Method Article

Modułowy montaż oparty na CRISPR do wysokoprzepustowej budowy biblioteki plazmidów UAS-cDNA/ORF

DOI:

10.3791/66581

⸱

May 17th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 2Department of Neurology, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 3Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 4Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy protokół do modułowego montażu opartego na CRISPR (CRISPRmass), metody wysokoprzepustowej budowy biblioteki plazmidów UAS-cDNA/ORF u Drosophila przy użyciu publicznie dostępnych zasobów cDNA/ORF. CRISPRmass może być stosowany do edycji różnych bibliotek plazmidów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Funkcjonalne badania przesiewowe genomiki oferują potężne podejście do badania funkcji genów i opierają się na budowie bibliotek plazmidowych obejmujących cały genom. Konwencjonalne podejścia do budowy biblioteki plazmidów są czasochłonne i pracochłonne. Dlatego niedawno opracowaliśmy prostą i wydajną metodę, modułowy montaż oparty na CRISPR (CRISPRmass), do wysokoprzepustowej budowy obejmującej cały genom biblioteki plazmidów aktywujących sekwencję komplementarną DNA/otwartą ramkę odczytu (UAS-cDNA/ORF). W tym miejscu przedstawiamy protokół dla CRISPRmass, biorąc za przykład konstrukcję biblioteki plazmidowej UAS-cDNA/ORF opartej na GAL4/UAS. Protokół obejmuje masowo równoległe dwuetapowe reakcje probówkowe, po których następuje transformacja bakteryjna. Pierwszym krokiem jest linearyzacja istniejącego komplementarnego DNA (cDNA) lub plazmidów cDNA lub biblioteki ORF z otwartą ramką odczytu (ORF) poprzez przecięcie wspólnych sekwencji wektorowych sąsiadujących z końcem 5' cDNA lub ORF za pomocą CRISPR/Cas9 wraz z pojedynczym przewodnikiem RNA (sgRNA), a drugim krokiem jest wstawienie modułu UAS do zlinearyzowanych plazmidów cDNA lub ORF za pomocą reakcji jednoetapowej. CRISPRmass pozwala na prostą, szybką, wydajną i ekonomiczną budowę różnych bibliotek plazmidowych. Biblioteka plazmidów UAS-cDNA/ORF może być wykorzystana do badań przesiewowych wzmocnienia funkcji w hodowanych komórkach oraz do budowy transgenicznej biblioteki UAS-cDNA/ORF obejmującej cały genom u Drosophila.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bezstronne genetyczne badania przesiewowe całego genomu to skuteczne podejście do identyfikacji genów zaangażowanych w dany proces biologiczny i wyjaśnienia jego mechanizmu. Dlatego jest szeroko stosowany w różnych dziedzinach badań biologicznych. Około 60% genów Drosophila jest konserwatywnych u ludzi1,2, a ~75% genów chorób u ludzi ma homologi w Drosophila3. Badania genetyczne dzielą się głównie na dwa typy: utratę funkcji (LOF) i wzmocnienie funkcji (GOF). Badania genetyczne LOF u Drosophila odegrały kluczową rolę w wyjaśnieniu mechanizmów, które rządzą prawie każdym aspektem biologii. Jednak większość genów Drosophila nie ma oczywistych fenotypów LOF4, dlatego badania przesiewowe GOF są ważną metodą badania funkcji tych genów4,5.

Binarny system GAL4/UAS jest powszechnie używany do ekspresji genów specyficznych dla tkanek w Drosophila6. W tym systemie tkanka specyficznie wyraża aktywator transkrypcji drożdży GAL4, który wiąże się z elementem reagującym na GAL4 (UAS), a tym samym aktywuje transkrypcję dalszych składników genetycznych (np. cDNA i ORF)6. Aby przeprowadzić badania przesiewowe GOF całego genomu u Drosophila, musimy skonstruować bibliotekę plazmidów UAS-cDNA/ORF obejmującą cały genom, a następnie transgeniczną bibliotekę UAS-cDNA/ORF u Drosophila.

