Artykuł metodologiczny

Przygotowanie próbek organoidów siatkówki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

DOI:

10.3791/66590

⸱

7 czerwca 2024

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Eye Hospital, Wenzhou Medical University, 2Laboratory of Retinal Physiology and Disease, School of Ophthalmology and Optometry, Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół zapewnia zoptymalizowaną i skomplikowaną procedurę przygotowania próbek organoidów siatkówki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nadaje się do zastosowań, które obejmują analizę synaps w dojrzałych organoidach siatkówki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoidy siatkówki (RO) to trójwymiarowy system hodowli naśladujący cechy ludzkiej siatkówki, które w określonych warunkach różnią się od indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Rozwój i dojrzewanie synaps w RO badano pod względem immunocytochemicznym i funkcjonalnym. Jednak bezpośrednie dowody na ultrastrukturę kontaktu synaptycznego są ograniczone, zawierają zarówno specjalne synapsy wstęgowe, jak i konwencjonalne synapsy chemiczne. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) charakteryzuje się wysoką rozdzielczością i szacowną historią wyjaśniającą rozwój siatkówki i dojrzewanie synaps u ludzi i różnych gatunków. Jest to potężne narzędzie do badania struktury synaptycznej w RO i jest szeroko stosowane w dziedzinie badań RO. Dlatego, aby lepiej zbadać strukturę kontaktów synaptycznych RO w nanoskali i uzyskać wysokiej jakości dowody mikroskopowe, opracowaliśmy prostą i powtarzalną metodę przygotowania próbki RO TEM. W tym artykule opisano protokół, użyte odczynniki i szczegółowe etapy, w tym przygotowanie do utrwalenia RO, po utrwaleniu, osadzanie i wizualizację.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siatkówka, ważny narząd zmysłów wzrokowych u ludzi i ssaków, wykazuje wyraźną laminowaną strukturę charakteryzującą się trzema warstwami jądrowymi mieszczącymi somy neuronów i dwiema warstwami splotowatymi utworzonymi przez połączenia synaptyczne1, w tym konwencjonalne synapsy i wyspecjalizowana synapsa wstęgowa2,3. Synapsa wstęgowa odgrywa kluczową rolę w stopniowym przekazywaniu impulsów pęcherzyków2,3. Proces widzenia obejmuje transmisję sygnału elektrooptycznego przez różne poziomy neuronów i synaps, ostatecznie docierając do kory wzrokowej4,5.

Organoidy siatkówki (RO) reprezentują trójwymiarowy (3D) system hodowli pochodzący z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), naśladujący stany fizjologiczne tkanki siatkówki in vitro1,6,7. Podejście to jest obiecujące w badaniu chorób siatkówki8, drug screening9 i służy jako potencjalna terapia nieodwracalnych stanów zwyrodnieniowych siatkówki, takich jak barwnikowe zwyrodnienie siatkówki10 i jaskra11. Jako potężny system przewodnictwa optycznego in vitro, synapsa w RO jest kluczową strukturą ułatwiającą efektywną transformację i transfer sygnału5.

Rozwój RO można z grubsza podzielić na trzy etapy, zgodnie z ich cechami morfologicznymi i profilami ekspresji molekularnej6,12. RO w stadium 1 (około D21-D60) obejmują nerwowe komórki progenitorowe siatkówki, wiele komórek zwojowych siatkówki (RGC) i kilka komórek amakrynowych gwiazdotwórczych (SAC), odpowiadających pierwszej epoce rozwoju płodu ludzkiego. W stadium 2 (około D50-D150) RO wyrażają niektóre prekursory fotoreceptorów, interneurony i geny związane z synaptogenezą, co stanowi fazę przejścia. Fotoreceptory osiągają dojrzałość w stadium 3 RO (mniej więcej po D100-D150), co odpowiada trzeciemu etapowi rozwoju płodu ludzkiego6,12,13. Warto zauważyć, że w porównaniu z RO w etapie 1 i etapie 2, RO w etapie 3 mają wyraźną strukturę blaszkową, której synapsy dojrzały12, w tym obecność synaps wstęgowych14. Co więcej, niedawne badania potwierdziły, że dojrzałe synapsy są transmisją sygnałów świetlnych, co wskazuje, że są funkcjonalne13. W związku z tym RO w stadium 3 są często wybierane do badania struktury synaptycznej.

