Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowa hodowla komórkowa komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w hydrożelu z augmentacją fotobiomodulacyjną

DOI:

10.3791/66616

⸱

5 kwietnia 2024

 ,  , 
1Laser Research Centre, Faculty of Health Science, University of Johannesburg

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół demonstrujący użycie hydrożelu jako trójwymiarowego (3D) szkieletu hodowli komórek do hodowli komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) i wprowadzający fotobiomodulację (PBM) w celu zwiększenia proliferacji ADSC w warunkach hodowli 3D.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ADSC), posiadające multipotencjalne cechy mezenchymalne podobne do komórek macierzystych, są często stosowane w medycynie regeneracyjnej ze względu na ich zdolność do różnorodnego różnicowania komórek i zdolność do zwiększania migracji, proliferacji i łagodzenia stanów zapalnych. Jednak ADSC często stają przed wyzwaniami związanymi z przeżyciem i wszczepieniem w rany, głównie z powodu niekorzystnych stanów zapalnych. Aby rozwiązać ten problem, opracowano hydrożele, które podtrzymują żywotność ADSC w ranach i przyspieszają proces gojenia się ran. W tym przypadku naszym celem była ocena synergicznego wpływu fotobiomodulacji (PBM) na proliferację ADSC i cytotoksyczność w ramach hodowli komórkowych 3D. Unieśmiertelnione ADSC rozsiano w 10 μl hydrożeli o gęstości 2,5 x 103 komórek i poddano naświetlaniu przy użyciu diod o długości fali 525 nm i 825 nm o płynności 5 J/cm2 i 10 J/cm2. Zmiany morfologiczne, cytotoksyczność i proliferację oceniano po 24 godzinach i 10 dniach od ekspozycji na PBM. ADSC wykazywały zaokrągloną morfologię i były rozproszone w żelu jako pojedyncze komórki lub agregaty sferoidalne. Co ważne, zarówno PBM, jak i struktura hodowli 3D nie wykazywały działania cytotoksycznego na komórki, podczas gdy PBM znacznie zwiększyły tempo proliferacji ADSC. Podsumowując, badanie to demonstruje zastosowanie hydrożelu jako odpowiedniego środowiska 3D do hodowli ADSC i przedstawia PBM jako istotną strategię augmentacji, w szczególności odnosząc się do powolnych temp proliferacji związanych z hodowlą komórek 3D.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ADSC to mezenchymalne, multipotencjalne komórki progenitorowe zdolne do samoodnawiania się i różnicowania w kilka linii komórkowych. Komórki te mogą być pobrane z frakcji zrębu naczyniowego (SVF) tkanki tłuszczowej podczas procedury lipoaspiracji1. ADSC stały się idealnym typem komórek macierzystych do wykorzystania w medycynie regeneracyjnej, ponieważ komórki te są obfite, minimalnie inwazyjne do pobrania, łatwo dostępne i dobrze scharakteryzowane2. Terapia komórkami macierzystymi oferuje możliwą drogę gojenia się ran poprzez stymulację migracji komórek, proliferacji, neowaskularyzacji i zmniejszanie stanu zapalnego w obrębie ran3,4. Około 80% zdolności regeneracyjnej ADSC można przypisać sygnalizacji parakrynnej za pośrednictwem ich secretome5. Wcześniej sugerowano, że bezpośrednie miejscowe wstrzyknięcie komórek macierzystych lub czynników wzrostu do uszkodzonej tkanki może zakłócić wystarczające mechanizmy naprawcze in vivo6,7,8. Jednak podejście to napotkało kilka wyzwań, takich jak słaba przeżywalność i zmniejszona liczba przeszczepów komórek macierzystych w uszkodzonych tkankach w wyniku środowiska zapalnego 9. Co więcej, jednym z przytoczonych powodów był brak macierzy zewnątrzkomórkowej, która wspierałaby przeżycie i funkcjonalność przeszczepionych komórek10. Aby sprostać tym wyzwaniom, kładzie się obecnie nacisk na rozwój nośników biomateriałów, które wspomagają żywotność i funkcję komórek macierzystych.

Trójwymiarowa (3D) hodowla komórkowa wzmacnia interakcję komórka-komórka i komórka-matryca in vitro, zapewniając środowisko, które lepiej przypomina środowisko in vivo11. Hydrożele były szeroko badane jako klasa nośników biomateriałów, które zapewniają środowisko 3D dla hodowli komórek macierzystych. Struktury te są zbudowane z wody i usieciowanych polimerów12. Enkapsulacja ADSC w hydrożelu praktycznie nie ma wpływu cytotoksycznego na komórki podczas hodowli, przy jednoczesnym zachowaniu żywotności komórek6. Komórki macierzyste hodowane w 3D wykazują zwiększoną retencję swojej łodygi i lepszą zdolność różnicowania13. Podobnie, ADSC nasączone hydrożelem wykazały zwiększoną żywotność i przyspieszone zamykanie ran w modelach zwierzęcych14. Co więcej, enkapsulacja hydrożelowa znacznie zwiększa wszczepianie i zatrzymywanie ADSC w ranach15,16. TrueGel3D jest wykonany z polimeru, polialkoholu winylowego lub dekstranu, zestalonego za pomocą środka sieciującego, cyklodekstryny lub glikolu polietylenowego17. Żel jest syntetycznym hydrożelem, który nie zawiera żadnych produktów pochodzenia zwierzęcego, które mogą zakłócać eksperymenty lub wywoływać reakcję immunologiczną podczas przeszczepiania żelu pacjentowi, skutecznie naśladując macierz zewnątrzkomórkową18. Żel jest w pełni konfigurowalny poprzez zmianę składu i poszczególnych składników. Może pomieścić różne komórki macierzyste i wspierać różnicowanie kilku typów komórek, dostosowując sztywność gel19. Miejsca przyłączenia można tworzyć poprzez dodanie peptydów20. Żel ulega degradacji w wyniku wydzielania metaloproteaz, co pozwala na migrację komórek21. Wreszcie, jest przejrzysty i pozwala na techniki obrazowania.