Budowa biblioteki plazmidów UAS-cDNA/ORF obejmujących cały genom za pomocą konwencjonalnych metod z publicznie dostępnych klonów cDNA/ORF jest czasochłonna i pracochłonna, ponieważ każdy gen wymaga indywidualnych projektów, w tym projektowania i syntezy starterów, reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) oraz oczyszczania żelu, sekwencjonowania, trawienia restrykcyjnego i tak dalej7,8. Dlatego budowa takiej biblioteki plazmidów jest krokiem ograniczającym szybkość tworzenia transgenicznej biblioteki UAS-cDNA/ORF obejmującej cały genom u Drosophila. Niedawno udało nam się rozwiązać ten problem, opracowując nowatorską metodę, CRISPRmass-based modular assembly (CRISPRmass)9. Istotą CRISPRmass jest manipulowanie współdzielonymi sekwencjami wektorowymi biblioteki plazmidowej poprzez połączenie technologii edycji genów i technologii bezproblemowego klonowania.

Tutaj prezentujemy protokół dla CRISPRmass, który obejmuje masowo równoległe dwuetapowe reakcje w probówkach, po których następuje transformacja bakteryjna. CRISPRmass to prosta, szybka, wydajna i opłacalna metoda, która w zasadzie może być stosowana do wysokoprzepustowej budowy różnych bibliotek plazmidowych.

strategia CRISPRmass
Procedura CRISPRmass rozpoczyna się od równoległych dwuetapowych reakcji w probówkach przed transformacją Escherichia coli (E. coli) (Rysunek 1). Krok 1 to rozszczepienie identycznych szkieletów wektorowych plazmidów cDNA/ORF przez Cas9/sgRNA. Idealne miejsce rozszczepienia przylega do końca 5′ cDNA / ORF. Produkty łupliwości nie muszą być oczyszczane. Krok 2 polega na wprowadzeniu specyficznego dla wektora modułu UAS do zlinearyzowanych plazmidów cDNA/ORF Cas9 / sgRNA przez montaż Gibsona (zwany dalej reakcją jednoetapową), w wyniku czego powstają plazmidy UAS-cDNA / ORF. Końcowe sekwencje 5′ i 3′ modułu UAS nakładają się na sekwencje linearyzowanych plazmidów cDNA/ORF, umożliwiając reakcję jednoetapową.

Produkty jednoetapowej reakcji są bezpośrednio poddawane przemianie E. coli. Teoretycznie tylko pożądane kolonie UAS-cDNA/ORF mogą rosnąć na płytkach Luria-Bertani (LB), które zawierają antybiotyki selekcyjne odpowiadające genowi oporności na antybiotyki modułu UAS. Moduł UAS składa się z rdzeniowego modułu UAS, genu oporności na antybiotyki odrębnego od plazmidów cDNA lub ORF oraz sekwencji końcowych 5′ i 3′. Podstawowy moduł UAS składa się z 10 kopii UAS, minimalnego promotora Hsp70, sekwencji attB do integracji genomowej za pośrednictwem phiC31 oraz mini-białego markera transformacji dla Drosophila7.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Określenie optymalnego miejsca cięcia Cas9/sgRNA przed cDNA/ORF

