Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Powstanie raka wątroby u myszy BALB/c-nu i badanie efektu terapeutycznego formuły Sanleng Jiashen

1.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66599

⸱

26 stycznia 2024

 ,  ,  , 
1School of Basic Medical Science, Changchun University of Chinese Medicine, 2College of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół do zbadania terapeutycznych i hamujących naczyń krwionośnych efektów formuły Sanleng Jiashen na myszach BALB/c-nu z ortotopowym rakiem wątrobowokomórkowym.

Streszczenie

Śmiertelność raka wątroby i odporność na chemiczne leki zmusiły do poszukiwania skutecznych recept na tradycyjne zioła na raka wątroby. Modele zwierzęce, które są powtarzalne, łatwe do manipulowania i w dużym stopniu naśladują patofizjologiczne procesy raka wątroby, są warunkiem wstępnym udanych badań przesiewowych skutecznych kandydatów na leki. Tymczasem wiarygodne wskaźniki i środki oceny skuteczności leków są również gwarancją badań i rozwoju leków przeciw rakowi wątroby.

Formuła Sanleng Jiashen, reprezentatywna recepta tradycyjnej medycyny chińskiej zawierająca Sparganium stoloni erum,. -Ham. (Sanleng), żeń-szeń Panax C. A. Mey. (żeń-szeń), Rheum officinale Baill. (rabarbar) i Ligusticum chuanxiong Hort. (Chuanxiong), jest przepisywany w celu odżywienia wątroby i usunięcia ciepła, usunięcia toksyn i pobudzenia krążenia krwi w leczeniu raka wątroby. Ten protokół eksperymentalny opisuje przygotowanie liofilizowanej formuły Sanleng Jiashen i proces tworzenia raka wątroby in situ u myszy BALB / c-nu. Barwienie histopatologiczne, immunohistochemiczne wykrywanie markerów nowotworowych, obrazowanie in vivo myszy oraz test błony kosmówkowo-omoczniowej zarodka pisklęcia zastosowano w celu zbadania hamowania i antyangiogenezy wpływu formuły Sanleng Jiashen na złośliwą proliferację tkanki raka wątroby. Dane pokazują, że formuła Sanleng Jiashen może skutecznie przeciwdziałać złośliwej proliferacji tkanki raka wątroby, co objawia się zmniejszoną objętością masy guza, poprawą uszkodzeń patologicznych i niższym poziomem markera rakowego ki67.

Doskonałe hamowanie angiogenezy sugeruje również, że formuła Sanleng Jiashen może potencjalnie leczyć i zapobiegać postępowi i pogorszeniu się stanu raka wątroby. Cały schemat eksperymentalny przedstawia kompleksowy proces składników tradycyjnej medycyny chińskiej w leczeniu raka wątroby u myszy, który stanowi odniesienie do ustanowienia i optymalizacji modelu raka wątroby, a także badań i rozwoju leków do zapobiegania i leczenia raka wątroby.

Wprowadzenie

Rak wątroby to śmiertelny nowotwór, który ma swoje źródło w wątrobie i jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem na świecie1. Wskaźniki chorób wątroby w Stanach Zjednoczonych i niektórych krajach rozwijających się wykazują wysoki poziom, a do 2030 roku na całym świecie może wystąpić ponad 1 milion przypadków raka wątroby2. Ze względu na niezdrowe nawyki życiowe, takie jak palenie tytoniu, otyłość i picie alkoholu, a także spustoszenie wywołane przez wirusowe zapalenie wątroby typu B, C i inne wirusy, częstość występowania i śmiertelność z powodu raka wątroby znacznie wzrosła z roku na rok3. Jako niejednorodny nowotwór złośliwy o różnych cechach histologicznych i złym rokowaniu, rak wątroby ma bardzo szeroki zakres występowania, w tym raka wątrobowokomórkowego, wewnątrzwątrobowego raka dróg żółciowych i włóknistego raka wątroby4. Rak wątroby jest często diagnozowany w zaawansowanym stadium, a wielu zaawansowanych pacjentów nie jest kandydatami do radioterapii5. Inhibitor multikinazy sorafenib jest wysoce akceptowanym lekiem dla pacjentów z zaawansowanym rakiem wątroby, ale u pacjentów często rozwija się znaczna oporność w krótkim czasie6. Obecnie inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych PD-1 i PD-L1 w połączeniu z sorafenibem poczyniły pewne postępy w kontrolowaniu rozwoju raka wątroby, ale efekt terapeutyczny jest nadal kontrowersyjny7.

Ortotopowy rak wątroby jest wczesnym typem raka wątroby: komórki rakowe nie rozprzestrzeniły się wokół tkanki wątroby ani nie występują przerzuty międzynarządowe, a funkcja wątroby nie jest znacząco zaburzona8. Ponieważ ortotopowy rak wątroby na ogół nie objawia się oczywistymi objawami dyskomfortu, niektórzy pacjenci mogą odczuwać łagodny ból wątroby, zmęczenie i inne objawy9. W praktyce klinicznej ultrasonografia wątroby metodą kolorowego Dopplera i ulepszone badanie tomografii komputerowej mogą zdiagnozować znaczne zmiany zajmujące przestrzeń w wątrobie10. Chociaż miejscowy rak wątroby, który nie rozprzestrzenił się i nie dał przerzutów, może zostać usunięty chirurgicznie, istnieje pewne ryzyko chirurgiczne i nieuniknione obciążenie psychiczne dla pacjentów11. Chemoradioterapia może zabić całość lub część komórek raka wątroby, a długotrwała immunosupresja u pacjentów przyjmujących leki może wpłynąć na skuteczność leczenia i zwiększyć ryzyko innych chorób12. Dlatego poszukiwanie bezpiecznej i skutecznej terapii lekowej w celu wczesnej profilaktyki i leczenia raka wątroby jest kluczem do ograniczenia postępu i pogorszenia się raka wątroby.