PBM to minimalnie inwazyjna i łatwa do wykonania forma niskopoziomowej terapii laserowej używanej do stymulacji wewnątrzkomórkowych chromoforów. Różne długości fal wywołują różny wpływ na komórki22. Światło w zakresie od czerwieni do bliskiej podczerwieni stymuluje zwiększoną produkcję trifosforanu adenozyny (ATP) i reaktywnych form tlenu (ROS) poprzez zwiększenie strumienia przez łańcuch transportu elektronów23. Światło w zakresie niebieskim i zielonym stymuluje kanały jonowe bramkowane światłem, umożliwiając niespecyficzny napływ kationów, takich jak wapń i magnez, do komórek, co jest znane z tego, że zwiększa różnicowanie24. Efektem netto jest generowanie wtórnych przekaźników, które stymulują transkrypcję czynników wyzwalających dalsze procesy komórkowe, takie jak migracja, proliferacja i różnicowanie25. PBM może być używany do wstępnego kondycjonowania komórek w celu proliferacji lub różnicowania przed przeszczepieniem komórek do niekorzystnego środowiska, np. uszkodzonej tkanki26. Ekspozycja ADSC na PBM przed i po przeszczepie (630 nm i 810 nm) znacznie poprawiła żywotność i funkcję tych komórek in vivo w modelu szczura z cukrzycą27. Medycyna regeneracyjna wymaga odpowiedniej liczby komórek do skutecznej naprawy tkanek28. W hodowli komórkowej 3D ADSC wiązały się z wolniejszym tempem proliferacji w porównaniu z dwuwymiarową hodowlą komórkową6. Jednak PBM może być używany do wspomagania procesu hodowli komórek 3D ADSC poprzez zwiększanie żywotności, proliferacji, migracji i różnicowania29,30.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów, odczynników i oprogramowania użytego w tym protokole. Protokół został graficznie podsumowany w Rysunek 1.

1. Dwuwymiarowa (2D) hodowla komórkowa

UWAGA: Unieśmiertelnione ADSC (1 x106 komórek) są przechowywane w temperaturze -195,8 °C w ciekłym azocie w fiolce do krioprezerwacji zawierającej 1 ml pożywki do zamrażania komórek.

  1. Przygotowanie pożywki do odzyskiwania komórek 2D i kolby do hodowli 2D
    1. Przenieść 39 ml podłoża podstawowego do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml
    2. Wzbogać podłoże podstawowe w 20% płodową surowicę bydlęcą (FBS; 10 ml) i antybiotyki (1 ml) (0,5 ml penicyliny-streptomycyny i 0,5 ml amfoterycyny B).
    3. Wstępnie kondycjonuj kolbę T75, przenosząc 6 ml pożywki do odzyskiwania komórek do kolby i inkubuj ją w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 85% przez 45 minut (można to zrobić podczas wykonywania etapów odzyskiwania komórek, aby zaoszczędzić czas).
      UWAGA: Przed użyciem podgrzej całe podłoże do 37 °C i przechowuj je w temperaturze 4 °C przez maksymalny okres 1 tygodnia.
  2. Odzyskiwanie komórek 2D
    1. Wyjąć kriowial ze zbiornika do przechowywania ciekłego azotu i szybko rozmrozić fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż do całkowitego rozmrożenia.
    2. Odwirować kriowial za pomocą wirówki o stężeniu 1006 x g przez 5 minut (20 °C), a następnie usunąć supernatant.
    3. Zawiesić granulowane komórki za pomocą 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki do odzyskiwania komórek.
    4. Równomiernie rozprowadzić zawieszone komórki w kondycjonowanej kolbie (końcowa objętość 7 ml) i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 85%.
    5. Po 24 godzinach wyrzuć i zastąp pożywkę do odzyskiwania komórek.
    6. Pożywkę należy wymieniać co 2-3 dni, aż kolba zacznie zlewać się z komórkami.
  3. Pobieranie kolby hodowlanej 2D w zawiesinie pojedynczych komórek i zliczanie komórek
    1. Wyjąć kolbę do hodowli 2D z inkubatora i wyrzucić pożywkę do odpowiedniego pojemnika na odpady.
    2. Przenieść 10 ml roztworu do płukania do kolby w celu przepłukania komórek i usunięcia odpadów i nagromadzonego białka. Następnie wylej roztwór do płukania.
    3. Dodać 6 ml roztworu oddzielającego do kolby hodowlanej w celu odłączenia komórek. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 85% przez 2 min.
      UWAGA: Obserwować kolbę pod mikroskopem, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały odłączone. Jeśli nie, delikatnie postukać w kolbę i inkubować przez kolejną minutę.
    4. Po odłączeniu wszystkich komórek przenieś zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i dodaj 1 ml pożywki do odzyskiwania komórek (zawierającej 20% FBS) do probówki. To zneutralizuje efekt roztworu odłączającego.
    5. Odwirować probówkę przez 5 minut w temperaturze 1711 x g (20 °C).
    6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml kompletnej pożywki.
    7. Pobrać 10 μl zawiesiny komórek, umieścić ją w probówce mikrowirówkowej o pojemności 500 μl i wymieszać z 10 μl błękitu trypanowego w stosunku 1:1.
    8. Umieścić 10 μl mieszaniny roztworu błękitnych krwinek trypanowych w komorze do liczenia komórek w dwóch egzemplarzach.
    9. Umieść komorę zliczania komórek w automatycznym liczniku komórek. Licznik komórek wskaże całkowitą liczbę komórek na ml, a także liczbę komórek żywotnych i martwych. Oblicz średnią liczbę żywotnych komórek i liczbę żywotnych komórek, które muszą być osadzone w hydrożelu 3D (krok 2.2.6).

