Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowa hodowla komórkowa komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w hydrożelu z augmentacją fotobiomodulacyjną

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66616

⸱

5 kwietnia 2024

 ,  , 
1Laser Research Centre, Faculty of Health Science, University of Johannesburg

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół demonstrujący użycie hydrożelu jako trójwymiarowego (3D) szkieletu hodowli komórek do hodowli komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) i wprowadzający fotobiomodulację (PBM) w celu zwiększenia proliferacji ADSC w warunkach hodowli 3D.

Streszczenie

Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ADSC), posiadające multipotencjalne cechy mezenchymalne podobne do komórek macierzystych, są często stosowane w medycynie regeneracyjnej ze względu na ich zdolność do różnorodnego różnicowania komórek i zdolność do zwiększania migracji, proliferacji i łagodzenia stanów zapalnych. Jednak ADSC często stają przed wyzwaniami związanymi z przeżyciem i wszczepieniem w rany, głównie z powodu niekorzystnych stanów zapalnych. Aby rozwiązać ten problem, opracowano hydrożele, które podtrzymują żywotność ADSC w ranach i przyspieszają proces gojenia się ran. W tym przypadku naszym celem była ocena synergicznego wpływu fotobiomodulacji (PBM) na proliferację ADSC i cytotoksyczność w ramach hodowli komórkowych 3D. Unieśmiertelnione ADSC rozsiano w 10 μl hydrożeli o gęstości 2,5 x 103 komórek i poddano naświetlaniu przy użyciu diod o długości fali 525 nm i 825 nm o płynności 5 J/cm2 i 10 J/cm2. Zmiany morfologiczne, cytotoksyczność i proliferację oceniano po 24 godzinach i 10 dniach od ekspozycji na PBM. ADSC wykazywały zaokrągloną morfologię i były rozproszone w żelu jako pojedyncze komórki lub agregaty sferoidalne. Co ważne, zarówno PBM, jak i struktura hodowli 3D nie wykazywały działania cytotoksycznego na komórki, podczas gdy PBM znacznie zwiększyły tempo proliferacji ADSC. Podsumowując, badanie to demonstruje zastosowanie hydrożelu jako odpowiedniego środowiska 3D do hodowli ADSC i przedstawia PBM jako istotną strategię augmentacji, w szczególności odnosząc się do powolnych temp proliferacji związanych z hodowlą komórek 3D.

Wprowadzenie

ADSC to mezenchymalne, multipotencjalne komórki progenitorowe zdolne do samoodnawiania się i różnicowania w kilka linii komórkowych. Komórki te mogą być pobrane z frakcji zrębu naczyniowego (SVF) tkanki tłuszczowej podczas procedury lipoaspiracji1. ADSC stały się idealnym typem komórek macierzystych do wykorzystania w medycynie regeneracyjnej, ponieważ komórki te są obfite, minimalnie inwazyjne do pobrania, łatwo dostępne i dobrze scharakteryzowane2. Terapia komórkami macierzystymi oferuje możliwą drogę gojenia się ran poprzez stymulację migracji komórek, proliferacji, neowaskularyzacji i zmniejszanie stanu zapalnego w obrębie ran3,4. Około 80% zdolności regeneracyjnej ADSC można przypisać sygnalizacji parakrynnej za pośrednictwem ich secretome5. Wcześniej sugerowano, że bezpośrednie miejscowe wstrzyknięcie komórek macierzystych lub czynników wzrostu do uszkodzonej tkanki może zakłócić wystarczające mechanizmy naprawcze in vivo6,7,8. Jednak podejście to napotkało kilka wyzwań, takich jak słaba przeżywalność i zmniejszona liczba przeszczepów komórek macierzystych w uszkodzonych tkankach w wyniku środowiska zapalnego 9. Co więcej, jednym z przytoczonych powodów był brak macierzy zewnątrzkomórkowej, która wspierałaby przeżycie i funkcjonalność przeszczepionych komórek10. Aby sprostać tym wyzwaniom, kładzie się obecnie nacisk na rozwój nośników biomateriałów, które wspomagają żywotność i funkcję komórek macierzystych.

Trójwymiarowa (3D) hodowla komórkowa wzmacnia interakcję komórka-komórka i komórka-matryca in vitro, zapewniając środowisko, które lepiej przypomina środowisko in vivo11. Hydrożele były szeroko badane jako klasa nośników biomateriałów, które zapewniają środowisko 3D dla hodowli komórek macierzystych. Struktury te są zbudowane z wody i usieciowanych polimerów12. Enkapsulacja ADSC w hydrożelu praktycznie nie ma wpływu cytotoksycznego na komórki podczas hodowli, przy jednoczesnym zachowaniu żywotności komórek6. Komórki macierzyste hodowane w 3D wykazują zwiększoną retencję swojej łodygi i lepszą zdolność różnicowania13. Podobnie, ADSC nasączone hydrożelem wykazały zwiększoną żywotność i przyspieszone zamykanie ran w modelach zwierzęcych14. Co więcej, enkapsulacja hydrożelowa znacznie zwiększa wszczepianie i zatrzymywanie ADSC w ranach15,16. TrueGel3D jest wykonany z polimeru, polialkoholu winylowego lub dekstranu, zestalonego za pomocą środka sieciującego, cyklodekstryny lub glikolu polietylenowego17. Żel jest syntetycznym hydrożelem, który nie zawiera żadnych produktów pochodzenia zwierzęcego, które mogą zakłócać eksperymenty lub wywoływać reakcję immunologiczną podczas przeszczepiania żelu pacjentowi, skutecznie naśladując macierz zewnątrzkomórkową18. Żel jest w pełni konfigurowalny poprzez zmianę składu i poszczególnych składników. Może pomieścić różne komórki macierzyste i wspierać różnicowanie kilku typów komórek, dostosowując sztywność gel19. Miejsca przyłączenia można tworzyć poprzez dodanie peptydów20. Żel ulega degradacji w wyniku wydzielania metaloproteaz, co pozwala na migrację komórek21. Wreszcie, jest przejrzysty i pozwala na techniki obrazowania.