Zasada leczenia raka wątroby w medycynie chińskiej opiera się na koncepcji równowagi i harmonii w ciele. Medycyna chińska postrzega raka wątroby jako brak równowagi lub dysharmonii w energii ciała, znany jako Qi, który wpływa na wątrobę13. Leczenie raka wątroby w medycynie chińskiej obejmuje różne podejścia, w tym ziołolecznictwo, akupunkturę, terapię dietetyczną i zalecenia dotyczące stylu życia. Zasada polega na przywróceniu równowagi Qi, wzmocnieniu mechanizmów obronnych organizmu i promowaniu zdolności organizmu do samoleczenia14,15. Rak wątroby w tradycyjnej medycynie chińskiej należy do kategorii "tympanites" i "nagromadzenia wątroby". Już w "Wewnętrznym Kanonie Huangdi" znajduje się szczegółowy zapis jego objawów, rak wątroby jest spowodowany zastojem krwi i niedoborem Zhengqi i jest leczony poprzez usunięcie zastoju krwi, wyeliminowanie tympanitów i wzmocnienie odporności organizmu w celu utrwalenia konstytucji13. Pigułka Sanleng wywodzi się z książki "Weisheng Baojian" napisanej przez Luo Tianyi, słynnego lekarza z dynastii Yuan. Składa się z trzech rodzajów leków: Sparganium stoloni erum,. -Szynka. (Sanleng), Ligusticum chuanxiong Hort. (Chuanxiong) i Rheum officinale Baill. (rabarbar). Te trzy rodzaje leków mogą dostać się do meridianu wątroby i mieć wartość terapeutyczną w leczeniu raka wątroby14. Formuła Sanleng Jiashen składa się z 16 g Sanleng, 16 g żeń-szenia Panax C.A.Mey. (żeń-szeń), 8 g rabarbaru i 2 g Chuanxiong (Ryc. 1), który jest przepisywany w celu tonizacji wątroby, usunięcia ciepła, wyeliminowania toksyn i pobudzenia krążenia krwi. Uważa się, że zioła te mają właściwości przeciwnowotworowe i pomagają zmniejszyć wzrost guza, złagodzić objawy i poprawić ogólne samopoczucie. W poprzednich eksperymentach in vitro formuła Sanleng Jiashen może hamować proliferację komórek raka wątroby15. Jak jednak skutecznie i rozsądnie ocenić hamujący wpływ chińskich związków ziołowych na raka wątroby? Ustanawiając mysi model raka wątroby in situ BALB/c-nu, badano hamujący wpływ formuły Sanleng Jiashen na raka wątroby i angiogenezę, głównie za pomocą obrazowania na żywo małych zwierząt i testu błony kosmówkowo-omoczniowej zarodka pisklęcia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

BALB/c-nu samce nagich myszy, które były wolne od specyficznych patogenów, w wieku 5 tygodni i ważące 18-22 g, były karmione w Animal Experimental Center of Transformation Medical College of Jilin University; warunki karmienia wynosiły 22 °C-24 °C przy wilgotności względnej 40%-60%. Numer licencji na zwierzę doświadczalne to SYXK(Ji) 2018-0006, a proces eksperymentalny jest zgodny z zasadami i przepisami Komisji Etyki Uniwersytetu Jilin, a numer zatwierdzenia etyki zwierząt to 20221228-01.

1. Przygotowanie liofilizowanej formuły Sanleng Jiashen15

  1. Umieść 16 g Sanleng, 16 g żeń-szenia, 8 g rabarbaru i 2 g Chuanxiong w inteligentnym garnku do dekoktowania (patrz Tabela Materiałów) i moczyć w 294 ml dejonizowanej wody o temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po podgrzaniu i ugotowaniu kontynuuj gotowanie przez 30 minut w temperaturze 100 °C i przefiltruj płyn przez podwójną gazę medyczną (patrz tabela materiałów). Dodać 252 ml wody dejonizowanej do pozostałości, gotować przez 30 minut w temperaturze 100 °C i przefiltrować płyn za pomocą podwójnej gazy.
  2. Zebrać filtrat z kroku 1.1 w czystym naczyniu ze stali nierdzewnej i zamrażać przez 12 godzin w temperaturze -80 °C (patrz tabela materiałów).
  3. Umieścić formułę Sanleng Jiashen z kroku 1.2 w liofilizatorze próżniowym (patrz tabela materiałów) (temperatura wymrażarki: -55 °C) i suszyć przez 48 godzin, aby uzyskać liofilizowany proszek formuły Sanleng Jiashen.