  1. Otrzymywanie plazmidów cDNA lub ORF z identycznym szkieletem wektorowym
    1. Kup klony cDNA/ORF, które są dostępne w zasobach publicznych, takich jak Drosophila genome resource center (DGRC, https://dgrc.bio.indiana.edu/) Gold Collection10,11, kolekcja genów ssaków myszy (MGC, https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/) oraz ludzka biblioteka ekspresji lentiwirusowej CCSB12. W tym protokole jako przykład bierzemy klony cDNA/ORF oparte na wektorze pOT2, które są dostępne w kolekcji DGRC Gold.
    2. Wyodrębnij plazmidowe DNA za pomocą zestawu do mini-przygotowania plazmidu. Zmierz stężenie plazmidów za pomocą spektrofotometru.
  2. Projektowanie sgRNA
    1. Odwiedź stronę internetową CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/). Kliknij przycisk Wklej cel, a następnie wprowadź interesującą Cię sekwencję DNA. Sekwencja będąca przedmiotem zainteresowania to region o długości 20-100 pz zlokalizowany w szkielecie wektora pOT2 przed końcem cDNA / ORF 5'.
    2. Wybierz gatunek Drosophila melanogaster. Kliknij przycisk Znajdź witryny docelowe. Wybierz kandydatów sgRNA o przewidywanej skuteczności wyższej niż 80%.
  3. Otrzymywanie sgRNA
    1. Zamów oligonukleotydy oczyszczone przez PAGE, starter do przodu (5′ -TAATACGACTCACTATAGG(N)20GTTTTAGAGCTA
      GAAATAG-3′), gdzie (N)20 jest sekwencją docelową sgRNA, a rusztowanie sgRNA odwrócony starter sgRNA-REV (5′-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3′).
      UWAGA: Zaleca się stosowanie wysokiej jakości oligonukleotydów oczyszczonych przez PAGE.
    2. Przygotuj matrycę DNA metodą PCR do transkrypcji in vitro (IVT) sgRNA. Ustaw reakcję PCR 100 μl w następujący sposób: 5 μl matrycy pX330 (plazmid Addgene 42230, prezent od Feng Zhang; 0,1 ng/μL), 5 μl startera (10 μM), 5 μL sgRNA-REV (10 μM), 50 μL 2x High fidelity PCR master mix i 35 μl wody uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC) w probówce PCR.
    3. Przeprowadzić PCR w następujących warunkach termocyklingu: 1 cykl w temperaturze 98 °C przez 30 s; 5 cykli w temperaturze 98 °C przez 10 s, 51 °C przez 10 s, 72 °C przez 5 s; 30 cykli w temperaturze 98 °C przez 10 s, 72 °C przez 15 s; 1 cykl w temperaturze 72 °C przez 2 s. Reakcje inkubować w termocyklerze.
    4. Oddzielić produkty PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym o stężeniu 0,8%. Fragment DNA o długości ~120 pz powinien być widoczny na żelu w promieniowaniu UV. Oczyść fragment DNA ~120-pz za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu. Oczyszczony fragment DNA służy jako matryca dla IVT sgRNA.
    5. Ustaw reakcję IVT o pojemności 5 μl w następujący sposób: 165 ng oczyszczonego fragmentu żelowego DNA o wartości ~120 pz, 1,65 μl mieszaniny buforowej NTP, 0,33 μl mieszaniny polimerazy RNA T7 i woda uzdatniona DEPC. Reakcje inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny. Postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu do transkrypcji in vitro.
    6. Dodać 45 μl wody uzdatnionej DEPC do produktu reakcji IVT. Traktuj produkty reakcji IVT jako RNA i użyj wody uzdatnionej DEPC jako ślepej próby. Zmierz stężenie sgRNA za pomocą spektrofotometru. Stężenie rozcieńczonego sgRNA wynosi około 870 ng/μL.
    7. Rozcieńczyć produkt reakcji IVT do 20 ng/μl wodą uzdatnioną DEPC. Podwielokrotność i przechowywanie sgRNA bezpośrednio w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Po reakcji IVT usunięcie matrycy DNA przez trawienie DNazy nie jest konieczne do pomiaru dokładnego stężenia sgRNA, ponieważ ilość matrycy DNA jest mniejsza niż 0,4% ilości sgRNA, a matryca DNA nie wpływa na późniejszą reakcję CRISPRmass. Dlatego oczyszczanie sgRNA nie jest konieczne.
  4. Ocena sgRNA
    1. Trawić plazmid cDNA/ORF zawierający szkielet wektora pOT2 za pomocą enzymu restrykcyjnego. Oddziel powstałe fragmenty DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym o stężeniu 0,8%. Oczyść substrat DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu.
      UWAGA: Powstały fragment DNA zawierający sekwencje celujące w sgRNA szkieletu wektora pOT2 służy jako substrat DNA Cas9 / sgRNA. Miejsca rozszczepienia Cas9 / sgRNA są asymetrycznie rozmieszczone w substracie DNA, a zatem rozszczepienie substratu DNA przez Cas9 / sgRNA daje dwa fragmenty DNA o różnych rozmiarach, co ułatwia ich odróżnienie od nierozszczepionego substratu DNA w reakcji trawienia.
    2. Ustaw reakcję rozszczepienia 5 μl Cas9 w następujący sposób: 0,2 μl 1,22 μM S. pyogenes Cas9, 0,5 μl 20 ng / μL sgRNA, 0,015 pmol substratu DNA, 0,5 μl 10x buforu Cas9 i woda uzdatniona DEPC. Inkubować reakcje w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    3. Oddzielić produkty cięcia za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym o stężeniu 0,8%. Załadować nienaruszony substrat DNA jako kontrolę ujemną dla strawionego substratu DNA.
      UWAGA: W tym przypadku nienaruszony substrat DNA odnosi się do substratu DNA, który nie jest poddawany reakcjom trawienia przez Cas9 / sgRNA. Rozszczepienie substratu DNA przez Cas9/sgRNA daje dwa fragmenty DNA o różnych rozmiarach, co ułatwia ich odróżnienie od rozszczepionego substratu DNA w reakcji trawienia.
    4. Analizuj wzorce rozszczepienia za pomocą cyfrowego systemu obrazowania (Rysunek 2). Wybierz najbardziej wydajne sgRNA do kolejnych eksperymentów CRISPRmass. Rysunek 2 pokazuje, że wszystkie cztery sgRNA wykazują wysoką wydajność cięcia i mogą być używane do CRISPRmass. Wybierz podkreślone sgRNA do kolejnych eksperymentów.
      UWAGA: Im mniej jest rozdrażnionego substratu DNA, tym bardziej wydajny jest sgRNA do trawienia Cas9 / sgRNA substratu DNA.