PBM to minimalnie inwazyjna i łatwa do wykonania forma niskopoziomowej terapii laserowej używanej do stymulacji wewnątrzkomórkowych chromoforów. Różne długości fal wywołują różny wpływ na komórki22. Światło w zakresie od czerwieni do bliskiej podczerwieni stymuluje zwiększoną produkcję trifosforanu adenozyny (ATP) i reaktywnych form tlenu (ROS) poprzez zwiększenie strumienia przez łańcuch transportu elektronów23. Światło w zakresie niebieskim i zielonym stymuluje kanały jonowe bramkowane światłem, umożliwiając niespecyficzny napływ kationów, takich jak wapń i magnez, do komórek, co jest znane z tego, że zwiększa różnicowanie24. Efektem netto jest generowanie wtórnych przekaźników, które stymulują transkrypcję czynników wyzwalających dalsze procesy komórkowe, takie jak migracja, proliferacja i różnicowanie25. PBM może być używany do wstępnego kondycjonowania komórek w celu proliferacji lub różnicowania przed przeszczepieniem komórek do niekorzystnego środowiska, np. uszkodzonej tkanki26. Ekspozycja ADSC na PBM przed i po przeszczepie (630 nm i 810 nm) znacznie poprawiła żywotność i funkcję tych komórek in vivo w modelu szczura z cukrzycą27. Medycyna regeneracyjna wymaga odpowiedniej liczby komórek do skutecznej naprawy tkanek28. W hodowli komórkowej 3D ADSC wiązały się z wolniejszym tempem proliferacji w porównaniu z dwuwymiarową hodowlą komórkową6. Jednak PBM może być używany do wspomagania procesu hodowli komórek 3D ADSC poprzez zwiększanie żywotności, proliferacji, migracji i różnicowania29,30.

Protokół

UWAGA: Zobacz Tabela materiałów w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat wszystkich materiałów, odczynników i oprogramowania wykorzystanych w tym protokole. Protokół został podsumowany graficznie w Rycina 1.

1. Dwuwymiarowa (2D) hodowla komórkowa

UWAGA: Unieśmiertelnione ADSC (1 x106 komórek) są przechowywane w temperaturze -195,8 °C w ciekłym azocie w fiolce do kriokonserwacji zawierającej 1 mL pożywki do zamrażania komórek.

  1. Przygotowanie pożywki do regeneracji komórek 2D oraz kolby do hodowli 2D
    1. Przenieś 39 mL pożywki podstawowej do probówki wirówkowej o pojemności 50 mL
    2. Wzbogać pożywkę podstawową 20% płatkową surowicą bydlęcą (FBS; 10 mL) oraz antybiotykami (1 mL) (0,5 mL penicyliny-streptomycyny i 0,5 mL amfoterycyny B).
    3. Przygotuj kolbę T75, przenosząc do niej 6 mL pożywki do regeneracji komórek, a następnie inkubuj w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i wilgotności 85% przez 45 min (można to zrobić podczas wykonywania kroków regeneracji komórek, aby zaoszczędzić czas).
      UWAGA: Przed użyciem podgrzej kompletną pożywkę do 37 °C; przechowuj w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 1 tydzień.
  2. Regeneracja komórek 2D
    1. Wyjmij kriotubkę z pojemnika do przechowywania w ciekłym azocie i szybko rozmroź ją w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, aż do całkowitego rozmrożenia.
    2. Odwirowuj kriotubkę w wirówce przy 1006 x g przez 5 min (20 °C), a następnie usuń supernatant.
    3. Resuspenduj osad komórkowy w 1 mL uprzednio ogrzanej pożywki do regeneracji komórek.
    4. Równomiernie rozdziel zawiesinę komórkową w przygotowanej wcześniej kolbie (objętość końcowa 7 mL) i inkubuj w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i wilgotności 85%.
    5. Po 24 h usuń i wymień pożywkę do regeneracji komórek.
    6. Wymieniaj pożywkę hodowlaną co 2-3 dni, aż komórki w kolbie osiągną pełną konfluencję.
  3. Zbiór komórek z kolby hodowli 2D w formie zawiesiny pojedynczych komórek i liczenie komórek
    1. Wyjmij kolbę z hodowlą 2D z inkubatora i wylej pożywkę do odpowiedniego pojemnika na odpady.
    2. Przenieś 10 mL roztworu płuczącego do kolby, aby wypłukać komórki oraz usunąć zanieczyszczenia i osady białkowe. Następnie wylej roztwór płuczący.
    3. Dodaj do kolby z hodowlą 6 mL roztworu odrywającego, aby odczepić komórki. Inkubuj kolbę w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i wilgotności 85% przez 2 min.
      UWAGA: Obserwuj kolbę pod mikroskopem, aby potwierdzić, że wszystkie komórki zostały odczepione. Jeśli nie, delikatnie ostukaj kolbę i inkubuj przez kolejną minutę.
    4. Gdy wszystkie komórki zostaną odczepione, przenieś zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej 15 mL i dodaj do niej 1 mL pożywki do regeneracji komórek (zawierającej 20% FBS). Zneutralizuje to działanie roztworu odrywającego.
    5. Wirowuj probówkę przez 5 min przy 1711 x g (20 °C).
    6. Usuń supernatant i resuspenduj komórki w 1 mL kompletnej pożywki.
    7. Pobierz 10 µL zawiesiny komórkowej, umieść w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 500 µL i zmieszaj z 10 µL błękitu trypanu w stosunku 1:1.
    8. Nanieś 10 µL mieszaniny zawiesiny komórkowej z błękitem trypanu w dwóch powtórzeniach do komory licznikowej.
    9. Umieść komorę licznikową w automatycznym liczniku komórek. Licznik wskaże całkowitą liczbę komórek na mL oraz liczbę komórek żywych i martwych. Oblicz średnią liczbę żywych komórek oraz ilość żywych komórek niezbędną do osadzenia w hydrożelu 3D (krok 2.2.6).