2. Budowa linii komórkowej HCCLM3 wykazującej stabilną ekspresję lucyferazy16

  1. Dodać 1,0 ml zawiesiny komórek HCCLM3 do płytki 24-dołkowej (patrz tabela materiałów) z 5 × 105 komórek/basenik i wyhodować w kompletnym podłożu (10% płodowej surowicy bydlęcej + 1% roztworu penicyliny-streptomycyny + DMEM) (patrz tabela materiałów) zawierającej 3 μg/ml puromycyny przez 72 godziny w inkubatorze komórkowym (37 °C, 5% CO2 , patrz tabela materiałów).
  2. Odrzucić supernatant komórkowy w kroku 2.1 i dodać 100 μl 0,25% roztworu trypsyny w celu trawienia komórek w inkubatorze komórkowym przez 1 minutę (patrz tabela materiałów). Dodać 300 μl kompletnej pożywki i za pomocą pipety uwolnić przylegające komórki i zakończyć trawienie. Zebrać wszystkie zawiesiny komórek i umieścić je w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml w temperaturze pokojowej 1 000 × g na 5 minut. Po odrzuceniu supernatantu dodać 1 ml kompletnej pożywki i wymieszać pipetując.
  3. Dodać 100 μl zawiesiny komórkowej składającej się z 4 × 103 komórek/basenik HCCLM3 z etapu 2.2 do 96-dołkowej płytki i hodować w inkubatorze komórkowym przez 24 godziny (37 °C, 5% CO2, patrz tabela materiałów).
  4. Dodać 0,27 μl lentiwirusa GFP do 96-dołkowych płytek w kroku 2.3 i hodować w inkubatorze komórkowym przez 15 godzin (37 °C, 5% CO2, patrz tabela materiałów). Odrzucić supernatant komórkowy, dodać 100 μl kompletnej pożywki hodowlanej i uzyskać obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy długości fali wzbudzenia 488 nm i długości fali emisji 507 nm (patrz tabela materiałów).
  5. Zastąp 2 ml lentiwirusa GFP i kontynuuj hodowlę przez 24 godziny. Zastąp 2 ml kompletnej pożywki hodowlanej bez lentiwirusa GFP na kolejne 24 godziny
    UWAGA: Skuteczność transfekcji lentiwirusa GFP do komórek HCCLM3 wynosiła 80%, co zaobserwowano pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym.
  6. Dodać 5 ml zawiesiny 2 × 105 komórek z etapu 2.1 do szalki Petriego o średnicy 60 mm i hodować w inkubatorze komórkowym przez 24 godziny. Dodać 64,5 μl lucyferazy i kontynuować hodowlę w inkubatorze komórkowym przez 15 godzin (37 °C, 5% CO2, patrz tabela materiałów).
  7. Odrzucić sklarowany osad i dodać 5 ml kompletnej pożywki, aby kontynuować hodowlę, aż komórki zrożą się w 90% na szalce Petriego. Odrzucić supernatant komórek, przemyć 2 x 1 ml PBS i dodać 1 ml 0,25% roztworu trypsyny w celu trawienia komórek w inkubatorze komórkowym przez 1 minutę (37 °C, 5% CO2, patrz tabela materiałów). Dodać 3 ml kompletnej pożywki i pipetować w górę iw dół, aby uwolnić przylegające komórki i zakończyć trawienie. Zbierz wszystkie zawiesiny komórek do kolejnego wstrzyknięcia myszy.
    UWAGA: Aby uzyskać wystarczającą liczbę komórek, komórki były w sposób ciągły pasażowane i hodowane.