2. 3D hodowla komórkowa

  1. Przygotowanie kompletnej pożywki hodowlanej 3D
    1. Przenieść 44 ml podłoża podstawowego do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
    2. Wzbogać pożywkę w 10% FBS (5 ml) i antybiotyki (1 ml) (0,5 ml penicyliny-streptomycyny i 0,5 ml amfoterycyny B).
      UWAGA: Przed użyciem podgrzej całe podłoże do 37 °C i przechowuj je w temperaturze 4 °C przez maksymalnie tydzień.
  2. Przygotowanie hydrożelu
    1. Przygotować szybki dekstran przez odwirowanie (1000 x g przez 30 s w temperaturze 20 °C) fiolki z szybkim dekstranem w celu zagęszczenia materiału. Dodać 175 μl wody do fiolki z szybkim dekstranem, aby uzyskać końcowe stężenie 30 mmol/l grup reaktywnych.
    2. Wirować probówkę (średnia prędkość przez 30 s) zawierającą roztwór szybkiego dekstranu, aż do całkowitego rozpuszczenia materiału. Rozpuszczony materiał inkubować na lodzie przez 5 minut. Odwirować probówkę, krótko ją zawirować i trzymać na lodzie podczas dalszego użytkowania.
    3. Odwirować środek sieciujący (1000 x g przez 30 s w temperaturze 20 °C) w celu zagęszczenia materiału. Dodać 188 μl wody do fiolki sieciującej, aby uzyskać końcowe stężenie 20 mmol/l grup tiolowych.
    4. Wirować rurkę (średnia prędkość przez 30 s) zawierającą roztwór środka sieciującego, aż cały materiał się rozpuści. Inkubować rozpuszczony środek sieciujący w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut. Odwirować probówkę, krótko zwirować i utrzymywać ją w temperaturze pokojowej podczas dalszego użytkowania.
    5. Dostosuj protokół hydrożelowy z 30 μl do 10 μl w celu obniżenia kosztów (szczegółowe informacje znajdują się w tabeli 1).
    6. Przygotować zawiesinę komórkową, aby uzyskać gęstość wysiewu 2,5 x 103 komórki na 10 μl hydrożelu.
    7. Połącz składniki zgodnie z tabelą 1, aby uzyskać mieszankę wzorcową. Przenieść 9 μl mieszanki wzorcowej do dołka w 96-dołkowej płytce paskowej.
    8. Zestalić żel, dodając 1 μl degradowalnego środka sieciującego 3 minuty po przeniesieniu mieszanki wzorcowej.
    9. Przykryj hydrożele 170 μl, wstępnie podgrzanymi, kompletnymi pożywkami hodowlanymi. Inkubować przez 1 godzinę. Po 1 godzinie wymienić pożywkę.
      UWAGA: Komórki zatopione w hydrożelu są gotowe do dalszych eksperymentów lub analiz w systemie hodowli 3D. Postępuj zgodnie z dodatkowymi protokołami zgodnie z potrzebami dla aplikacji podrzędnych.

3. Ekspozycja na fotobiomodulację

  1. Ustawianie lasera
    1. Skonfiguruj system lasera diodowego na fale zielone (525 nm) lub bliskiej podczerwieni (825 nm). Włącz lasery i pozwól im się rozgrzać przez zalecany czas.
    2. Ustabilizuj moc wyjściową laserów, pozwalając im osiągnąć stan ustalony. Zapewnia to stałe i dokładne napromieniowanie.
    3. Zmierz moc wyjściową laserów za pomocą miernika mocy lasera. Zapisz wartości mocy dla każdej długości fali.
    4. Użyj równania 1 ( Czas naświetlania laserem), aby obliczyć czas naświetlania laserem. Zastąp wartości z tabeli 2 równaniem 1, aby określić odpowiedni czas napromieniania dla każdej płynności. W równaniu 1 "r" oznacza promień strefy napromieniowania lasera.
      figure-protocol-1
      figure-protocol-2
      figure-protocol-3
      Równanie 1
    5. Patrz Tabela 2, aby zapoznać się z konkretnymi parametrami potrzebnymi do obliczeń, w tym płynnością (5 J/cm² lub 10 J/cm²) i mocą wyjściową lasera.
  2. Napromienianie kultur komórkowych 3D
    1. Po wymianie kompletnych pożywek (krok 2.2.9) umieść 96-dołkową płytkę zawierającą ogniwa zatopione w hydrożelu pod systemem lasera diodowego. Naświetlić hydrożele obliczonym czasem naświetlania laserem dla wybranej płynności (5 J/cm² lub 10 J/cm²) na wybranej długości fali (zielona lub bliska podczerwień). Dlatego kultury otrzymają tylko jedną dawkę.
    2. Zapewnić, że każdej grupie doświadczalnej towarzyszy grupa kontrolna (n = 4), składająca się z ADSC zatopionych w hydrożelu bez ekspozycji na PBM.
      UWAGA: Zawsze noś okulary ochronne odpowiednie do długości fali światła, z którym pracujesz. Lasery są używane na zewnątrz szafy bezpieczeństwa; Dlatego niezwykle ważne jest, aby zdezynfekować obszar przed użyciem.
    3. Inkubować płytki hodowlane w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 85% na czas trwania eksperymentów. Inkubować płytki przez 24 godziny w przypadku pierwszej analizy lub 10 dni w drugim okresie analizy, po napromieniowaniu.

