekombinowana chimera mysz ICAM-1 FcR& Systemy D796-IC-050lub równoważne
Mysz rekombinowana IL2Biolegend575410lub równoważna
RPMI 1640xThermoFisher11875093lub równoważne
kołki TFisher ScientificS99385lub równoważny
TE2000-Umikroskop Nikonlub równoważny
Różne rekombinowane mysie chemokinyR& D lubrównoważne
VCAM-1 Fc chimeraR& D systems643-VM-050lub równoważne
oprogramowanieVolocityPerkinElmer
podłącz strzykawka ThermoFisher 21083027

Bibliografia

  1. Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
  2. Fowell, D. J., Kim, M. The spatio-temporal control of effector T cell migration. Nat Rev Immunol. 21 (9), 582-596 (2021).
  3. Tabdanov, E. D., et al. Engineering t cells to enhance 3d migration through structurally and mechanically complex tumor microenvironments. Nat Commun. 12 (1), 2815(2021).
  4. Kameritsch, P., Renkawitz, J. Principles of leukocyte migration strategies. Trends Cell Biol. 30 (10), 818-832 (2020).
  5. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse naive CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets. J Vis Exp. (98), e52739(2015).
  6. Sailer, C. J., et al. Pd-1(hi) CAR-T cells provide superior protection against solid tumors. Front Immunol. 14, 1187850(2023).
  7. Lim, K., Hyun, Y. M., Lambert-Emo, K., Topham, D. J., Kim, M. Visualization of integrin mac-1 in vivo. J Immunol Methods. 426, 120-127 (2015).
  8. Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza-specific CD8+ T cells in the airways. Science. 349, 4352(2015).
  9. Lim, K., et al. In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection. Nat Immunol. 21 (9), 1046-1057 (2020).
  10. Reilly, E. C., et al. T(rm) integrins CD103 and CD49a differentially support adherence and motility after resolution of influenza virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (22), 12306-12314 (2020).
  11. Amitrano, A. M., et al. Optical control of CD8(+) T cell metabolism and effector functions. Front Immunol. 12, 666231(2021).
  12. Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and t-cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), 6371-6376 (2014).
  13. Capece, T., et al. A novel intracellular pool of IFA-1 is critical for asymmetric CD8(+) T cell activation and differentiation. J Cell Biol. 216 (11), 3817-3829 (2017).
  14. Hirai, T., Whitley, S. K., Kaplan, D. H. Migration and function of memory CD8(+) T cells in skin. J Invest Dermatol. 140 (4), 748-755 (2020).
  15. Mouchacca, P., Schmitt-Verhulst, A. M., Boyer, C. Visualization of cytolytic T cell differentiation and granule exocytosis with T cells from mice expressing active fluorescent granzyme B. PLoS One. 8 (6), e67239(2013).
  16. Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol Biol. 370, 23-36 (2007).
  17. Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J Cell Biol. 159 (1), 91-102 (2002).
  18. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2), Pt 1 606-616 (1977).
  19. Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integr Biol (Camb). 2 (11-12), 648-658 (2010).
  20. Sai, J., Walker, G., Wikswo, J., Richmond, A. The IL sequence in the LLKIL motif in CXCR2 is required for full ligand-induced activation of Erk, Akt, and chemotaxis in HL60 cells. J Biol Chem. 281 (47), 35931-35941 (2006).
  21. Choi, Y., Sunkara, V., Lee, Y., Cho, Y. K. Exhausted mature dendritic cells exhibit a slower and less persistent random motility but retain chemotaxis against ccl19. Lab Chip. 22 (2), 377-386 (2022).
  22. Harding, M. G., Zhang, K., Conly, J., Kubes, P. Neutrophil crawling in capillaries: A novel immune response to staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 10 (10), e1004379(2014).
  23. Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zanker, K. S., Dittmar, T. Analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix. J Vis Exp. (92), e51963(2014).
  24. Wu, P. H., Giri, A., Sun, S. X., Wirtz, D. Three-dimensional cell migration does not follow a random walk. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (11), 3949-3954 (2014).
  25. Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
  26. Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin αv. Nat Immunol. 14 (9), 949-958 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Migracja limfocyt w Tlimfocyty T CD8mikroskopia time lapseizolacja limfocyt wurz dzenia mikrofluidyczneledzenie kom rekblokowanie integrynmikroskopia w wietle przechodz cymr czne ledzenie kom rek
Test migracji in vitro w czasie rzeczywistym dla pierwotnych mysich limfocytów T CD8 +
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.