3. Stworzenie modelu BALB/c-nu nagich myszy raka wątroby in situ i leczenie15

  1. Dodać 100 μl 1 × 107 komórek HCCLM3 transfekowanych lucyfekazą w kroku 2.7 i 100 μl kleju matrycowego (patrz tabela materiałów) do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml (patrz tabela materiałów) i lekko wymieszać pipetą o pojemności 1 ml (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Cały proces przygotowania roztworu musi być przeprowadzony na lodzie, aby zapobiec utwardzeniu kleju matrycowego.
  2. Zdezynfekuj lewą i prawą pachę nagich myszy BALB/c-nu jodopiną (patrz Tabela Materiałów) i odjoduj alkoholem (patrz Tabela Materiałów).
  3. Powoli wstrzyknąć 100 μl mieszaniny komórek HCCLM3 i kleju matrycowego z kroku 3.1 w lewą i prawą pachę nagich myszy BALB/c-nu za pomocą jednorazowej strzykawki o pojemności 1 ml.
    UWAGA: Po około 10 dniach u myszy nagich BALB/c-nu rozwinęła się masa guza około 0,5cm3 w miejscu obustronnego wstrzyknięcia pod pachą.
  4. Znieczulenie nagich myszy BALB/c-nu w kroku 3.3 przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 1%, 50 mg/kg pentobarbitalu sodu. Przeciąć skórę obu pach nożyczkami okulistycznymi i pęsetą (patrz Tabela Materiałów) i delikatnie obrać podskórną masę guza, aby umieścić ją w naczyniu do hodowli komórkowych (patrz Tabela Materiałów) zawierającym wstępnie schłodzony bufor PBS (patrz Tabela Materiałów) i pokrój ją na 1 mm3 części skalpelem (patrz Tabela Materiałów).
    UWAGA: Masa guza pod pachami nagich myszy BALB/c-nu musi zostać zebrana na lodzie w ciągu 0,5 godziny, aby utrzymać aktywność komórek nowotworowych i zwiększyć wskaźnik sukcesu modelu. Pod koniec pobierania próbek myszy zostały zabite przez usunięcie kręgów szyjnych. Jeśli w guzie znajduje się martwicza część, należy ją usunąć, pozostawiając tylko biały guz ryby, aby zapobiec infekcji podczas ortotopowego przeszczepu raka.
  5. Znieczulenie nagich myszy BALB/c-nu 1%, 50 mg/kg pentobarbitalu sodu dootrzewnowo (patrz Tabela materiałów), dezynfekcja brzucha jodem (patrz Tabela materiałów) i dejodowanie alkoholem (patrz Tabela materiałów).
  6. Za pomocą nożyczek okulistycznych i pęsety (patrz Tabela materiałów) wyciąć nacięcie chirurgiczne pod kątem 45° około 1 cm w pozycji 0,5 cm poniżej wyrostka mieczykowatego, aby odsłonić wątrobę, delikatnie dociśnij wątrobę, aby wycisnąć tkankę wątroby i przymocuj wątrobę papierem do ważenia.
    UWAGA: Bawełniane waciki lub patyczki można umieścić pod żebrami myszy, aby skutecznie odsłonić wątrobę.
  7. Weź mały kawałek tkanki nowotworowej w kroku 3.4 za pomocą jednorazowej igły do wstrzykiwań o pojemności 10 ml i wszczep masę guza do wątroby około 0,5 cm równolegle do wątroby, aby zamocować go pod torebką wątroby i powoli wycofaj igłę.
    UWAGA: Użyj jednorazowej strzykawki o pojemności 1 ml, aby wpuścić 2 krople stopionego kleju matrycowego, obserwuj masę guza bez przypadkowych poślizgnięć i krwawienia, a następnie zszyj nacięcie chirurgiczne.
  8. Zamknij nacięcie chirurgiczne za pomocą kleszczy do trzymania igły o długości 12 cm i szwów chirurgicznych 6-0 (patrz tabela materiałów). Nałóż maść do oczu z erytromycyną (patrz tabela materiałów) na miejsce operacji, aby zapobiec infekcji. Umieść myszy na podgrzewanej podkładce (patrz Tabela materiałów) i trzymaj je w oddzielnych klatkach po przebudzeniu.
  9. Począwszy od pierwszego dnia po modelowaniu, podawaj 7,5 mg/kg sorafenibu i formuły Sanleng Jiashen (7,8 g/kg, 15,6 g/kg i 31,2 g/kg) przez zgłębnik myszom z kroku 3.8 przez 14 dni, raz dziennie. Podaj równą objętość soli fizjologicznej myszom w grupie modelowej.

4. Ocena obrazowania in vivo

UWAGA: W dniu 14, obrazowanie na żywo zostało wykonane 1 godzinę po zakończeniu podawania.

  1. Włącz komputer i przyrząd do obrazowania in vivo (patrz tabela materiałów). Kliknij dwukrotnie ikonę Living Image na pulpicie, aby uruchomić program. Kliknij na Zainicjuj system IVIS w panelu sterowania, aby uruchomić cały system IVIS.
    UWAGA: Po zakończeniu autotestu urządzenie lampka stanu temperatury na panelu sterowania świeci na czerwono. Odczekaj około 5-10 minut, aż temperatura spadnie, a światło zmieni kolor na zielony, można przeprowadzić akwizycję obrazu.
  2. Zdezynfekuj brzuch myszy alkoholem i wstrzyknąć dootrzewnowo 10 μl D-lucyferyny na g masy ciała (patrz Tabela Materiałów) za pomocą jednorazowej strzykawki. Znieczulenie myszy przez wstrzyknięcie dootrzewnowe 1%, 50 mg/kg pentobarbitalu sodu.
    UWAGA: D-lucyferynę rozcieńczono sterylnym PBS do 15 mg/ml.
  3. Umieść znieczulone myszy w kroku 4.3 w skrzynce obserwacyjnej i zamknij drzwiczki, ustaw czas ekspozycji na 30 s na panelu sterowania: Wybór trybu: wybierz luminescencję zgodnie z typem próbki, domyślnie wybierz program automatyczny i naciśnij acquire, aby uzyskać obrazy.
  4. Kliknij Zapisz dane żywego obrazu, wybierz Wszystkie pliki danych żywego obrazu i zapisz je na pulpicie komputera.
  5. Kliknij Wyjdź w obrazie na żywo na ekranie głównym. Wyłączaj kolejno zasilanie aparatu, zasilanie instrumentu do przetwarzania obrazu i zasilanie komputera.
  6. Po obrazowaniu należy poddać znieczulone myszy eutanazji (wstrzyknięcie dootrzewnowe 1%, 50 mg/kg pentobarbitalu sodu) poprzez zwichnięcie kręgów szyjnych.