4. Morfologia

  1. Mikroskopia w świetle odwróconym
    1. Włącz mikroskop z odwróconym światłem i pozwól mu się rozgrzać przez kilka minut. Upewnij się, że mikroskop jest prawidłowo ustawiony i skalibrowany.
    2. Przygotuj próbkę do obserwacji na szkiełku mikroskopowym lub specjalistycznym naczyniu do hodowli komórkowych, w zależności od konfiguracji eksperymentalnej. Skalibruj mikroskop, aby uzyskać optymalne warunki obrazowania.
    3. W razie potrzeby dostosuj ustawienia ostrości, jasności i kontrastu. Wybierz soczewkę obiektywu 20x w mikroskopie, aby obserwować i rejestrować morfologię komórek.
    4. Umieść próbkę na stoliku mikroskopu i skup się na interesujących komórkach za pomocą okularu. Korzystając z okularu lub kamery view, obserwuj i rejestruj morfologię komórki. Zwróć uwagę na kształt komórki, rozmiar i wszelkie charakterystyczne cechy.
    5. Podłącz moduł kamery do mikroskopu. Skonfiguruj aparat do obrazowania cyfrowego. Upewnij się, że połączenie i komunikacja między kamerą a mikroskopem jest prawidłowa.
    6. Korzystając z obiektywu 20x, uchwyć cyfrowe zdjęcia obserwowanych komórek. Użyj elementów sterujących aparatu, aby dostosować ekspozycję, ostrość i inne odpowiednie ustawienia.
      UWAGA: Upewnij się, że przechwycone obrazy są wysokiej jakości i zapewniają reprezentatywny widok morfologii komórki.
    7. Uruchom oprogramowanie do obrazowania na komputerze. Uchwyć obraz i użyj narzędzi analitycznych w oprogramowaniu, aby przeanalizować morfologię komórki.
    8. Zmierz wymiary komórek, policz komórki lub wykonaj odpowiednią analizę w oparciu o cele eksperymentu.
    9. Dodaj odpowiednią podziałkę liniową do obrazów za pomocą oprogramowania. Użyj znanego powiększenia obiektywu mikroskopu, aby dokładnie odwzorować skalę obrazów.

5. Testy biochemiczne

  1. Odzyskiwanie komórek
    UWAGA: Komórki muszą zostać odzyskane z hydrożelu w zawiesinie jednokomórkowej w celu przeprowadzenia dalszych testów biochemicznych.
    1. Przygotuj enzymatyczny roztwór do odzyskiwania komórek. W sterylnym środowisku przygotuj roztwór roboczy, rozcieńczając enzymatyczny roztwór do odzyskiwania komórek solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w stosunku 1:20 (roztwór: PBS). Jeśli wymagane jest odzyskanie komórek z określonej liczby żeli lub studzienek, należy obliczyć całkowitą wymaganą objętość na podstawie 30 μl roztworu regeneracyjnego na żel.
    2. Dodać 30 μl roztworu roboczego do każdego żelu lub studzienki zawierającej komórki wymagające regeneracji. Zapewnij dokładne i równomierne rozprowadzenie roztworu regeneracyjnego, delikatnie kołysząc lub obracając płytką. Inkubować płytkę z roztworem regeneracyjnym zgodnie z zalecanym czasem inkubacji. Informacje te można zazwyczaj znaleźć w karcie katalogowej produktu lub protokole dostarczonym przez dostawcę.
    3. Po okresie inkubacji ostrożnie wyjąć płytkę z inkubatora. Odwirować płytki o stężeniu 1409 x g przez 5 minut (20 °C) w celu osadzenia komórek. Zapoznaj się z arkuszem danych produktu lub protokołem, aby uzyskać informacje na temat zalecanych warunków wirowania. Po zakończeniu wirowania ostrożnie wyrzuć supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego.
    4. Delikatnie zawiesić granulowane komórki w 220 μl sterylnego PBS. Zapewnić dokładne wymieszanie, aby uzyskać jednorodną zawiesinę jednokomórkową. Komórki są teraz gotowe do dalszych testów biochemicznych. Należy postępować zgodnie ze szczegółowymi protokołami dla zamierzonych testów, biorąc pod uwagę charakter odzyskanych komórek i wymagania konfiguracji doświadczalnej.
  2. Test cytotoksyczności dehydrogenazy mleczanowej (LDH)
    1. Z każdej studzienki ostrożnie usuń 50 μl kompletnej pożywki hodowlanej, zapewniając minimalne zakłócenie warstwy komórkowej.
    2. Dodać 50 μl odczynnika cytotoksyczności bezpośrednio do każdego studzienki zawierającego pozostałe 50 μl pożywki hodowlanej. Delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół, aby zapewnić dokładne wymieszanie próbki z odczynnikiem.
    3. Przygotuj kontrolę pozytywną. Ustawić trzy studzienki z 5 μl 10-krotnego roztworu do lizy na 50 μl dodatnich komórek kontrolnych zawartych w zestawie.
    4. Inkubować płytkę w zalecanej temperaturze i czasie trwania. Ten etap pozwala odczynnikowi cytotoksycznemu na lizę komórek i uwolnienie LDH do pożywki hodowlanej.