2. Budowa modułu UAS

UWAGA: moduł UAS składa się z rdzenia UAS i około 20-40 pz sekwencji końcowych 5′ i 3′ nakładających się na końce 5′ i 3′ miejsca rozszczepienia kręgosłupa, odpowiednio (Rysunek 1). Sekwencje końcowe 5′ i 3′ modułu UAS są określane przez miejsce cięcia szkieletu wektora pOT2.

  1. Sklonuj moduł UAS specyficzny dla wektora pOT2 do miejsca EcoRI wektora pCR8GW, w wyniku czego powstanie plazmid pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 (plik uzupełniający 1). Uwolnić specyficzny dla wektora moduł UAS pOT2 przez mineralizację plazmidu pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 z EcoRI w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  2. Oddzielić produkty cięcia za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym o stężeniu 0,7%. Oczyść moduł 6178-bp UAS za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu. Rozcieńczyć moduł UAS do 23 ng/μl do kolejnych eksperymentów. Ten fragment 6178-bp służy jako moduł UAS do budowy plazmidów UAS-cDNA/ORF z klonów cDNA/ORF opartych na wektorze pOT2
    3. .

3. Wielkoskalowa budowa plazmidów UAS-cDNA/ORF przez CRISPRmass

UWAGA: CRISPRmass jest standaryzowany jako masowo równoległe dwuetapowe reakcje w probówkach przed transformacją E. coli (Rysunek 1).