5. Barwienie hematoksyliną-eozyną17

  1. Utrwal świeżą tkankę wątroby myszy z kroku 4.7 w 4% paraformaldehydzie przez 48 godzin, a następnie spłucz bieżącą wodą 3 razy przez 5 minut za każdym razem, aby zmyć paraformaldehyd (patrz Tabela materiałów).
  2. Odwodnić tkanki wątroby w kroku 5.1 w 30% etanolu, 50% etanolu, 70% etanolu, 95% etanolu figure-protocol-1, 95% etanolu figure-protocol-2, oraz bezwodny etanol przez 1 godzinę z kolei (patrz Tabela Materiałów).
  3. Umieść odwodnione tkanki wątroby w kroku 5.2 do 50% etanolu, 50% ksylenu, ksylenu figure-protocol-3, ksylen figure-protocol-4, oraz ksylen figure-protocol-5 sekwencyjnie, aby były przezroczyste przez 1 h (patrz Tabela Materiałów).
    UWAGA: Ksylen jest lotny i toksyczny, ten krok odbywa się w dygestorium.
  4. Stopić wosk parafinowy i utrzymać temperaturę na poziomie około 55 °C. Umieścić bloki tkanki wątroby w kroku 5.3 w maszynie do zatapiania parafiny (patrz Tabela materiałów) wypełnionej roztworem wosku do zatapiania.
  5. Zamocuj osadzony blok wosku w tkance wątroby myszy w kroku 5.4 na maszynie do krojenia parafiny (patrz Tabela materiałów), pokrój go na plastry o grubości 5 μm, ułóż plastry całkowicie płasko w wodzie o temperaturze 50 °C i zgarnij je szkiełkiem. Na koniec umieścić je w maszynie do pieczenia tkanek biologicznych w celu wyschnięcia przez 20 minut w temperaturze 70 °C (patrz tabela materiałów).
  6. Zanurz sekcje 5 μm w kroku 5.5 w ksylenie figure-protocol-6, ksylen figure-protocol-7, bezwodny etanol figure-protocol-8, oraz bezwodny etanol figure-protocol-9 przez kolejne 10 minut, następnie moczyć w 95% etanolu, 90% etanolu, 80% etanolu i 70% etanolu odpowiednio przez 5 minut, a na koniec umyć wodą destylowaną w celu odparafinowania (patrz tabela materiałów).
  7. Odwodnione skrawki tkanki wątroby z wosku parrafinowego farbować hematoksyliną o grubości 5 μm hematoksyliną, a następnie spłukać bieżącą wodą.
  8. Różnicować w 1% roztworze kwasu solnego przez 10 s i płukać bieżącą wodą przez 30 minut (patrz Tabela Materiałów).
  9. Farbować 0,5% roztworem eozyny przez 1 minutę (patrz tabela materiałów).
  10. Plastry wsypujemy do 95% alkoholu figure-protocol-10, 95% alkoholu figure-protocol-11, bezwodny etanol figure-protocol-12, bezwodny etanol figure-protocol-13, ksylen figure-protocol-14, and xylen figure-protocol-15 przez 5 minut do odwodnienia (patrz Tabela Materiałów).
  11. Uszczelnij neutralną gumą i zrób zdjęcia pod mikroskopem światła odwróconego (patrz tabela materiałów).

6. Barwienie immunohistochemiczne18

  1. Upuść 1,5% H2O2 na skrawki 5 μm wątroby myszy w kroku 5.6 i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie przemyj PBS przez 2 x 5 minut (patrz Tabela Materiałów).
  2. Naprawić tkankę roztworem kwasu cytrynowego (patrz tabela materiałów) przez 5 minut i przemywać PBS przez 3 x 5 minut.
  3. Inkubować z 0,2% trytonem X-100 (patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej przez 4 minuty, następnie inkubować z 0,5% trytonem X-100 w temperaturze pokojowej przez 4 minuty i przemywać PBS.
  4. Dodać kozią surowicę (patrz Tabela Materiałów) w celu zamknięcia przez 15 minut, a następnie dodać pierwszorzędowe przeciwciało ki67 (patrz Tabela Materiałów) rozcieńczone PBS (1:300) do inkubacji w temperaturze 4 °C przez noc. Myć PBS przez 3 x 5 min.
  5. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym PBS (1:200) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę i przemywać PBS przez 3 x 5 minut (patrz tabela materiałów).
  6. Plamić roztworem rozwijającym się przez 5 minut i spłukać wodą podwójnie destylowaną (patrz tabela materiałów).
  7. Ponownie barwić hematoksyliną przez 2 minuty, różnicować w 1% roztworze kwasu solnego przez 10 s i płukać bieżącą wodą przez 30 minut (patrz tabela materiałów).
  8. Plastry wsypujemy do 95% alkoholu figure-protocol-16, 95% alkoholu figure-protocol-17, bezwodny etanol figure-protocol-18, bezwodny etanol figure-protocol-19, ksylen figure-protocol-20, and xylen figure-protocol-21 przez 5 minut do odwodnienia (patrz Tabela Materiałów).
  9. Uszczelnij neutralną gumą i zrób zdjęcia pod mikroskopem światła odwróconego (patrz tabela materiałów).