    5. Po okresie inkubacji dodać 50 μl roztworu zatrzymującego bezpośrednio do każdej studzienki zawierającej odczynnik cytotoksyczny i lizat komórkowy. Delikatnie mieszać, pipetując w górę i w dół, aby zapewnić prawidłowe zatrzymanie reakcji.
      UWAGA: Roztwór zatrzymujący zatrzymuje dalsze uwalnianie LDH i zapewnia stabilność rozwoju koloru.
    6. Zainstaluj czytnik płytek spektrofotometrycznych zgodnie z instrukcjami producenta. Zapisać absorbancję każdej studzienki przy długości fali 490 nm. Ta długość fali jest specyficzna dla kolorymetrycznej detekcji produktu formazanu generowanego w reakcji LDH.
    7. Odejmij odczyty absorbancji tła zarówno z grup poddanych zabiegowi, jak i studzienek kontrolnych. Uzyskaj odczyty tła z dołków zawierających pożywki i odczynniki cytotoksyczności bez komórek.
    8. Przeanalizować skorygowane wartości absorbancji dla każdej próbki w celu określenia poziomu cytotoksyczności. Wyższe wartości absorbancji wskazują na zwiększone uwalnianie LDH, a co za tym idzie, wyższą cytotoksyczność.
    9. Upewnij się, że każda grupa doświadczalna i kontrolna składała się z czterech powtórzeń (krok 3.2.2) dla dokładności statystycznej. Oblicz i zaimportuj średnią absorbancję każdej grupy i kontroli do odpowiedniego programu statystycznego.
    10. Porównaj wyniki między grupami poddanymi działaniu substancji i odpowiednimi kontrolami, aby dokładnie ocenić skutki cytotoksyczne i zapisać wszystkie odczyty absorbancji, obliczenia i warunki eksperymentalne do wykorzystania w przyszłości.
  3. Test proliferacji ATP
    1. W sterylnym środowisku wymieszaj 50 μl odzyskanych komórek z 50 μl odczynnika ATP w każdym dołku.
      UWAGA: Dostosuj objętość komórek i odczynników w oparciu o liczbę dołków i projekt eksperymentalny. Utrzymuj stałe proporcje, aby uzyskać dokładne wyniki.
    2. Umieść talerz na shakerze i energicznie potrząsaj w ciemności przez 5 minut. Ten etap zapewnia dokładne wymieszanie komórek z odczynnikiem. Po wstrząśnięciu inkubować płytkę przez dodatkowe 25 minut w temperaturze suchej masy. Ten okres inkubacji pozwala odczynnikowi na lizę komórek i wygenerowanie sygnału luminescencyjnego proporcjonalnego do ilości obecnego ATP.
    3. Skonfiguruj czytnik płytek zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi wykrywania luminescencji. Zmierz luminescencję z każdej studzienki zawierającej lizat komórkowy i odczynnik ATP. Upewnij się, że czytnik płytek jest ustawiony na pomiar luminescencji z odpowiednimi ustawieniami.
    4. Odejmij odczyty luminescencji tła zarówno z grup poddanych zabiegowi, jak i studzienek kontrolnych. Uzyskaj odczyty tła ze studzienek zawierających tylko odczynnik ATP i PBS bez komórek.
    5. Przeanalizuj skorygowane wartości luminescencji dla każdej próbki, aby określić poziomy ATP, odzwierciedlające proliferację lub żywotność komórek.
    6. Upewnij się, że każda grupa doświadczalna i kontrolna składała się z czterech powtórzeń (krok 3.2.2) dla dokładności statystycznej. Oblicz i zaimportuj średnią luminescencję każdej grupy i kontroli do odpowiedniego programu statystycznego.
    7. Porównaj wyniki między grupami leczonymi i odpowiednimi kontrolami, aby dokładnie ocenić proliferację ATP. Zapisz wszystkie odczyty luminescencji, obliczenia i warunki eksperymentalne do wykorzystania w przyszłości.
      UWAGA: W przypadku wszystkich analiz biochemicznych w formie zestawu należy postępować zgodnie z instrukcją lub protokołem zestawu dostarczonym przez producenta, aby uzyskać szczegółowe informacje, takie jak zalecane czasy inkubacji, stężenia oraz wszelkie dodatkowe kroki lub względy. Zawsze przestrzegaj wytycznych bezpieczeństwa laboratoryjnego podczas obchodzenia się z chemikaliami i materiałami biologicznymi.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby ocenić morfologię i wizualnie sprawdzić gęstość komórek hydrożeli, użyto mikroskopii odwrotnej (Rysunek 2). ADSC zachowały zaokrągloną morfologię 24 godziny po wysiewie i ekspozycji na PBM. Komórki były rozrzucone po całym żelu jako pojedyncze komórki lub w gronach przypominających winogrona. Morfologia pozostała niezmieniona po 10 dniach w hodowli 3D. Nie stwierdzono definitywnej różnicy w morfologii między grupami eksperymentalnymi i kontrolnymi ani między różnymi grupami eksperymentalnymi.