Immunohistochemia jest szeroko stosowana do badania ekspresji różnych białek molekularnych. Jednak ograniczenie mikroskopii optycznej polega na jej zdolności do obserwowania tylko ograniczonej liczby określonych komórek i cząsteczek jednocześnie, co skutkuje brakiem kompleksowej analizy relacji między komórkami a otaczającym je środowiskiem. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) charakteryzuje się wysoką rozdzielczością, z ograniczoną rozdzielczością 0,1-0,2 nm, przewyższając mikroskop świetlny o ~10-20 razy15. Uzupełnia wady mikroskopii optycznej i służy do wyjaśniania rozwoju siatkówki i dojrzewania synaps u ludzi16,17 i różnych gatunków18,19,20,21. TEM umożliwia bezpośrednie rozróżnienie komponentów presynaptycznych i postsynaptycznych18,20, a nawet pozwala na kompleksową obserwację struktur subkomórkowych, takich jak wstążki2,3, vesicles22 i mitochondria23. Dlatego TEM jest niezbędnym narzędziem do identyfikacji typów synaps i badania ultrastruktury kontaktów synaptycznych w RO w nanoskali.

Należy zauważyć, że przygotowanie próbki ma ogromne znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości mikrofotografii elektronowych. Chociaż niektóre badania przeprowadziły EM na ROs12,13,24, szczegółowe procedury są niejasne. Ponieważ jakość obrazu z mikroskopii elektronowej zależy w dużym stopniu od efektu utrwalania RO i przenikania odczynników, podczas przygotowania należy wziąć pod uwagę różne ważne czynniki. W związku z tym, aby lepiej zbadać kontakty synaptyczne w RO, przedstawiamy metodę o dobrej odtwarzalności, która pokazuje punkty działania mocowania RO, osadzania i identyfikacji miejsc obserwacji.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Uzyskiwanie RO z iPSCs25

UWAGA: RO zostały uzyskane z iPSC poprzez modyfikację poprzednio zgłoszonej procedury.

  1. Dysocjację iPSC przy ~90% konfluencji za pomocą proteazy bakteryjnej (patrz Tabela materiałów). Pokrój kolonie na kawałki i zeskrob je podnośnikiem komórkowym.
  2. Po pobraniu ponownie zawieś skupiska komórek w 0,25 ml lodowatego Matrigelu. Po 20 minutach inkubacji w temperaturze 37 °C zestalony żel rozsypać pożywką DMEM/F12 (0,5% suplementu N2, 1% suplementu B27, 0,1 mM β-merkaptoetanolu, 0,2 mM substytutu L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny). Zdefiniuj ten czas jako dzień 0 różnicowania.
  3. Po 5 dniach pływającej hodowli komórki grupują się, tworząc torbiele komórkowe. Przenieś te torbiele komórkowe na 100-milimetrową szalkę Petriego, gdzie będą teraz przylegać i rosnąć.
  4. W dniu 15 użyj proteazy bakteryjnej, aby oddzielić przylegające komórki i hodować je w pożywce DMEM/F12 (2% suplementu B27, 0,1 mM aminokwasów endogennych).
  5. W dniu 21 zmień pożywkę na 20 ml pożywki zawierającej surowicę (pożywka DMEM/F12, 8% FBS, 2% suplementu B27, 100 mM tauryny i 2 mM substytut L-glutaminy) i wymieniaj pożywkę co tydzień.

2. Przednie unieruchomienie RO

  1. Delikatnie przesunąć jedną z kultur RO (~D180, optymalna jest średnica około 1~2 mm) z szalki Petriego do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety i zaznaczyć odpowiednie informacje o ROs.
    UWAGA: Przeciąć RO na pół lub odciąć słabo ustrukturyzowaną tkankę brzytwą pod mikroskopem w naczyniu zawierającym utrwalacz, jeśli RO są zbyt duże.
  2. Usunąć pożywkę hodowlaną z probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety. Dodać 1,5 ml utrwalacza 2% paraformaldehydu-2% aldehydu glutarowego rozcieńczonego w 0,1 M buforze fosforanowym (PB) o pH 7,4 i utrwalić w temperaturze pokojowej (RT) przez 4 godziny. Probówki do mikrowirówek należy przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Ten krok można wstrzymać na 1 tydzień, ale zaleca się ponowne uruchomienie tak wcześnie, jak to możliwe. Jeśli RO są pozostawione na dłużej, może to spowodować autolizę komórek prowadzącą do zniszczenia ultrastruktury RO. Ze względu na kruchość RO należy unikać obracania, oscylacji, przewracania lub trudnych operacji.