7. Test błony kosmówkowo-omoczniowej zarodka pisklęcia19

  1. Pozostaw jaja kurze z białych piór (patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej na 2 godziny i spryskaj alkoholem w celu dezynfekcji. Wywierć otwór w komorze powietrznej za pomocą wiertła czaszkowego (patrz Tabela materiałów) i wysiaduj jaja z podniesioną komorą powietrzną przez 7 dni (temperatura inkubacji 37,8-38,2 °C i wilgotność względna 65%).
    UWAGA: W ciągu pierwszych 3 dni inkubacji włącza się przycisk automatycznego obracania jaj, aby zapobiec przyleganiu błony kosmówkowo-omoczniowej zarodka pisklęcia do skorupki i tworzeniu fałszywej komory powietrznej.
  2. Wyrzuć słabe/niezapłodnione jaja do iluminatora jaj (patrz Tabela materiałów). Ostrożnie odklej okienko o wymiarach 1 x 1 cm pęsetą do oczu (patrz Tabela materiałów) po wywierceniu otworu w sztucznej komorze powietrznej za pomocą wiertła do czaszki (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Należy pamiętać, że skorupka jaja nie powinna wpadać do błony kosmówkowo-omoczniowej zarodka pisklęcia.
  3. W 8 dniu inkubacji dodać 100 μl zawiesiny komórek nowotworowych (1 ×10 6 komórek) do każdego jaja z fałszywej komory powietrznej, z wyjątkiem grupy kontrolnej. W grupach leków dodać 100 μl roztworu sorafenibu i formuły Sanleng Jiashen. W grupie kontrolnej i modelowej dodaj 100 μl PBS.
    UWAGA: Zawiesina komórek nowotworowych składa się z komórek HCCLM3 i kleju matrycowego w równej objętości. Stężenie leku ustala się w następujący sposób: 7,5 mg/kg sorafenibu i formuły Sanleng Jiashen (7,8 g/kg, 15,6 g/kg i 31,2 g/kg).
  4. Przykryj okno przezroczystym opatrunkiem (patrz Tabela Materiałów) i zdezynfekuj alkoholem w sprayu (patrz Tabela Materiałów). Po 7 dniach inkubacji usunąć przezroczysty opatrunek i dodać 1 ml utrwalacza (metanol: aceton = 1:1) (patrz tabela materiałów) z fałszywej komory powietrznej na 30-minutowe utrwalanie.
  5. Wyrzucić utrwalacz za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. Wytnij ~5 x 5 cm błonę kosmówkowo-omoczniową w sztucznej komorze powietrznej za pomocą nożyczek okulistycznych i umieść na szalce Petriego o średnicy 60 mm.
    UWAGA: W przypadku błony kosmówkowo-omoczniowej zarodka pisklęcia z krwią przepłukać PBS. W przypadku błony kosmówkowo-omoczniowej zarodka pisklęcia przyczepionej do tkanki, oddzielić nożyczkami okulstycznymi.
  6. Umieścić błonę kosmówkowo-omoczniową z kroku 7.5 pod mikroskopem optycznym i sfotografować naczynia (patrz Tabela materiałów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jak pokazano w Rysunek 2A, stworzyliśmy model raka wątroby in situ myszy BALB/c-nu i oceniliśmy działanie przeciwnowotworowe formuły Sanleng Jiashen. Rysunek 2B pokazuje, że formuła Sanleng Jiashen może znacząco zahamować wzrost nowotworów wątroby. Wyniki patologiczne wskazały, że w porównaniu z grupą kontrolną, ogniska nowotworowe w grupie modelowej miały wyraźne granice z otaczającą tkanką, większe ogniska guza, ekspansję guzkową i wzrost kompresji. Tymczasem u...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Duża ilość dowodów potwierdziła, że Sanleng, żeń-szeń, rabarbar i Chuanxiong w formule Sanleng Jiashen mają działanie farmakologiczne w leczeniu raka wątroby. Badania wykazały, że Sanleng może znacznie hamować proliferację i wzrost komórek nowotworowych, aby zapobiec inwazji komórek nowotworowych i przerzutom, indukować apoptozę komórek oraz regulować cykl komórkowy i mikrośrodowisko guza20. Udowodniono, że kemferol, aktywny składnik Sanleng, może hamować występowanie i rozwój raka żołądka