Aby ocenić cytotoksyczne efekty ekspozycji na PBM i hodowlę 3D przy użyciu hydrożelu, zmierzono wyciek LDH (Rysunek 3). Nie stwierdzono istotnych różnic między grupami eksperymentalnymi a kontrolnymi po 24 godzinach lub 10 dniach, co wskazuje, że ekspozycja na PBM i hodowla hydrożelu nie miały szkodliwego wpływu na komórki.

Tempo proliferacji komórek mierzono poprzez pomiar zawartości ATP w ADSC (Rysunek 4). Ekspozycja na PBM skutkowała zwiększonym tempem proliferacji we wszystkich grupach eksperymentalnych w porównaniu z grupą kontrolną. Po 24 godzinach od ekspozycji na PBM długość fali 525 nm stymulowała najwyższe tempo proliferacji. Jednak po 10 dniach długość fali 825 nm wykazała lepsze tempo proliferacji w porównaniu z długością fali 525 nm. Pod koniec 10-dniowego okresu hodowli grupa 825 nm, 10 J/cm2 wykazała najwyższy wskaźnik proliferacji.

figure-results-1
Rysunek 1: Przegląd protokołu. Skrócony protokół podkreślający przygotowanie hydrożelu w 96 płytkach dołkowych, ekspozycję na PBM oraz pomiar morfologii i testów biochemicznych po 24 godzinach i 10 dniach po ekspozycji na PBM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: ADSC agregowane samodzielnie po rozsianiu. Komórki zachowały morfologię od okrągłego do owalnego i były rozmieszczone w hydrożelu jako pojedyncze komórki lub agregaty z wyglądem klastra przypominającego winogrona po (A) 24 godzinach i (B) 10 dniach po wysiewie i ekspozycji na PBM. Nie zaobserwowano żadnej ostatecznej zmiany po 10 dniach inkubacji. Za pomocą kontroli (1 i 4), odpowiednio 525 nm przy 5 J/cm2 (2) i 10 J/cm2 (5) lub 825 nm przy 5 J/cm2 (3) i 10 J/cm2 (6). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Wyciek komórkowego LDH jako miara cytotoksyczności 24 godziny i 10 dni po ekspozycji na PBM, przy użyciu diody 525 nm i 825 nm (5 J/cm2 i 10 J/cm2) w hydrożelu. Nie zaobserwowano istotnego zwiększenia cytotoksyczności w porównaniu z kontrolą doświadczalną. Kontrola pozytywna była reprezentatywna dla całkowitej śmierci komórki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Komórkowe ATP jako miara proliferacji 24 godziny i 10 dni po ekspozycji na PBM, przy użyciu diody 525 nm i 825 nm (5 J/cm2 i 10 J/cm2) w hydrożelu. Ekspozycja na PBM stymulowała zwiększone tempo proliferacji we wszystkich grupach eksperymentalnych w obu punktach czasowych i obu płynnościach. Istotne różnice (P < 0,001) są oznaczone symbolem ***. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

składnikObjętość (μl) na studzienkę
Polimer SLO-Dekstran (30 mmol/L)0,7
Zawiesina komórekcyfra arabska
bufor0,8
WodaRozdział 5.5
Urządzenie sieciujące1
Całkowita objętość10

Tabela 1: Objętości odczynnika hydrożelowego (10 μL).

szt. szt. TGL szt. pkt.
Parametry laseraZielony (G)Bliska podczerwień (NIR)
Źródło światłaLaser diodowyLaser diodowy
Długość fali (nm)525825
Moc wyjściowa (mW)Okręg wyborczy 553515
Gęstość mocy (mW/cm2)Klasa 57,4853,53

Tabela 2: Parametry lasera.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ADSC są idealnym typem komórek do wykorzystania w medycynie regeneracyjnej, ponieważ stymulują różne procesy, aby pomóc w gojeniu się ran 3,4. Istnieje jednak kilka wyzwań, które należy obejść, np. słabe wskaźniki przeżycia i nieskuteczne wszczepienie komórek w miejsce urazu9. Unieśmiertelnione komórki wykorzystano jako dostępną na rynku linię komórkową, ponieważ mogą być pasażowane przez więcej pokoleń w porównaniu z komórkami pierwotnymi, nie trzeba ich zbierać, są dobrze scharakteryzowane i stanowią jednorodne populacje zapewniające spójne wyniki31. Celem pracy było określenie potencjału augmentacyjnego PBM na proliferację i cytotoksyczność ADSC z wykorzystaniem hodowli komórkowej 3D. Protokół producenta dla hydrożelu o pojemności 30 μl został dostosowany do 10 μl, aby zaoszczędzićkoszty 32. Jednak ta zmniejszona objętość utrudniała przygotowanie i obchodzenie się z żelem.

Wykazano, że ADSC same agregują się w środowisku3D 33. Podobnie w tym badaniu, komórki utworzyły agregaty komórkowe o wyglądzie przypominającym winogrona. Zidentyfikowano jednak również komórki nieśne. Złuszczanie komórek jest znaną właściwością sferoid, w której komórki odłączają się od głównego ciała sferoidalnego lub zbiorczego i są uwalniane do środowiska hodowli. Wydalanie komórek może wynikać z proliferacji komórek, w której żywe komórki są zrzucane podczas mitozy i umożliwiają migrację34. Alternatywnie, linienie może nastąpić z powodu śmierci komórki i utraty sferoidalnego lub zagregowanego kształtu35, szczególnie w bardzo dużych sferoidach z powodu rosnącego nekrotycznego rdzenia. Komórki przyjęły zaokrągloną morfologię w hodowli 3D, w porównaniu z kształtem wrzeciona w hodowlach 2D. Zgodnie z wynikami podobnych badań, wyniki te wynikają z braku miejsc przyczepu lub macierzy zewnątrzkomórkowej, do której komórki mogłyby przylegać do 6,9. Co więcej, komórki nie wykazały znaczącej migracji w żelu, co dodatkowo sugeruje potrzebę miejsc przyłączenia36. Zaleca się dodanie peptydu adhezyjnego lub innego białka macierzy zewnątrzkomórkowej w celu ułatwienia przyłączenia, adhezji i migracji. Ograniczeniem badania było zastosowanie mikroskopii światła odwróconego do obserwacji morfologii 3D ADSC zamiast układania w stosy Z. Ekspozycja na PBM i hodowla 3D nie miały znaczącego wpływu na cytotoksyczność ADSC zarówno po 24 godzinach, jak i 10 dniach od ekspozycji, co wskazuje, że hodowla hydrożelu i PBM są bezpieczne i nie mają negatywnego wpływu na komórki 6,26. W hodowli komórkowej 3D ADSC są związane z wolniejszym tempem proliferacji w porównaniu z hodowlą komórkową 2D. Potwierdzają to niskie wskaźniki proliferacji w grupie kontrolnej w obecnym badaniu6. PBM (525 nm i 825 nm) znacznie zwiększył tempo proliferacji ADSC w hodowli 3D. Początkowo zielone światło (525 nm) zarówno o płynności 5 J/cm2, jak i 10 J/cm2 wywoływało najwyższe tempo proliferacji w porównaniu ze światłem bliskiej podczerwieni (825 nm). Jednak po 10 dniach światło bliskiej podczerwieni (825 nm) ma najwyższe tempo proliferacji zarówno przy płynności 5 J/cm2, jak i 10 J/cm2. Podobnie wykazano, że PBM (525 nm i 825 nm) zwiększa tempo proliferacji w kulturach 2D37. Zaleca się również uwzględnienie grupy kombinacji długości fal, ponieważ inne badania wykazały synergiczny efekt światła zielonego i bliskiej podczerwieni.