3. Po utrwaleniu RO

  1. Usunąć 2% utrwalacz paraformaldehydu-2% aldehydu glutarowego i przemyć 1 ml 0,01 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) o pH 7,4 przez 3 x 10 min. Delikatnie zawiesić RO w probówkach mikrowirówek o pojemności 1,5 ml podczas procesu mycia w celu całkowitego wypłukania. Za każdy dodatkowy dzień utrwalania zwiększaj liczbę prań o dwa, aby w jak największym stopniu usunąć resztki utrwalacza.
  2. Usuń pozostały PBS za pomocą pipety i zastąp go ~150 μl 1% kwasu osmowego (OsO4), aż bloki tkanek zostaną zanurzone. Umieść probówki do mikrowirówek w ciemnym pudełku, aby chronić je przed światłem i infiltruj w temperaturze pokojowej przez 1 h.
    UWAGA: OsO4 jest silnym utleniaczem i należy się z nim obchodzić w dygestorium.

4. Barwienie i odwodnienie

UWAGA: Osuszacz musi być włączony, aby osuszyć środowisko od tego kroku.

  1. Usunąć OsO4 za pomocą pipety, przemyć 0,01 M PBS (pH 7,4) 3 x 10 min, a następnie przemyć 3 x 10 min wodą dejonizowaną.
    UWAGA: Aby zapewnić całkowite wypłukanie RO, zalecamy zawieszenie RO. Zassać OsO4 do dedykowanej butelki do utylizacji.
  2. Usuń ostatnie płukanie wodą dejonizowaną i zastąp ~150 μl na probówkę (zapewnić pełną infiltrację bloków tkanek) octanu uranu i zabarwić przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej. Chroń probówki mikrowirówek przed światłem.
  3. Usuń octan uranu i zastąp go 1 ml 50% acetonu w dygestorium, odwadniając przez 10 minut. Następnie użyj 70%, 80%, 90%, 100% i 100% acetonu do stopniowego odwadniania RO kolejno. Każde odwodnienie trwa 10 min.
    UWAGA: Pozostaw trochę płynu, aby namoczyć RO przy każdej wymianie, aby zapobiec narażeniu na powietrze i wilgoć. Dodatkowo działaj szybko, tak szybko, jak to możliwe, ponieważ aceton jest lotny. Odessać octan uranu do specjalnej butelki do utylizacji.

5. Infiltracja

  1. Wyrzucić aceton i dodać ~150 μL mieszaniny składającej się z acetonu i żywicy Epon-812 w stosunku 1:1. Wstaw do piekarnika o temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
  2. Usuń powyższą mieszaninę i zastąp ją mieszaniną składającą się z acetonu i żywicy Epon-812 w stosunku 1:4. Wstaw na noc do piekarnika o temperaturze 37 °C.
  3. Ostrożnie przenieś RO do nowych probówek zawierających ~500 μl czystej żywicy epoksydowej i umieść je w piecu o temperaturze 45 °C na 1 godzinę.

6. Osadzanie

  1. Przygotuj 30-50 ml czystej żywicy epoksydowej w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml, mieszając wcześniej zestaw odczynników zgodnie z instrukcjami producenta. Obracaj czystą żywicę epoksydową powoli do góry nogami przez 30 minut, aby zredukować pęcherzyki powietrza wprowadzane przez mieszalnik. Następnie odstaw do piekarnika o temperaturze 37 °C na 20 minut. Dodaj 2/3 objętości czystej żywicy epoksydowej do rowka formy do zatapiania.
  2. Użyj wykałaczki, aby pobrać RO do formy do zatapiania wyposażonej w czystą żywicę epoksydową.
  3. Wypełnij rowek czystą żywicą epoksydową, aż lekko wystaje lub wybrzusza się.
  4. Dostosuj położenie RO na obu końcach formy do osadzania, aby osadzić kierunkowo. Umieść formę do zatapiania w piekarniku o temperaturze 45 °C na 1-2 godziny, a następnie wstaw ją do piekarnika o temperaturze 65 °C na 48-72 godziny.