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Chińską Fundację Filozofii i Nauk Społecznych (20VYJ070), Projekt Departamentu Edukacji Prowincji Jilin (JJKH20230963KJ) oraz Drugą Partię Projektu Inżynieryjnego Xinglin Scholars na Uniwersytecie Medycyny Chińskiej w Changchun (QNKXJ2-2021+ZR25).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% roztwór trypsynyHyClone, AmerykaSH30042.01B
1 ml jednorazowa strzykawkaMingankang Medical Equipment Co., Ltd., ChinyRWSB
1% roztwór penicyliny i streptomycynyHyklon, AmerykaSV30010
1,5 ml probówka wirówkowaCorning, AmerykaMCT-150-C-S
Szczypceigłowe 12 cmHesdick, ChinyHKQS-211
6-0 szwy chirurgiczneShanghai Jinhuan Medical Equipment Co., Ltd., Szanghaj, ChinyCR631
75% alkoholuSichuan Youbang Enterprise Co., Ltd., Syczuan, Chiny1.00009E+11
96-dołkowe płytkiNEST, Chiny701001
AcetonTianjin Dingfu Chemical General Plant, Tianjin, ChinyGB686-89
BALB/c-nu samce nagich myszyPekin Weitonglihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., Pekin, ChinySYXK(Ji) 2018-0006
Maszyna do pieczenia tkanek biologicznychLeica, Niemcy LeicaHI1220
Naczynie do hodowli komórkowychNEST, ChinyNEST.706001
Roztwór kwasu cytrynowegoWuhan Canos Technology Co., Ltd., Wuhan, Chinysj1074
D-lucyferinGold Biotechnology®, Inc., ChinyLUCK-100
DMEMHyclone, AmerykaSH30243.01
Iluminator jajShandong Weizhen Incubation Equipment Company, Shandong, ChinyWZSDT
Roztwór do barwienia EosinHunan BKMAM Biotechnology Co., Ltd., Hunan, Chiny110703061
Maść do oczu z erytromycyną  Cisen Pharmaceutical Co., Ltd., Szanghaj, ChinyH37022025
Surowica bydlęcapłodu Clark, AmerykaFB25015 
W pełni automatyczny inteligentny inkubator dla pisklątShandong Weizhen Incubation Equipment Company, Shandong, Chiny29538
Roztwór lentiwirusa GFPSuzhou GenePharma Co., Ltd., Suzhou, ChinyF22AZ
Surowica koziaShenyang Wanlei Biotechnology Co., Ltd., Shengyang, ChinyWLA067
Ręczna wiertarka do czaszki myszySTRONGWT, Chiny190
Linia komórkowa HCCLM3WheLab, Szanghaj, ChinyC1010
Zhongke Life Technology Co., Ltd., Hangzhou, ChinyGEJRD-10W
HematoxylinHunan BKMAM Biotechnology Co., Ltd., Hunan, ChinyB-YH250-1
Inteligentny garnek na wywarHangzhou Jiuyang living Appliance Co., Ltd., Hangzhou, Chiny3003BQ
  Mikroskop odwróconej fluorescencjiOlympus, JaponiaIX73
ki67 przeciwciało pierwotneWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, ChinyGB121141-100
Lodophor środek dezynfekującyCofoe Medical Technology Co., Ltd., Hunan, Chiny202110073
LucyferazySuzhou GenePharma Co., Ltd., Suzhou, ChinyE26JZ
Corning, Ameryka356234
Gaza medycznaYunnan Chenye Biotechnology Co., Ltd., Yunnan, Chiny71712049971
MetanolGuangdong Guanghua Sci-Tech Co., Ltd., Guangdong, Chiny1.17001.023
Nożyczki okulistyczneHesdick, ChinyHKQS-209
Pęseta okulistycznaHesdick, ChinyHKCL-20
Maszyna do zatapiania parafinyLeica, Niemcy 
Krajalnica parafinyLeica, Niemcy LeicaCM1950
ParaformaldehydeBiosharp, ChinyBL539A
PBS BuforWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, ChinyG2156-1L
PuromycinPekin Solarbio Nauka i Technology Co., Ltd., Pekin, ChinyP8230
LodówkaThermo Scientific, AmerykaTDE40086FV-ULTS
SkalpelHesdick, ChinyHKCL-93
Przeciwciało wtórneWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, ChinyGB23301
System obrazowania na żywo małych zwierzątCaliper Life Sciences, AmerykaIVIS Lumina XR
SorafenibShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Szanghaj, Chiny284461-73-0 
Przezroczysty opatrunek3M, Ameryka9534HP
Triton X-100Pekin Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Pekin, ChinyT8200
Liofilizator próżniowy Ningbo Xinzhi Biotechnology Co., Ltd., Ningbo, Chinysz-10N
Jaja kurze z białych piórShandong Haotai Experimental Animal Breeding Co., Ltd., Shandong, ChinySCXK(Lu) 20180004
XyleneSigma-Aldrich, , Ameryka534056
Poduszka grzewcza Klej matrycowy EG1150H