2. Trójwymiarowa (3D) hodowla komórek

  1. Przygotowanie pełnej pożywki do hodowli 3D
    1. Przenieś 44 mL pożywki podstawowej do probówki wirówkowej o pojemności 50 mL.
    2. Wzbogać pożywkę w 10% FBS (5 mL) oraz antybiotyki (1 mL) (0,5 mL Penicyliny-Streptomycyny i 0,5 mL Amfoterycyny B).
      UWAGA: Przed użyciem podgrzej pełną pożywkę do 37 °C i przechowuj w temperaturze 4 °C przez maksymalnie jeden tydzień.
  2. Przygotowanie hydrożelu
    1. Przygotuj fast-dekstran, wirując (1000 x g przez 30 s w 20 °C) fiolkę z fast-dekstranem w celu zagęszczenia materiału. Dodaj 175 µL wody do fiolki z fast-dekstranem, aby uzyskać końcowe stężenie 30 mmol/L grup reaktywnych.
    2. Mieszaj probówkę z roztworem fast-dekstranu na vortexie (średnia prędkość przez 30 s) aż do całkowitego rozpuszczenia materiału. Inkubuj rozpuszczony materiał na lodzie przez 5 min. Wiruj probówkę, krótko wymieszaj na vortexie i przechowuj na lodzie do dalszego użycia.
    3. Wiruj sieciujący (1000 x g przez 30 s w 20 °C) w celu zagęszczenia materiału. Dodaj 188 µL wody do fiolki z sieciującym, aby uzyskać końcowe stężenie 20 mmol/L grup tiolowych.
    4. Mieszaj probówkę z roztworem sieciującego na vortexie (średnia prędkość przez 30 s) aż do rozpuszczenia całego materiału. Inkubuj rozpuszczony sieciujący w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 min. Wiruj probówkę, krótko wymieszaj na vortexie i przechowuj w RT do dalszego użycia.
    5. Zmodyfikuj protokół hydrożelu z 30 µL na 10 µL w celu redukcji kosztów (szczegóły znajdują się w Tabeli 1).
    6. Przygotuj zawiesinę komórkową tak, aby uzyskać gęstość siewu 2,5 x 103 komórek na 10 µL hydrożelu.
    7. Połącz składniki zgodnie z Tabelą 1, aby przygotować master mix. Przenieś 9 µL master mixu do dołka w 96-dołkowej płytce paskowej.
    8. Utwardź żel, dodając 1 µL degradowalnego sieciującego 3 min po przeniesieniu master mixu.
    9. Przykryj hydrożele 170 µL uprzednio ogrzanej pełnej pożywki do hodowli. Inkubuj przez 1 h. Po 1 h wymień pożywkę hodowlaną.
      UWAGA: Komórki osadzone w hydrożelu są gotowe do dalszych eksperymentów lub analiz w systemie hodowli 3D. Postępuj zgodnie z dodatkowymi protokołami w zależności od wymagań dla kolejnych etapów analiz.

3. Ekspozycja na fotobiomodulację

  1. Konfiguracja lasera
    1. Skonfiguruj system laserów diodowych dla długości fali zielonej (525 nm) lub bliskiej podczerwieni (825 nm). Włącz lasery i pozwól im rozgrzać się przez zalecany czas.
    2. Stabilizuj moc wyjściową laserów, dopóki nie osiągną stanu ustalonego. Zapewnia to spójne i dokładne naświetlanie.
    3. Zmień moc wyjściową laserów za pomocą miernika mocy laserowej. Zapisz wartości mocy dla każdej długości fali.
    4. Użyj równania 1 (Czas naświetlania laserem), aby obliczyć czas naświetlania laserem. Podstaw wartości z Tabeli 2 do równania 1, aby określić odpowiedni czas naświetlania dla każdej gęstości energii (fluencji). W równaniu 1 „r” oznacza promień strefy naświetlania lasera.
      Wzór obliczania gęstości mocy, mW/cm² = mW/(π×r²), stosowany w pomiarach optycznych.
      Wzór konwersji gęstości mocy z W/cm² na mW/cm², równanie do obliczeń naukowych.
      Wzór obliczania czasu, \( \text{Time (s)} = \frac{J/\text{cm}^2}{W/\text{cm}^2} \), analiza fotoniki.
      Równanie 1
    5. Kieruj się Tabelą 2 w celu uzyskania konkretnych parametrów niezbędnych do obliczeń, w tym gęstości energii (5 J/cm² lub 10 J/cm²) oraz mocy wyjściowej lasera.
  2. Naświetlanie 3D hodowli komórkowych
    1. Po wymianie pełnej pożywki (krok 2.2.9) umieść płytkę 96-dołkową zawierającą komórki wbudowane w hydrożel pod systemem laserów diodowych. Naświetlaj hydrożele przez obliczony czas naświetlania dla wybranej gęstości energii (5 J/cm² lub 10 J/cm²) przy wybranej długości fali (zielonej lub bliskiej podczerwieni). W ten sposób hodowle otrzymają tylko jedną dawkę.
    2. Upewnij się, że każda grupa eksperymentalna posiada grupę kontrolną (n = 4), składającą się z komórek ADSCs wbudowanych w hydrożel bez ekspozycji na PBM.
      UWAGA: Zawsze noś okulary ochronne odpowiednie dla długości fali światła, z którą pracujesz. Lasery są używane poza komorą bezpieczeństwa, dlatego niezwykle ważne jest zdezynfekowanie obszaru przed użyciem.
    3. Inkubuj płytki hodowlane w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i 85% wilgotności przez czas trwania eksperymentów. Inkubuj płytki przez 24 h przed pierwszą analizą lub przez 10 dni przed drugim okresem analizy, po naświetlaniu.