7. Półcienkie pozycjonowanie

  1. Przeszlifuj nadmiar żywicy epoksydowej wokół tkanki od końców dłuższych czterech boków bloku osadzającego, aby utworzyć trapezoidalną powierzchnię. Zamontuj blok osadzający w przykładowym stojaku montażowym i przykręć śrubokrętem L. Następnie zainstaluj szklane noże na stojaku na noże i ręcznie dokręć nakrętkę.
  2. Odetnij nadmiar żywicy, aż żądany obszar zostanie odsłonięty.
  3. Napełnij koryto szklanego noża wodą. Pokrój półcienkie plastry na grubość 1 μm za pomocą półcienkiego mikrotomu i ułóż je na szkiełku mikroskopowym za pomocą igły.
  4. Dodać 50 μl 1% błękitu toluidynowego do barwienia półcienkich plastrów i inkubować przez 1 minutę w temperaturze 95 °C na płycie grzewczej. Spłukiwać wodą destylowaną przez 2 min. Użyj zwykłego mikroskopu optycznego 20x, aby obserwować strukturę przekrojów.

8. Ultracienkie przekroje

  1. Zamontuj bloki osadzające i noże szklane zgodnie z opisem w kroku 7.1. Dostosuj odległość między nożem a blokiem tkanki, poziom płynu w zlewie i prędkość krojenia. Ultracienkie odcinki o grubości ~70-100 nm należy wyciąć ultracienkim mikrotomem i nanieść plastry na siatkę miedzianą (200 oczek) za pomocą folii nośnej.
  2. Barwienie ultracienkich skrawków 3% cytrynianem ołowiu przez 15 minut, aby zwiększyć kontrast w procedurze podwójnego barwienia.

9. Obrazowanie RO za pomocą TEM

  1. Uruchom oprogramowanie (patrz tabela materiałów).
  2. Kliknij przycisk Tryb pamięci i z grubsza zaznacz każdą ultracienką sekcję.
  3. Szukaj struktur synaptycznych.
    1. Wyróżnij laminowaną strukturę RO przy małym powiększeniu.
    2. Zlokalizuj zewnętrzną warstwę jądrową (ONL), która pokazuje strukturę jądrową o większej gęstości elektronów. Następnie przejdź do terminala fotoreceptora, w którym gromadzą się liczne pęcherzyki. Szukaj końcówek pręcików z pojedynczą wstęgą synaptyczną i końcówek stożkowych z wieloma wstęgami synaptycznymi.
    3. Przejdź do wewnętrznej warstwy pleksi (IPL) i poszukaj podobnej struktury za pomocą małej wstążki.
  4. Uchwyć obraz mikroskopowy.
    1. Kliknij Start i wprowadź odpowiednią moc powiększania.
    2. Zapisz obrazy.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ustanowienie RO 3D poprzez różnicowanie iPSC dostarcza potężnego narzędzia do badania mechanizmów choroby siatkówki i terapii zastępczej komórkami macierzystymi. Chociaż inni wykazali połączenia synaptyczne w RO funkcjonalnie i immunocytochemicznie, bezpośrednie dowody na istnienie synaps konwencjonalnych i wstęgowych są bardzo ograniczone. W niniejszej pracy przedstawiono metodę badania ultrastruktury dwóch typów synaps w RO za pomocą TEM. Po 180 dniach hodowli RO utrwalono, wybarwiono, zatopiono i ultracienkie plasterki. Obserwacja TEM ujawniła synapsy wstęgowe na zakończeniach aksonalnych fotoreceptorów (Ryc. 1 i Ryc. 2), które są rozmieszczone w OPL. Pod TEM wstęgi pręcików rozczesują się wokół wgłębienia synaptycznego, tworząc profil w kształcie podkowy z poziomymi komórkami (Ryc. 1). Pręty zazwyczaj mają tylko jedną wstęgę, ale stożki mają wiele wstęg (Rysunek 2). Dodatkowo zaobserwowano klasyczne synapsy chemiczne między komórkami amakrynowymi w IPL (Ryc. 3). W TEM synapsa chemiczna składa się z trzech części: presynaptycznej, synaptycznej szczeliny i postsynaptycznej. Błony komórkowe odpowiadające częściom presynaptycznym i postsynaptycznym są nieco grubsze niż reszta części, a wąska szczelina między dwiema błonami nazywana jest szczeliną synaptyczną. W cytoplazmie błony presynaptycznej znajduje się wiele pęcherzyków synaptycznych. Badanie to potwierdza obecność kompletnych połączeń synaptycznych w RO 3D pochodzących z iPSC. Należy jednak zauważyć, że niepełne płukanie między etapami doprowadziłoby do wytrącenia się czarnych cząstek podczas procesu przygotowania próbki (Rysunek 4).