Bibliografia

  1. Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis. Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).
  2. Starley, B. Q., Calcagno, C. J., Harrison, S. A. Nonalcoholic fatty liver disease and hepatocellular carcinoma: a weighty connection. Hepatology. 51 (5), 1820-1832 (2010).
  3. Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics. CA-A Cancer J. Clin. 73 (1), 17-48 (2023).
  4. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
  5. Verslype, C., et al. The management of hepatocellular carcinoma. Current expert opinion and recommendations derived from the 10th World Congress on Gastrointestinal Cancer, Barcelona, 2008. Ann. Oncol. , (2009).
  6. Greten, T. F., et al. Biomarkers for immunotherapy of hepatocellular carcinoma. Nat. Rev. Clin. Oncol. 20 (11), 780-798 (2023).
  7. Rimassa, L., Finn, R. S., Sangro, B. Combination immunotherapy for hepatocellular carcinoma. J. Hepatol. 79 (2), 506-515 (2023).
  8. Wu, Z. H., et al. A terrylene-anthraquinone dyad as a chromophore for photothermal therapy in the NIR-II window. J. Am. Chem. Soc. 145 (48), 26487-26493 (2023).
  9. Pawlik, T. M. Hepatocellular carcinoma. Sure. Oncol. Clin. N. Am. 33 (1), (2024).
  10. Schwarze, V., et al. Diagnostic value of contrast-enhanced ultrasound versus computed tomography for hepatocellular carcinoma: a retrospective, single-center evaluation of 234 patients. J. Int. Med. Res. 48 (6), 1-10 (2020).
  11. Maki, H., Hasegawa, K. Advances in the surgical treatment of liver cancer. Biosci. Trends. 16 (3), 178-188 (2022).
  12. Pepe, A., et al. Medical radiology: current progress. Diagnostics. 13 (14), 2439(2023).
  13. Li, Y., Zhang, C. Significance of 'harmonious' thinking in Inner Canon of Huangdi on the prevention and treatment of primary liver cancer. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 28 (02), 305-308 (2013).
  14. Luo, T. Wishing Baojian (M). , China Medical Science and Technology Press. Beijing, China. (2019).
  15. Li, Y. Effect and mechanism of Sanlengjiashen Decoction on hepatocellular carcinoma by JAK2/STAT3 signaling pathway [D]. , Changchun University of Chinese Medicine. (2022).
  16. Wang, P., et al. BTF3 promotes proliferation and glycolysis in hepatocellular carcinoma by regulating GLUT1. Cancer Biol. Ther. 24 (1), 2225884(2023).
  17. Xie, N., et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240(2022).
  18. Wang, X., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA210/ISCU1/2 (COX10) signaling pathway. J. Ethnopharmacol. 241, 111801(2019).
  19. Guerrieri, A. N., et al. A novel patient-derived immortalised cell line of myxofibrosarcoma: a tool for preclinical drugs testing and the generation of near-patient models. BMC Cancer. 23 (1), 1194(2023).
  20. Li, Y., Zhao, J., Zhao, H., Yu, C. Research progress of Sparganium Stoloniferum. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine. 20 (09), 92-94 (2018).
  21. Kim, T. W., Lee, S. Y., Kim, M., Cheon, C., Ko, S. G. Kaempferol induces autophagic cell death via IRE1-JNK-CHOP pathway and inhibition of G9a in gastric cancer cells. Cell Death Dis. 9 (9), 875(2018).
  22. Lee, M. J., et al. Kaempferol alleviates mitochondrial damage by reducing mitochondrial reactive oxygen species production in lipopolysaccharide-induced prostate organoids. Foods. 12 (20), 3836(2023).
  23. Zhang, Q., et al. Molecular docking and in vitro experiments verified that kaempferol induced apoptosis and inhibited human HepG2 cell proliferation by targeting BAX, CDK1, and JUN. Mol. Cell. Biochem. 478 (4), 767-780 (2023).
  24. Kumar, S., et al. Myricetin: a potential plant-derived anticancer bioactive compound-an updated overview. N-S Arch. Pharmacol. 396 (10), 2179-2196 (2023).
  25. Wang, M., et al. Myricetin reverses epithelial-endothelial transition and inhibits vasculogenic mimicry and angiogenesis of hepatocellular carcinoma by directly targeting PAR1. Phytother. Res. 36 (4), 1807-1821 (2022).
  26. Li, J., Li, F., Jin, D. Ginsenosides are promising medicine for tumor and inflammation: A review. Am. J. Chinese Med. 51 (4), 883-908 (2023).
  27. Guo, X., Hu, N., Sun, G., Li, M., Zhang, P. Shenyi capsule plus chemotherapy versus chemotherapy for non-small cell lung cancer:A systematic review of overlapping meta-analyses. Chinese Journal of Integrative Medicine. 24 (3), 227-231 (2018).
  28. Zhang, R., et al. Network Meta-analysis of oral Chinese patent medicine for adjuvant treatment of primary liver cancer. China Journal of Chinese Materia Medica. 46 (09), 2333-2343 (2021).
  29. Oh, H. M., Cho, C. K., Son, C. G. Experimental evidence for the anti-metastatic action of ginsenoside Rg3: A systematic review. Int. J. Mol. Sci. 23 (16), 9077(2022).
  30. Nowak-Perlak, M., Ziółkowski, P., Woźniak, M. A promising natural anthraquinones mediated by photodynamic therapy for anti-cancer therapy. Phytomedicine. 119, 155035(2023).
  31. Bai, J., et al. Emodin, a natural anthraquinone, suppresses liver cancer in vitro and in vivo by regulating VEGFR and miR-34a. Invest. New Drug. 38 (2), 229-245 (2020).
  32. Cheng, G., et al. Cell metabolomics reveals the potential mechanism of aloe emodin and emodin inhibiting breast cancer metastasis. Int. J. Mol. Sci. 23 (22), 13738(2022).
  33. Wang, X., et al. Inhibition of tetramethylpyrazine on P-gp, MRP2, MRP3 and MRP5 in multidrug resistant human hepatocellular carcinoma cells. Oncol. Rep. 23 (1), 211-215 (2010).
  34. Hu, J., et al. Ultrasonic extraction, antioxidant and anticancer activities of novel polysaccharides from Chuanxiong rhizome. Int. J. Biol. Macromol. 85, 277-284 (2016).
  35. Zhong, C., et al. Physicochemical properties of polysaccharides from Ligusticum chuanxiong and analysis of their anti-tumor potential through immunoregulation. Food Funct. 12 (4), 1719-1731 (2021).
  36. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2023).
  37. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J. Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Rak wątrobymodel raka wątrobowokomórkowegotradycyjna medycyna chińskahamowanie wzrostu guzahamowanie angiogenezybarwienie histopatologicznedetekcja immunohistochemicznaobrazowanie in vivo

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.