4. Morfologia

  1. Inwertowana mikroskopia świetlna
    1. Włączyć odwrócony mikroskop świetlny i odczekać kilka minut na jego rozgrzanie. Upewnić się, że mikroskop jest prawidłowo ustawiony i skalibrowany.
    2. Przygotować próbkę do obserwacji na szkiełku przedmiotowym lub w specjalistycznym naczyniu do hodowli komórek, w zależności od konfiguracji eksperymentu. Skalibrować mikroskop w celu uzyskania optymalnych warunków obrazowania.
    3. W razie potrzeby dostosować ustawienia ostrości, jasności i kontrastu. Wybrać obiektyw 20x w mikroskopie do obserwacji i rejestracji morfologii komórek.
    4. Umieścić próbkę na stoliku mikroskopu i odnaleźć interesujące komórki, korzystając z okularu. Obserwować i rejestrować morfologię komórek, korzystając z okularu lub podglądu z kamery. Zwrócić uwagę na kształt, rozmiar oraz wszelkie charakterystyczne cechy komórek.
    5. Podłączyć moduł kamery do mikroskopu. Skonfigurować kamerę do obrazowania cyfrowego. Upewnić się, że połączenie i komunikacja między kamerą a mikroskopem przebiegają prawidłowo.
    6. Przechwycić cyfrowe zdjęcia obserwowanych komórek przy użyciu obiektywu 20x. Skorzystać z elementów sterujących kamery, aby dostosować ekspozycję, ostrość i inne odpowiednie parametry.
      UWAGA: Należy upewnić się, że przechwycone obrazy są wysokiej jakości i stanowią reprezentatywny widok morfologii komórek.
    7. Uruchomić oprogramowanie do obrazowania na komputerze. Przechwycić obraz i skorzystać z narzędzi analitycznych w programie w celu analizy morfologii komórek.
    8. Zmierzyć wymiary komórek, policzyć komórki lub przeprowadzić wszelkie analizy właściwe dla celów eksperymentu.
    9. Dodać do obrazów odpowiedni pasek skali za pomocą oprogramowania. Wykorzystać znane powiększenie obiektywu mikroskopu, aby dokładnie oddać skalę obrazów.

5. Analizy biochemiczne

  1. Odzyskiwanie komórek
    UWAGA: Komórki muszą zostać odzyskane z hydrożelu w formie zawiesiny pojedynczych komórek do dalszych analiz biochemicznych.
    1. Przygotować enzymatyczny roztwór do odzyskiwania komórek. W warunkach sterylnych przygotować roztwór roboczy, rozcieńczając enzymatyczny roztwór do odzyskiwania komórek w solance z buforem fosforanowym (PBS) w stosunku 1:20 (roztwór: PBS). Jeśli wymagane jest odzyskanie komórek z określonej liczby żeli lub studzienek, obliczyć całkowitą potrzebną objętość w oparciu o 30 µL roztworu do odzyskiwania na żel.
    2. Do każdej żelowej studzienki zawierającej komórki do odzyskania dodać 30 µL roztworu roboczego. Aby zapewnić dokładne i równomierne rozprowadzenie roztworu, delikatnie kołysać lub obracać płytką. Inkubować płytkę z roztworem do odzyskiwania zgodnie z zalecanym czasem inkubacji. Informacje te znajdują się zazwyczaj w karcie produktu lub protokole dostarczonym przez producenta.
    3. Po zakończeniu inkubacji ostrożnie wyjąć płytkę z inkubatora. Wirować płytki przy 1409 x g przez 5 min (20 °C), aby ubić komórki w osad. Zalecane warunki wirowania znajdują się w karcie produktu lub protokole. Po zakończeniu wirowania ostrożnie usunąć nadsącz, uważając, aby nie zaburzyć osadu komórkowego.
    4. Delikatnie resuspender osad komórkowy w 220 µL sterylnego PBS. Zapewnić dokładne wymieszanie, aby uzyskać jednorodną zawiesinę pojedynczych komórek. Komórki są teraz gotowe do dalszych analiz biochemicznych. Należy postępować zgodnie z konkretnymi protokołami dla planowanych analiz, uwzględniając naturę odzyskanych komórek i wymagania układu eksperymentalnego.
  2. Test cytotoksyczności dehydrogenazy mleczanowej (LDH)
    1. Z każdej studzienki ostrożnie pobrać 50 µL pełnej pożywki hodowlanej, dbając o minimalne zaburzenie warstwy komórek.
    2. Bezpośrednio do każdej studzienki zawierającej pozostałe 50 µL pożywki dodać 50 µL odczynnika do badania cytotoksyczności. Delikatnie wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół, aby zapewnić dokładne zmieszanie próbki z odczynnikiem.
    3. Przygotować kontrolę pozytywną. Przygotować studzienki w trzech powtórzeniach, dodając 5 µL 10-krotnego roztworu lizującego na 50 µL komórek kontroli pozytywnej dołączonych do zestawu.
    4. Inkubować płytkę w zalecanej temperaturze i czasie. Ten etap pozwala odczynnikowi do badania cytotoksyczności na lizę komórek i uwolnienie LDH do pożywki hodowlanej.
    5. Po okresie inkubacji dodać 50 µL roztworu zatrzymującego bezpośrednio do każdej studzienki zawierającej odczynnik do badania cytotoksyczności i lizat komórkowy. Delikatnie wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół, aby zapewnić prawidłowe zatrzymanie reakcji.
      UWAGA: Roztwór zatrzymujący hamuje dalsze uwalnianie LDH i zapewnia stabilność wybarwienia.
    6. Ustawić spektrofotometryczny czytnik płytek zgodnie z instrukcją producenta. Zmierzyć absorbancję każdej studzienki przy 490 nm. Długość fali ta jest specyficzna dla kolorymetrycznej detekcji produktu formazanu generowanego w reakcji LDH.
    7. Odjąć wartości absorbancji tła od obu grup badawczych oraz studni kontrolnych. Odczyty tła uzyskać ze studni zawierających pożywkę i odczynniki do badania cytotoksyczności bez komórek.
    8. Przeanalizować skorygowane wartości absorbancji dla każdej próbki, aby określić poziom cytotoksyczności. Wyższe wartości absorbancji wskazują na zwiększone uwalnianie LDH, a w konsekwencji na wyższą cytotoksyczność.
    9. Dla zapewnienia dokładności statystycznej należy upewnić się, że każda grupa eksperymentalna i kontrolna składała się z czterech powtórzeń (krok 3.2.2). Obliczyć i wprowadzić średnią absorbancję każdej grupy i kontroli do odpowiedniego programu statystycznego.
    10. Porównać wyniki między grupami badawczymi a odpowiednimi kontrolami, aby dokładnie ocenić efekty cytotoksyczne, oraz zapisać wszystkie odczyty absorbancji, obliczenia i warunki eksperymentalne do późniejszego wykorzystania.
  3. Test proliferacji ATP
    1. W warunkach sterylnych zmieszać 50 µL odzyskanych komórek z 50 µL odczynnika ATP w każdej studzience.
      UWAGA: Dostosować objętość komórek i odczynników w zależności od liczby studzienek i projektu eksperymentalnego. Zachować stałe proporcje dla uzyskania dokładnych wyników.
    2. Umieścić płytkę na wytrząsarce i wytrząsać energicznie w ciemności przez 5 min. Ten etap zapewnia dokładne wymieszanie komórek z odczynnikiem. Po wytrząsaniu inkubować płytkę przez dodatkowe 25 min w temperaturze pokojowej (RT). Ten okres inkubacji pozwala odczynnikowi na lizę komórek i wygenerowanie sygnału luminescencyjnego proporcjonalnego do ilości obecnego ATP.
    3. Ustawić czytnik płytek zgodnie z instrukcją producenta w celu detekcji luminescencji. Zmierzyć luminescencję z każdej studzienki zawierającej lizat komórkowy i odczynnik ATP. Upewnić się, że czytnik płytek jest ustawiony na pomiar luminescencji z odpowiednimi parametrami.
    4. Odjąć odczyty luminescencji tła od obu grup badawczych i studni kontrolnych. Odczyty tła uzyskać ze studni zawierających tylko odczynnik ATP i PBS bez komórek.
    5. Przeanalizować skorygowane wartości luminescencji dla każdej próbki, aby określić poziom ATP, co odzwierciedla proliferację lub żywotność komórek.
    6. Dla zapewnienia dokładności statystycznej należy upewnić się, że każda grupa eksperymentalna i kontrolna składała się z czterech powtórzeń (krok 3.2.2). Obliczyć i wprowadzić średnią luminescencję każdej grupy i kontroli do odpowiedniego programu statystycznego.
    7. Porównać wyniki między grupami badawczymi a odpowiednimi kontrolami, aby dokładnie ocenić proliferację ATP. Zapisać wszystkie odczyty luminescencji, obliczenia i warunki eksperymentalne do późniejszego wykorzystania.
      UWAGA: W przypadku wszystkich analiz biochemicznych wykonywanych za pomocą zestawów, należy stosować instrukcję zestawu lub protokół dostarczony przez producenta w celu uzyskania szczegółowych informacji, takich jak zalecane czasy inkubacji, stężenia oraz wszelkie dodatkowe kroki lub uwagi. Podczas pracy z chemikaliami i materiałami biologicznymi zawsze należy przestrzegać zasad bezpieczeństwa w laboratorium.