figure-results-1
Rysunek 1: Obrazy TEM synaps wstęgowych prętów w RO. (A,B) Pręt i komórki poziome tworzą profil w kształcie podkowy. Pojedyncza wstęga (groty strzał) została zaobserwowana na każdej sferule pręta w OPL RO, otoczona licznymi pęcherzykami. Podziałka = 0,2 μm. Skróty: RO = organoidy siatkówki; HC = komórka pozioma; OPL = zewnętrzna warstwa pleksi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Obrazy TEM synaps wstęgowych stożków w RO. Trzy synapsy wstęgowe (groty strzałek) były widoczne na stożkowej szypułce w OPL RO. Podziałka = 0,2 μm. Skróty: TEM = transmisyjna mikroskopia elektronowa; RO = organoidy siatkówki; OPL = zewnętrzna warstwa pleksi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Obraz TEM synaps chemicznych w RO. Zaobserwowano konwencjonalną synapsę chemiczną między komórkami amakrynowymi w warstwie IPL RO. Synapsa chemiczna składa się z trzech części: presynaptycznej, synaptycznej szczeliny i postsynaptycznej. W cytoplazmie błony presynaptycznej znajduje się wiele pęcherzyków synaptycznych. Strzałka oznacza kierunek transmisji synaptycznej, wskazując na przeniesienie licznych pęcherzyków z jednego procesu AC1 do innego profilu AC2. Podziałka = 0,2 μm. Skróty: TEM = transmisyjna mikroskopia elektronowa; RO = organoidy siatkówki; IPL = wewnętrzna warstwa pleksiformu; AC = komórki amakrynowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Przykład problemu, który może wystąpić podczas procesu przygotowania próbki. W szypułce stożka znajduje się wiele czarnych cząstek (kółek) z powodu niepełnego płukania między etapami. Strzałki: synapsa wstęgowa. Podziałka = 0,2 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule przedstawiliśmy szczegółowy protokół obserwacji konwencjonalnej i wstęgowej ultrastruktury synaptycznej w RO za pomocą TEM. Protokół ten opiera się na wcześniej opisanych metodach preparacji siatkówki z pewnymi modyfikacjami20. Aby poprawić wskaźnik powodzenia obróbki próbek i jakość mikrofotografii TEM, należy wziąć pod uwagę następujące kluczowe punkty. Po pierwsze, ważne jest, aby przyznać, że RO rozwijają się z iPSC, tworząc masę komórkową pozbawioną układu naczyniowego 6,26 i komórek glejowych26. Ten brak może prowadzić do mniej zwartej organizacji w porównaniu z siatkówką in vivo. Dlatego ważne jest, aby obchodzić się z Ros delikatnie, aby zachować ich strukturę i integralność. Dodaj płyny wzdłuż ścianki rury, aby zminimalizować zakłócenia.

Co ważne, należy zapewnić dokładne odwodnienie tkanki w kroku 4 protokołu i włączyć osuszacz, aby zmniejszyć wilgotność w pomieszczeniu przed rozpoczęciem etapu odwadniania. Zastępując aceton, działaj szybko i pozostaw trochę płynu, aby zanurzyć tkankę, zapobiegając poważnemu zniszczeniu struktury tkanki RO. Nieodwodniona tkanka kurczy się gwałtownie na dużych wysokościach EM, a woda w tkance utrudnia penetrację środka zatapiającego.

Ponieważ RO występują jako przezroczyste kule, upewnij się, że podczas cięcia półcienkich plastrów należy zapewnić właściwy kierunek, aby uzyskać nienaruszone struktury lamelarne. Wreszcie, RO w stadium 3 (około po D100-D150) są uważane za dojrzałe i posiadają integralne synapsy12, w wyniku czego zaleca się przeprowadzenie badania kontaktów synaptycznych, w tym synaps wstęgowych i synaps chemicznych, w tych RO.