Podsumowując, zastosowany hydrożel jest syntetycznym hydrożelem o ogromnych możliwościach dostosowywania do potrzeb różnych zastosowań. Obecne badanie wykazało, że żel nie ma działania cytotoksycznego na komórki w hodowli przez okres 10 dni. Co więcej, PBM wykazał pozytywny potencjał augmentacyjny poprzez znaczne zwiększenie tempa proliferacji ADSC, mimo że znajduje się w środowisku hodowli 3D. W ten sposób ten hydrożel może służyć jako możliwy nośnik biomateriału do przeszczepu do ran. Przyszłe badania powinny mieć na celu przetestowanie potencjalnej zdolności żelu do wspomagania gojenia się ran za pomocą badań na zwierzętach. Jeśli wyniki badań na zwierzętach są korzystne, przewiduje się, że ADSC pochodzące od pacjentów mogą być zbierane, kapsułkowane i wzmacniane PBM przed przeszczepem do ran, aby pomóc w gojeniu się ran w zastosowaniach klinicznych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane przez National Research Foundation of South Africa Thuthuka Instrument, grant numer TTK2205035996; Departament Nauki i Innowacji (DSI) sfinansował African Laser Centre (ALC), numer grantu HLHA23X zadanie ALC-R007; University Research Council, grant number 2022URC00513; Departament Nauki i Technologii's South African Research Chairs Initiative (DST-NRF/SARChI), Numer grantu 98337. Organy finansujące nie odegrały żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu, analizie, interpretacji danych ani pisaniu manuskryptu. Autorzy dziękują Uniwersytetowi w Johannesburgu (UJ) i Centrum Badań Laserowych (LRC) za wykorzystanie obiektów i zasobów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Laser diodowy 525 nmNarodowe Centrum Laserowe Republiki Południowej AfrykiEN 60825-1:2007
Laser diodowy 825 nmNarodowe Centrum Laserowe Republiki Południowej AfrykiSN 101080908ADR-1800
96-dołkowe płytki paskoweSigma-AldrichBR782301
Amfoterycyna BSigma-AldrichA2942Antybiotyk (0,5%; 0,5 ml)
Żywotność komórek CellTiter-Glo 3D TestOdczynnik ATP PromegaG9681, Zestaw do oznaczania proliferacji
Corning 2 ml Fiolka kriogeniczna z polipropylenu z gwintem zewnętrznymCorning430659kriowialna
CryoSOfreeSigma-AldrichC9249Pożywka do zamrażania komórek
CytoTox96 Nieradioaktywna analiza cytotoksycznościPromegaG1780Odczynnik cytotoksyczności
Dulbecco' s Zmodyfikowana pożywka EagleSigma-AldrichD5796Pożywka podstawowa (39 ml/44 ml)
Miernik mocy lasera FieldMateKoherentny1098297
płaskodenna bezbarwna płytka polistyrenowa Corning 96 wellSigma-AldrichCLS3370
Surowica bydlęca dla płoduBiochromS0615Wzbogacenie pożywki hodowlanej (5 ml; 10% / 10 ml; 20%)
Hanks Zrównoważony roztwór soli (HBSS)Sigma-AldrichH9394Roztwór do płukania
Inkubator CO2Thermo Scientific51026280
Heraeus Labofuge 400Thermo Scientific75008371Wirówka do płytek 96-dołkowych
Heraeus Megafuge 16RThermoFisher75004270
Immortalized ADSCATCCASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000Passage 37
Invitrogen Countess 3InvitrogenAMQAX2000Automatyczny licznik komórek do kąpieli wodnej Trypan Blue
Julabo TW20Sigma-AldrichZ615501Kąpiel wodna służąca do podgrzewania mediów do 37 & deg; C
Olympus CellSens EntryOlympusWersja 3.2 (23706) Oprogramowanie do obrazowania: cyfrowa akwizycja obrazu
Olympus CKX41OlympusSN9B02019Mikroskop światła odwróconego
Aparat Olympus SC30Aparat OlympusSN57000530podłączony do mikroskopu światła odwróconego
Nieprzezroczystościenne mikropłytki polistyrenowe Corning 96 dołkówSigma-AldrichCLS3912Nieprzezroczysty dobrze stosowany do luminescencji ATP
Penicylina-StreptomycynaSigma-AldrichP4333Antybiotyk (0,5%; 0,5 ml)
SigmaPlot 12.0Systat Software Incorporated
TrueGel3D – True3Sigma-AldrichTRUE3-1KT10 &mikro; L
TrueGel3D Enzymatyczne rozwiązanie do odzyskiwania komórekSigma-AldrichTRUEENZ 01:20
Trypan Blue StainThermo Fisher - InvitrogenT102820,4% roztwór
TrypLE Select Enzyme (1x)Gibco12563029Roztwór do odrywania komórek
Victor Nivo Czytnik płytekPerkin ElmerHH3522019094Czytnik płytek spektrofotometrycznych