  1. Reakcja w probówce, krok 1
    1. Rozszczepić identyczne szkielety wektorowe plazmidów cDNA / ORF przez Cas9 / sgRNA. Ułóż probówki o pojemności 0,2 ml w aluminiowym bloku chłodzącym na lodzie i ostrożnie oznacz probówki. Przygotuj mieszankę wzorcową w następujący sposób.
      1. Do pojedynczej reakcji dodać 0,16 μl 1,22 μM S. pyogenes Cas9, 0,4 μl 20 ng/μL sgRNA, 0,24 μl 10x buforu Cas9, 1,2 μl wody uzdatnionej DEPC. W przypadku reakcji N dodać (N+1) x 0,16 μL 1,22 μM S. pyogenes Cas9, (N+1) x 0,4 μL 20 ng/μL sgRNA, (N+1) x 0,24 μL 10x buforu Cas9, (N+1) x 1,2 μL wody uzdatnionej DEPC.
    2. Wiruj, dobrze wymieszaj i odwiruj. Podaniec 2 μl mieszanki wzorcowej do każdej probówki. Dodaj 0,4 μl z 0,019 μM plazmidu cDNA/ORF do każdej probówki. Inkubować reakcje rozszczepienia w temperaturze 37 °C przez 1 h.
      UWAGA: Rozcieńczyć każdy plazmid do 0,019 μM wodą uzdatnioną DEPC. Jeśli stężenie plazmidu jest mniejsze niż 0,019 μM, należy dodać plazmidowe DNA bezpośrednio do reakcji rozszczepienia. Używaj probówek wolnych od RNaz i wody uzdatnionej DEPC. Wykonanie tych kroków na dużą skalę zajmie kilka godzin. O ile nie określono inaczej, odczynniki i reakcje należy przechowywać na lodzie.
  2. Reakcja w probówce, krok 2
    1. Wstawić specyficzny dla wektora moduł UAS z kroku 2 do linearyzowanych plazmidów cDNA/ORF Cas9 za pomocą jednoetapowego zestawu reakcji. Ustawić jednoetapową reakcję o objętości 1,4 μl dla każdej próbki. Ułóż probówki o pojemności 0,2 ml w aluminiowym bloku chłodzącym na lodzie i ostrożnie oznacz probówki.
      1. Przygotuj mieszankę wzorcową w następujący sposób. W przypadku pojedynczej reakcji dodać 0,07 μl modułu UAS 0,006 μM i 0,7 μl jednoetapowej mieszanki wzorcowej zespołu reakcji. W przypadku reakcji N dodać (N+1) x 0,07 μl 0,006 μM modułu UAS i (N+1) x 0,7 μl jednoetapowego zestawu reakcyjnego mieszanki wzorcowej.
    2. Wiruj, dobrze wymieszaj i odwiruj. Porcję 0,77 μl mieszanki wzorcowej do każdej probówki. Dodaj 0,7 μl plazmidu cDNA/ORF zlinearyzowanego Cas9 do każdej probówki. Reakcje inkubować w temperaturze 50 °C przez 1 h.
      UWAGA: Oczyszczanie produktów reakcji montażu jednoetapowego nie jest konieczne. Wykonanie tych kroków na dużą skalę zajmuje kilka godzin. O ile nie określono inaczej, odczynniki i reakcje należy przechowywać na lodzie.
  3. Przekształć jednoetapowe produkty reakcji montażu w E. coli na dużą skalę.
    1. Schłodź wstępnie końcówki 10 μl w temperaturze 4 °C. Schłodź wstępnie probówki o pojemności 1,5 ml w aluminiowym bloku chłodzącym na lodzie.
    2. Rozmrażać kompetentne komórki E. coli na lodzie przez 5 minut. Podwielokrotność 10 μl kompetentnych komórek do każdej wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Stosować dostępne w handlu kompetentne komórki E. coli o wydajności transformacji co najmniej 1 x 108 CFU/μg DNA pUC19.
    3. Dodać 1 μl produktu reakcji jednoetapowego składania do 10 μl kompetentnych komórek, delikatnie zamieszać do wymieszania i umieścić na lodzie na 30 minut.
    4. Inkubować probówki w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C przez 1 minutę, a następnie natychmiast schładzać na lodzie przez 2 minuty.