Chociaż w poprzednich badaniach dostarczono ograniczonych dowodów ultrastrukturalnych na istnienie synaps RO, nie ma szczegółów na temat pełnej procedury przygotowania próbki RO, a także identyfikacji różnych typów struktur synaptycznych 12,13,24. Capowski i wsp. zastosowali różne techniki do zbadania charakterystyki RO indukowanych przez różne linie hPSC na różnych etapach, w tym mikrofotografie elektronowe wykazujące istnienie pęcherzykowatych synaps wstęgowych w szypułce stożka, które ujawniły, że RO w stadium 3 indukowane przez różne linie hPSC są dojrzałe i funkcjonalne12. Korzystając z TEM i obrazowania dwufotonowego, Cowan i wsp. potwierdzili tworzenie funkcjonalnych struktur synaptycznych wstęgowych w dojrzałych RO13, ale nie wskazano rodzaju synapsy (synapsy czopkowe lub pręcikowe). Jednak nasze kilka partii wyników mikrofotografii wykazało strukturę błonową synaps wstęgowych z idealną przejrzystością i kontrastem, co ilustruje, że nasza metoda jest wykonalna i powtarzalna. Ponadto zidentyfikowaliśmy różne typy synaps zgodnie z ich różnymi cechami morfologicznymi: synapsy czopkowe są zwykle większe i mają kilka wstążek, podczas gdy synapsy pręcikowe są zwykle mniejsze, pokazując tylko jedną wstęgę; W synapsach chemicznych pęcherzyki gromadzą się w strukturach presynaptycznych, a gęstość elektronowa szczeliny synaptycznej jest zwiększona.

Ultrastrukturalna integralność kontaktów synaptycznych w RO ma kluczowe znaczenie dla ich funkcjonowania. Wykorzystanie TEM do zbadania tych kontaktów oferuje szerokie i znaczące korzyści w różnych dziedzinach, takich jak między innymi badanie patogenezy siatkówki in vitro, przeprowadzanie badań przesiewowych leków u RO i ocena technik różnicowania RO. Ograniczony przez obrazowanie 2D TEM, można zaobserwować tylko określony aspekt ultrastruktury ROs, co utrudnia stereoskopową analizę całej struktury synapsy. Ponadto ograniczona dyferencjacja przyczynia się do nieprawidłowego rozmieszczenia komórek13,26, co dodatkowo komplikuje proces obserwacji. Tak więc połączenie objętości EM z rekonstrukcją 3D może przezwyciężyć te niedociągnięcia w przyszłości.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez granty z Narodowego Programu Badań i Rozwoju Chin (2022YFA1105503), Państwowego Kluczowego Laboratorium Neuronauki (SKLN-202103) oraz Chińskiej Fundacji Nauk Przyrodniczych Zhejiang (Y21H120019), Chińskiej Fundacji Nauk Przyrodniczych (82070981).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100 mm szalka PetriegoCorning430167
AcetonMikroskopia elektronowa Science10000
B27 suplementGibcoA3582801
Podnośnik komórekSanta Cruzsc-395251
Siatki miedzianeBeijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.
Oprogramowanie DigitalMicrographGatan, Inc.Oprogramowanie
DispaseStemCell Technologies# 07913Proteaza bakteryjna
DMEM / F12 mediumGibco# 11320033
Forma do zatapianiaBeijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.
Żywica Epon-812Mikroskopia elektronowa Nauka#14900
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Przemysł biologiczny#04-0021A
Mikroskopia elektronowaaldehydu glutarowegoNauka 16020
hiPSCPokazany w Biotechnology Co., Ltd.RC01001-A
Główny cytrynianBeijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.
L-GlutaMaxLife Technologies#35050061 SubstytutL-glutaminy
MatrigelCorning356234
Szkiełko mikroskopoweCITOTEST80312-3161
Suplement N2Gibco17502048
Na2HPO4· 12H2OSigma71650Składnik PB/PBS
NaH2PO4· H2OSigma71507Składnik PB/PBS
Aminokwasy endogenneSigma#M7145
Mikroskop optycznyLaboratoryjny lornetkowy mikroskop biologicznyXsz-107bnii
OsO4TED PELLA4008-160501
PiekarnikBluepardBPG9040A
Paraformaldehydowamikroskopia elektronowa Nauka157-8
Penicylina-StreptomycynaGibco#15140-122
Pół/ultracienki mikrotomReichert-Jung396649
TaurynaSigma#T0625
Błękit toluidynowySangon BiotechE670105-0100
Transmisyjne mikroskopy elektronoweHITACHIH-7500
Octan uranyluTED PELLACA96049
β-merkaptoetanolSigma444203
AZH400HHGZ10592GZ02618