Wyniki

W celu oceny morfologii i wizualnej inspekcji gęstości komórek w hydrożelach zastosowano mikroskopię odwróconą (Rysunek 2). Komórki ADSCs zachowały zaokrągloną morfologię 24 h po wysianiu i ekspozycji na PBM. Komórki były rozproszone w całej objętości żelu jako pojedyncze komórki lub w skupiskach przypominających grona winogrosza. Morfologia nie uległa zmianie po 10 dniach hodowli 3D. Nie odnotowano jednoznacznych różnic w morfologii pomiędzy grupami eksperymentalnymi a kontrolnymi ani pomiędzy poszczególnymi grupami eksperymentalnymi.

Aby ocenić efekty cytotoksyczne ekspozycji na PBM oraz hodowli 3D z użyciem hydrożelu, zmierzono wyciek LDH (Rysunek 3). Nie stwierdzono istotnych różnic między grupami eksperymentalnymi a kontrolnymi po 24 h lub 10 dniach, co wskazuje, że ekspozycja na PBM oraz hodowla w hydrożelu nie miały szkodliwego wpływu na komórki.

Szybkość proliferacji komórek mierzono poprzez oznaczenie zawartości ATP w ADSC (Rysunek 4). Ekspozycja na PBM doprowadziła do zwiększenia tempa proliferacji we wszystkich grupach eksperymentalnych w porównaniu z grupami kontrolnymi. W 24 h po ekspozycji na PBM najwyższe tempo proliferacji stymulowała długość fali 525 nm. Jednak w 10. dniu długość fali 825 nm wykazała wyższy stopień proliferacji w porównaniu z długością fali 525 nm. Pod koniec 10-dniowego okresu hodowli najwyższą szybkość proliferacji odnotowano w grupie 825 nm, 10 J/cm2.