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
  2. Yuan, X., et al. Strategies for improving adipose-derived stem cells for tissue regeneration. Burns Trauma. 10, (2022).
  3. Nilforoushzadeh, M. A., et al. Mesenchymal stem cell spheroids embedded in an injectable thermosensitive hydrogel: An in situ drug formation platform for accelerated wound healing. ACS Biomater Sci Eng. 6 (9), 5096-5109 (2020).
  4. Yang, M., et al. Thermosensitive injectable chitosan/collagen/β-glycerophosphate composite hydrogels for enhancing wound healing by encapsulating mesenchymal stem cell spheroids. ACS Omega. 5 (33), 21015-21023 (2020).
  5. Chimenti, I., et al. Relative roles of direct regeneration versus paracrine effects of human cardiosphere-derived cells transplanted into infarcted mice. Circ Res. 106 (5), 971-980 (2010).
  6. Hassan, W., Dong, Y., Wang, W. Encapsulation and 3d culture of human adipose-derived stem cells in an in-situ crosslinked hybrid hydrogel composed of peg-based hyperbranched copolymer and hyaluronic acid. Stem Cell Res Ther. 4 (2), 32(2013).
  7. Wu, K. H., Mo, X. M., Han, Z. C., Zhou, B. Stem cell engraftment and survival in the ischemic heart. The Ann Thorac Surg. 92 (5), 1917-1925 (2011).
  8. Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: General approaches and a review of recent developments. J R Soc Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
  9. Koivunotko, E., et al. Angiogenic potential of human adipose-derived mesenchymal stromal cells in nanofibrillated cellulose hydrogel. Biomedicines. 10 (10), 2584(2022).
  10. Dong, Y., et al. Injectable and tunable gelatin hydrogels enhance stem cell retention and improve cutaneous wound healing. Adv Funct Mater. 27 (24), 1606619(2017).
  11. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3d cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  12. Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323(2019).
  13. Sung, T. -C., et al. 3D culturing of human adipose-derived stem cells enhances their pluripotency and differentiation abilities. J Mater Sci Technol. 63, 9-17 (2021).
  14. Garg, R. K., et al. Capillary force seeding of hydrogels for adipose-derived stem cell delivery in wounds. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1079-1089 (2014).
  15. Kim, Y. M., et al. Adipose-derived stem cell-containing hyaluronic acid/alginate hydrogel improves vocal fold wound healing. Laryngoscope. 124 (3), E64-E72 (2014).
  16. Dong, Y., et al. Conformable hyaluronic acid hydrogel delivers adipose-derived stem cells and promotes regeneration of burn injury. Acta Biomater. 108, 56-66 (2020).
  17. Truegel3d hydrogel for 3d cell culture. Merck. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/ZA/en/technical-documents/technical-article/cell-culture-and-cell-culture-analysis/3d-cell-culture/truegel3d (2024).
  18. Braccini, S., Tacchini, C., Chiellini, F., Puppi, D. Polymeric hydrogels for in vitro 3d ovarian cancer modeling. Int J Mol Sci. 23 (6), 3265(2022).
  19. Mashinchian, O., et al. In vivo transcriptomic profiling using cell encapsulation identifies effector pathways of systemic aging. eLife. 11, e57393(2022).
  20. Matsushige, C., Xu, X., Miyagi, M., Zuo, Y. Y., Yamazaki, Y. Rgd-modified dextran hydrogel promotes follicle growth in three-dimensional ovarian tissue culture in mice. Theriogenology. 183, 120-131 (2022).
  21. Marx, V. How some labs put more bio into biomaterials. Nat Methods. 16 (5), 365-368 (2019).
  22. Marques, M. M. Photobiomodulation therapy weaknesses. Laser Dent Sci. 6 (3), 131-132 (2022).
  23. Hamblin, M. R. Mechanisms and mitochondrial redox signaling in photobiomodulation. Photochem Photobiol. 94 (2), 199-212 (2018).
  24. Chen, J., et al. Low-level controllable blue LEDs irradiation enhances human dental pulp stem cells osteogenic differentiation via transient receptor potential vanilloid 1. J Photochem Photobiol B. 233, 112472(2022).
  25. Chang, S. -Y., Carpena, N. T., Kang, B. J., Lee, M. Y. Effects of photobiomodulation on stem cells important for regenerative medicine. Med Lasers. 9 (2), 134-141 (2020).
  26. Bikmulina, P. Y., et al. Beyond 2d: Effects of photobiomodulation in 3d tissue-like systems. J Biomed Opt. 25 (4), 048001(2020).
  27. Ahmadi, H., et al. Transplantation of photobiomodulation-preconditioned diabetic stem cells accelerates ischemic wound healing in diabetic rats. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 494(2020).
  28. Mao, A. S., Mooney, D. J. Regenerative medicine: Current therapies and future directions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (47), 14452-14459 (2015).
  29. De Andrade, A. L. M., et al. Effect of photobiomodulation on the behaviour of mesenchymal stem cells in three-dimensional cultures. Lasers Med Sci. 38 (1), 221(2023).
  30. Diniz, I. M., et al. Photobiomodulation of mesenchymal stem cells encapsulated in an injectable rhbmp4-loaded hydrogel directs hard tissue bioengineering. J Cell Physiol. 233 (6), 4907-4918 (2018).
  31. Carter, M., Shieh, J. C. Guide to Research Techniques in Neuroscience. , Elsevier, Academic Press. (2015).
  32. Lutolf, M. P., et al. Synthetic matrix metalloproteinase-sensitive hydrogels for the conduction of tissue regeneration: Engineering cell-invasion characteristics. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5413-5418 (2003).
  33. Robledo, F., et al. Spheroids derived from the stromal vascular fraction of adipose tissue self-organize in complex adipose organoids and secrete leptin. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 70(2023).
  34. Landry, J., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Shedding of mitotic cells from the surface of multicell spheroids during growth. J Cell Physiol. 106 (1), 23-32 (1981).
  35. Bogacheva, M. S., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into definitive endoderm cells in various flexible three-dimensional cell culture systems: Possibilities and limitations. Front Cell Dev Biol. 9, 726499(2021).
  36. Chen, X., Thibeault, S. L. Biocompatibility of a synthetic extracellular matrix on immortalized vocal fold fibroblasts in 3-d culture. Acta Biomater. 6 (8), 2940-2948 (2010).
  37. Crous, A., Van Rensburg, M. J., Abrahamse, H. Single and consecutive application of near-infrared and green irradiation modulates adipose derived stem cell proliferation and affect differentiation factors. Biochimie. 196, 225-233 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rusztowanie hydro eloweproliferacja kom rek macierzystychr nicowanie kom rek macierzystychmedycyna regeneracyjnamezenchymalne kom rki macierzystenapromieniowanie laseroweywotno kom rek

Powiązane artykuły