    5. Dodać 100 μl pożywki SOC (podgrzanej do 37 °C) do każdej probówki w temperaturze pokojowej i inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem (250 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    6. Podgrzać do temperatury 37 °C płytki LB zawierające antybiotyk odpowiadający genowi oporności na antybiotyki modułu UAS. Rozsiać komórki na płytkach i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
      UWAGA: Wykonanie tych kroków na dużą skalę zajmuje kilka godzin. O ile nie określono inaczej, odczynniki i reakcje należy przechowywać na lodzie.
  4. Sprawdź plazmidy UAS-cDNA/ORF skonstruowane za pomocą CRISPRmass
    1. Wybierz pojedynczą kolonię i zaszczep ją w 4,5 ml płynnej pożywki LB uzupełnionej odpowiednim doborem antybiotyków odpowiadających genowi oporności na antybiotyki modułu UAS. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 250 obr./min.
    2. Wyodrębnij plazmidowe DNA za pomocą zestawu do miniprzygotowania plazmidu. Ustaw reakcję trawienia restrykcyjnego o pojemności 20 μl w następujący sposób: 300-500 ng/μl plazmidu, odpowiednie enzymy restrykcyjne, bufor trawienia restrykcyjnego i ultraczysta woda. Inkubować reakcje w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    3. Oddziel fragmenty DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym o stężeniu 0,8% i przeanalizuj za pomocą cyfrowego systemu obrazowania (Rysunek 3).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zastosowaliśmy CRISPRmass do wygenerowania biblioteki plazmidów UAS-cDNA/ORF obejmującej cały genom, używając 3402 klonów cDNA/ORF posiadających szkielet wektora pOT2 z kolekcji DGRC Gold. Losowo przeanalizowaliśmy tylko jedną kolonię dla każdego konstruktu UAS-cDNA/ORF, a późniejsza analiza restrykcji za pomocą PstI wykazała, że 98,6% konstruktów UAS-cDNA/ORF zostało utworzonych pomyślnie9. Uzasadnienie stosowania PstI do analizy restrykcyjnej konstruktów UAS-cDNA/ORF zawierających szkielet wektora pOT2 jest następujące. W module UAS znajdują się dwa miejsca PstI dla klonów cDNA/ORF opartych na wektorze pOT2, a w szkielecie wektora pOT2 znajduje się miejsce PstI. W związku z tym trawienie konstruktu UAS-cDNA/ORF opartego na wektorze pOT2 za pomocą PstI daje fragment specyficzny dla modułu UAS 408 bp i fragment specyficzny dla zespołu wektora modułu UAS 5649 bp. Fragmenty PstI o długości 408 pz i 5649 pz wskazują, że konstrukty UAS-cDNA/ORF dla klonów cDNA/ORF opartych na wektorze pOT2 zostały pomyślnie utworzone, a reprezentatywne wyniki przedstawiono w Rysunek 3.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat blokowy budowy biblioteki UAS-cDNA/ORF przy użyciu CRISPRmass. Potok CRISPRmass do budowy biblioteki UAS-cDNA/ORF. (1) Pierwszy krok reakcji w probówce. Identyczne szkielety wektorowe plazmidów cDNA/ORF są rozszczepiane przez Cas9/sgRNA. Miejsce rozszczepienia znajduje się w szkielecie wektora przylegającym przed końcem cDNA / ORF 5′. Produkty rozszczepienia, bez oczyszczania, są bezpośrednio poddawane drugiemu etapowi reakcji probówkowej. SgRNA stosowane w reakcjach rozszczepienia są przygotowywane przez transkrypcję in vitro i mogą być stosowane bezpośrednio bez oczyszczania. Następnie 28-40 pz końca 5′ miejsca