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Andreazzoli, M., Barravecchia, I., De Cesari, C., Angeloni, D., Demontis, G. C. Inducible pluripotent stem cells to model and treat inherited degenerative diseases of the outer retina: 3d-organoids limitations and bioengineering solutions. Cells. 10 (9), 2489(2021).
  2. Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F. Sensory processing at ribbon synapses in the retina and the cochlea. Physiol Rev. 100 (1), 103-144 (2020).
  3. Tom Dieck, S., Brandstätter, J. H. Ribbon synapses of the retina. Cell Tissue Res. 326 (2), 339-346 (2006).
  4. Webvision: The organization of the retina and visual. Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. , University of Utah Health Sciences Center, Webvision. Salt Lake City (UT). (1995).
  5. Soto, F., Zhao, L., Kerschensteiner, D. Synapse maintenance and restoration in the retina by ngl2. Elife. 7, e30388(2018).
  6. Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
  7. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: A window into human retinal development. Development. 147 (24), dev189746 (2020).
  8. Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535(2021).
  9. Luni, C., Serena, E., Elvassore, N. Human-on-chip for therapy development and fundamental science. Curr Opin Biotechnol. 25, 45-50 (2014).
  10. Chahine Karam, F., et al. Human ipsc-derived retinal organoids and retinal pigment epithelium for novel intronic rpgr variant assessment for therapy suitability. J Pers Med. 12 (3), 502(2022).
  11. Lo, J., et al. Therapeutic strategies for glaucoma and optic neuropathies. Mol Aspects Med. 94, 101219(2023).
  12. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3d human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686(2019).
  13. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), e1634 1623-1640 (2020).
  14. Cora, V., et al. A cleared view on retinal organoids. Cells. 8 (5), 391(2019).
  15. Żak, A. M. Light-induced in situ transmission electron microscopy─development, challenges, and perspectives. Nano Lett. 22 (23), 9219-9226 (2022).
  16. Tschulakow, A. V., Oltrup, T., Bende, T., Schmelzle, S., Schraermeyer, U. The anatomy of the foveola reinvestigated. PeerJ. 6, e4482(2018).
  17. Syrbe, S., et al. Müller glial cells of the primate foveola: An electron microscopical study. Exp Eye Res. 167, 110-117 (2018).
  18. Xiao, J., et al. Rod bipolar cells receive cone photoreceptor inputs through both invaginating synapses and flat contacts in the mouse and guinea pig retinas. J Comp Neurol. 531 (11), 1184-1197 (2023).
  19. Liu, X., et al. Retinal degeneration in rpgra mutant zebrafish. Front Cell Dev Biol. 11, 1169941(2023).
  20. Yang, Q., et al. Expression of α-synuclein in the mouse retina is confined to inhibitory presynaptic elements. J Comp Neurol. 531 (10), 1057-1079 (2023).
  21. Zhang, J., et al. Early degeneration of photoreceptor synapse in ccl2/cx3cr1-deficient mice on crb1(rd8) background. Synapse. 67 (8), 515-531 (2013).
  22. De Robertis, E., Franchi, C. M. Electron microscope observations on synaptic vesicles in synapses of the retinal rods and cones. J Biophys Biochem Cytol. 2 (3), 307-318 (1956).
  23. Frey, T. G., Mannella, C. A. The internal structure of mitochondria. Trends Biochem Sci. 25 (7), 319-324 (2000).
  24. Gonzalez-Cordero, A., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).
  25. Gao, M. L., et al. Patient-specific retinal organoids recapitulate disease features of late-onset retinitis pigmentosa. Front Cell Dev Biol. 8, 128(2020).
  26. Afanasyeva, T. aV., et al. A look into retinal organoids: Methods, analytical techniques, and applications. Cell Mol Life Sci. 78 (19-20), 6505-6532 (2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Organoidy siatk wkiprzygotowanie pr bek organoid wultrastruktura synapssynapsy wst goweindukowane pluripotencjalne kom rki macierzystezatapianie organoid wodwodnienie gradientowezatapianie w ywicy epoksydowejmikrotom do skrawk w p cienkich

Powiązane artykuły