Przygotowanie hydrożelu, ekspozycja na PBM, analizy; polimer, mikroskopia, cytotoksyczność, proliferacja.
Rysunek 1: Przegląd protokołu. Podsumowanie protokołu przedstawiające przygotowanie hydrożelu w płytkach 96-dołkowych, ekspozycję na PBM oraz pomiar morfologii i analizy biochemiczne po 24 h i 10 dniach od ekspozycji na PBM. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Morfologia komórek, obraz mikroskopowy, skala 60 μm, eksperyment analizujący zmienność struktury komórkowej.
Rysunek 2: ADSC po samoagregacji po wysiewaniu. Komórki zachowały morfologię od okrągłej do owalnej i były rozmieszczone w hydrożelu jako pojedyncze komórki lub agregaty o wyglądzie przypominającym grona winogron w (A) 24 h i (B) 10 dni po wysiewaniu i ekspozycji na PBM. Po 10 dniach inkubacji nie zaobserwowano definitywnych zmian. Zastosowano kontrole (1 i 4), 525 nm przy 5 J/cm2 (2) i 10 J/cm2 (5) lub 825 nm przy 5 J/cm2 (3) i 10 J/cm2 (6), odpowiednio. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Aktywność enzymu LDH, wykres przedstawiający absorbancję przy 490 nm dla różnych zabiegów świetlnych w czasie.
Rycina 3: Wyciek komórkowej LDH jako pomiar cytotoksyczności 24 h i 10 dni po ekspozycji na PBM, z użyciem diod 525 nm i 825 nm (5 J/cm2 i 10 J/cm2) w hydrożelu. Nie zaobserwowano istotnego wzrostu cytotoksyczności w porównaniu z kontrolą eksperymentalną. Kontrola dodatnia była reprezentatywna dla całkowitej śmierci komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy luminescencji ATP; efekty przy 525 nm i 825 nm w czasie; analiza danych fotonicznych.
Rysunek 4: Komórkowe ATP jako miara proliferacji 24 h i 10 dni po ekspozycji na PBM, z użyciem diody 525 nm i 825 nm (5 J/cm2 oraz 10 J/cm2) w hydrożelu. Ekspozycja na PBM stymulowała wzrost tempa proliferacji we wszystkich grupach eksperymentalnych w obu punktach czasowych i przy obu gęstościach energii. Istotne różnice (P < 0,001) są oznaczone przez ***. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

KomponentObjętość (µL) na dołek
polimer SLO-dekstran (30 mmol/L)0.7
Zawiesina komórkowa2
Bufor0.8
Woda5.5
Sieciujący / czynnik sieciujący1
Objętość całkowita10

Tabela 1: Objętości odczynników dla hydrożelu (10 µL).

Parametry laseraZielony (G)Bliska podczerwień (NIR)
Źródło światłaLaser diodowyLaser diodowy
Długość fali (nm)525825
Moc wyjściowa (mW)553515
Gęstość mocy (mW/cm²)2)57.4853.53

Tabela 2: Parametry lasera.

Dyskusja

ADSC są idealnym typem komórek do wykorzystania w medycynie regeneracyjnej, ponieważ stymulują różne procesy, aby pomóc w gojeniu się ran 3,4. Istnieje jednak kilka wyzwań, które należy obejść, np. słabe wskaźniki przeżycia i nieskuteczne wszczepienie komórek w miejsce urazu9. Unieśmiertelnione komórki wykorzystano jako dostępną na rynku linię komórkową, ponieważ mogą być pasażowane przez więcej pokoleń w porównaniu z komórkami pierwotnymi, nie trzeba ich zbierać, są dobrze scharakteryzowane i stanowią jednorodne populacje zapewniające spójne wyniki31. Celem pracy było określenie potencjału augmentacyjnego PBM na proliferację i cytotoksyczność ADSC z wykorzystaniem hodowli komórkowej 3D. Protokół producenta dla hydrożelu o pojemności 30 μl został dostosowany do 10 μl, aby zaoszczędzićkoszty 32. Jednak ta zmniejszona objętość utrudniała przygotowanie i obchodzenie się z żelem.

Wykazano, że ADSC same agregują się w środowisku3D 33. Podobnie w tym badaniu, komórki utworzyły agregaty komórkowe o wyglądzie przypominającym winogrona. Zidentyfikowano jednak również komórki nieśne. Złuszczanie komórek jest znaną właściwością sferoid, w której komórki odłączają się od głównego ciała sferoidalnego lub zbiorczego i są uwalniane do środowiska hodowli. Wydalanie komórek może wynikać z proliferacji komórek, w której żywe komórki są zrzucane podczas mitozy i umożliwiają migrację34. Alternatywnie, linienie może nastąpić z powodu śmierci komórki i utraty sferoidalnego lub zagregowanego kształtu35, szczególnie w bardzo dużych sferoidach z powodu rosnącego nekrotycznego rdzenia. Komórki przyjęły zaokrągloną morfologię w hodowli 3D, w porównaniu z kształtem wrzeciona w hodowlach 2D. Zgodnie z wynikami podobnych badań, wyniki te wynikają z braku miejsc przyczepu lub macierzy zewnątrzkomórkowej, do której komórki mogłyby przylegać do 6,9. Co więcej, komórki nie wykazały znaczącej migracji w żelu, co dodatkowo sugeruje potrzebę miejsc przyłączenia36. Zaleca się dodanie peptydu adhezyjnego lub innego białka macierzy zewnątrzkomórkowej w celu ułatwienia przyłączenia, adhezji i migracji. Ograniczeniem badania było zastosowanie mikroskopii światła odwróconego do obserwacji morfologii 3D ADSC zamiast układania w stosy Z. Ekspozycja na PBM i hodowla 3D nie miały znaczącego wpływu na cytotoksyczność ADSC zarówno po 24 godzinach, jak i 10 dniach od ekspozycji, co wskazuje, że hodowla hydrożelu i PBM są bezpieczne i nie mają negatywnego wpływu na komórki 6,26. W hodowli komórkowej 3D ADSC są związane z wolniejszym tempem proliferacji w porównaniu z hodowlą komórkową 2D. Potwierdzają to niskie wskaźniki proliferacji w grupie kontrolnej w obecnym badaniu6. PBM (525 nm i 825 nm) znacznie zwiększył tempo proliferacji ADSC w hodowli 3D. Początkowo zielone światło (525 nm) zarówno o płynności 5 J/cm2, jak i 10 J/cm2 wywoływało najwyższe tempo proliferacji w porównaniu ze światłem bliskiej podczerwieni (825 nm). Jednak po 10 dniach światło bliskiej podczerwieni (825 nm) ma najwyższe tempo proliferacji zarówno przy płynności 5 J/cm2, jak i 10 J/cm2. Podobnie wykazano, że PBM (525 nm i 825 nm) zwiększa tempo proliferacji w kulturach 2D37. Zaleca się również uwzględnienie grupy kombinacji długości fal, ponieważ inne badania wykazały synergiczny efekt światła zielonego i bliskiej podczerwieni.