rozszczepienia (żółta ramka) definiuje się jako zakładkę końca 5′, a 28-40 pz końca 3′ miejsca rozszczepienia (czerwona ramka) definiuje się jako zakładkę końca 3′. Szkielet wektora jest nosicielem genu oporności na antybiotyk A (zielona skrzynka). (2) Drugim krokiem jest reakcja w probówce. Specyficzny dla wektora moduł UAS jest łączony z linearyzowanymi plazmidami cDNA/ORF Cas9 bezpośrednio przed końcem cDNA/ORF5′ poprzez jednoetapowy montaż reakcji, w wyniku czego powstają konstrukty UAS-cDNA/ORF. Produkty jednoetapowego montażu reakcji są bezpośrednio poddawane transformacji E. coli. Transformanty są wybierane na płytkach agarowych LB zawierających antybiotyk B odpowiadający genowi oporności na antybiotyki B (brązowa skrzynka) modułu UAS specyficznego dla wektora. Tylko pożądane kolonie UAS-cDNA/ORF mogą rosnąć. Moduł UAS składa się z 10 kopii UAS, minimalnego promotora Hsp70, sekwencji attB do integracji genomowej za pośrednictwem phiC31, mini-białego markera transformacji dla transgenezy Drosophila, selektywnego genu oporności na antybiotyki B do selekcji pozytywnej oraz nakładania się końców 5′ i nakładania się końców 3′ umożliwiających jednoetapowy montaż reakcji. Jednoetapowy montaż reakcji odfiltrowuje wszelkie potencjalne rozszczepienia DNA poza celem spowodowane przez CRISPR/Cas9. Ten rysunek został zmodyfikowany z9. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Ocena sgRNA ukierunkowanych na określone regiony szkieletu wektora pOT2 za pomocą analizy in vitro rozszczepienia Cas9. Podkreślone sgRNA są wybierane do CRISPRmass. M jest markerem DNA. Ten rysunek został zmodyfikowany z9. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Analiza restrykcyjna 20 konstruktów UAS-cDNA/ORF wygenerowanych przez CRISPRmass. Konstrukty analizowano za pomocą mineralizacji PstI. Zaobserwowano oczekiwane wzorce restrykcji dla wszystkich konstruktów UAS-cDNA/ORF. M jest markerem DNA. Ten rysunek został zmodyfikowany z9. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Budowa plazmidu pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70. Specyficzny dla wektora moduł UAS pOT2 zawierający plazmid pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 jest zbudowany w oparciu o trzy plazmidy: pMartini-Amp, pBS-attB-UAS-Hsp70 i pCR8GW-Amp-attB-UAS-Hsp70. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najbardziej krytycznymi etapami CRISPRmass są projektowanie sgRNA i ocena sgRNA. Wybór wysoce wydajnych sgRNA dla Cas9 jest kluczem do sukcesu CRISPRmass. Jeśli po przekształceniu E. coli z jednoetapowymi produktami montażu reakcji obserwuje się bardzo mało kolonii lub nie obserwuje się ich wcale na większości płytek LB zawierających antybiotyk, należy sprawdzić trawienie plazmidu za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Jeśli plazmidy nie są dobrze trawione, sprawdź aktywność Cas9, degradację sgRNA i jakość plazmidu; jeśli plazmidy są dobrze trawione, sprawdź odczynniki do jednoetapowego montażu reakcji i upewnij się, że wydajność transformacji kompetentnych komórek wynosi co najmniej 1 x 108 jtk/μg DNA pUC19. Warto zauważyć, że zastosowanie aluminiowego bloku chłodzącego może ułatwić transformację bakteryjną na dużą skalę.

Ograniczenia CRISPRmass wynikają z manipulacji i włączania sekwencji szkieletu wektora, co ogranicza możliwość znakowania cDNA i ORF na końcu 5' lub 3'.

W przeciwieństwie do wszystkich innych istniejących metod 7,8, CRISPRmass manipuluje i włącza wektorowe sekwencje szkieletowe9. Tak więc, po zaprojektowaniu i przygotowaniu modułów UAS, CRISPRmass nie potrzebuje zindywidualizowanego projektowania ani manipulacji dla każdego pojedynczego plazmidu, ale masowo równoległych dwuetapowych reakcji w probówkach przed transformacją bakteryjną, eliminując PCR i związane z nim manipulacje. Co więcej, zarówno transkrybowane in vitro sgRNA, jak i jednoetapowe produkty montażu reakcji nie muszą być oczyszczane do kolejnych eksperymentów. W porównaniu z technologią klonowania Gateway, CRISPRmass jest bardziej odpowiedni do generowania konstruktów UAS-cDNA/ORF, szczególnie z długich lub bogatych w GC cDNA/ORF, ponieważ CRISPRmass nie amplifikuje PCR cDNA ani samych ORF9.

CRISPRmass może być wykorzystany do wysokoprzepustowej budowy biblioteki plazmidów UAS-cDNA/ORF, a także do edycji różnych bibliotek plazmidów obejmujących cały genom. CRISPRmass można zastosować do budowy biblioteki plazmidów ekspresyjnych poprzez wstawienie promotora CMV do wspólnych sekwencji wektorowych sąsiadujących z końcem 5' cDNA lub ORF. CRISPRmass daje nadzieję na przyspieszenie rozwoju genomiki funkcjonalnej.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była sponsorowana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32071135 i 31471010), Shanghai Pujiang Program (14PJ1405900) oraz Fundację Nauk Przyrodniczych w Szanghaju (19ZR1446400).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Aluminiowy blok chłodzącyAikbbioADMK-0296Do przeprowadzania przemian bakteryjnych
DEPC-Treated WaterInvitrogenAM9906
OmegaD2500Do oczyszczania DNA z żelu agarozowego
System obrazowania żeluTanon2500B
HiScribe T7 Szybki zestaw do syntezy RNA o wysokiej wydajnościNEBE2050
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621
Plasmid Mini KitOmegaD6943Do izolacji plazmidowego DNA z komórek bakteryjnych
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master MixNEBM0494
S. pyogenes Cas9GenScriptZ03386
Inkubator z wytrząsaniemShanghai Zhichu serii ZQLY-180V
TLongGeneT20Do wykonywania PCR 
Trans10 Chemicznie kompetentna komórkaTranGen BioTechCD101
Spektrofotometr ultrafioletowyShimadzuBioSpec-nanoDo pomiaru stężenia DNA lub RNA
Zestaw do ekstrakcji żelu Wieloblokowy termocykler

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).
  2. Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
  3. Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11 (6), 1114-1125 (2001).
  4. Miklos, G. L., Rubin, G. M. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms. Cell. 86 (4), 521-529 (1996).
  5. St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nat Rev Genet. 3 (3), 176-188 (2002).
  6. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  7. Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), 2434-2442 (2013).
  8. Xu, R., et al. A large-scale functional approach to uncover human genes and pathways in Drosophila. Cell Res. 18 (11), 1114-1127 (2008).
  9. Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).
  10. Rubin, G. M., et al. A Drosophila complementary DNA resource. Science. 287 (5461), 2222-2224 (2000).
  11. Stapleton, M., et al. The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes. Genome Res. 12 (8), 1294-1300 (2002).
  12. Yang, X., et al. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nat Meth. 8 (8), 659-661 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR Modular AssemblyPlasmid Library ConstructionUAS cDNA ORF LibraryFunctional Genomics ScreeningCRISPR Cas9 EditingHigh Throughput CloningBacterial TransformationSingle Guide RNAGenome Wide LibraryGain Of Function Screening

Related Articles