Podsumowując, zastosowany hydrożel jest syntetycznym hydrożelem o ogromnych możliwościach dostosowywania do potrzeb różnych zastosowań. Obecne badanie wykazało, że żel nie ma działania cytotoksycznego na komórki w hodowli przez okres 10 dni. Co więcej, PBM wykazał pozytywny potencjał augmentacyjny poprzez znaczne zwiększenie tempa proliferacji ADSC, mimo że znajduje się w środowisku hodowli 3D. W ten sposób ten hydrożel może służyć jako możliwy nośnik biomateriału do przeszczepu do ran. Przyszłe badania powinny mieć na celu przetestowanie potencjalnej zdolności żelu do wspomagania gojenia się ran za pomocą badań na zwierzętach. Jeśli wyniki badań na zwierzętach są korzystne, przewiduje się, że ADSC pochodzące od pacjentów mogą być zbierane, kapsułkowane i wzmacniane PBM przed przeszczepem do ran, aby pomóc w gojeniu się ran w zastosowaniach klinicznych.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez National Research Foundation of South Africa Thuthuka Instrument, grant numer TTK2205035996; Departament Nauki i Innowacji (DSI) sfinansował African Laser Centre (ALC), numer grantu HLHA23X zadanie ALC-R007; University Research Council, grant number 2022URC00513; Departament Nauki i Technologii's South African Research Chairs Initiative (DST-NRF/SARChI), Numer grantu 98337. Organy finansujące nie odegrały żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu, analizie, interpretacji danych ani pisaniu manuskryptu. Autorzy dziękują Uniwersytetowi w Johannesburgu (UJ) i Centrum Badań Laserowych (LRC) za wykorzystanie obiektów i zasobów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Laser diodowy 525 nmNarodowe Centrum Laserowe Republiki Południowej AfrykiEN 60825-1:2007
Laser diodowy 825 nmNarodowe Centrum Laserowe Republiki Południowej AfrykiSN 101080908ADR-1800
96-dołkowe płytki paskoweSigma-AldrichBR782301
Amfoterycyna BSigma-AldrichA2942Antybiotyk (0,5%; 0,5 ml)
Żywotność komórek CellTiter-Glo 3D TestOdczynnik ATP PromegaG9681, Zestaw do oznaczania proliferacji
Corning 2 ml Fiolka kriogeniczna z polipropylenu z gwintem zewnętrznymCorning430659kriowialna
CryoSOfreeSigma-AldrichC9249Pożywka do zamrażania komórek
CytoTox96 Nieradioaktywna analiza cytotoksycznościPromegaG1780Odczynnik cytotoksyczności
Dulbecco' s Zmodyfikowana pożywka EagleSigma-AldrichD5796Pożywka podstawowa (39 ml/44 ml)
Miernik mocy lasera FieldMateKoherentny1098297
płaskodenna bezbarwna płytka polistyrenowa Corning 96 wellSigma-AldrichCLS3370
Surowica bydlęca dla płoduBiochromS0615Wzbogacenie pożywki hodowlanej (5 ml; 10% / 10 ml; 20%)
Hanks Zrównoważony roztwór soli (HBSS)Sigma-AldrichH9394Roztwór do płukania
Inkubator CO2Thermo Scientific51026280
Heraeus Labofuge 400Thermo Scientific75008371Wirówka do płytek 96-dołkowych
Heraeus Megafuge 16RThermoFisher75004270
Immortalized ADSCATCCASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000Passage 37
Invitrogen Countess 3InvitrogenAMQAX2000Automatyczny licznik komórek do kąpieli wodnej Trypan Blue
Julabo TW20Sigma-AldrichZ615501Kąpiel wodna służąca do podgrzewania mediów do 37 & deg; C
Olympus CellSens EntryOlympusWersja 3.2 (23706) Oprogramowanie do obrazowania: cyfrowa akwizycja obrazu
Olympus CKX41OlympusSN9B02019Mikroskop światła odwróconego
Aparat Olympus SC30Aparat OlympusSN57000530podłączony do mikroskopu światła odwróconego
Nieprzezroczystościenne mikropłytki polistyrenowe Corning 96 dołkówSigma-AldrichCLS3912Nieprzezroczysty dobrze stosowany do luminescencji ATP
Penicylina-StreptomycynaSigma-AldrichP4333Antybiotyk (0,5%; 0,5 ml)
SigmaPlot 12.0Systat Software Incorporated
TrueGel3D – True3Sigma-AldrichTRUE3-1KT10 &mikro; L
TrueGel3D Enzymatyczne rozwiązanie do odzyskiwania komórekSigma-AldrichTRUEENZ 01:20
Trypan Blue StainThermo Fisher - InvitrogenT102820,4% roztwór
TrypLE Select Enzyme (1x)Gibco12563029Roztwór do odrywania komórek
Victor Nivo Czytnik płytekPerkin ElmerHH3522019094Czytnik płytek spektrofotometrycznych

Bibliografia

  1. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
  2. Yuan, X., et al. Strategies for improving adipose-derived stem cells for tissue regeneration. Burns Trauma. 10, (2022).
  3. Nilforoushzadeh, M. A., et al. Mesenchymal stem cell spheroids embedded in an injectable thermosensitive hydrogel: An in situ drug formation platform for accelerated wound healing. ACS Biomater Sci Eng. 6 (9), 5096-5109 (2020).
  4. Yang, M., et al. Thermosensitive injectable chitosan/collagen/β-glycerophosphate composite hydrogels for enhancing wound healing by encapsulating mesenchymal stem cell spheroids. ACS Omega. 5 (33), 21015-21023 (2020).
  5. Chimenti, I., et al. Relative roles of direct regeneration versus paracrine effects of human cardiosphere-derived cells transplanted into infarcted mice. Circ Res. 106 (5), 971-980 (2010).
  6. Hassan, W., Dong, Y., Wang, W. Encapsulation and 3d culture of human adipose-derived stem cells in an in-situ crosslinked hybrid hydrogel composed of peg-based hyperbranched copolymer and hyaluronic acid. Stem Cell Res Ther. 4 (2), 32(2013).
  7. Wu, K. H., Mo, X. M., Han, Z. C., Zhou, B. Stem cell engraftment and survival in the ischemic heart. The Ann Thorac Surg. 92 (5), 1917-1925 (2011).
  8. Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: General approaches and a review of recent developments. J R Soc Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
  9. Koivunotko, E., et al. Angiogenic potential of human adipose-derived mesenchymal stromal cells in nanofibrillated cellulose hydrogel. Biomedicines. 10 (10), 2584(2022).
  10. Dong, Y., et al. Injectable and tunable gelatin hydrogels enhance stem cell retention and improve cutaneous wound healing. Adv Funct Mater. 27 (24), 1606619(2017).
  11. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3d cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  12. Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323(2019).
  13. Sung, T. -C., et al. 3D culturing of human adipose-derived stem cells enhances their pluripotency and differentiation abilities. J Mater Sci Technol. 63, 9-17 (2021).
  14. Garg, R. K., et al. Capillary force seeding of hydrogels for adipose-derived stem cell delivery in wounds. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1079-1089 (2014).
  15. Kim, Y. M., et al. Adipose-derived stem cell-containing hyaluronic acid/alginate hydrogel improves vocal fold wound healing. Laryngoscope. 124 (3), E64-E72 (2014).
  16. Dong, Y., et al. Conformable hyaluronic acid hydrogel delivers adipose-derived stem cells and promotes regeneration of burn injury. Acta Biomater. 108, 56-66 (2020).
  17. Truegel3d hydrogel for 3d cell culture. Merck. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/ZA/en/technical-documents/technical-article/cell-culture-and-cell-culture-analysis/3d-cell-culture/truegel3d (2024).
  18. Braccini, S., Tacchini, C., Chiellini, F., Puppi, D. Polymeric hydrogels for in vitro 3d ovarian cancer modeling. Int J Mol Sci. 23 (6), 3265(2022).
  19. Mashinchian, O., et al. In vivo transcriptomic profiling using cell encapsulation identifies effector pathways of systemic aging. eLife. 11, e57393(2022).
  20. Matsushige, C., Xu, X., Miyagi, M., Zuo, Y. Y., Yamazaki, Y. Rgd-modified dextran hydrogel promotes follicle growth in three-dimensional ovarian tissue culture in mice. Theriogenology. 183, 120-131 (2022).
  21. Marx, V. How some labs put more bio into biomaterials. Nat Methods. 16 (5), 365-368 (2019).
  22. Marques, M. M. Photobiomodulation therapy weaknesses. Laser Dent Sci. 6 (3), 131-132 (2022).
  23. Hamblin, M. R. Mechanisms and mitochondrial redox signaling in photobiomodulation. Photochem Photobiol. 94 (2), 199-212 (2018).
  24. Chen, J., et al. Low-level controllable blue LEDs irradiation enhances human dental pulp stem cells osteogenic differentiation via transient receptor potential vanilloid 1. J Photochem Photobiol B. 233, 112472(2022).
  25. Chang, S. -Y., Carpena, N. T., Kang, B. J., Lee, M. Y. Effects of photobiomodulation on stem cells important for regenerative medicine. Med Lasers. 9 (2), 134-141 (2020).
  26. Bikmulina, P. Y., et al. Beyond 2d: Effects of photobiomodulation in 3d tissue-like systems. J Biomed Opt. 25 (4), 048001(2020).
  27. Ahmadi, H., et al. Transplantation of photobiomodulation-preconditioned diabetic stem cells accelerates ischemic wound healing in diabetic rats. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 494(2020).
  28. Mao, A. S., Mooney, D. J. Regenerative medicine: Current therapies and future directions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (47), 14452-14459 (2015).
  29. De Andrade, A. L. M., et al. Effect of photobiomodulation on the behaviour of mesenchymal stem cells in three-dimensional cultures. Lasers Med Sci. 38 (1), 221(2023).
  30. Diniz, I. M., et al. Photobiomodulation of mesenchymal stem cells encapsulated in an injectable rhbmp4-loaded hydrogel directs hard tissue bioengineering. J Cell Physiol. 233 (6), 4907-4918 (2018).
  31. Carter, M., Shieh, J. C. Guide to Research Techniques in Neuroscience. , Elsevier, Academic Press. (2015).
  32. Lutolf, M. P., et al. Synthetic matrix metalloproteinase-sensitive hydrogels for the conduction of tissue regeneration: Engineering cell-invasion characteristics. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5413-5418 (2003).
  33. Robledo, F., et al. Spheroids derived from the stromal vascular fraction of adipose tissue self-organize in complex adipose organoids and secrete leptin. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 70(2023).
  34. Landry, J., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Shedding of mitotic cells from the surface of multicell spheroids during growth. J Cell Physiol. 106 (1), 23-32 (1981).
  35. Bogacheva, M. S., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into definitive endoderm cells in various flexible three-dimensional cell culture systems: Possibilities and limitations. Front Cell Dev Biol. 9, 726499(2021).
  36. Chen, X., Thibeault, S. L. Biocompatibility of a synthetic extracellular matrix on immortalized vocal fold fibroblasts in 3-d culture. Acta Biomater. 6 (8), 2940-2948 (2010).
  37. Crous, A., Van Rensburg, M. J., Abrahamse, H. Single and consecutive application of near-infrared and green irradiation modulates adipose derived stem cell proliferation and affect differentiation factors. Biochimie. 196, 225-233 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rusztowanie hydrożeloweproliferacja komórek macierzystychróżnicowanie komórek macierzystychmedycyna regeneracyjnamezenchymalne komórki macierzystenapromieniowanie laseroweżywotność komórek
Trójwymiarowa hodowla komórkowa komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w hydrożelu z augmentacją fotobiomodulacyjną
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.